EP1951870A1 - Dna-konstrukte zur spezifischen hemmung der genexpression durch rna-interferenz - Google Patents

Dna-konstrukte zur spezifischen hemmung der genexpression durch rna-interferenz

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EP1951870A1
EP1951870A1 EP06805529A EP06805529A EP1951870A1 EP 1951870 A1 EP1951870 A1 EP 1951870A1 EP 06805529 A EP06805529 A EP 06805529A EP 06805529 A EP06805529 A EP 06805529A EP 1951870 A1 EP1951870 A1 EP 1951870A1
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dna
stranded
promoter
shaped
sequence
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Definitions

  • the invention relates to methods for the production of vectors which are suitable, after their transfection into eukaryotic cells, specifically to inhibit the formation of one or more proteins by RNA interference and such vectors.
  • RNA interference small interference RNA
  • the siRNA does not prevent the reading of the gene, but activates a cell-specific mechanism that prevents the mRNAs read by the gene and thus the formation of the corresponding protein (post-transcriptional gene silencing).
  • siRNA molecules with 19-23 RNA bases in length, which are homologous to the target mRNA whose conversion into a protein is to be prevented.
  • the siRNA molecules assemble with special endo ribonucleases to form a cell-specific RNA-protein complex called "RISC” (RNA-induced silencing complexes), where the two RNA strands dissociate to form so-called activated RISCs each containing a single strand of the siRNA molecule.
  • RISC RNA-induced silencing complexes
  • the siRNA can be generated experimentally in the cell or introduced by introducing it from the outside. On the one hand, this is achieved via synthetically produced siRNA molecules, which can be administered both in vitro and in vivo.
  • siRNA can be generated by vectors in the cell. These are viral or plasmid-based vectors, which lead to the formation of the siRNA sequences only in the cell by expression.
  • the advantages over transfection with synthetic siRNA lie in the more stable and possibly more regulated transcription of the corresponding siRNA sequence.
  • the plasmid-based vectors also show a complex production process. So it is necessary to select stable clones. In this often protracted process, which can take weeks but even months, there are often numerous potential difficulties inherent in cloning experiments. To check the product sequencing is necessary, which are also labor-intensive and cost-intensive.
  • the plasmid-based vectors contain antibiotic resistance genes that are necessary for their selection. For this reason, such vectors are not suitable for use in living organisms. The possible recombination with ubiquitous bacteria in the organism carries the risk of an increasing occurrence of antibiotic-resistant bacteria. The spread of antibiotic resistance is a serious problem and unacceptable. Because viral vectors are capable of efficient and targeted transfection, they offer an advantage over synthetic siRNA molecules as well as plasmid-based vectors.
  • RNA interference One of the major problems with multiple inhibition of gene expression by RNA interference, in the case of using multiple independent constructs, is the low probability that a cell will be transfected by only one construct alone. This low probability narrows negatively with the number of constructs used. Often, however, certain gene therapy approaches require controlled, simultaneous inhibition of gene expression.
  • RNAs there are a variety of methods that allow the cotranscription of multiple RNAs in a cell.
  • the simplest method is the cotransfection of two independent expression constructs (in the following also: vectors).
  • Another method involves transfection with a vector carrying two independent expression cassettes.
  • Such constructs can also be used for the generation of si RNAs.
  • IRES elements have been discovered in picornavirus mRNA (Pelletier and Sonenberg, 1988, Nature 334: 320-325, Jang et al., 1988, Journal Virology 62: 2636-2643).
  • bicistronic vectors most frequently uses the IRES elements of poliovirus and EMCV (encephalomyocarditis virus) (Dirks et al., 1993, Gene 128: 247-249). Disadvantageously, their effectiveness varies greatly depending on the cell line used (Borman et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 925-932).
  • bicistronic expression cassettes consist of a selectable marker or reporter gene located on the 3 ⁇ side of the IRES element and a multiple cloning site (MCS) for the insertion of the desired gene (Dirks et al., 1993, Gene 128: 247-249).
  • MCS multiple cloning site
  • tri- and polycistronic expression systems using IRES elements are known (Zitvogel et al., 1994, Hum Gene Ther 5: 1493-1506, Fussenegger et al., 1998a, Nature Biotechnol. 16: 468-472, Mielke et al., 2000, Gene 254. 1-8).
  • viral IRES elements can only be used with reservations for therapeutic use.
  • the recombination of viral sequences with naturally occurring viruses also represents an inherent security risk here, since the generation of new, pathogenic hybrid viruses must be feared.
  • Multicistronic vectors can also be constructed by linking transcription units without IRES elements.
  • the desired genes can be cloned into a plasmid vector via different MCS, and secondly, expression cassettes isolated from plasmids can be linked by DNA linkers to linear multicistronic vectors (Tsang et al., 1997, Bio Techniques 22: 68).
  • Plasmid vectors for the expression of multiple genes differ from the usual plasmid vectors in the number of mononated transcription units. Promoters or poly (A) sequences of the same or different origin can be used for the transcription units.
  • the disadvantage resulting from the use of different promoters is that the promoters differ in their strength and thus the expression rates of the individual genes can vary, whereas the use of identical promoters can lead to the formation of secondary structures of the DNA, which a loss of function the promoters can result.
  • siRNA which are also capable of simultaneously inhibiting the gene expression of several genes.
  • a linker of the sequences for generating the siRNAs which ensures sufficient transcription to inhibit gene expression of these sequences.
  • a method of linking DNA fragments by DNA linkers is known in the literature. Seeman describes DNA sequences for the investigation of naturally occurring branches, so-called Holliday junctions, which are postulated as topological special forms of B-DNA under torsional stress (Seeman: 1982, J Theor Biol 99: 237-247; Annu. Rev. Bio - Phys. Biomol. Struct. 1998. 27: 225-248). The application of these structures has hitherto been limited to short pieces of oligonucleotide for studying DNA structural forms.
  • an expression construct which consists of a first DNA terminating hairpin structure in which a single strand of deoxyribonucleotides is folded back to a double-stranded region in such a way that it has a cohesive overhang end and at the opposite end the single stranded double stranded strands a single-stranded loop, a second end-hairpin structure constructed analogously to the first end-hairpin structure, and a T-shaped DNA structure having three double-stranded DNA arms joined via Holliday junctions, at least one arm containing the sequences to be transcribed and the single strands of this DNA double-stranded arm at the end opposite to the junction with the other arms are interconnected by a single-stranded DNA loop and the other two arms have cohesive ends, one arm e Ine suitable termination sequence and the other arm has a suitable promoter sequence.
  • the components mentioned represent the essential constituents of a construct according to the invention.
  • the invention also encompasses expression constructs which comprise these components, but these arise from other combinations of DNA structures.
  • an expression construct for targeted inhibition of gene expression by means of RNA interference which comprises a first DNA terminating hairpin structure in which a single strand of deoxyribonucleotides is folded back into a double-stranded region in such a way that it has an end with cohesive overhang and at the opposite end Furthermore, a second terminating hairpin structure which is constructed analogously to the first terminating hairpin structure and whose double-stranded and single-stranded region consists of the sequence to be transcribed and a suitable promoter sequence and a suitable reverse-complementary Termination sequence located between the two final hairpin structures described above in a DNA double strand.
  • Such an expression construct has only one double-stranded copy of the siRNA to be generated.
  • the generation of a siRNA in the presence of only one copy is possible with this construct since the sequences to be transcribed are read from the RNA polymerase across the single-stranded loop and transcribed. This would not be possible with a double-stranded plasmid.
  • T-shaped or linear DNA structures are each connected at one end by a linker by means of Holliday junctions.
  • sequences to be transcribed will code for identical or different genes.
  • Linkers are understood to mean oligonucleotides for the connection of DNA expression cassettes.
  • a linker according to the invention consists of two or more strands, as illustrated by the following example of a linker formed from three oligonucleotides which are to be illustrated with three expression cassettes on interconnected strands A, B and C: End of A has a complementary sequence to the 3 'end of B and forms a duplex, while the 3' end of A pairs with the 5 'end of C, and finally the 5' end of B with the 3 'End of C pairs.
  • This type of combination of DNA duplexes is also referred to as the Holliday junction (FW Stahl: Genetics, 1994 Oct; 138 (2): 241-6), which offers the advantage that only naturally occurring building blocks are used to join the expression cassettes , which may prove to be particularly advantageous for use of the invention for medical purposes for toxicological reasons.
  • the oligodeoxynucleotide sequences used for the DNA branches are chosen such that upon hybridization at the 5 X ends of the oligonucleotides (for example) a four base long, overhanging, cohesive end is generated.
  • the sequences of the cohesive ends may or may not be different for each arm of a branch.
  • the T-shaped or linear DNA structures have an overhang complementary to the cohesive end. This allows the targeted ligation of the expression cassettes to the individual "arms" of the branches.
  • Such designed expression constructs according to the invention are suitable for targeted, multiple inhibition of gene expression of various genes.
  • the identical structure of the T-shaped structures which each contain the necessary sequences for generating the siRNAs, the different siRNAs are generated equally strong.
  • the number of genes whose protein expression is inhibited depends on the number of T-shaped structures connected via the linker.
  • the cohesive ends of individual components are specifically and differently selected for specific connection with other components. This allows the targeted construction of the desired expression construct.
  • a DNA expression construct containing the sequences for generating one or more siRNAs can selectively transfect cells.
  • Transfection should be understood to mean the introduction into the cell of nucleic acid sequences by means of biological, chemical or physical methods, as a result of which sustained or transient expression of catalytically active RNA transcripts encoded by these sequences occurs in the transfected cell.
  • the expression constructs according to the invention covalently bound have one or more peptides, proteins, carbohydrates, antibodies or steroids.
  • a further subject of the present invention are production methods for expression constructs which, after being transfected into eukaryotic cells, specifically inhibit the formation of defined proteins by RNA interference.
  • a method is provided, starting in process step a) with the mixture of a DNA double strand, which contains a 19 - 23 bases long, single copy of a gene sequence or its reverse-complementary sequence and a termination signal for RNA polymerases, and is terminated by an 8-12 base sequence loop at one end, which is chosen such that opposite bases in no case complement one another.
  • a hairpin-shaped oligodeoxynucleotide having at the end short protruding ends of single-stranded DNA in process step b) and in method step c) a promoter with short protruding ends of single-stranded DNA, wherein the single-stranded 5 'end of the promoter can pair with the hairpin-shaped oligodeoxynucleotide or the 10 to 1000 base double strand and the single-stranded 3' end of the promoter is complementary to the single-stranded 5 ' End of the DNA double strand described under a) and subsequent ligation of the DNA fragments in process step d) and final purification of the vectors produced in the last process step e).
  • a method is provided, starting in step a) with the mixture of a T-shaped DNA double strand, which is a 19 Contains 23 bases long, single copy of a gene sequence in the 5 'to 3' direction as well as a termination signal for RNA polymerases and is terminated by an 8 to 12 base sequence loop at one end so chosen in that opposite bases are in no way complementary to one another and the flanking double stranded regions are interconnected by two single strands of DNA and at the other end have two short protruding DNA strands, and an oligodeoxynucleotide whose sequence is complementary to the two short protruding DNA single strands and forming two short protruding ends of single-stranded DNA, in Ver step b) with a hairpin-shaped Oligodeoxynucleotide which has short protruding ends of single-stranded DNA
  • a method in which the promoter is part of a bacterially amplifiable plasmid which is excised prior to mixing the components with a restriction endonuclease which recognizes an interface flanking the promoter on the plasmid which is not present on the molecule to be produced is.
  • promoters are provided as promoters which are operable in the target cells, ie the cells in which gene expression is to be inhibited.
  • these promoters are of human origin, provided that human Cells or tissues are transfected with the expression constructs according to the invention.
  • they may also be of viral, bacterial or parasitic origin, for example, or derived from species other than the target species.
  • the human U6 promoter, the human H1 promoter, the murine U6 promoter, the CMV promoter and the 7SK promoter are provided as promoters.
  • the ligation step takes place in the presence of the restriction endonuclease with which the promoter has been excised from the plasmid.
  • digestion of the reaction mixture is performed by means of an exonuclease specific for 3 'or 5' DNA ends only.
  • the DNA double strand added at the beginning of the mixture may result from the annealing of a partially self-complementary oligodeoxynucleotide or from two complementary oligodeoxynucleotides.
  • the annealing can also first take place in the reaction mixture, so that only single-stranded complementary oligodeoxynucleotides are added at the beginning of the process according to the invention.
  • the sequence of the oligodeoxynucleotides is selected in a preferred embodiment so that the resulting hairpins have in their double-stranded region the recognition sequence for a restriction endonuclease.
  • the final purification of the vectors produced by the method according to the invention is preferably carried out either by chromatography or gel electrophoresis.
  • the restriction endonuclease with which the promoter can be excised from the plasmid is an enzyme of the class II restriction endonucleases, preferably from the group Bbsl, Bbvl, Bbvll, Bpil; BpII, Bsal, BsmAl, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104l, Earl, Eco31 l, Esp31, Fokl, Hgal, SfaNI or their iso-isomers.
  • kits for carrying out the method according to the invention containing at least one promoter, hairpin-shaped oligodeoxynucleotides and enzymes.
  • the enzymes are ligases, restriction endonucleases, restriction exonucleases, kinases and polymerases, or selected combinations thereof, in the form of an enzyme mix.
  • the kit may also contain means for carrying out the enzymatic reactions and means for purifying the vectors produced.
  • the promoter can be included in the kit as part of a plasmid from which it can be excised using a suitable restriction endonuclease.
  • kits which allows the synthesis of the multiple RNAi expression constructs containing the described T-shaped structure.
  • a T-shaped structure is also contained in which the desired sequence can be inserted into the double-stranded arm with the sequence to be transcribed.
  • the expression constructs according to the invention for the targeted inhibition of gene expression by means of RNA interference, if a linker with Holliday junctions is used, are suitable for inhibiting the gene expression of several genes. Due to the specific structure of the constructs according to the invention, the sequences to be transcribed to form the siRNA are read to the same extent by the RNA polymerase.
  • the number of genes that are inhibited upon transfection of a multiple inhibition construct of the present invention depends on the number of double-stranded arms that the linker has.
  • Another object of the present invention is a medicament, preferably a vaccine, which contains one of the expression constructs according to the invention.
  • Such drugs can be used locally and systemically in humans and animals and are for the treatment of infections such as infections with herpesviruses, papillomaviruses or lentiviruses for the treatment of metabolic disorders such as Parkinson's disease or cystic fibrosis for the treatment of cardiovascular diseases , for the treatment of cancers, such as, for example, carcinomas, melanomas or sarcomas, for the treatment of other diseases, such as age-related macular degeneration, and for the treatment of inflammations, injuries or surgical interventions which may affect, for example, the spinal cord, the brain or other organs ,
  • Fig. 1 Components of the linear siRNA vectors
  • Fig. 2 components of the T-shaped siRNA vectors
  • Fig. 3 Components of the T-shaped di-siRNA vectors
  • Fig. 4 Components of the T-shaped triple siRNA vectors
  • FIG. 6/7 Experimental results of the comparison of the T-shaped siRNA expression vector according to the invention (T-siRNA-CDC2) with synthetic RNA (CDC2-RNA) containing the identical target sequences.
  • Fig. 1 shows the components of the linear siRNA vectors
  • siRNA sequence to be used in the method which is homologous to the target mRNA.
  • the sequence consists of a sense or antisense region (target), an 8-12 base sequence loop, and a reversible termination sequence.
  • the siRNA sequence can be ligated from individual ODN fragments annealed with the aid of the enzyme mix, u. may need to be phosphorylated, exist, they may already be present as a complete ODN fragment.
  • the components which are ligated by the enzyme ligase to the ODN fragment is the promoter sequence with corresponding complementary overhangs and a hairpin-shaped oligodinucleotide whose complementary and unique 4-base ligand results in the formation of a covalently closed linear vector consisting of promoter, target sequence and termination sequence and hairpin-shaped closed at the ends.
  • Fig. 2 shows the components of the T-shaped siRNA vectors
  • siRNA sequence to be used in the method which is homologous to the target mRNA.
  • the sequence consists of the sense or antisense region (tar- get), an 8 - 12 base sequence loop and a termination sequence.
  • the siRNA sequence can be generated from individual ODN fragments containing
  • ligates u. may need to be phosphorylated, exist, they may already be present as a complete ODN fragment.
  • the components which are ligated by the enzyme ligase to the ODN fragment are the promoter sequence with corresponding complementary overhangs and hairpin-shaped oligodinucleotides whose complementary and unique overhangs of 4 bases each lead to the formation of a covalently closed vector consisting of promoter, senso-loop or antisense loop and termination sequence and hairpin-shaped at the ends.
  • siRNA sequences to be used in the method that are homologous to the target mRNA.
  • the two sequences consist of the sense or antisense region (target A, target B), an 8-12 base sequence loop and a termination sequence.
  • the siRNA sequences can be ligated from individual ODN fragments annealed with the aid of the enzyme mix, u. may need to be phosphorylated, exist, they may already be present as a complete ODN fragment. Furthermore, the components which are ligated by the enzyme ligase to the ODN fragment.
  • Ends of single-stranded DNA can be used.
  • siRNA sequences to be used in the method that are homologous to the target mRNA.
  • the three sequences consist of the sense or antisense region (target A, target B), an 8-12 base sequence loop and a termination sequence.
  • the siRNA sequences can be ligated from individual ODN fragments annealed with the aid of the enzyme mix, u. may need to be phosphorylated, exist, they may already be present as a complete ODN fragment. Furthermore, the components which are ligated by the enzyme ligase to the ODN fragment.
  • promoter sequence with corresponding complementary overhangs a DNA double-stranded linker and hairpin-shaped oligodinucleotides whose complementary and unique overhangs of 4 bases each lead to the formation of a covalently closed vector consisting of promoter, Senseloop or Antisenseloop and termination sequence exists and hairpin-shaped at the ends is closed.
  • Fig. 5 shows a detailed representation of the target sequence loop of the T-shaped constructs.
  • Fig. 6 shows the results of an experiment in which the T-shaped siRNA expression vector according to the invention (T-siRNA-CDC2) is compared with synthetic RNA (CDC2-RNA) containing the identical target sequences.
  • CDC2 mRNA was determined by quantitative real-time PCR after transfection of HELA cells. The following were used: T-shaped siRNA vector produced according to the method of the invention, which contains a CDC2 target sequence, synthetic RNA of the same CDC2 target sequence and untreated cells. The values represent mean values which were calculated from multiple determinations. Suppression of CDC2 mRNA was not expected to be observed in the untreated cells. In contrast, the cells treated with the T-shaped siRNA vector as well as the synthetic RNA showed a significantly lower amount of CDC2 mRNA. This is up to 96.7% lower compared to the positive control (untreated cells).
  • T-siRNA-CDC2 T-shaped siRNA expression vector according to the invention
  • CDC2-RNA synthetic RNA
  • CDC2 protein was determined by Western blot after transfection of HELA cells. The following were used: T-shaped siRNA vector prepared according to the invention containing a CDC2 target sequence, synthetic RNA of the same CDC2 target sequence and untreated Cells. As an internal standard ß-Tubilin was used. As expected, suppression of CDC2 mRNA was not observed in the untreated cells (lane 4). In contrast, the cells treated with the T-shaped siRNA construct (band 2) and the synthetic RNA (band 3) showed a significantly lower amount of CDC2 protein.
  • the suppression of gene expression by the T-shaped siRNA constructs which were produced with a siRNA Expression Vector Kit using the method according to the invention is comparable to the effects of the synthetic RNA transfections.
  • the suppression of gene expression is located in both transfections in the range between 94 -
  • Example 1 Preparation of the T-shaped siRNA vector to suppress CDC2 expression
  • the vector coding for siRNA of CDC2 was obtained as follows:
  • Seq. ID 1 TGGGGTCAGCTCGTTACTCTCTC
  • the 19 bases form the sense strand, the following 4 bases (underlined) the beginning of the loop sequence.
  • SEQ. ID 2 ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTGT ATGAGAGCAC AGATAGGG Seq. ID 3: 5 '-PH-GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3' (1, 3 micrograms) and
  • Seq. ID 4 5 'PH-GTT GGA ATT CAG TTT TCT GAA TTC-3' (1.3 micrograms)
  • the individual fragments were ligated using the enzyme T4-DNA ligase.
  • the resulting mixture of nucleic acids was treated with the enzyme T7 DNA polymerase.
  • the final product, the siRNALuc-expressing vector, was purified by column chromatography and ready for transfection.

Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskonstrukte und Verfahren zur ihrer Herstellung, die geeignet sind, nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen in diesen die Bildung definierter Proteine durch RNA-Interferenz gezielt zu inhibieren. Die Verfahren zur Herstellung derartiger Vektoren beinhalten keine PCR-Schritte, sind eine Dreischrittprozedur in einem Reaktionsgefäß und in wenigen Stunden durchführbar. Weiter sind DNA-Expressionskonstrukte, die zur gezielten Hemmung der Genexpression mittels RNA-Interferenz geeignet sind, Gegenstand der Erfindung, wobei es sich um Expressionskonstrukte handelt, die auch zur multiplen Genexpressionshemmung geeignet sind.

Description

DNA-Konstrukte zur spezifischen Hemmung der Genexpression durch RNA-
Interferenz
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Vektoren, die geeignet sind, nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen gezielt die Bildung von einem oder mehreren Proteinen durch RNA-I nterferenz zu inhibieren sowie derartige Vektoren.
Eine kürzlich nachgewiesene Möglichkeit der Hemmung der Genexpression beruht auf der Erzeugung von doppelsträngigen RNA-Moleküle. Mit dieser Doppelstrang- RNA (dsRNA) lassen sich hochwirksam und schneller als mit jedem anderen Verfahren einzelne Gene gezielt ausschalten, ohne die Proteinbildung benachbarter Gene zu stören. Das zugrunde liegende Prinzip wird als RNA-I nterferenz, kurz RNAi, bezeichnet. Die dieses Phänomen verursachende dsRNA-Sequenz als siRNA (small interference RNA).
Die siRNA verhindert nicht das Ablesen des Gens, sondern schaltet einen zelleigenen Mechanismus an, der die vom Gen abgelesenen mRNA's und so die Bildung des entsprechenden Proteins unterbindet (post-transcriptional gene silencing).
Ausgelöst wird dieser gezielte mRNA-Abbau durch kurze siRNA-Moleküle mit 19-23 RNA-Basen Länge, die homolog zu der Target-mRNA sind, deren Umsetzung in ein Protein verhindert werden soll. Die siRNA-Moleküle setzen sich mit speziellen Endo- ribonukleasen zu einem zelleigenen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC" (RNA-induced silencing complexes) zusammen. Bei dem Aufbau dieser Komplexe dissoziieren die beiden RNA-Stränge voneinander, wodurch sogenannte aktivierte RISC entstehen, die jeweils einen Einzelstrang des siRNA-Moleküls enthalten. Aktivierte RISC, welche den antisense-Strang enthalten, der komplementär zu der Target-mRNA ist, binden an diese und die Endoribonuklease des RNA- Proteinkomplexes sorgt nun für den sequenzspezifischen mRNA-Abbau.
Die siRNA kann in der Zelle experimentell erzeugt werden oder durch Einschleusen von außen eingebracht werden. Zum Einen gelingt das über synthetisch hergestellte siRNA-Moleküle, die sowohl in-vitro und in-vivo verabreicht werden können.
Diese Methode hat jedoch technische Grenzen. Neben der generellen Instabilität der synthetischen siRNA im Medium als auch in der Zelle, ist die Inhibierung mittels synthetischer siRNA prinzipiell nur vorübergehend möglich und viele Zellen (z.B. neuronale Zellen) lassen sich nur sehr ineffizient transfizieren. Studien, die auf der Transfektion synthetischer siRNA beruhen, sind daher in der Regel sowohl zeitlich auf 1 - 5 Tage als auch Zelltyp-spezifisch eingeschränkt. Im Weiteren sind die hohen Produktionskosten und die lange Produktionsdauer nachteilig.
Zum Anderen kann siRNA durch Vektoren in der Zelle erzeugt werden. Dabei handelt es sich um virale oder plasmidbasierte Vektoren, die erst in der Zelle durch Ex- pression zur Bildung der siRNA-Sequenzen führen. Die Vorteile gegenüber der Transfektion mit synthetischer siRNA liegen in der stabileren und ggf. regulierteren Transkription der entsprechenden siRNA-Sequenz.
Jedoch zeigen die plasmidbasierten Vektoren neben einer niedrigen Transfektion- seffizienz ebenfalls einen aufwendigen Produktionsprozess. So ist es notwendig stabile Klone zu selektieren. In diesem oftmals langwierigen Prozess, der Wochen aber auch Monate dauern kann, kommt es häufig zum Auftreten zahlreicher potentieller Schwierigkeiten, die Klonierungsexperimenten innewohnen. Zur Überprüfung des Produkts sind Sequenzierungen notwendig, die ebenfalls arbeits- und kostenintensiv sind.
Des Weiteren enthalten die plasmidbasierten Vektoren Antibiotika-Resistenzgene, die zu ihrer Selektion notwendig sind. Aus diesem Grund sind derartige Vektoren nicht zur Anwendung in lebenden Organismen geeignet. Die mögliche Rekombination mit ubiquitär im Organismus vorkommenden Bakterien, birgt das Risiko eines zunehmenden Auftretens antibiotikaresistenter Bakterien. Die Verbreitung von Anti- biotikaresistenzen ist ein schwerwiegendes Problem und nicht vertretbar. Da virale Vektoren zur effizienten und gezielten Transfektion fähig sind, bieten sie einen Vorteil gegenüber synthetischen siRNA-Molekülen als auch plasmidbasierten Vektoren.
Für die therapeutische Anwendung sind derartige virale Vektoren jedoch nur mit Vorbehalt einsetzbar. Auch hier stellt die Rekombination viraler Sequenzen mit natürlich vorkommenden Viren ein inhärentes Sicherheitsrisiko dar, da die Erzeugung neuer, pathogener Hybridviren befürchtet werden muss. Zudem ist auch ihre Herstellung aufwendig und kostenintensiv.
Da schon allein die Inhibition der Expression von nur einem Genprodukt unter der Verwendung von Expressionssystemen mit einer Vielzahl von Komplikationen verbunden ist, versteht es sich nahezu von selbst, dass die simultane Abschaltung der Expression mehrerer Genprodukte in einer Zelle oder einem Gewebe deutlich komplexer und somit schwieriger zu erzielen ist.
Eines der Hauptprobleme bei der multiplen Hemmung der Genexpression durch RNA-Interferenz, für den Fall der Verwendung mehrerer unabhängiger Konstrukte, stellt die geringe Wahrscheinlichkeit dar, dass eine Zelle allein von nur einem Kon- strukt transfiziert wird. Diese geringe Wahrscheinlichkeit potenziert sich negativ mit der Anzahl an verwendeten Konstrukten. Oftmals ist jedoch für bestimmte gentherapeutische Ansätze eine kontrollierte, simultane Hemmung der Genexpression er- forderlich.
Es existiert eine Vielzahl an Methoden, welche die Kotranskription mehrerer RNAs in einer Zelle ermöglichen. Die einfachste Methode ist die Kotransfektion zweier unabhängiger Expressionskonstrukte (im Folgenden auch: Vektoren). Eine andere Methode besteht in der Transfektion mit einem Vektor, der zwei unabhängige Ex- pressionskassetten trägt. Derartige Konstrukte lassen sich auch für die Erzeugung von si RNAs verwenden.
Bei beiden Möglichkeiten besteht jedoch die Gefahr, dass die Transkripte sich signifikant bezüglich ihrer Anzahl, Prozessierung, Halbwertszeit und translationalen Effektivität und somit in der Menge des exprimierten Proteins unterscheiden, so dass ihr Einsatz durch Ineffektivität und schlechte Reproduzierbarkeit gekennzeichnet ist. Daher würde die Verwendung derartiger Expressionssysteme auch zu einer unterschiedlich starken Transkription von siRNA führen, wodurch letztlich eine ungleiche Hemmung der jeweiligen Gene erreicht würde.
Die Konstruktion von di- und polycistronischen RNAs durch die Verwendung von IRES (Internal Ribosome Entry Site) Elementen stellt eine weitere Möglichkeit zur
Koexpression mehrerer Gene dar. Diese ermöglichen die Initiation der Translation durch Ribosomen unabhängig von der mRNA-cap-Struktur durch Sequenzelemente.
Erstmalig wurden IRES-Elemente in der mRNA des Picornavirus entdeckt (Pelletier und Sonenberg, 1988, Nature 334: 320-325, Jang et al., 1988, Journal Virology 62: 2636-2643).
Für die Konstruktion bicistronischer Vektoren werden am häufigsten die IRES- Elemente des Poliovirus und des EMCV (Encephalomyocarditis Virus) verwendet (Dirks et al., 1993, Gene 128: 247-249). Nachteilhafterweise variiert deren Effektivität stark in Abhängigkeit von der verwendeten Zelllinie (Borman et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 925-932).
Die meisten der verfügbaren bicistronischen Expressionskassetten bestehen aus einem selektierbaren Marker oder einem Reportergen, welche auf der 3Λ -Seite des IRES Elementes und einer MCS (Multiple Cloning Site) für die Einfügung des gewünschten Gens angeordnet sind (Dirks et al., 1993, Gene 128: 247-249). Ebenso sind tri- und polycistronische Expressionssysteme unter Verwendung von IRES- Elementen bekannt (Zitvogel et al., 1994, Hum Gene Ther 5: 1493-1506, Fusseneg- ger et al., 1998a, Nature Biotechnol. 16: 468-472, Mielke et al., 2000, Gene 254. 1- 8).
Für die therapeutische Anwendung sind virale IRES-Elemente jedoch nur mit Vor- behalt einsetzbar. Die Rekombination viraler Sequenzen mit natürlich vorkommenden Viren stellt auch hier ein inhärentes Sicherheitsrisiko dar, da die Erzeugung neuer, pathogener Hybridviren befürchtet werden muss.
Multicistronische Vektoren können auch durch die Verknüpfung von Transkriptionseinheiten ohne IRES-Elemente konstruiert werden. Zum Einen können die ge- wünschten Gene über verschiedene MCS in einen Plasmid-Vektor kloniert werden, und zum Anderen können aus Plasmiden isolierte Expressionskassetten durch DNA-Linker zu linearen multicistronischen Vektoren verknüpft werden (Tsang et al., 1997, Bio Techniques 22: 68).
Untersuchungen der Expressionsraten linearer cis-verknüpfter Gene zeigten jedoch einen starken negativen Einfluss auf die Transkription derart angeordneter Expressionskassetten (Esperet et al., 2000, J Biol Chem 275: 25831-25839).
Plasmid-Vektoren für die Expression multipler Gene unterscheiden sich von den üblichen Plasmid-Vektoren durch die Anzahl der Monierten Transkriptionseinheiten. Dabei können Promotoren bzw. poly(A)-Sequenzen gleichen oder unterschiedlichen Ursprungs für die Transkriptionseinheiten verwendet werden.
Der Nachteil, der sich aus der Verwendung unterschiedlicher Promotoren ergibt, besteht darin, dass die Promotoren sich in ihrer Stärke unterscheiden und so die Expressionsraten der einzelnen Gene variieren können, wohingegen der Einsatz gleicher Promotoren zur Ausbildung von Sekundärstrukturen der DNA führen kann, welche einen Funktionsverlust der Promotoren zur Folge haben können.
Allen genannten Vektoren zur multiplen Genexpression ist gemeinsam, dass sie entweder auf Plasmiden oder aber viralen Vektoren basieren. Neben allen beschriebenen Unzulänglichkeiten der gegenwärtigen mehrfachkodierenden Vektoren weisen sie zusätzlich die Nachteile dieser Art von Vektoren auf. Die Nachteile viraler Vektoren, zu denen Instabilität des attenuierten Impfstammes zählen, und die Unzulänglichkeiten von Plasmid-DNA-Vektoren, wie die mit ihrer Verwendung einhergehende Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen (ausführlich beschrieben in EP 0 941 318 B1 ), sind hinlänglich bekannt.
Wünschenswert wären daher Expressionssysteme für siRNA, die auch zur simulta- nen Hemmung der Genexpression mehrerer Gene in der Lage sind. Das wohl größte Problem bei der Lösung dieser Fragestellung stellt eine Verbindung (Linker) der Sequenzen zur Erzeugung der siRNAs dar, welche eine jeweils ausreichende Transkription zur Hemmung der Genexpression dieser Sequenzen gewährleistet. Eine Methode zur Verknüpfung von DNA-Fragmenten durch DNA- Verbindungselemente ist aus der Literatur bekannt. Seeman beschreibt DNA- Sequenzen zur Untersuchung von natürlich vorkommenden Verzweigungen, sog. Holliday-Junctions, die als topologische Sonderformen von B-DNA unter torsionalem Stress postuliert werden (Seeman: 1982, J Theor Biol 99: 237-247; Annu. Rev. Bio- phys. Biomol. Struct. 1998. 27:225-248). Die Anwendung dieser Strukturen blieb bisher auf kurze Oligonukleotid-Stücke zur Untersuchung von DNA-Strukturformen beschränkt.
Aus der DE 100 48 417 A1 ist eine polyfunktionale Verbindung bekannt, welche die Konjugation von zwei reaktiven funktionellen Gruppen mittels eines Linkers beschreibt. Als biologische Substanzen, welche derart gekoppelt werden können, werden auch Nukleinsäuren erwähnt, die Beispiele zeigen jedoch nur die Anwendungen der Erfindung zur Konjugation von Peptiden. Einen anderen Ansatz mehrere Gene zur effizienten Expression in Zellen einzuschleusen beschreibt die WO 01/87348 A2. Nukleinsäuren sollen durch kovalente Bindungen zu supramolekularen Strukturen, sog. Dendrimeren, verknüpft werden.
Eine weitere Möglichkeit Vektoren für siRNA herzustellen, zeigt http://www.ambion.com. Dieser Prozess vermeidet die oben genannten Nachteile. Jedoch ist auch dieser Produktionsprozess zeitaufwendig und durch eine Reihe an notwendigen Vervielfältigungsschritten der betreffenden Sequenzen mittels PCR (Polymerase chain reaction) sehr fehlerbehaftet. Die Möglichkeit der Erzeugung sowohl unerwünschter als auch unbemerkter Mutationen, die durch den PCR-Prozess noch potenziert werden, ist sehr groß. So sind auch hier Kontrollsequenzierungen nötig, die den Herstellungsprozess verlängern und zu erhöhten Kosten beitragen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung ein geeignetes Verfahren zur in-vitro oder in-vivo Synthese einer oder mehrerer definierter siRNA-Sequenzen, die dadurch hergestellten Expressionskonstrukte sowie einen Kit zur Durchführung der Synthese zur Verfügung zu stellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale der selbstständigen Ansprüche. Erfindungsgemäß ist danach ein Expressionskonstrukt vorgesehen, dass aus einer ersten DNA-Abschlusshaarnadelstruktur besteht, bei der ein Einzelstrang aus De- soxyribonukleotiden derart zu einem doppelsträngigen Bereich rückgefaltet ist, dass dieser ein Ende mit kohäsivem Überhang aufweist und am entgegengesetzten Ende die den Doppelstrang bildenden Einzelstränge durch einen einzelsträngigen Loop miteinander verbunden sind, einer zweiten Abschlusshaarnadelstruktur, die analog zur ersten Abschlusshaarnadelstruktur aufgebaut ist und einer T-förmigen DNA- Struktur mit drei doppelsträngigen DNA-Armen, welche über Holliday-Junctions verbunden sind, wobei wenigstens ein Arm die zu transkribierenden Sequenzen enthält und die Einzelstränge dieses DNA-Doppelstrangarmes an dem Ende, welches der Verbindung mit den anderen Armen entgegengesetzt ist, durch einen einzelsträngigen DNA-Loop miteinander verbunden sind, und die beiden anderen Arme kohäsive Enden aufweisen, wobei ein Arm eine geeignete Terminationssequenz aufweist und der andere Arm eine geeignete Promotorsequenz.
Die genannten Komponenten stellen die essentiellen Bestandteile eines erfindungsgemäßen Konstruktes dar. Von der Erfindung sind auch Expressionskonstrukte um- fasst, welche diese Komponenten aufweisen, wobei diese jedoch aus anderen Kombinationen von DNA-Strukturen hervorgehen.
Erfindungsgemäß ist weiterhin ein Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Genexpression mittels RNA-Interferenz vorgesehen, welches eine erste DNA- Abschlusshaarnadelstruktur, bei der ein Einzelstrang aus Desoxyribonukleotiden derart zu einen doppelsträngigen Bereich rückgefaltet ist, dass dieser ein Ende mit kohäsivem Überhang aufweist und am entgegengesetzten Ende die den Doppelstrang bildenden Einzelstränge durch einen einzelsträngigen Loop miteinander ver- bunden sind aufweist, ferner eine zweite Abschlusshaarnadelstruktur, die analog zur ersten Abschlusshaarnadelstruktur aufgebaut ist, und deren doppelsträngiger und einzelsträngiger Bereich aus der zu transkribierenden Sequenz besteht sowie einer geeigneten Promotorsequenz und einer geeigneten revers-komplementären Terminationssequenz, die sich zwischen den beiden oben beschriebenen Abschlusshaar- nadelstrukturen in einem DNA-Doppelstrang befinden.
Ein derartiges Expressionskonstrukt weist nur eine doppelsträngige Kopie der zu erzeugenden siRNA auf. Die Erzeugung einer siRNA bei Vorliegen nur einer Kopie ist mit diesem Konstrukt möglich, da die zu transkribierenden Sequenzen von der RNA-Polymerase über den einzelsträngigen Loop hinweg abgelesen und transkribiert werden. Dies wäre mit einem doppelsträngigen Plasmid nicht möglich.
Für beide erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte ist vorgesehen, dass mehrere T-förmige oder lineare DNA-Strukturen jeweils an einem Ende durch einen Linker mittels Holliday-Junctions verbunden sind. In diesem Fall ist vorgesehen, dass die zu transkribierenden Sequenzen für identische oder unterschiedliche Gene kodieren.
Unter Linker sollen Oligonukleotide zur Verbindung von DNA-Expressionskassetten verstanden werden. Ein erfindungsgemäßer Linker besteht aus zwei oder mehr Strängen, wie an folgendem Beispiel für einen Linker, gebildet aus drei Oligonukleo- tiden, die mit drei 3 Expressionskassetten auf miteinander verbundenen Strängen A, B und C verbunden sind, illustriert werden soll: Das 5'-Ende von A hat zu dem 3'- Ende von B eine komplementäre Sequenz und bildet einen Doppelstrang, während das 3'-Ende von A mit dem 5'-Ende von C paart, und schließlich das 5'-Ende von B mit dem 3'-Ende von C paart. Diese Art von Verbindung von DNA-Doppelsträngen wird auch als Holliday-Junction bezeichnet (F.W. Stahl: Genetics. 1994 Oct;138(2):241-6), welche den Vorteil bietet, dass ausschließlich natürlich vorkommende Bausteine zum Verbinden der Expressionskassetten verwendet werden, was sich bei einer Verwendung der Erfindung zu medizinischen Zwecken aus toxikologischen Gründen als besonders vorteilhaft erweisen kann.
Die für die DNA-Verzweigungen verwendeten Oligodesoxynukleotidsequenzen werden so gewählt, dass bei der Hybridisierung an den 5X-Enden der Oligonukleotide (beispielsweise) je ein vier Basen langes, überhängendes, kohäsives Ende erzeugt wird. Die Sequenzen der kohäsiven Enden können sich für jeden Arm einer Verzweigung unterscheiden, müssen es aber nicht. Die T-förmigen oder linearen DNA- Strukturen weisen ein zu dem kohäsiven Ende komplementären Überhang auf. Hierdurch wird die gezielte Ligation der Expressionskassetten an die einzelnen „Arme" der Verzweigungen möglich.
Derartig ausgestaltete erfindungsgemäße Expressionskonstrukte sind zur gezielten, multiplen Hemmung der Genexpression verschiedener Gene geeignet. Aufgrund des identischen Aufbaus der T-förmigen Strukturen, welche jeweils die zur Erzeugung der siRNAs notwendigen Sequenzen enthalten, werden die verschiedenen siRNAs gleich stark erzeugt. Die Anzahl der Gene, deren Proteinexpression gehemmt wird, ist abhängig von der Anzahl der über den Linker miteinander verbun- dene T-förmigen Strukturen.
Vorteilhafterweise sind in einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Expressionskonstruktes die kohäsiven Enden einzelner Komponenten zur gezielten Verbindung mit anderen Komponenten spezifisch und unterschiedlich gewählt. Dadurch wird der gezielte Aufbau des gewünschten Expressionskonstruktes ermöglicht.
Ein DNA-Expressionskonstrukt, das die Sequenzen zur Erzeugung einer oder mehrer siRNAs enthält, kann Zellen gezielt transfizieren.
Unter Transfektion soll das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen mittels biologischer, chemischer oder physikalischer Methoden in die Zelle verstanden werden, in dessen Folge es zu anhaltender oder vorübergehender Expression von durch diese Sequenzen kodierten katalytisch wirksamen RNA-Transkripten in der transfizierten Zelle kommt.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte weisen in einer Weiterbildung kova- lent gebunden ein oder mehrere Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Antikörper oder Steroide auf.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Herstellungsverfahren für Expressionskonstrukte, die nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen die Bildung definierter Proteine gezielt durch RNA-Interferenz inhibieren.
Für lineare Expressionskonstrukte ist ein Verfahren vorgesehen, beginnend in Ver- fahrensschritt a) mit der Mischung eines DNA-Doppelstranges, welcher eine 19 - 23 Basen lange, singuläre Kopie einer Gensequenz oder ihre revers-komplementäre Sequenz sowie ein Terminationssignal für RNA-Polymerasen enthält und durch einen 8 - 12 Basen langen Sequenzloop an einem Ende abgeschlossen ist, welcher so gewählt ist, dass gegenüberliegende Basen in keinem Fall komplementär zuein- ander sind und die flankierenden DNA-Einzelstränge zu einem DNA-Doppelstrang miteinander verbunden sind, der am anderen Ende einen kurzen überstehenden DNA-Einzelstrang aufweist, mit einem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngiger DNA aufweist in Ver- fahrensschritt b) und in Verfahrensschritt c) einem Promotor mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende des Promotors mit dem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid oder dem 10 bis 1000 basenlangen Doppelstrang paaren kann und das einzelsträngige 3'-Ende des Promotors komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des unter a) beschriebenen DNA- Doppelstranges ist und anschließender Ligation der DNA-Fragmente in Verfahrensschritt d) sowie abschließender Aufreinigung der hergestellten Vektoren im letzten Verfahrensschritt e).
Optional ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung linearer Expressions- konstrukte derart ausgestaltet, dass vor Zugabe des haarnadelförmigen Olidodeso- xynukleotids in Verfahrensschritt c) ein 10 bis 1000 Basen (= n) langen DNA- Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA zugegeben wird, wobei das einzelsträngige 3'-Ende mit dem einzelsträngigen 5Λ-Ende des Promoters paaren kann und das einzelsträngige 5'- Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 3'-Ende des haarnadelförmigen Oli- godesoxynukleotid ist.
Zur Herstellung von T-förmigen Expressionskonstrukten, die nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen die Bildung definierter Proteine gezielt durch RNA-Interferenz inhibieren, ist ein Verfahren vorgesehen, beginnend in Verfahrensschritt a) mit der Mischung eines T-förmigen DNA-Doppelstranges, welcher eine 19 - 23 Basen lan- ge, singuläre Kopie einer Gensequenz in 5' - 3'-Richtung sowie ein Terminations- signal für RNA-Polymerasen enthält und durch einen 8 - 12 Basen langen Sequenz- loop an einem Ende abgeschlossen ist, welcher so gewählt ist, dass gegenüberliegende Basen in keinem Fall komplementär zueinander sind und die flankierenden Doppelstrangbereiche so durch zwei DNA-Einzelstränge miteinander verbunden sind und am anderen Ende zwei kurze überstehende DNA-Einzelstränge aufweist, und einem Oligodesoxynukleotid dessen Sequenz komplementär zu den beiden kurzen überstehenden DNA Einzelsträngen ist und zwei kurze überstehende Enden einzelsträngiger DNA bildet, in Verfahrensschritt b) mit einem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngi- ger DNA aufweist und in Verfahrensschritt c) einem weiteren haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngi- ger DNA aufweist, komplementär zu dem T-förmigen DNA-Doppelstrang aus a) und in Verfahrensschritt d) einem Promotor mit kurzen überstehenden Enden ein- zelsträngiger DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende des Promotors mit dem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid aus b) paaren kann und das einzelsträngige 3'- Ende des Promotors komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des T- förmigen DNA-Doppelstranges ist, gefolgt von anschließender Ligation der DNA- Fragmente in Verfahrensschritt e), wobei das Konstrukt auch ohne den 10 bis 1000 Basen langen DNA-Doppelstrang hergestellt werden kann sowie abschließender Aufreinigung der hergestellten Vektoren im abschließenden Verfahrensschritt f).
Dieses Herstellungsverfahren weist erfindungsgemäß nach Verfahrenschritt c) die Zugabe eines 10 bis 1000 Basen (= n) langen DNA-Doppelstrang einer nichtkodie- renden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA auf, wobei das einzelsträngige 3'-Ende mit dem einzelsträngigen 5'-Ende des Promoters paaren kann und das einzelsträngige 5'-Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 3'-Ende des haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid aus Verfahrensschritt b) ist zugegeben wird und/oder die Zugabe eines 10 bis 1000 Basen (= n) langen DNA- Doppelstranges einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende mit dem einzelsträngigen 3'-Ende des T-förmigen DNA-Doppelstranges paaren kann und das einzelsträngige 3'-Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid aus Verfahrensschritt c) ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren vorgesehen, bei dem der Promotor Teil eines bakteriell amplifizierbaren Plasmides ist, welches vor der Mischung der Komponenten mit einer Restriktionsendonuklease ausgeschnitten wird, welche eine den Promotor auf dem Plasmid flankierende Schnittstelle erkennt, die nicht auf dem herzustellenden Molekül vorhanden ist.
Grundsätzlich sind als Promotoren jegliche Promotoren vorgesehen, die in den Zielzellen, also den Zellen, in welchen die Genexpression gehemmt werden soll, operabel sind. Vorzugsweise sind diese Promotoren humanen Ursprungs, sofern humane Zellen oder Gewebe mit den erfindungsgemäßen Expressionskonstrukten transfi- ziert werden. Sie können jedoch beispielsweise ebenso viralen, bakteriellen oder parasitären Ursprungs sein oder aus anderen Spezies als der der Zielspezies stammen. Dabei sind als Promotor insbesondere, aber nicht ausschließlich, der menschliche U6-Promotor, der menschliche H1 -Promotor, der murine U6-Promotor, der CMV-Promotor und der 7SK-Promotor vorgesehen.
Ferner ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass im Falle der Verwendung eines Promotors als Teil eines bakteriell amplifizierbaren Plasmides der Ligationsschritt in Anwesenheit der Restriktionsendonuklease erfolgt, mit welcher der Promotor aus dem Plasmid ausgeschnitten wurde.
In einer Ausführungsform wird vor dem abschließenden Aufreinigungsschritt ein Verdau der Reaktionsmischung mittels einer ausschließlich für 3'- oder 5'-DNA- Enden spezifischen Exonuklease durchgeführt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der DNA-Doppelstrang, welcher zu Beginn der Mischung zugegeben wird, aus dem Annealing von einem partiell selbstkomplementären Oligodesoxynukleotid resultieren oder von zwei komplementären Oligodesoxynukleotiden. Das Annealing kann auch erst in der Reaktionsmischung erfolgen, so dass zu Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens lediglich ein- zelsträngige komplementäre Oligodesoxynukleotide zugegeben werden.
Die Sequenz der Oligodesoxynukleotide ist in einer bevorzugten Ausführungsform so gewählt, dass die daraus resultierenden Haarnadeln in ihrem doppelsträngigen Bereich die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease aufweisen.
Die abschließende Aufreinigung der mittels des erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vektoren erfolgt bevorzugt entweder durch Chromatographie oder GeIe- lektrophorese.
Wird der Promotor als Teil eines bakteriell amplifizierbaren Plasmides in das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren eingesetzt, so handelt es sich bei der Restriktionsendonuklease, mit welcher der Promotor aus dem Plasmid ausgeschnitten werden kann, um ein Enzym der Gruppe der Klasse-Il-Restriktionsendonukleasen, vorzugsweise aus der Gruppe Bbsl, Bbvl, Bbvll, Bpil; BpII, Bsal, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104l, Earl, Eco31 l, Esp3l, Fokl, Hgal, SfaNI oder deren Iso- schizomere.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren enthaltend wenigstens einen Promotor, haarnadel- förmige Oligodesoxynukleotide und Enzyme. Bei den Enzymen handelt es sich um Ligasen, Restriktionsendonukleasen, Restriktionsexonukleasen, Kinasen und Polymerasen oder ausgewählte Kombinationen davon, in Form eines Enzymmixes. Zusätzlich kann der Kit je nach Ausführungsform noch Mittel zur Durchführung der enzymatischen Reaktionen enthalten sowie Mittel zur Aufreinigung der hergestellten Vektoren. Der Promotor kann im Kit als Teil eines Plasmids enthalten sein, aus dem dieser unter Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuklease herausgeschnitten werden kann.
Des Weiteren ist ein Kit vorgesehen, der die Synthese der multiplen RNAi- Expressionskonstrukte erlaubt, welche die beschriebene T-förmige Struktur enthalten. Dabei ist zu den bereits erwähnten Komponenten in dem Kit auch noch eine T- förmige Struktur enthalten, bei der in den doppelsträngigen Arm mit der zu transkribierenden Sequenz die gewünschte Sequenz inseriert werden kann.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte zur gezielten Hemmung der Ge- nexpression mittels RNA-Interferenz sind, sofern ein Linker mit Holliday-Junctions verwendet wird, zur Hemmung der Genexpression mehrer Gene geeignet. Aufgrund des speziellen Aufbaus der erfindungsgemäßen Konstrukte werden die zur Bildung der siRNA zu transkribierenden Sequenzen in gleichem Maß durch die RNA- Polymerase abgelesen.
Die Anzahl der Gene, die nach Transfektion eines erfindungsgemäßen multiplen Inhibitionskonstrukts gehemmt werden, hängt von der Anzahl der doppelsträngigen Arme ab, die der Linker aufweist.
Bezüglich der vorliegenden Erfindung ist weder die Kotransfektion von zwei separaten Vektoren noch die in der DE 100 48 417 A1 beschriebene Methode, die kodie- renden Gensequenzen zusammen mit den notwendigen Steuerelementen (Promo- tor, poly(A)-Signal) chemisch miteinander zu verbinden, ein naheliegender Stand der Technik. Zwar werden bei der Kotransfektion mittels Lipofektion ebenfalls unterschiedliche Vektoren in räumliche Nähe zueinander gebracht und in die Zelle eingeschleust, jedoch ist das zugrundeliegende Prinzip dieser Methode ein anderes. Zu- dem entstehen nachteilhafterweise durch die beschriebene chemische Konjugation von Expressionskonstrukten Strukturen mit einem deutlich größeren Molekulargewicht, welche sich bekanntermaßen schwieriger in Zellen einschleusen lassen. Das gleiche trifft auch auf das in der WO 01/87348 A2 beschriebene Verfahren zum Aufbau eines Nukleinsäuren enthaltenden Dendrimers zu. Zusätzlich ist das darge- stellte Verfahren zum Aufbau von Dendrimeren ein mehrstufiger und aufwendiger Herstellungsprozess.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, vorzugsweise eine Vakzine, welche eines der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte enthält. Derartige Arzneimittel können bei Mensch und Tier lokal und systemisch angewendet werden und sind zur Behandlung von Infektionen, beispielsweise Infektionen mit Herpesviren, Papillomaviren oder Lentiviren, zur Behandlung von Stoffwechselstörungen, wie beispielsweise der Parkinson' sehen Krankheit oder der zystischen Fibrose, zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen, zur Behandlung von Krebserkrankungen, wie beispielsweise Karzinomen, Melanomen oder Sarkomen, zur Behandlung weiterer Krankheiten, wie beispielsweise der altersbedingten Makuladegeneration, und zur Behandlung nach Entzündungen, Verletzungen oder chirurgischen Eingriffen, die beispielsweise das Rückenmark, das Gehirn oder andere Organe betreffen können, geeignet.
Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen beschrieben; die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen und der nachfolgenden Figuren näher beschrieben; es zeigt:
Fig. 1 Bestandteile der linearen siRNA-Vektoren
Fig. 2 Bestandteile der T-förmigen siRNA-Vektoren
Fig. 3 Bestandteile der T-förmigen Di-siRNA-Vektoren Fig. 4 Bestandteile der T-förmigen Triple-siRNA-Vektoren
Fig. 5 Detaillierte Darstellung des Targetsequenzloops der T- förmigen Konstrukte
Fig. 6 / 7 Experimentelle Ergebnisse des Vergleichs erfindungsgemäßer, T-förmiger siRNA Expressionsvektor (T- SiRNA-CDC2) mit synthetischer RNA (CDC2-RNA), die die identischen Targetsequenzen enthalten.
Fig. 1: zeigt die Bestandteile der linearen siRNA-Vektoren
A: In das Verfahren einzusetzende siRNA-Sequenz, die homolog zur Target- mRNA ist. Die Sequenz besteht aus einem sense oder antisense Bereich (target), einem 8 - 12 Basen langen Sequenzloop und einer revers komlpe- mentären Terminationssequenz. Die siRNA-Sequenz kann aus einzelnen ODN-Fragmenten, die mit Hilfe des Enzymmix annealt, ligiert u. ggf. phosphoryliert werden müssen, bestehen, sie kann auch schon als vollständiges ODN-Fragment vorliegen.
Desweiteren die Bestandteile, die durch das Enzym Ligase an das ODN- Fragment ligiert werden. Dabei handelt es sich um die Promotorsequenz mit entsprechenden komplementären Überhängen und um ein haarnadelförmi- ges Oligodinukleotid, dessen wiederum komplementär und einzigartiger Ll- berhang von jeweils 4 Basen dazu führt, das ein kovalent geschlossener linearer Vektor entsteht, der aus Promotor, Targetsequenz und Terminationssequenz besteht und an den Enden haarnadelförmig geschlossen ist.
Zwischen Promoter und abschließendem Oligonukleotid kann ein 10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA-Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA eingesetzt werden.
B: zur Transfektion bereites Endprodukt Fig. 2: zeigt die Bestandteile der T-förmigen siRNA-Vektoren
A: In das Verfahren einzusetzende siRNA-Sequenz, die homolog zur Target- mRNA ist. Die Sequenz besteht aus dem sense oder antisense Bereich (tar- get), einem 8 - 12 Basen langen Sequenzloop und einer Terminationsse- quenz. Die siRNA-Sequenz kann aus einzelnen ODN-Fragmenten, die mit
Hilfe des Enzymmix annealt, ligiert u. ggf. phosphoryliert werden müssen, bestehen, sie kann auch schon als vollständiges ODN-Fragment vorliegen.
B/C: Desweiteren die Bestandteile, die durch das Enzym Ligase an das ODN-Fragment ligiert werden. Dabei handelt es sich um die Promotorse- quenz mit entsprechenden komplementären Überhängen und um haarnadel- förmige Oligodinukleotide, deren wiederum komplementären und einzigartigen Überhänge von jeweils 4 Basen dazu führt, das ein kovalent geschlossener Vektor entsteht, der aus Promotor, Senseloop oder Antisenseloop und Terminationssequenz besteht und an den Enden haarnadelförmig geschlos- sen ist.
Zwischen Promoter und abschließendem Oligonukleotid, sowie zwischen Terminationssequenz und abschließendem Oligonukleotid kann ein 10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA-Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA eingesetzt werden.
D: zur Transfektion bereites Endprodukt
Fig. 3: zeigt die Bestandteile der T-förmigen Multi-siRNA-Vektoren (Di-Konstrukt)
AJBICID: In das Verfahren einzusetzende siRNA-Sequenzen, die homolog zur Target-mRNA sind. Die zwei Sequenzen bestehen aus dem sense oder antisense Bereich (target A, target B), einem 8 - 12 Basen langen Sequenz- loop und einer Terminationssequenz. Die siRNA-Sequenzen können aus einzelnen ODN-Fragmenten, die mit Hilfe des Enzymmix annealt, ligiert u. ggf. phosphoryliert werden müssen, bestehen, sie können auch schon als vollständiges ODN-Fragment vorliegen. Desweiteren die Bestandteile, die durch das Enzym Ligase an das ODN-Fragment ligiert werden. Dabei han- delt es sich um die Promotorsequenz mit entsprechenden komplementären Überhängen, um einen DNA-Doppelstrang-Linker und um haarnadelförmige Oligodinukleotide, deren wiederum komplementären und einzigartigen Überhänge von jeweils 4 Basen dazu führt, das ein kovalent geschlossener Vek- tor entsteht, der aus Promotor, Senseloop oder Antisenseloop und Termina- tionssequenz besteht und an den Enden haarnadelförmig geschlossen ist.
Zwischen Promoter und abschließendem Oligonukleotid, zwischen Terminationssequenz und abschließendem Oligonukleotid sowie jeweils zwischen Linker und Promoter kann ein 10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA- Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden
Enden einzelsträngiger DNA eingesetzt werden.
E: zur Transfektion bereites Endprodukt
Fig. 4: zeigt die Bestandteile der T-förmigen Multi-siRNA-Vektoren (Tri-Konstrukt)
A/B/C/D/E: In das Verfahren einzusetzende siRNA-Sequenzen, die homolog zur Target-mRNA sind. Die drei Sequenzen bestehen aus dem sense oder antisense Bereich (target A, target B), einem 8 - 12 Basen langen Sequenz- loop und einer Terminationssequenz. Die siRNA-Sequenzen können aus einzelnen ODN-Fragmenten, die mit Hilfe des Enzymmix annealt, ligiert u. ggf. phosphoryliert werden müssen, bestehen, sie können auch schon als vollständiges ODN-Fragment vorliegen. Desweiteren die Bestandteile, die durch das Enzym Ligase an das ODN-Fragment ligiert werden. Dabei handelt es sich um die Promotorsequenz mit entsprechenden komplementären Überhängen, um einen DNA-Doppelstrang-Linker und um haarnadelförmige Oligodinukleotide, deren wiederum komplementären und einzigartigen Über- hänge von jeweils 4 Basen dazu führt, das ein kovalent geschlossener Vektor entsteht, der aus Promotor, Senseloop oder Antisenseloop und Terminationssequenz besteht und an den Enden haarnadelförmig geschlossen ist.
Zwischen Promoter und abschließendem Oligonukleotid, zwischen
Terminationssequenz und abschließendem Oligonukleotid sowie jeweils zwi- sehen Linker und Promoter kann ein 10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA- Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA eingesetzt werden.
F: zur Transfektion bereites Endprodukt
Fig. 5 zeigt eine detaillierte Darstellung des Targetsequenzloops der T-förmigen Konstrukte.
Fig. 6: zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem der erfindungsgemäße T- förmige siRNA Expressionsvektor (T-SiRNA-CDC2) mit synthetischer RNA (CDC2-RNA) verglichen wird, die die identischen Targetsequenzen enthalten.
CDC2 mRNA wurde mittels quantitativer Real-time PCR nach Transfektion von HELA-Zellen bestimmt. Eingesetzt wurden: mit erfindungsgemäßem Verfahren hergestellter T-förmiger siRNA-Vektor, der eine CDC2 Targetsequenz beinhaltet, synthetische RNA derselben CDC2 Targetsequenz und unbehandelte Zellen. Die Werte stellen Mittelwerte dar, die aus Mehrfachbe- Stimmungen errechnet wurden. Bei den unbehandelten Zellen wurde die Unterdrückung der CDC2 mRNA erwartungsgemäß nicht beobachtet. Dagegen zeigten die mit dem T-förmigen siRNA Vektor sowie der synthetischen RNA behandelten Zellen eine signifikant geringere CDC2 mRNA Menge. Diese ist bis zu 96,7% herabgesetzt im Vergleich zur Positivkontrolle (unbehandelte Zellen).
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem der erfindungsgemäße T- förmige siRNA Expressionsvektor (T-SiRNA-CDC2) mit synthetischer RNA (CDC2-RNA) verglichen wird, die die identischen Targetsequenzen enthal- ten.
CDC2 Protein wurde mittels Western blot nach Transfektion von HELA- Zellen bestimmt. Eingesetzt wurden: mit erfindungsgemäßem Verfahren hergestellter T-förmiger siRNA-Vektor, der eine CDC2 Targetsequenz beinhaltet, synthetische RNA derselben CDC2 Targetsequenz und unbehandelte Zellen. Als interner Standard wurde ß-Tubilin verwendet. Bei den unbehandelten Zellen (Bande 4) wurde die Unterdrückung der CDC2 mRNA erwartungsgemäß nicht beobachtet. Dagegen zeigten die mit dem T-förmigen siRNA Konstrukt (Bande 2) sowie der synthetischen RNA (Bande 3) behan- delten Zellen eine signifikant geringere CDC2 Protein Menge.
Die Unterdrückung der Genexpression durch die T-förmigen SiRNA Kon- strukte, welche mit einem „siRNA Expression Vector Kit" unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurden, ist vergleichbar mit den Effekten der synthetischen RNA-Transfektionen. Die Unterdrückung der Genexpression liegt bei beiden Transfektionen im Bereich zwischen 94 -
96%.
Beispiel 1 : Herstellung vom T-förmigen siRNA-Vektor zur Unterdrückung der CDC2 Expression
Der für die siRNA der CDC2 kodierende Vektor wurde wie folgt erhalten:
Die zwei ODN-Fragmente für CDC2 wurden bei 900C für 3min erhitzt und durch langsames Abkühlen annealt. Dadurch wurde folgende für CDC2 kodierende Sequenz erhalten:
Seq. ID 1 : TGGGGTCAGCTCGTTACTCTCTC
Dabei bilden die 19 Basen den sense Strang, die folgenden 4 Basen (unterstrichen) den Anfang der Loopsequenz.
Die Phosphorylierung durch PNKinase erfolgte im Anschluß. Zum Erhalt von 10 Mikrogramm Endprodukt wurden 3,9 Mikrogramm CDC2 eingesetzt. Nach Zugabe von 5,2 Mikrogramm H 1 -Promotor (Seq. ID 2) sowie der 5'-phosphorylierten haar- nadeiförmigen Oligodesoxynukleotide (Seq. ID 3 und 4):
SEQ. ID 2: ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTGT ATGAGAGCAC AGATAGGG Seq. ID 3: 5' -PH-GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3' (1 ,3 Mikrogramm) und
Seq. ID 4: 5' PH-GTT GGA ATT CAG TTT TCT GAA TTC-3' (1,3 Mikrogramm)
wurden mit Hilfe des Enzymes T4-DNA Ligase die einzelnen Fragmente ligiert. Das resultierende Gemisch an Nukleinsäuren wurde mit dem Enzym T7-DNA- Polymerase behandelt. Das Endprodukt, der siRNALuc exprimierende Vektor, wurde durch Säulenchromatographie aufgereinigt und stand zur Transfektion bereit.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Genexpression mittels RNA-I nterferenz bestehend aus folgende Komponenten
a) einer ersten DNA-Abschlusshaarnadelstruktur, bei der ein Einzelstrang aus Desoxyribonukleotiden derart zu einem doppelsträngigen Bereich rückgefaltet ist, dass dieser an einem Ende einen kohäsiven Überhang aufweist und am entgegengesetzten Ende einen ein- zelsträngigen Loop,
b) einer zweiten Abschlusshaarnadelstruktur, die analog zur ersten Abschlusshaarnadelstruktur aufgebaut ist,
c) wenigstens einer T-förmigen DNA-Struktur mit drei doppelsträngigen DNA-Armen, welche über Holliday-Junctions verbunden sind, wobei
i. ein Arm die zu transkribierenden Sequenzen enthält und die Einzelstränge dieses DNA-Doppelstrangarmes an dem Ende, welches der Verbindung mit den anderen Armen entgegengesetzt ist, durch einen einzelsträngigen DNA-Loop miteinander verbunden sind, und
ii. die beiden anderen Arme kohäsive Enden aufweisen, wobei ein Arm eine geeignete Terminationssequenz aufweist und der andere Arm eine geeignete Promotorsequenz.
2. DNA-Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Genexpression mittels RNA-Interferenz bestehend aus folgenden Komponenten
a) einer ersten DNA-Abschlusshaarnadelstruktur, bei der ein Einzel- sträng aus Desoxyribonukleotiden derart zu einem doppelsträngigen
Bereich rückgefaltet ist, dass dieser ein Ende mit kohäsivem Überhang aufweist und am entgegengesetzten Ende die den Doppel- sträng bildenden Einzelstränge durch einen einzelsträngigen Loop miteinander verbunden sind,
b) einer zweiten Abschlusshaarnadelstruktur, die analog zur ersten Abschlusshaarnadelstruktur aufgebaut ist, und deren doppelsträngiger und einzelsträngiger Bereich aus der zu transkribierenden Sequenz besteht
c) einer geeigneten Promotorsequenz und einer geeigneten reverskomplementären Terminationssequenz, die sich zwischen den beiden unter a) und b) beschriebenen Abschlusshaarnadelstrukturen in einem DNA-Doppelstrang befinden.
3. DNA-Expressionskonstrukt nach Anspruch 1 , wobei mehrere T-förmige DNA-Strukturen jeweils an einem Ende durch einen Linker mittels Holliday- Junctions verbunden sind.
4. DNA-Expressionskonstrukt nach Anspruch 2, wobei mehrere lineare DNA- Strukturen jeweils an einem Ende durch einen Linker mittels Holliday-
Junctions verbunden sind.
5. DNA-Expressionskonstrukt nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kohäsiven Enden einzelner Komponenten zur gezielten Verbindung mit anderen Komponenten spezifisch und unterschiedlich ge- wählt sind.
6. DNA-Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Expression eines oder mehrerer Gene nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die die zu transkribierenden Sequenzen für identische oder unterschiedliche Gene kodieren.
7. DNA-Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Expression eines oder mehrerer Gene nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Schutz vor Exonukleaseabbau durch einen kurzen Einzelstrangbereich aus drei bis acht Desoxynukleotiden erreicht wird, der die beiden Stränge des linearen Doppelstranges kovalent miteinander verknüpft.
8. DNA-Expressionskonstrukt zur gezielten Hemmung der Expression eines oder mehrerer Gene nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei dieses in dem kurzen Einzelstrangbereich mit einem oder mehreren Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Antikörpern oder Steroiden kovalent verknüpft ist.
9. Herstellungsverfahren für Vektoren, die nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen die Bildung definierter Proteine gezielt durch RNA-I nterferenz inhibie- ren, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte
a) Mischung eines DNA-Doppelstranges, welcher eine 19 - 23 Basen lange, singuläre Kopie einer Gensequenz oder ihre reverskomplementäre Sequenz sowie ein Terminationssignal für RNA- Polymerasen enthält und durch einen 8 - 12 Basen langen Sequenz- loop an einem Ende abgeschlossen ist, welcher so gewählt ist, dass gegenüberliegende Basen in keinem Fall komplementär zueinander sind und die flankierenden DNA-Einzelstränge zu einem DNA- Doppelstrang miteinander verbunden sind, der am anderen Ende einen kurzen überstehenden DNA Einzelstrang aufweist, mit
b) einem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngiger DNA aufweist und
c) einem Promotor mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende des Promotors mit dem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid oder dem 10 bis 1000 Ba- sen-langem Doppelstrang paaren kann und das einzelsträngige 3'-
Ende des Promotors komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des unter a) beschriebenen DNA-Doppelstranges ist und
d) anschließender Ligation der DNA-Fragmente,
e) sowie abschließender Aufreinigung der hergestellten Vektoren.
10. Herstellungsverfahren nach Anspruch 9, wobei nach Verfahrenschritt b) ein 10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA-Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA zugegeben wird, wobei das einzelsträngige 3'-Ende mit dem einzelsträngigen 5"-Ende des Promoters paaren kann und das einzelsträngige 5'-Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 3'-Ende des haarnadelförmigen Oligodesoxy- nukleotid ist.
11. Herstellungsverfahren für Vektoren, die nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen die Bildung definierter Proteine gezielt durch RNA-Interferenz inhibie- ren, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte
a) Mischung eines T-förmigen DNA-Doppelstranges, welcher eine 19 - 23 Basen lange, singuläre Kopie einer Gensequenz in 5' - 3!- Richtung sowie ein Terminationssignal für RNA-Polymerasen enthält und durch einen 8 - 12 Basen langen Sequenzloop an einem Ende abgeschlossen ist, welcher so gewählt ist, dass gegenüberliegende
Basen in keinem Fall komplementär zueinander sind und die flankierenden Doppelstrangbereiche so durch zwei DNA-Einzelstränge miteinander verbunden sind und am anderen Ende zwei kurze überstehende DNA-Einzelstränge aufweist, und einem Oligodesoxynukleotid dessen Sequenz komplementär zu den beiden kurzen überstehenden DNA-Einzelsträngen ist und zwei kurze überstehenden Enden einzelsträngiger DNA bildet, mit
b) einem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngiger DNA aufweist und
c) einem weiteren haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid, welches am Ende kurze überstehende Enden einzelsträngiger DNA aufweist, komplementär zu dem T-förmigen DNA-Doppelstrang aus a) und
d) einem Promotor mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger
DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende des Promotors mit dem haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotid aus b) paaren kann und das einzelsträngige 3'-Ende des Promotors komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des T-förmigen DNA-Doppelstranges ist und
e) anschließender Ligation der DNA-Fragmente, sowie
f) abschließender Aufreinigung der hergestellten Vektoren.
12. Herstellungsverfahren nach Anspruch 11, wobei nach Verfahrenschritt c) ein
10 bis 1000 Basen (= n) langer DNA-Doppelstrang einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA zugegeben wird, wobei das einzelsträngige 3'-Ende mit dem einzelsträngigen 5*-Ende des Promoters paaren kann und das einzelsträngige 5'-Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 3'-Ende des haarnadelförmigen Oligodesoxy- nukleotid aus Verfahrensschritt b) ist und/oder der Zugabe eines 10 bis 1000 Basen (= n) langen DNA-Doppelstranges einer nichtkodierenden Sequenz mit kurzen überstehenden Enden einzelsträngiger DNA, wobei das einzelsträngige 5'-Ende mit dem einzelsträngigen 3Λ-Ende des T-förmigen DNA- Doppelstranges paaren kann und das einzelsträngige 3'-Ende komplementär zu dem einzelsträngigen 5'-Ende des haarnadelförmigen Oligodesoxy- nukleotid aus Verfahrensschritt c) ist.
13. Herstellungsverfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei vor Beginn des Verfahrens partiell zueinander komplementäre ein- zelsträngige Oligodesoxynukleotide zu einem Verbindungsmolekül (Linker) hybridisiert werden, wobei die Hybridisierung derart unvollständig erfolgt, dass zwei oder mehr doppelsträngige Bereiche mit kohäsiven Enden mit gleicher oder unterschiedlicher Basensequenz durch Holliday-Junctions miteinander verbunden werden und anschließender Durchführung der angege- benen Verfahrensschritte.
14. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der Promotor Teil eines bakteriell amplifizierbaren Plasmides ist, welches vor der Mischung der jeweiligen Komponenten mit einer Restriktionsendonuklease ausgeschnitten wird, welche eine den Promotor auf dem Plasmid flankieren- de Schnittstelle erkennt, die auf dem herzustellenden Expressionskonstrukt nicht vorhanden ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der jeweilige Ligationsschritt in Anwesenheit der Restriktionsendonuklease erfolgt, mit welcher der Promotor aus dem Plasmid gespalten wurde.
16. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei vor dem abschließenden Aufreinigungsschritt ein Verdau der Reaktionsmischung mittels einer ausschließlich für 3'- oder 5'-DNA-Enden spezifischen Exonuklea- se erfolgt.
17. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei es sich bei der Restriktionsendonuklease um ein Enzym der Gruppe der Klasse-Il- Restriktionsendonukleasen, vorzugsweise ein Enzym aus der Gruppe
Bbsl , Bbvl , BbvII , Bpil ; BpII , Bsal , BsmAI , BsmBI , BsmFI , BspMI , Eaml l O 4 I , Earl , Eco31I , Esp3I , Fo kl , Hgal , S faN I oder deren Isoschizomere handelt.
18. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei bei der Mischung der Komponenten ein DNA-Doppelstrang zugegeben wird, der aus dem partiellen Annealing von einem partiell selbstkomplementären Oligode- soxynukleotid oder wenigstens zwei Oligodesoxynukleotiden resultiert.
19. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei die haar- nadelförmigen Oligodesoxynukleotide in ihrem doppelsträngigen Bereich die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease aufweisen.
20. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei die Aufreinigung durch Chromatographie und/oder mittels Gelelektrophorese erfolgt.
21. Kit zur Herstellung von Vektoren, die geeignet sind, nach ihrer Transfektion in eukaryote Zellen in diesen die Bildung definierter Proteine durch RNA- Interferenz gezielt zu inhibieren, nach wenigstens einem der Verfahren ge- maß der Ansprüche 9 bis 20, enthaltend zumindest einen Promotor, haarna- delförmige Oligodesoxynukleotide und Enzyme.
22. Kit zur Herstellung eines Expressionskonstruktes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, enthaltend zumindest zur Bildung von Abschlusshaarnadelstrukturen geeignete Oligodesoxynukleotide, zur Bildung eines Linkers geeignete Oligodesoxynukleotide, T-förmige DNA-Strukturen in welche die zu transkribierenden Sequenzen inseriert werden können sowie Enzyme und Mittel zur Durchführung von Ligations-, Spaltungs-, DNA-Degradations- und Aufreinigungsschritten.
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