JP2009521210A - Rna干渉による遺伝子発現の特異的抑制のためのdna構築 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図4
Description
a) 19から23塩基の、遺伝子配列又はその逆相補配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、及び8から12塩基の配列ループにより一つの末端が閉じられているDNA二本鎖であり、DNA二本鎖はその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA一本鎖はお互いに結合されDNA二本鎖を形成されるように選択され、DNA二本鎖はその他方の末端で短い突出するDNA一本鎖を持つ、
b) 二本鎖をその末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、
c) 一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの一本鎖5’末端は、ヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチド又は10から1000塩基の二本鎖と対を成すことができ、プロモータの一本鎖3’末端は、a) に記載のDNA二本鎖の一本鎖の5’末端に相補的であり、
d) 続いてDNA断片の結紮を実施し、最後に、
e) 合成されたベクターを最終的に精製する。
b)で末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、
c)更に、ヘアピン型オリゴデオキシヌクレオチドを持ち、オリゴデオキシヌクレオチドは末端にa)のT型DNA二本鎖に相補的である一本鎖DNAの短い突出する末端を持ち、
d)一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの
一本鎖5’末端はb)のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと対を成すことができ、そしてプロモータの一本鎖3’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖5’末端に相補的であり、
e)続いてDNA断片の結紮が行われ、構築体はまた10から1000塩基DNA二本鎖を用いないで合成することができ、
f)合成されたベクターは最終ステップで最終的に精製される。
図1は線状siRNAベクターの構成部分を示す。
更に、構成部分はリガーゼ酵素によりODN断片に結紮される。これらの構成部分は対応する相補的張り出し及びヘアーピン型オリゴジヌクレオチド(oligodinucleotide)を持つプロモータ配列であり、ヘアーピン型オリゴデジヌクレオチドの、各4つの塩基のそれ自身と相補的な独特の張り出しが、共有結合的に閉じた線状ベクターから生ずるものとなり、ベクターはプロモータ、標的配列及び終止配列よりなり、閉じたヘアーピン型末端を持つ。
図2はT型siRNAベクターの構成部分を表わす。
図3はT型複数siRNAベクター(二構築体)の構成部分を示す。
図4はT型複数siRNAベクター(三構築)の構成部分を示す。
図5はT型構築体の標的配列ループの詳細を示す。
CDC2のsiRNAをコードするベクターは以下の様に得られた:
CDC2のための2つのODN断片が90℃で3分加熱され、ゆっくり冷却することでアニールされた。この様にしてCDC2をコードする以下の配列が得られた。
ここで19の塩基がセンス鎖を形成し、続く4つの塩基(下線部分)がループ配列の最初の部分を形成する。
配列番号2: ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTGT ATGAGAGCAC AGATAGGG
配列番号3: 5'-PH-GGG AAA GCT TAG TTT TCT AAG CTT-3' (1.3 ミクログラム)及び
配列番号4: 5'−PH-GTT GGA ATT CAG TTT TCT GAA TTC-3' (1.3 ミクログラム)
個々の断片がT4 DNAリガーゼ酵素の助けにより結紮された。出来た核酸の混合物はT7 DNA-ポリメラーゼ酵素により処理された。最終製品、siRNALuc発現T7 DNAベクターがカラムクロマトグラフィーにより精製され、トランスフェクションのために備えられた。
Claims (22)
- RNA干渉により遺伝子発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、
a) 第一末端DNAヘアーピン ループであり、それはデオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者はその一端が結合性張出し部を持ち、反対側の末端では一本鎖ループを持ち;
b) 第二末端ヘアーピン ループであり、それは第一末端ヘアーピン ループに類似様に構築されており;
c) ホリデイ 接合(Holiday junction)により互いに結合されている3つの二本鎖DNAアームを持つ少なくとも一つのT-型DNA構造であり、
i) 一つのアームは転写される配列を含み、このDNA二本鎖アームの個々の鎖は、他のアームと接合している部分と反対側の末端で、一本鎖DNAループによりお互いに結合されており、及び
ii) 2つの他のアームは結合性末端を持ち、その1つのアームは好適な終止配列を持ち、他のアームは好適なプロモータ配列を持つ、
を含む前記発現構築体。 - RNA干渉により遺伝子発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、
a) 第一末端DNAヘアーピン ループであり、それはデオキシリボヌクレオチドの一本鎖がそれ自身の上に折畳まれて二本鎖領域を形成しており、後者は結合性張出し部を持つ一端を形成し、反対側の末端では二本鎖を形成する個々の鎖が、一本鎖ループによってお互いに結合されており;
b) 第二末端ヘアーピン ループであり、それは第一末端ヘアーピン ループと類似様に構築されており、その二本鎖及び一本鎖領域は、転写される配列よりなり;
c) 好適なプロモータ配列及び好適な逆相補的終止配列であり、これらはDNAの二本鎖中の、a)及びb)の末端ヘアーピン ループの間に位置する、
を含む前記発現構築体。 - 幾つかのT型DNA構造がそれぞれの場合において、ホリデイ 接合(Holiday junction)により末端でリンカーによって結合される、請求項1のDNA発現構築体。
- 幾つかの線状DNA構造がそれぞれの場合において、ホリデイ 接合(Holiday junction)により末端でリンカーによって結合される、請求項2のDNA発現構築体。
- 他の構成部分と標的を定めた結合をするための、個々の構成部分の結合性末端は、特異的であり、かつお互いに異なる様に選択される、請求項1乃至4のいずれか1項のDNA発現構築体。
- 請求項1乃至4のいずれか1項の一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、転写される配列が同一又は異なる遺伝子をコードする、前記発現構築体。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載の、一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、エクソヌクレアーゼ分解に対する保護が、3から8のデオキシヌクレオチドの短一本鎖領域により達成され、短一本鎖領域は線状二本鎖領域の2つの鎖を互いに共有結合でリンクする、前記構築体。
- 請求項1乃至4のいずれか1項の一又は幾つかの遺伝子の発現を標的を定めて抑制するDNA発現構築体であって、一又は幾つかの遺伝子が、短一本鎖領域で、一又は幾つかのペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体又はステロイドと共有結合している、前記構築体。
- 真核細胞にトランスフェクトされた後、RNA干渉により規定のタンパク質の形成を標的を定めた方法により抑制するベクターの合成方法であって、
a) 19から23塩基の、遺伝子配列又はその逆相補配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、及び8から12塩基配列ループにより一つの末端が閉じられているDNA二本鎖であり、DNA二本鎖はその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA一本鎖はお互いに結合されDNA二本鎖を形成されるように選択され、DNA二本鎖はその他方の末端で短い突出する、DNA一本鎖を持つ、二本鎖を、
b)その末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、及び
c) 一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの一本鎖5’末端は、ヘアーピン型のオリゴデオキシヌクレオチド又は10から1000塩基の二本鎖と対を成すことができ、プロモータの一本鎖3’末端は、a) に記載のDNA二本鎖の一本鎖5’末端に相補的であり、及び
d) 続いてDNA断片の結紮し、及び
e) 合成されたベクターを最終的に精製する、
ステップを含む前記ベクターの合成方法。 - 請求項9の合成方法であって、ステップb)の後に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の10から1000(=n)塩基のDNA二本鎖が加えられ、そして一本鎖3’末端はプロモータの一本鎖5’末端と対を成すことができ、そして一本鎖5’末端はヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖3’末端に相補的である、前記合成方法。
- ベクターが真核細胞にトランスフェクトされた後、規定のタンパク質の形成をRNA干渉により標的を定めた方法により抑制するベクターの合成方法であって、
a)19から23塩基の、5’から3’方向の遺伝子配列の単一コピー及びRNAポリメラーゼの終止コドンを含み、8から12塩基の配列ループにより一つの末端が閉じられているT型DNA二本鎖であり、そしてその対向する塩基はお互いに相補的でなく、隣接するDNA二本鎖領域は、2つのDNA一本鎖でお互いに結合される様に選択され、他の末端で短い突出する二本のDNA一本鎖、及びオリゴデオキシヌクレオチドを持ち、オリゴデオキシヌクレオチドはその配列が2つの短い突出するDNA一本鎖と相補的であり、一本鎖DNAの2つの短い突出する末端を形成するT型DNA二本鎖を,
b)末端に一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと混合し、及び
c)更に、末端にa)のT型DNA二本鎖に相補的である一本鎖DNAの短い突出する末端を持つヘアーピン型のオリゴデオキシヌクレオチド、
d)一本鎖DNAの短い突出する末端を持つプロモータであり、プロモータの
一本鎖5’末端はb)のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドと対を成すことができ、そしてプロモータの一本鎖3’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖5’末端に相補的であり、
e)続いてDNA断片の結紮が行われ、及び
f)合成されたベクターが最終的に精製される、
ステップを含む前記ベクターの合成方法。 - 請求項11の合成方法であり、ステップc)の後に、一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の10から1000塩基(=n)DNA二本鎖が加えられ、一本鎖3’末端はプロモータの一本鎖5’末端と対になることができ、及び一本鎖5’末端は、ステップb)のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖3’末端と相補的であり、及び/又は一本鎖DNAの短い突出する末端を持つ非コード配列の10から1000塩基(=n)DNA二本鎖を加え、一本鎖5’末端はT型DNA二本鎖の一本鎖3’末端と対になることができ、一本鎖3’末端はステップc)のヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドの一本鎖5’末端に相補的である、ステップを含む前記合成方法。
前記合成方法。 - 請求項9乃至12のいずれか1項に記載の合成方法であって、その方法が開始される前に、部分的に相補的な一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドがハイブリッドされリンカー分子を形成し、ハイブリッドは不完全であるため、同じ又は異なる塩基配列を持つ結合性末端を持つ2以上の二本鎖領域がホリデー接合により互いに結合され、そしてこれに続いて各記載方法のステップが実施される前記合成方法。
- 請求項9乃至13のいずれか1項に記載の方法であって、前記プロモータが細菌により増幅可能なプラスミドの一部であり、プラスミドは構成部分を混合する前に、プラスミド上のプロモータに隣接する、合成される発現構築体上に存在しないインターフェイスを認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて切除される、前記方法。
- 関連する結紮ステップが、プロモータをプラスミドからスプライスする制限エンドヌクレアーゼの存在下で起きる、請求項14の方法。
- 反応混合物の消化が、3’DNA末端又は5’DNA末端に特異な制限エクソヌクレアーゼを用いて最終精製ステップの前に実施される、請求項14又は15の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼのクラスIIの酵素、好ましくはBbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BpII, BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI又はそのアイソシゾマー(iso-schizomer)の酵素であるのが良い、請求項14乃至16のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項9乃至17のいずれか1項に記載の方法であって、DNA二本鎖が構成部分の混合物に添加され、二本鎖は一つの部分的に自己相補的オリゴデオキシヌクレオチド又は少なくとも2つのオリゴデオキシヌクレオチドの部分的アニールにより生成される、前記方法。
- ヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチドは、二本鎖領域に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を持つ、請求項9乃至18のいずれか1項に記載の方法。
- 精製が、クロマトグラフィー又はゲル電気泳動法により行われる、請求項9乃至19のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項9乃至20のいずれか1項に記載の方法により、真核細胞にトランスフェクトされた後、RNA干渉により規定のタンパク質の形成をこれらの細胞において標的を定めた方法により抑制するのに好適なベクターの合成のためのキットであって、少なくとも一つのプロモータ、ヘアーピン型オリゴデオキシヌクレオチド及び酵素を含む、前記キット。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載の発現構築体の合成のためのキットであって、少なくとも、末端ヘアーピン ループの形成に好適なオリゴデオキシヌクレオチド、リンカーの形成に好適なオリゴデオキシヌクレオチド、その転写される配列が挿入されるT型DNA構造、及び酵素、及び結紮、スプライシング、DNA分解及び精製を実施する手段を含む、前記キット。
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