PT1504126E - Um método para regular a expressão génica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

UM MÉTODO PARA REGULAR A EXPRESSÃO GENICA

CAMPO TÉCNICO A presente revelação refere-se, em geral, à expressão génica e, em particular, a um método de inibir a expressão de um gene alvo, a construções adequadas para utilização em tal método em plantas e animais não humanos compreendendo tais construções. A revelação também se refere a composições e kits que compreendem construções que podem ser utilizadas para inibir a expressão génica.

ANTECEDENTES

Demonstrou-se recentemente que as células animais expressam uma nova classe de ARNs de cadeia simples, ~22 nucleotídeos (nt) não codificantes, designados ARNs micro (ARNmi) (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001); Lau et al, Science 294:858-862 (2001); Lee e Ambros, Science 294:862-864 (2001)). Os ARNmi parecem ser derivados de precursores com ~7 0 nt que formam uma estrutura de loop em grampo de ARN prevista. Ficou por esclarecer se este precursor das moléculas de ARNmi é transcrito de promotores autónomos ou se, por oposição, está contido em ARNs mais longos (Ambros, Cell 107:823-826 (2001); Lau et al, Science 294:858-862 (2001)). 1 ΕΡ1504126Β1

Enquanto que mais de 100 ARNmi diferentes sao expressos em organismos tão diversos como nemátodos (Lau et al, Science 294:858-862 (2001), Lee et al, Science 294:862-864 (2001)), moscas da fruta (Lagos-Quintana et al, Science 294 858-858 (2002) e humanos (Mourelatos et al, Genes Dev. 16:720-728 (2002)), bem como em plantas (Tang et al, Genes Dev. 17:49-63 (2003), Reinhart et al, Genes Dev. 16:1616-1626 (2002)), a sua função permanece desconhecida. Contudo, a atividade biológica de dois ARNmi, let-7 e lin-4 de C. elegans, está bem estabelecida (Lee et al, Cell 75:843-854 (1993); Reinhart et al, Nature 403: 901-906 (2000)). Ambos lin-4 e let-7 são expressos durante estádios larvares específicos e ambos ARNmi interagem com alvos de ARN parcialmente complementares, localizados na região não traduzida a 3' (3' UTR) de ARNm específicos, para bloquearem seletivamente a sua tradução. Esta inibição é importante para a regulação do desenvolvimento apropriada em C. elegans (Wightman et al, Cell 75:855-862 (1993); Slack et al, Mol. Cell 5:659-669 (2000)). Vários ARNmi, incluindo let-7, são conservados evolutivamente de C. elegans para o homem, tal como o são vários alvos let-7 (Ambros, Cell 107:823-826 (2001)). Esta conservação implica que let-7, bem como outros ARNmi, também podem reprimir a expressão de espécies de ARNm específicas em células de mamíferos. Esta hipótese também é sugerida pela semelhança entre ARNmi e ARN de interferência pequenos (ARNsi) , ARN de cadeia dupla com ~21 nt que podem induzir a degradação de moléculas de ARNm contendo alvos complementares perfeitamente correspondidos, um processo designado interferência de ARN (ARNi) (revisto por Sharp, Genes Dev. 15:485-490 (2001), ver também Hutvágner et al, 2 ΕΡ1504126Β1

Curr. Opin. Genet. Dev. 12:225-232 (2002) e Zamore et al, Science 296:1265-1269 (2002), ver ainda documento USP 6 506 559) . Contudo, enquanto que os ARNmi são codiicados dentro do genoma do hospedeiro, os ARNsi são geralmente excisados de precursores de ARNds maiores produzidos durante a infeção virai ou introduzidos artificalmente.

Porque a introdução de ARNsi artificial em células animais pode induzir a degradação de moléculas de ARNm homólogas, o ARNi emergiu como uma ferramenta experimental útil (Elbashir et al, Nature 411:494-498 (2001); Fire et al, Nature 391:806-811 (1998); Hammond et al, Nature 404:293-295 (2000)). Contudo, em células de mamíferos, a indução de ARNi requer a transfeção de oligonucleotídeos de ARN, o que pode ser ineficaz e dá origem apenas à inibição transitória na expressão do gene alvo. A presente revelação providencia moléculas de ARN (ARNmi) funcionalmente equivalentes a ARNsi que podem ser transcritas endogenamente em células animais e de plantas. A invenção torna possível a produção de ARNmi especificamente desenhado para inibir a expressão de ARNm contendo uma sequência alvo complementar. As moléculas de ARNmi da revelação podem ser utilizadas experimental ou terapeuticamente para inibir a função do gene.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente revelação refere-se a ARNmi artificial e a um método de utilizar o mesmo para inibir especificamente a expressão de genes selecionados em células animais humanas e não humanas e em células de plantas. De acordo com a revelação, uma sequência de ADN que codifica ARNmi é introduzida nas células e a inibição do gene alvo é induzida pelo ARNmi transcrito endogenamente. Onde 3 ΕΡ1504126Β1 providenciar vantagem, a transcrição do ARNmi pode ser colocada sob o controlo de um promotor indutivel ou de um promotor especifico do tecido. Como o presente método pode resultar na produção continua de ARNmi, pode ser efetuada a inibição estável da expressão de ARNm alvo.

Objetos e vantagens da presente invenção serão claros da descrição que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras 1A-1B. Produção de ARNmi de miR-30 em células transfetadas. (Figura IA) Diagrama do ARN precursor de miR-30 humano previsto (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001)). miR-30 maduro (braço 3') e anti-

miR-30 (braço 5') são as linhas indicadas. As setas apontam para as extremidades 5' do ARNmi maduro conforme determinado por análise de extensão dos iniciadores. A posição das extremidades 3' podem ter um erro de 1 nucleotideo. (Figura 1B) Análise Northern blot de miR-30 e anti-miR-30 em células 293T transfetadas. Vias 1 e 4: ARN de células 293T transfetadas mock. Vias 2 e 5: células transfetadas com pCMV-miR-30. Vias 3 e 6: células transfetadas com pCMV-mmiR-30 (mmiR= miR maduro). A mobilidade relativa de oligos de ADN sintéticos é indicada. indica a posição de uma espécie anti-miR-30 endógena suspeita.

Figuras 2A-2C. O ARNmi de miR-30 inibe seletivamente a expressão de um ARNm indicador contendo locais alvo de miR-30. (Figura 2A) A sequência de um local alvo designado parcialmente complementar a miR-30. pDM128/RRE/4XT foi derivado de pDM128/RRE por inserção de quatro cópias deste local alvo no 3' UTR (caixas negras) . Os locais unidos (ss) , o RRE e a posição 4 ΕΡ1504126Β1 relativa da sonda RPA são indicados. (Figura 2B) células 293T foram co-transfetadas, com 10 ng de um plasmideo controlo interno (pBC12/CMV/β-gal) que expressa β-galactosidase (β-gal) e, conforme indicado, 10 ng de pDM128/RRE ou pDM128/RRE/4XT, 10 ng pcRev e 400 ng de pC-MV-mmiR-30 ou pCMV-miR-30. O plasmideo pBC12/CMV parental serviu como o controlo negativo. As atividades CAT foram determinadas às 48 horas após a transfeção e foram normalizadas para atividades de β-gal. As colunas 2 e 6 são definidas arbitrariamente para 100%. (Figura 2C) células 293T foram transfetadas com o plasmideo pDM128/RRE/ 4XT, com ou sem pcRev ou pCMV-miR-30, conforme descrito na Figura 2B. Às 48 horas após a transfeção, as células foram divididas em frações nuclear (N) e citoplasmática (C) , o ARN total isolado e analisado pro RPA. Os fragmentos da sonda salvo pelos ARNms unidos (S) e separados (U) codificados por pDM128/RRE/4XT são indicados.

Figuras 3A-3D. O novo ARNmi de miR-30-nxt inibe especificamente a expressão citoplasmática de ARNm de pgTAT-nxt separados. (Figura 3A) Desenho do precursor do ARNmi de miR-30-nxt. Sequências inseridas derivadas do gene nxt de Drosophila global são indicadas. (Figura 3B) Deteção do novo ARNmi de miR-30-nxt e anti-miR-30-nxt em células 293T transfetadas por análise Northern. Vias 1 e 3: células transfetadas mock; vias 2 e 4: células transfetadas pCMV-miR-30-nxt. A mobilidade relativa de marcadores de ADN é indicada. (Figura 3C) Western blots utilizando antisoros policlonais de coelho dirigidos contra HIV-1 Tat ou Rev. Células 293T foram transfetadas utilizando 25 ng de pgTAT ou pgTAT-nxt, 25 ng de pcRev e 400 ng de pGMV-miR-30-nxt. O plasmideo pBC12/CMV parental serviu como o controlo negativo. Esta análise Western 5 ΕΡ1504126Β1 foi realizada ~48 horas após a transfeção. (Figura 3D) 0 ARNmi de miR-30-nxt reduz o nivel citoplasmático de ARNm de pgTAT-nxt separados. Células 293T foram transfetadas com pgTAT-nxt, com ou sem pcRev ou pCMV-miR-30-nxt. Dois dias depois da transfeção, ARNs nuclear (N) e citoplasmático (C) foram preparados e analisados por RPA. A via 1 representa aproximadamente 3% da sonda de entrada (I) . Os fragmentos da sonda salvos por ARNm unido (S) e separado (U) são indicados.

Figuras 4A-4D. Inibição da expressão génica endógena por novo ARNmi em células 293T. (Figura 4A) Deteção de expressão de miR -30-PTB e anti-miR-30-ΡΤΒ. Células 293T foram transfetadas mock (vias 1 e 3) ou transfetadas com pCMV-miR-30-ΡΤΒ (vias 2 e 4) . Após 2 dias, o ARN total foi isolado e utilizado para análise de extensão de iniciadores. As posições dos marcadores de ADN são indicadas. (Figura 4B) Redução de proteína PTB endógena e expressão de ARNm por pCMV-miR-30-ΡΤΒ. As células foram transfetadas com pC-MV-miR-30-nxt (vias 1 e 3) ou pCMV-miR-30-ΡΤΒ (vias 2 e 4) . Após cinco dias, os lisados celulares totais e ARNs foram preparados. Vias 1 e 2: Western blot utilizando anticorpos dirigidos contra PTB ou CA150, que serviram como um controlo de carga. Vias 3 e 4: Análise Northern para ARNm PTB. (Figura 4C) Perda de SV40 Tag em células transfetadas com pCMV-miR-30-Tag. As células foram co-transfetadas com phrGFP-C (um plasmídeo de expressão de proteína fluorescente verde) e pCMV-miR-30-nxt ou pCMV-miR-30-Tag, e tres dias mais tarde, analisados por imunofluorescência. (Figura 4D) 6 ΕΡ1504126Β1

Quantificação de células que expressam SV40 Tag. Células com coloração Tag nuclear clara foram contadas como positivas (coloração citoplasmática foi fraca e também presente em controlos de anticorpo apenas secundários). Pelo menos 200 células foram contadas para cada amostra.

Figuras 5A e 5B. Desenho da construção indicadora. (Figura 5A) Sequências dos alvos de ARN sintéticos utilizadas e os seus emparelhamentos previstos com o ARNmi de miR-30, anti-miR-30 ou miR21 ou ARNsi de dNxt. As sequências alvo ou foram perfeitamente (P) complementares ou foram desenhadas para formar uma saliência com 3 nt central (B) . Uma sequência aleatória, para a qual não se conhece um ARN pequeno complementar, foi utilizada como um controlo. (Figura5B) Estrutura das construções indicadoras pCMV-luc-alvo e pCMV-luc-alvo-CAT. Os alvos, representados por caixas negras, são oito repetições em tandem de uma das sequências mostradas na Figura. 5A. PA, sinal de poliadenilação.

Figuras 6A-6C. Atividade biológica dos ARNmi de miR-30 e anti-miR-30. (Figura 6A) O nivel de expressão de miR-30, anti-miR-30 e de miR-21 em células 293T transfetadas mock, ou em células 293T transfetadas com os plasmideos de expressão de ARNmi indicados, foi determinado por extensão de iniciadores (Zeng et al, RNA 9: 112-123 (2003)) . (Figura 6B) As atividades da enzima luc detetadas nas culturas de células 293T transfetadas com os plasmideos efetores e indicadores listados, bem como com o plasmideo controlo 7 ΕΡ1504126Β1 pBC12/CMV/p-gal, foram determinadas ~40 horas após a transfeção e depois ajustadas com base em variações menores observadas no controlo interno CAT. Estes valores são apresentados normalizados para a cultura transfetada com pCMV-luc-aleatório-CAT e pCMV-miR-21, que foi definido arbitrariamente para 1,0. A média de três experiências independentes com o desvio padrão é indicada. O número de nanogramas de cada plasmideo de expressão de ARNmi transfetado em cada cultura é indicado. (Figura 6C) Análise northern paralela para detetar o ARNmi repórter de luc (painel superior) e o ARNm de β-gal controlo (painel inferior). Mostradas acima do painel superior são as quantidades de pCMV-miR-30 ou pCMV-miR-21 transfetadas por cultura. O nível de atividade da enzima luc detetado para cada construção indicadora é dada como uma percentagem do nível obtido no momento da co-transfeção com o plasmideo controlo pCMV-miR-21. Via 1: ARN de células 293T transfetadas mock. A seta indica a posição do produto de clivagem de ARNm de luc com 1,8 kb.

Figuras 7A e 7B. Atividade biológica do ARNmi de miR-21 humano. (Figura 7A) Esta experiência foi realizada conforme descrito na Figura 6B. Os dados mostrados são a média de 4 experiências independentes. (Figura 7B) Análise northern paralela da expressão de ARNm de luc (painel superior) e β-gal (painel inferior). O nível da atividade da enzima luc detetado com cada construção indicadora é dado como uma percentagem do nível obtido no momento da co-transfeção com o plasmideo controlo pCMV-mir-30. Via 1, ARN de células 293T transfetadas mock. A seta indica a posição do 8 ΕΡ1504126Β1 produto de clivagem do ARNm de luc com ~1,8 kb.

Figuras 8A e 8B. Inibição da utilização do ARNm por um ARNsi sintético. (Figura 8A) As culturas foram co-transfetados com um dos três plasmídeos indicadores listados junto com o ARNsi do dNxt ou dTap e os plasmídeos controlo internos pRL-CMV e pBC12CMV^-gal. A quantidade de cada ARNsi utilizada é dada em picomoles. Aproximadamente 40 horas após a transfeção, as culturas foram utilizadas para o ensaio dual da luciferase ou para isolamento do ARN. As atividades de luc de pirilampos foram ajustadas para variações menores no controlo interno de luc de Renilla e são apresentadas normalizadas para a atividade observada na cultura transfetada com o plasmídeo controlo pCMV-luc-aleatório e o ARNsi controlo dTap, que foi definido para 1,0. Estes dados representam a média de três experiências independentes, com o desvio padrão indicado. (Figura 8B) Análise Northern da expressão do ARNm da luc de pirilampo (painel superior) e β-gal (painel inferior). O nível da atividade da enzima luc de pirilampo detetado para cada construção indicadora é dado como uma percentagem do nível obtido com o ARNsi controlo dTap. Via 1, ARN de uma cultura transfetada mock. A seta indica a posição do produto de clivagem do ARNm de luc com ~1,8 kb.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente revelação refere-se a um método de inibir especificamente a expressão de genes alvo selecionados em células animais humanas e não humanas e em células de plantas utilizando ARNmi produzido endogenamente. De acordo com este método, são utilizadas construções que codificam um ou mais ARNmi. As construções são desenhadas de modo que 9 ΕΡ1504126Β1 o processamento nuclear, transporte e excisão de ARNmi maduro é efetuado de forma eficiente. 0 ARNmi resultante induz a degradação de um ARNm produzido na célula que contém uma sequência alvo complementar ou, de outra forma, inibe a tradução do ARNm. A revelação refere-se, ainda, a construções adequadas para utilização em tal método e a composições e kits que compreendem tais construções.

De acordo com o presente método, uma construção de ADN é introduzida nas células (células hospedeiras) nas quais uma sequência do gene alvo é expressa. A construção compreende um promotor funcional nas células hospedeiras operativamente ligado a uma sequência que codifica um precursor do ARNmi. A introdução da construção nas células hospedeiras é efetuada em condições de tal forma que o transcrito do precursor do ARNmi é produzido e o ARNmi maduro é depois excisado do precursor por uma ribonuclease endógena. 0 ARNmi maduro resultante induz a degradação do transcrito de ARNm da sequência do gene alvo produzida na célula ou, de outra forma, inibe a tradução do ARNm. (Será apreciado que a degradação de outros tipos de ARN, incluindo ARN virai, podem ser induzidos de forma semelhante.) ARNmi adequados para utilização na presente invenção têm, de forma vantajosa, cerca de 19-24 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente, cerca de 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento. 0 ARNmi pode ser desenhado de modo a hibridizar com qualquer transcrito de ARN com um elevado grau de especificidade. De forma vantajosa, o ARNmi é desenhado de forma a ser perfeitamente complementar com a sequência alvo dentro do ARN (por exemplo, ARNm) já que mesmo a redução de um único nucleotídeo na complementaridade com o alvo pode, dependendo da sua localização, atenuar o nível de inibição. Os dados 10 ΕΡ1504126Β1 apresentados no Exemplo 2 indicam que o ARNmi pode partir o ARNm transportando um local alvo completamente complementar enquanto que o ARNmi pode inibir a expressão de ARNm transportando sequência parcialmente complementar sem necessariamente induzir clivagem. 0 ARNmi pode ser desenhado de modo a dirigir uma região não traduzida 3' ou 5' do ARNm ou região codificante do ARNm.

Conforme indicado anteriormente, o ARNmi é excisado de um precursor que inclui uma estrutura de loop em grampo de ARN prevista (Lagos-Quintana et ai, Science 294:853 (2001), Lau et ai, Science 294:858 (2001), Lee e Ambrose, Science 294:362 (2001)). Esta estrutura de loop em grampo pode ser desenhada de modo a ser reconhecida por uma ribonuclease (por exemplo, uma enzima tipo ARNase III, tal como DICER, ou uma enzima com as propriedades de reconhecimento da mesma), com a excisão resultante do ARNmi maduro. Tais estruturas de loop em grampo precursoras podem ter cerca de 40 a 100 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente, cerca de 50 a 75 nucleotídeos. A região do grampo pode ter cerca de 19-45 nucleotídeos de comprimento (ou mais), preferencialmente, cerca de 20-30 nucleotídeos. O grampo pode compreender um duplex perfeitamente complementar (mas para qualquer extremidade 3' ) , contudo, podem estar presentes "saliências" em qualquer um dos braços do grampo e podem ser preferidas. De forma vantajosa, quaisquer tais "saliências" são poucas em número (por exemplo, 1, 2 ou 3) e têm cerca de 3 nucleotídeos ou menos de tamanho. A porção loop terminal pode compreender cerca de 4 ou mais nucleotídeos (preferencialmente, não mais de 25) ; o loop tem preferencialmente 6-15 nucleotídeos de tamanho. A estrutura de loop em grampo precursora pode ser produzida como parte de um transcrito veículo maior a partir do qual o ARNmi é excisado, ou pode ser produzido como um transcrito preciso. 11 ΕΡ1504126Β1

Os dados apresentados em Zeng et al, RNA 9: 112-123 (2003), tornam claros os requisites de certas sequências para o processamento e funcionamento eficientes de ARNmi (por exemplo, manutenção do emparelhamento de bases na base do grampo previsto, fora da porção do grampo que codifica o ARNmi maduro, sendo significativa). Os dados apresentados também demonstram a desejabilidade de sequências de grampo substituintes de ARNmi que ocorre naturalmente (por exemplo, miR-30) para gerar ARNmi adequado para utilização na inibição da expressão de qualquer gene alvo. Os dados indicam que enquanto a presença de um loop miR-30 pode ser desejável, variações dessa estrutura também podem ser toleradas (por exemplo, loops podem ser utilizados aue são superiores a 72%, preferencialmente superiores a 79%, mais preferencialmente superiores a 86%, e mais preferencialmente, superiores a 93% idênticos à, por exemplo, sequência miR-30 (determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos tais como o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Grupo de Computadores de Genética, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)). A sequência codificante da revelação (por exemplo, a sequência codificante do precursor do ARNmi ou a sequência codificante do veiculo mais longo) pode estar presente na construção em ligação operativa com um promotor. Promotores apropriados podem ser selecionados com base na célula hospedeira e efetor procurados. Promotores adequados incluem promotores constitutivos e indutiveis, tais como promotores baseados na ARN polimerase II (polll) indutiveis. Os promotores podem ser específicos do tecido, sendo tais promotores bem conhecidos na arte. Exemplos de promotores adequados incluem o promoter regressível ou 12 ΕΡ1504126Β1 indutível tetraciclina, promotores baseados na ARN polimerase I ou III, os promotores virais dependentes de pol II tais como o promotor CMV-IE e os promotores polIII U6 e Hl. 0 promotor do bacteriófago T7 também pode ser utilizado (em cujo caso, será apreciado, a polimerase T7 também terá de estar presente).

As construções da invenção podem ser introduzidas nas células hospedeiras utilizando qualquer uma de uma variedade de abordagens. Pode ser efetuada a infeção com um vetor virai compreendendo a construção. Exemplos de vetores virais adequados incluem vetores retrovirais de replicação defeituosa, vetores adenovirais, vetores adeno-associados e vetores lentivirais. A transfeção com um plasmídeo compreendendo a construção é um modo alternativo de introdução. 0 plasmídeo pode estar presente como ADN nú ou pode estar presente em associação com, por exemplo, um lipossoma. A natureza do veículo de entrega pode variar com a célula hospedeira. A entrega in vivo da construção (por exemplo, presente num vetor virai) pode ser realizada utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas, dependendo do tecido alvo. A entrega pode ser, conforme apropriado, por injeção direta, inalação, injeção intravenosa ou outro método físico (incluindo através de microprojéteis dirigidos a regiões visíveis e accessíveis do tecido (por exemplo, com ADN nú) ) . A administração pode ser por agulha de seringa, trocar, cânula, catéter, etc., conforme apropriado. 0 ARNmi da revelação pode ser utilizado para regular (por exemplo, inibir) a expressão de genes alvos em células e tecidos em cultura e em células presentes em plantas e em animais humanos e não humanos. As sequências alvo podem ser sequências que ocorrem naturalmente, transgenes ou podem 13 ΕΡ1504126Β1 ser sequências patogénicas presentes, por exemplo, como resultado de infeção. A titulo de exemplo, o ARNmi da revelação pode ser utilizado para "desligar os virus papiloma em humanos (por exemplo, no útero utilizando um vetor virai adeno-associado adequadamente desenhado). Células cultivadas adequadas como hospedeiras de acordo com a revelação incluem tanto células primárias como linhas de células. As células podem ser células humanas, incluindo células estaminais humanas. Uma construção da revelação que codifica um ARNmi pode ser introduzida em células cultivadas para desativar um gene especifico de função desconhecida. Silenciar o gene utilizando o método da invenção pode ser utilizado como uma abordagem para avaliar a sua função. Em alternativa, uma construção que codifica um ARNmi pode ser introduzida em células a serem implantadas num animal humano ou não humano para fins terapêuticos. Por exemplo, células estaminais hepaticas podem ser obtidas de um paciente infetado com hepatite C e colocadas em cultura. Uma construção da revelação que codifica um ARNmi dirigido a um gene da hepatite C essencial para, por exemplo, a replicação ou embalamento pode ser introduzida nas células explantadas em condições de modo a que o gene seja silenciado. As células podem depois ser reimplantadas no paciente em condições de modo que a regeneração seja efetuada. 0 ARNmi da revelação também pode ser introduzido num animal não humano para produzir um modelo animal experimental, ou num animal humano ou não humano para fins terapêuticos. No caso de animais experimentais, o ARNmi pode ser utilizado paa análise a grande escala da função génica. Como o alvo para o ARNmi tem cerca de 22 nucleotideos, o ARNmi pode ser utilizado para desligar a expressão de isoformas individuais resultando, por exemplo, 14 ΕΡ1504126Β1 da união alternativa. No caso de terapêutica, o ARNmi pode ser desenhado, por exemplo, para bloquear a replicação virai. Animais humanos ou não humanos podem ser manipulados por engenharia genetic, por exemplo, para expressarem permanentemente múltiplos ARNmi dirigidos a sequências conservadas em vírus (por exemplo, sequências de embalamento ou elementos reguladores) , tornando, assim, os humanos/animais permanentemente imunes ao desafio pelo vírus, incluindo desafio pelo HIV. Abordagens semelhantes podem ser utilizadas em plantas para tornar as plantas imunes aos vírus. ARNmi desenhado de forma adequada também pode ser utilizado em animais humanos e não humanos para desligar a expressão oncogene em células tumorais, ou inibir a expressão de genes associados com outras condições médicas, por exemplo, formas mutantes de Huntingtin ou da proteína prião bem como mutantes proteicos negativos dominantes vistos em algumas doenças genéticas humanas. 0 ARNmi da invenção pode ser utilizado, por exemplo, para inibir a expressão de genes pró-inflamatórios ou genes apoptóticos onde terapeuticamente desejável. Por exemplo, a expressão de BCL-2 pode tornar as células cancerígenas resistentes à quimioterapia. Utilizando a presente abordagem, o ARNmi pode ser utilizado para inibir a expressão de BCL-2 e potenciar a capacidade dos agentes quimioterapêuticos de causar senescência nas células tumorais. De forma análoga, células T isoladas de um paciente com um tumor podem ser modificadas ex vivo utilizando a presente abordagem de modo que a expressão do recetor TGFp é inibida. No momento da reintrodução no paciente, a capacidade para matar das células T é aumentada. Da mesma forma, as células T podem ser modificadas ex vivo para inibir a expressão do recetor Fas, aumentando assim a capacidade de matar o tumor das células no momento da reintrodução. 0 ARNmi da invenção 15 ΕΡ1504126Β1 pode ser utilizado para tratar qualquer doença onde desligar um ou um conjunto de produtos génico específicos é benéfico. 0 ARNmi da invenção também pode ser utilizado para transportar vários ecrãs de rendimento elevado para selecionar a perda de fenótipo de função. Por exemplo, uma biblioteca de construções codificante do precursor de ARNmi aleatórias pode ser introduzida nas células (por exemplo, utilizando um vetor virai) para determinar a função de uma sequência genómica. Tipicamente, o protocolo utilizado é tal que o vírus é introduzido por célula. Utilizando qualquer uma de uma variedade de abordagens, aquelas células nas quais a função do gene alvo é perdida podem ser selecionadas (por exemplo, se é procurado um gene envolvido na morte celular resultante de infeção virai, apenas aquelas células que contêm o ARNmi alvo permanecerão viáveis após exposição ao vírus; em alternativa, podem ser utilizado marcadores (por exemplo, proteínas indicadoras) para selecionar células contendo o ARNmi alvo). 0 ARNmi pode depois ser clonado das células selecionadas, a sequência determinada e utilizada para identificar o gene alvo. A presente revelação inclui composições e kits que compreendem o ARNmi descrito anteriormente e/ou sequências de ácidos nucleicos que codificam o mesmo (e construções compreendendo tais ácidos nucleicos) . Tais composições podem ainda incluir, por exemplo, um veículo (por exemplo, um veículo estéril) e tais kits podem ainda compreender, por exemplo, reagentes ancilares (por exemplo, tampões) tais como os necessários para transportar os métodos instantâneos e meios de recipiente.

Certos aspetos da invenção são descritos com maior 16 ΕΡ1504126Β1 detalhe nos Exemplos não limitantes que se seguem (ver também Zeng et al, Mol. Cell 9:1327-1333 (2002), Coburn et al, J. Virol. 76:9225-9231 (2002) e Zeng et al, RN A 9:112- 123 (2003), bem como os documentos USP 6 506 559, por exemplo, para aplicações específicas). EXEMPLO 1

Procedimentos experimentais

Construção de plasmídeo e descrição de oligonucleotídeo

Os plasmídeos de expressão pBC12/CMV, pBC12/CM ν/β-gal e pcRev, e as construções indicadoras pDMl28/RRE e pgTat, foram descritos previamente (Malim et al, Nature 338:254-257 (1989); Bo-gerd et al, Crml. J. Virol. 72:8627-8635 (1998); Hope et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:7787-7791 (1990); Cullen, Cell 46:973-982 (1986)). Um plasmídeo de expressão GPP, phrGFP-6, foi obtido de Strategene. Para fazer pC-MV-miR-30, os dois iniciadores de ADN: 5'-TACTCGAGATCTGCGACTGTAAACATCCTC-GACTGGAAGCTGTGAAGCCACAGATGG-3' e 5'-CGCTCGAGGATCCGCAGCTGCAAACATC-CGACTGAAAGCCCATCTGTGGCTTCACAG-3' foram emparelhados, extendidos utilizando a Taq ADN polimerase, cortados com Xhol, e clonados no local Xhol presente no pBC12/CMV. Para fazer pCMV-miR-30, 5'-ATCCCTT-TCAGTCGGATGTTTGCAGCT-3' e 5'-CTAGAGCT-GCAAACATCCGACTGAAAGG-3' foram emparelhados e clonados em pBC12/CMV. Para fazer pDM128/RRE/4XT, quatro cópias do local alvo de miR-30 (Figura 2A, separados por dois ou cinco nucleotídeos um do outro) foram clonados no local Xhol de pDM128/RRE. Para 17 ΕΡ1504126Β1 fazer pgTAT-nxt, a sequência codificante nxt~ de

Drosophila (nucleotídeos 1-420) foram amplificadas de uma biblioteca ADNc embriónica de Drosophila e clonadas entre los dois locais BglII presentes em pgTAT. Os plasmideos de expressão pCMV-miR-30-ΡΤΒ, pCMV-miR-30-nxt e pCMV-miR-30-TAg foram preparados conforme descrito para pCMV-miR-30, exceto que as sequências estaminais inseridas foram derivadas de cada gene alvo.

Cultura de células e transfeção Células 293T foram crescidas conforme descrito previamente (Bogerd et al, Crml. J. Virol. 72:8627-8635 (1998)) e foram transfetadas utilizando Reagente FuGene 6 (Roche). Foram realizados ensaios CAT às 48 horas após a transfeção, conforme descrito (Bogerd et al, Crml. J. Virol. 72:8627-8635 (1998)). Para o Western blotting, os lisados foram fracionados num gel de gradiente de SDS-acrilamida 4-20% (Bio-Rad), transferidos e depois sondados com um anti-soro policlonal de coelho dirigido contra Tat, Rev (Malim et al, Nature 338:254-257 (1989)), CA 150 (Suné et al, Mol. Cell. Biol. 17:6029-6039 (1997)) ou PTB. As bandas reativas foram visualizadas utilizando ECL (Amersham). Um anti-soro policlonal especifico para PTB 1 humana foi preparado por imunização dos coelhos com uma proteína de fusão recombinante purificada consistindo em glutationa-S-transferase fundida com PTB1 de comprimento inteiro. Foram realizadas analyses de imunofluorescência conforme descrito (Wiegand et al, Mol. Cell. Biol. 22:245-256 (2002)) utilizando um anticorpo monoclonal contra SV40 Tag (Pab 108, Santa Cruz) e anti-soro anti-ratinho de cabra conjugado com rodamina (ICN) bem como a estirpe DAPI de 18 ΕΡ1504126Β1 ADN .

Análise de ARN 0 ARN total foi isolado utilizando Reagente Trizol (Invitrogen). 0 fracionamento celular e RPA foram realizados conforme descrito previamente (Kang e Cullen, Genes Dev. 13:1126-1139 (1999)). Para análise Northern do ARNmi, aproximadamente 20 yg do ARN total foi separado num gel de poliacrilamida desnaturante 15%, transferido para uma membrana Hy-Bond-N (Amersham), reticulado por UV e sondado com oligos 5' 32P-fosforilados em solução de

ExpressHyb (Clontech). Para análise Northern do ARNm, 20 yg of total RNA foi fracionado num gel de agarose 1% desnaturante, transferido para uma membrana, fixado e sondado com uma sonda de ADNc PTB iniciada aleatória.

Resultados

Expressão de uma sequência de ARNmi miR-30 introduzida em células humanas

MiR-30 é um de vários ARNmi novos recentemente isolados da linha de células humanas HeLa (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001)). Uma sequência de ADNc que codifica o precursor de miR-30 com 71 nt complete previsto (Figura IA) foi clonada no contexto de um ARNm irrelevante expresso sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovirus (CMV-IE), em pCMV-miR-30. Um plasmideo semelhante, pCMV-miR-30, contendo apenas a sequência do ADNc do miR-30 maduro também foi construído. Células 293T humanas foram depois transfetadas com estes plasmídeos de expressão e o ARN total foi analisado para a presneça do ARNmi do miR-30 por Northern blotting (Figura 1B) . O miR-30 maduro pode ser prontamente detetado nas 19 ΕΡ1504126Β1 células transfetadas com pCMV-miR-30 (Figura 1B) . O ARNmi produzido do plasmídeo pCMV-miR-30 transfetado pareceu ter ~22 nt de comprimento e tinha a mesma extremidade 5' que a reportada para o miR-30 endógeno (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001)), conforme determinado por análise de extensão dos iniciadores (Figura IA). Por oposição, as células transfetadas mock ou células 293T transfetadas com pCMV-miR-30 não expressaram qualquer ARNmi de miR-30 detetável (Figura 1B, vias 1 e 3) . A produção do ARNmi de miR-30 também pode ser detetada em células HeLa ou NIH3T3 transfetadas ou quando o ADN do precursor do miR-30 foi colocado dentro de um intrão ou na 3'-UTR de outro ARNm expresso sob o controlo do promotor CMV-IE. Assim, o ARNmi de miR-30 maduro pode ser excisado da sequência precursora de miR-30 quando esta última for expressa no contexto de um ARNm irrelevante. O miR-30 maduro é codificado pelo braço 3' do seu precursor (Figura IA) e um precursor do ARNmi geralmente origina apenas uma espécie de ARNmi madura, estável derivada ou do braço 5' ou do 3' do grampo de ARN precursor (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001); Lau et al, Science 294:858-862 (2001); Lee e Ambros, Science 294:862-864 (2001)). Ainda assim, foi possível detetar também um ARNmi derivado do braço 5' (miR-30 antissenso, ou anti-miR-30) em células transfetadas (Figura 1B. via 5). Enquanto que níveis significativos de ARNmi de miR-30 endógeno não foram detetados nem nas células 293T nem, surpreendentemente, nas células HeLa, pareceu haver um nível baixo, constitutivo de anti-miR-30 endógeno ou possivelmente de um ARNmi semelhante nas células 293T, HeLa e NIH3T3 (marcados por na Figura 1B). 20 ΕΡ1504126Β1 0 MiR-30 inibe a expressão de um ARNm contendo locais alvo complementares 0 ARNmi lin-4 e let-7 de C. elegans inibe a tradução de ARNms contendo múltiplas sequências complementares nos seus 3' UTRs sem afetar de forma significativa o nivel constante do ARNmi miRNA (Lee et al, Cell 75:843-854 (1993); Wightman et al, Cell 75:855-862 (1993)). Foi, por isso, questionado se o miR-30 humano poderia também atuar através de um mecanismo semelhante. Uma sequência alvo miR-30 foi desenhada e quatro cópias desta sequência foram inseridas no 3' UTR da construção indicadora pDM128/RRE para originar o plasmideo pDMl28/RRE/4XT (Figura 2A) . De forma importante, esta sequência alvo não é um complemento perfeito do miR-30 e, em vez disso, como os alvos conhecidos lin-4 e let-7 (Lee et al, Cell 75:843-854 (1993); Slack et al Mol. Cell 5:659-669 (2000)), contém uma discordância central (Figura 2A). A construção indicadora parental pDM128/RRE utilizada nestas experiências contém locais unidos 5' e 3' que flanqueiam um intrão, derivado do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), que contém ambos o gene cat e o Elemento de Resposta Rev (RRE) (Hope et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:7787-7791 (1990)). Conforme mostrado previamente (Hope et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 7787-7791 (1990); Bogerd et al, Crml. J. Virol. 72: 8627- 8635 (1998); Kang e Cullen, Genes Dev. 13: 1126-1139 (1999)); a exportação nuclear deste ARNm cat separado depende da co-expressão da proteína HIV-1 Rev, enquanto que a exportação nuclear do ARNm unido codificado por pDM12 8/RRE, que não codifica CAT, ocorre de forma constitutiva (Figura 2). Conforme mostrado na Figura 2B, a co-transfeção de pCMV-miR-30, que codifica o precursor de 21 ΕΡ1504126Β1 ARN de miR-30 completo, resultou num declínio marcado no nível da atividade de CAT expressa do plasmídeo pDM12S/RRE/4XT, que contém quatro cópias do local alvo mas falhou em afetar a expressão de CAT do plasmídeo indicador parental pDM128/RRE (Fiqura 2B) . Em contraste, a co-transfeção de pCMV-miR-30, contendo apenas a sequência de miR-30 maduro, não reduziu a expressão de CAT (Figura 2B).

Para determinar se a redução observada na atividade de CAT foi devido a uma redução na expressão de ARNm cat, foi realizado um ensaio de proteção de ARNase (RPA) utilizando frações de ARN nuclear e citoplasmático derivadas de células 293T transfetadas. Conforme mostrado na Figura 2C, o miR-30 não afetou de forma significativa o nível constante citoplasmático do ARNm cat separado codificado por pDM128/RRE/4XT (comparar as vias 6 e 8). Assim, a ação do ARNmi de miR-30 neste sistema repórter parece imitar o efeito do ARNmi lin-4 em C. elegans (Olsen e Ambros, Dev. Biol. 216:671-680 (1999)) . ARNmi desenhado pode ser produzido in vivo a partir de precursores do ARNmi artificiais

Para determinar se as características encontradas no precursor do miR-30 poderiam ser utilizadas para desenhar e sintetizar novos ARNmi em células humanas, a sequência estaminal no precursor do miR-30 foi substituída com uma sequência baseada no gene nxt de Drosophila (Gene CG10174, nucleotídeos 121-143 do codão de iniciação da tradução) (Figura 3A). Foi mostrado previamente que o ARNsi sintético análogo pode bloquear a expressão de ARNm do nxt em células S2 de Drosophila (Wiegand et al, Mol. Cell. Biol. 22:245-256 (2002)) . De forma importante, esta sequência não é conservada em homólogos humanos do nxt. 22 ΕΡ1504126Β1 0 novo precursor do ARNmi, designado miR-30-nxt, foi de novo expresso como parte de um transcrito de ARNm mais longo, conforme descrito anteriormente para o tipo selvagem de miR-30. Inicialmente, o plasmídeo pC-MV-miR-30-nxt foi transfetado para células 293T humanas, o ARN total foi isolado e a produção de ambos miR-30-nxt miRNA maduro (o braço 3' , de acordo com miR-30) e anti-mir-30-nxt (o braço 5' previsto) analisados por análise Northern. Na Figura 3B (vias 2 e 4), foi mostrado que ambos miR-30-nxt e anti-miR-30-nxt foram de facto expressos. Utilizando análise de extenção dos iniciadores foi possível determinar que os locais de clivagem 5' utilizados na síntese destes novos ARNmi estavam próximos dos observados no precursor de mir-30. Assim, os novos ARNmi podem ser produzidos em células humanas utilizando o precursor do ARNmi de mir-30 existente, natural como um molde.

Inibição da expressão de ARNm por ARNmi desenhado

Para determinar se ARNmi transcritos endogenamente poderiam ser utilizados como ARNsi para iniciar ARNi contra alvos ARNm específicos em células de mamíferos, como construção indicadora, designados pgTat-nxt, foi construído que continha um sequência nucleotídica 402 inserida, derivada do gene nxt de Drosophila, que deveria providenciar um único local alvo completamente complementar para o novo, ARNmi de miR-30-nxt. A anteriormente descrita, construção indicadora pgTat (Malim et al, Nature 333:254-257 (1989)) contém os dois exões que codificam a proteína HLV-1 Tat que flanqueia um intrão, derivada do gene env HIV-1, que também contém o RRE HIV-1. Na ausência de Rev, pgTat produz exclusivamente 86 aminoácidos (aa), dois formas de exões de Tat codificados pelo ARNm tat unido (Figura 3C, via 2). Contudo, na presença de fato de exportação de ARN nuclear Rev, o ARNm separado codificado 23 ΕΡ1504126Β1

pro pg-Tat também é exportado do núcleo, resultando na expressão da forma curta com 72 aa da proteína Tat (Figura 3C, via 3) (Malim et al, Nature 338:254-257 (1989)) . A inserção da seguência nxt no intrão de pgTat não perturbou este padrão de expressão (Figura 3C, vias 5 e 6). Porgue o alvo para pCMV-miR-30-nxt está apenas presente no intrão, a expressão de miR-30-nxt só deveria afetar a produção de 72 aa Tat (na presença de Rev), mas não de 86 aa Tat, providenciando assim um ideal de controlo para a especificidade. Esta inibição seletiva foi de facto observada (Figura 3C, comparar vias 6 e 7) . De forma importante, miR-30-nxt não inibiu a síntese da proteína Rev, da forma longa de Tat produzida por ambos pgTAT e pgTAT-nxt ou da forma curta com 72 aa de Tat expressa do plasmídeo controlo negativo pgTAT (Figura 3C, vias 4 e 7). 0 ARNi induz a degradação de ARNms alvo (Hammond et al, Nature 404:293-295 (2000); Zamore et al, Cell 101:25-33 (2000)) . Um RPA foi, portanto, realizado para comparar os níveis de ARNms de Tat unidos e separados na ausência ou presença de Rev e miR-30-nxt. MiR-30-nxt induziu uma diminuição específica (-7 vezes) no nível citoplasmático de ARNm tat separado observado na presença de Rev (comparar vias 7 e 9 na Figura 3D), apesar de não ter tido efeito no ARNm tat unido. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando um ARNsi sintético, o que sugere fortemente que o ARNmi de miR-30-nxt induz ARNi.

Inibição de expressão génica endógena utilizando ARNmi artificial

Para testar se um novo ARNmi poderia inibir a expressão de genes endógenos em células humanas, foi escolhida a proteína de ligação ao trato polipirimidina (PTB) (Wagner e Garcia-Blanco, Mol. Cell. Biol. 21:3281- 24 ΕΡ1504126Β1 3288 (2001)) como um alvo. O plasmídeo de expressão pCMV-miR-30-ΡΤΒ (contendo os nucleotídeos PTB 1179-1201), foi construído da mesma forma que descrita para pCMV-miR-30-nxt e transfetado em células 293T. Ambos ARNmi de miR-30-ΡΤΒ e anti-miR-30-ΡΤΒ foram rapidamente detetados por extensão de iniciadores (Figura 4A) . De forma importante, a introdução de pCMV-mirR30-PTB resultou numa redução marcada e específica no nível da expressão da proteína PTB endógena e ARNm PTB, quando comparado com as células controlo (Figura 4B) .

Apesar da introdução de pCMV-miR-30-ΡΤΒ resultar numa redução reproduzível de 70-80% no nível da proteína PTB e expressão de ARNm em células 293T transfetadas (Figura 4B), a inibição não foi completa. Uma explicação possível para o nível residual da expressão de PTB é que a transfeção de células 293T não é 100% eficiente. Para investigar esta questão, foi construído um terceiro plasmídeo de expressão de ARNmi, pCMV-miR-30-Tag, que foi desenhado para expressar um ARNmi artificial dirigido contra o antigeno SV40 T (Tag) (nt 639-661, Harborth et al, J. Cell Sei. 114:4557-4565 (2001)). Este plasmídeo de expressão foi depois introduzido em células 293T, que expressam Tag constitutivamente, juntamente com um plasmídeo que expressa proteína fluorescente verde (GFP) e o número de células que expressam Tag foi quantificado utilizando imunofluorescência. A co-transfeção do plasmídeo de expressão GFP tornou possível discriminar prontamente células transfetadas de não transfetadas (Figura 4C).

Conforme mostrado na Figura 4D, ~90% das células que não foram transfetadas ou que foram transfetadas com GFP mais pCMV-miR-30-nxt (como um controlo negativo) expressaram 25 ΕΡ1504126Β1 rapidamente níveis detetáveis de TAg. Em contraste, a co-transfeção do plasmídeo de expressão pCMV-miR-30-TAg resultou numa redução dramática no número de células que foram ambas GFP e TAg positivas (Figuras 4C e 4D).

Foi demonstrado posteriormente que um segundo ARNmi humano, designado miR-21, também poderia ser expresso de forma eficaz quando o precursor do mesmo formava parte de um ARNm mais longo (Zeng et al. RNA 9:112-123 (2003)). Para ambos miR-30 e miR-21, a produção de ARNmi maduro foi altamente dependente da integridade do grampo de ARN precursor, apesar da sequência subjacente ter pouco efeito. EXEMPLO 2

Procedimentos experimentais Plasmídeos e ARNsi.

Plasmideos pCMV-miR-30, pCMV-miR-21 e pBC12/CMV/p-gal foram descritos (Zeng et al, RNA 9:112-123 (2003)). Plasmídeos indicadores pCMV-luc-alvo (alvo sendo miR30 (B), miR-30(AB), miR-30 (P), miR-30(AP), miR-21 (B), miR-21 (P), dNxt (B), dNxt (P) ou aleatório, Figura 5A) foram feitos combinando oligos que codificam duas cópias da sequência alvo e inserindo-os depois do codão de terminação da luciferase (luc) no pCMV-luc (Zeng et al, RNA 9:112-123 (2003) ) . Pelo menos uma separação de 2 pb foi introduzida entre sequências alvo adjacentes. Todos os plasmídeos foram sequenciados para verificar os alvos inseridos. Uma cassete de expressão (CAT) da transferase acetil cloranfenicol amplificada por PCR (Figura 5B) foi depois clonada no único local Stul presente em cada intermediário de pCMV-luc-alvo. Os ARNsi sintético de dNxt e dTap foram obtidos de Dharmacon, emparelhados e armazenados como stocks de 20 mM. 26 ΕΡ1504126Β1

Transfeções e ensaios repórter.

Foram realizadas transfeções em triplicado em placas com 24 poços. FuGene 6 (Roche) foi utilizado para transfetar plasmideos em células 293T. Cada poço recebeu 10 ng de pCMV-luc-Target-CAT, 8 ng de pBC12/CMV/3-gal e 400 ng de pCMV-miR-30 e/ou pCMV-miR-21. Para transfeções

envolvendo ambos plasmideos e ARNsi, foi utilizada Cellfectamine 2000 (Invitrogen). Cada poço recebeu 15 ng de pC-MVluc-alvo, 8 ng de pBC12/CMV/β-gal, 0,2 ng de pRL-CMV (Promega) e 40 pmol de ARNsi de dNxt e/ou dTap. 36-44 horas mais tarde, um poço de células foi lisado e testado para luciferase de pirilampo e ou luciferase de CAT ou de Renilla (Zeng et al, RN A 9:112-123 (2003)). Os ARN foram isolados dos restantes dois poços utilizando Reagente Trizol (Invitrogen) ou kits RNAeasy (Qiagen). Foi realizado Northern blotting para pelo menos duas transfeções independentes, conforme descrito previamente (Zeng et al, RN A 9: 112-123 (2003)). As membranas foram primeiro hibridizadas com uma sonda luc, despidas e depois sondadas para ARNm de β-galactosidase (β-gal).

Resultados

Previamente, foi demonstrado que um gene indicador pode ser reprimido translacionalmente em células humanas no momento da sobre-expressão do ARNmi de miR-30 humano, se o ARNm cognato transporta quatro cópias em tandem de uma sequência alvo de ARN com saliência no 3'UTR (Zeng et al, Mol. Cell 9:1327-1333 (2002)). As construções indicadoras semelhantes utilizadas aqui são baseadas no gene indicador da luciferase do pirilampo e contêm oito locais alvo de ARN arranjados em tandem no 3 ' UTR (Figura 5B) . Este número é comparável aos sete locais alvo para o ARNmi lin-4 encontrado no 3'UTR do ARNm lin-14 em C. elegans (Lee et 27 ΕΡ1504126Β1 al, Cell 75: 843-854 (1993), Wightman et al, Cell 75:855- 862 (1993)) e foi escolhido na esperança de maximizar o fenótipo de baixos níveis de ARNmi expresso endogenamente. Os locais alvo introduzidos ou foram perfeitamente (P) homólogos ao ARNmi ou ARNsi utilizado, ou continham uma saliência central prevista de 3 nucleotídeos (B) (Figura 5A) . Um controlo interno é critic para as experiências descritas e experiências iniciais envolveram, por isso, a co-transfeção de construções indicadoras equivalentes a pCMV-luc-alvo (Figura 5B) com um plasmídeo controlo que codifica luciferase de Renilla. À luz de dados recentes que sugerem que o ARNmi pode modular a composição em cromatina dos genes que transportam sequências de ADN homólogo (Demburg et al, Cell 111:159-162 (2002)), também foi construído um segundo conjunto de construções indicadoras análogas, designadas pCMV-luc-alvo-CAT, nas quais o gene cat foi expresso a partir de uma cassete presente no mesmo plasmídeo (Figura 5B). Dados muito idênticos foram obtidos utilizando qualquer um dos conjuntos de plasmídeos indicadores. ARNmi humano sobre-expresso pode induzir a clivagem de ARNm.

Apesar da maioria do ARNmi ser expresso como ARN de cadeia simples derivado de um braço da estrutura de loop em grampo pre-miR-NA, um pequeno número de pre-ARNmi dão origem a níveis detetáveis de um ARNmi derivado de ambos os braços (Lau et al, Science 294:858-862 (2001), Mourelatos et al Genes Dev. 16:720-728 (2002)). Um tal ARNmi é miR-30 humano e a sua forma antissenso anti-miR-30, ambos os quais foram detetados em células humanas (Lagos-Quintana et al, Science 294:853-858 (2001), Mourelatos et al Genes Dev. 16:720-728 (2002)). Previamente, foi reportado que as células 293T humanas não expressam miR-30 detetável, mas 28 ΕΡ1504126Β1 expressam baixos níveis de anti-miR-30 (Figura 6A, vias 1 e 3) (Zeng et al, Mol. Cell 9:1327-1333 (2002)). A transfeção de células 293T com pC-MV-miR-30, que codifica a estrutura de loop em grampo pre-ARNmi de miR-30 contida dentro de um transcrito mais longo (Zeng et al, Mol. Cell 9:1327-1333 (2002)), resulta na sobre-expressão de anti-miR-30 e na produção de níveis rapidamente detetáveis de miR-30 (Figura 6A, vias 2 e 4) .

Para avaliar a atividade biológica destes ARNmi, células 293T foram transfetadas com construções indicadoras análogas a pCMV-luc-alvo-CAT (Figura 5B) contendo oito cópias de uma sequência alvo perfeitamente homóloga tanto a miR-30 [miR-30(P)] como a anti-miR-30 [miR-30(AP)] ou alvos semelhantes previstos formar uma saliência de ARN central com 3 nucleotídeos [miR-30(B) e miR-30(AB)]. Uma sequência aleatória com 22 nt serviu como um controlo da especificidade (Figura 5A). Cada construção indicadora foi co-transfetada com plasmídeos de expressão previamente descritos (Zeng et al, RNA 9:112-123 (2003), Zeng et al, Mol. Cell 9:1327-1333 (2002)) codificando ou miR-30 (e anti-miR-30) ou miR21 humana, que aqui serve como um control negativo. Além disso, estas células também foram co-transfetadas com um plasmídeo que codifica β-gal.

Conforme mosrado na Figura 6B, a co-transfeção de pCMV-miR-30 suprimiu a expressão de luc de todas as quatro construções indicadoras transportando alvos de ARN miR-30 senso ou antissenso, quando comparada com o plasmídeo controlo pCMV-miR-2 1, mas não afetou a construção indicadora controlo que transporta o alvo aleatório. Os dois plasmídeos indicadores que codificam alvos de ARN perfeitos (P) completamente homólogos foram inibidos de forma significativa mais eficazmente do que as duas construções que codificam parcialmente locais alvo de ARN 29 ΕΡ1504126Β1 (B) discordantes e com saliências quando um nivel semelhante do plasmideo efetor pCMV-miR-30 foi co-transfetado. Contudo, níveis equivalentes de inibição da expressão de luc foram conseguidos por, por exemplo, co- transfetar um nível ~10 vezes inferior de pCMV-miR-30 com a construção indicadora pCMV-luc-miR-30 (P)-CAT (Figura 6B) . A construção indicadora controlo, com oito cópias em tandem de uma sequência alvo aleatória, originou de forma consistente a uma atividade de luciferase ~1,8 mais baixa do que a observada com a construção indicadora que transporta o local alvo de miR-30 (B) na ausência de ARNmi de miR-30 sobre-expresso. Apesar de não se desejar estar ligado pela teoria, põe-se a hipótese que esta atividade inferior pode refletir um efeito cis fraco, inespecífico da sequência aleatória utilizada. Apesar da possibilidade da inserção de sequências no 3' UTR de um ARNm poder exercer um efeito inespecífico na função do ARNm, é ainda assim, de interesse, dado que as células 293T expressam um baixo nível de anti-miR-30 endógeno, mas não miR-30, miRNA (Figura 6A), que a previsão de resposta de ambas as construções indicadoras ao anti-miR30 originou níveis significativamente inferiores de luciferase do que os plasmídeos indicadores concordantes específicos para miR-30 (Figura 6B, comparar colunas 3 e 5 com 9 e 11) . Esta observação é consistente com a hipótese de que estas construções indicadoras estão sujeitas a inibição parcial pelo ARNmi anti-miR-30 endógeno. 30 ΕΡ1504126Β1

Para conhecer melhor o mecanismo de inibição da expressão da luciferase documentado na Figura 6B, foi realizada a seguir uma análise northern que mediu o nível de expressão de ambos ARNm de luc e do ARNm controlo interno da β-gal (Figura 6C) . Consistente com os dados proteicos, os níveis de ARNm de luc codificados pela construção indicadora que transporta locais alvo aleatórios não foram afetados pela expressão de miR-30 ou miR-21, apesr de terem sido drasticamente reduzidos pela co-transfeção de um plasmídeo previemente descrito (Zeng et al, RN A 9:112-123 (2003)), designado pCMV-miR30-luc, que codifica um ARNsi que é específico para o quadro de leitura aberta luc (Figura 6C, vias 2-4). Uma observação importante emergiu da comparação do padrão de expressão de ARNm de luc em culturas transfetadas com plasmídeos indicadores que transportam alvos de ARN perfeitos versus com saliências. Especificamente, enquanto que todas as cultures deram origem a níveis detetáveis do ARNm de luc de comprimento inteiro com ~2,3 kb, as culturas transfetadas com pCMV-miR-30 e plasmídeos indicadores que transportam alvos perfeitos foram diferentes em também darem origem a uma segunda banda de ARNm de luc com ~1,8 kb de tamanho (Figura 6C, vias 8, 9 e 13). Este é o tamanho previsto do

fragmento 5' do ARNmi de luc de comprimento inteiro que apareceria no momento da clivagem nos locais alvo 3 ' UTR (Figura 5B) e sugere, portanto, que ambos miR-30 (Figura 6C, vias 8 e 9) e anti-miR-30 (Figura 6C, via 13) são capazes de induzir a clivagem específica de um ARNm que 31 ΕΡ1504126Β1 transporta locais alvo perfeitos quando é sobre-expresso. De forma importante, a falta de clivagem detetável de ARNm de luc próximos e semelhantes que transportam locais alvo com saliências (Figura 6C, vias 6 e 11) nã é simplesmente devido a um nível inferior de inibição, já que a banda de ARNm de luc mais curta permaneceu prontamente detetável quando o ARN foi preparado a partir das células co-transfetadas com a construção indicadora a transportar os locais alvo perfeitos juntamente com um baixo nível de pCMV-miR-30 desenhado para imitar o nível de inibição observado quando os locais alvo foram com saliências (comparar vias 6 e 8, Figura 6C).

Clivagem de um ARNm por um ARNmi humano endógeno.

Ao contrário do miR-30, mas como a maioria dos ARNmi, processar o pre-ARNmi de miR-21 origina apenas um ARNmi maduro estável (Lagos-Quintana, Science 294:853-858 (2001), Zeng et al, RN A 9:112-123 (2003)). Apesar de miR-21 ser expresso em níveis rapidamente detetáveis nas células 293T, este ARNmi (mas não o seu suposto parceiro antissenso) pode ser sobre-expresso por transfeção das células 293T com o plasmídeo de expressão pCMV-miR-21 (Figura 6A, vias 5 e 6) .

Construções indicadoras análogas a pCMV-luc-alvo-CAT, mas contendo oito cópias de um alvo perfeito ou com saliência especifico para miR-21 (Figura 5A) , foram construídas e a sua atividade biológica foi analisada. Conforme mostrado na Figura 7A, estas construções comportaram-se de forma semelhante às construções equivalentes analisadas na Figura 6A, já que ambos os locais alvo perfeitos e com saliência suportaram inibição específica pelo plasmídeo efetor co-transfetado pCMV-miR-21, com o indicador perfeito a ser de novo algo mais 32 ΕΡ1504126Β1 recetivo. De notar, a construção indicadora pCMV-luc-miR-21(P)-CAT originou um nível realmente baixo de expressão da enzima luc mesmo na ausência de um plasmídeo efetor co-transfetado, sugerindo, assim, de novo a inibição por miR-21 endógeno (Figura 7A, via 7) . A análise da expressão de ARNm por análise northern blot revelou níveis rapidamente detetáveis do produto de clivagem do ARNm de luc com ~1,8 kb em culturas transfetadas com a construção indicadora gue transporta o alvo miR-31 (P) mas não o alvo miR-21(B) (Figura 7B, vias 2, 4 e 5) , conforme foi também previamente observado com miR-30 (Figura 6C). De forma importante, contudo, este produto de clivagem também foi rapidamente detetável, apesar de a um nível baixo, em culturas transfetadas pCMV-luc-miR-21(P)-CAT que não foram co-transfetadas com pC-MV-miR-21 (Figura 6B, via 6) . A explicação mais simples para esta observação é que o ARNmi de miR-21 endógeno é responsável pela clivagem do ARNm indicador de luc de miR-21 (P) dentro da sequência alvo totalmente homóloga. Em contraste, nenhum miR-21 sobre-expresso ou endógeno é capaz de induzir a clivagem do ARNm quando este alvo transporta uma discordância central (Figura 6C, vias 2 e 3) . De forma análoga, o baixo nível de ARNmi de anti-miR-30 endógeno (Figura 6A) também originou um baixo nível de clivagem do ARNm codificado pela construção indicadora pCMV-luc-miR-30 (AP)-CAT em algumas experiências, apesar do produto de clivagem do ARNm resultante estar presente em níveis apenas acima dos limites inferiores (Figura 6C, via 12).

Inibição da tradução de ARNm por um ARNsi sintético.

Tendo estabelecido gue ambos ARNmi sobre-expressos e 33 ΕΡ1504126Β1 endógenos podem clivar ARNm alvo, a questão seguinte foi se o ARNsi sintético pode inibir a função do ARNm sem induzir a clivagem do ARNm. Para investigar este assunto, foram utilizados dois ARNsi sintéticos específicos para ARNm que codificam as proteínas Nxt e Tap de Drosophila. Apesar destes reagentes podem inibir a expressão das proteínas dNxt e dTap e do ARNm em células S2 de Drosophila transfetadas (Wiegand et al, Mol. Cell. Biol. 22:245-256 (2002)), estas sequências nucleotídicas alvo não são conservadas nos genes Nxt e Tap humanos.

Construções indicadoras baseadas em pCMV-luc-alvo, com sequências alvo perfeitas ou com saliência homólogas ao ARNsi de dNxt (Figura 5A) foram transfetadas em células 2 93T juntamente com ARNsi de dNxt ou de dTap (este último como um controlo negativo) e um plasmídeo de expressão de β-gal. Conforme mostrado na Figura 8A, tanto o alvo dNxt com saliência como o perfeito suportaram inibição específica da expressão da proteína luc no momento da co-transfeção de ARNsi de dNxt, apesar do alvo perfeito ser de novo mais recetivo do que o alvo com saliência. A análise da expressão de ARNm de luc por northern blot revelou uma queda no nível de ARNm de luc de comprimento inteiro e o aparecimento do fragment de ARNm de luc truncado previsto nas culturas transfetadas com a construção que transporta o alvo dNxt perfeito, mesmo quando a inibição da atividade da enzima luc foi apenas uma relativamente modesta ~5 vezes (Figura 8B, vias 7 e 8). Em contraste, uma inibição equivalente de ~5 vezes da construção que transporta o 34 ΕΡ1504126Β1 alvo dNxt com saliência falhou em originar qualquer ARNm de luc truncado detetável e de facto não conseguiu afetar de forma significativa o nivel de expressão do ARNm de luc de comprimento inteiro (Figura 8B, via 5). Concluiu-se, portanto, que a inibição da expressão da enzima luc observada com a construção indicadora que transporta os alvos dNxt com saliência não é devida à clivagem e degradação do alvo ARNm de luc mas a alguma forma de inibição translacional.

Resumindo, utilizando ensaios inteiramente in vivo em células humanas, demonstrou-se que o ARNmi de miR-21 humano endógeno ou formas sobre-expressas do ARNmi de miR-30 e anti-miR-30 humano, podem induzir a clivagem de ARNm que transporta locais alvo totalmente complementares, um fenótipo previamente considerado característico do ARNsi (Figuras 5 e 7) . Por oposição, também foi demonstrado que um ARNsi sintético é capaz de regular para jusante a expressão de um ARNm que transporta locais alvo com saliência, parcialmente discordantes sem induzir a clivagem do ARNm detetável ou reduzir os niveis de expressão de ARNm (Figura 8), um atributo previamente considerado característico do ARNmi (Hutvágner et al, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-232 (2002))). Juntos, estes daods indicam que os ARNmi e ARNsi interagem de forma identical com as moléculas de ARNm que transportam locais alvo de complementaridade equivalente, isto é, em ambos casos a homologia perfeita conduz à clivagem do ARNm, ao passo que uma saliência central induz inibição translacional. Estas observações confirmam e estendem os dados in vitro recentes que documentam a clivagem especifica de um alvo de ARN artificial por um extrato citoplasmático contendo o ARNmi humano let-7 (Hutvágner et al, Science 297: 2056-2060 (2002)). 35 ΕΡ1504126Β1 A interpretação dos dados anteriores foi grandemente facilitada pela observação de que o ARNm de luc com ~2,3 kb codificado pelas construções indicadoras utilizadas origina um produto de clivagem 5' estável com ~lm8 kb após clivagem mediada por ARNsi ou ARNmi nos locais alvo introduzidos. Este intermediário do ARN foi detetado invariavelmente quando um ARNmi ou ARNsi encontrou um alvo artificial totalmente complementar mas nunca foi observado quando o alvo foi desenhado com uma discordância central (Figura 6C, Figura 7B e Figura 8B). Este ARN também diferiu do ARNm de luc de comprimento inteiro pelo facto de apenas este ultimo foi detetável por análise Northern quando foi testada uma sonda especifica para as sequências 3' para os locais alvo introduzidos. Enquanto que a estabilidade deste fragmento de ARNm é claramente fortuito, outros detetaram previamente o aparecimento de um intermediário de clivagem de ARNm de luc estável em células tratadas com um ARNsi especifico de luc (Gitlin et al, Nature 418:320-434 (2002)).

Apesar dos dados apresentados anteriormente demonstrarem que o ARNmi e ARNsi podem inibir a expressão de ARNm através de mecanismos aparentes idênticos, poder-se-ia argumentar que o ARNsi pode ser ainda mais eficaz na degradação do ARN do que na inibição da tradução, enquanto que o ARNmi pode exibir a atividade inversa. Contudo, para ambos ARNmi e ARNsi, foi observada uma inibição eficaz mais significativa da atividade da enzima luc se o ARNm de luc transporta um alvo totalmente complementar e foi, por isso, 36 ΕΡ1504126Β1 sujeito a clivagem do ARN (Figura 6B, 7A e 8A) . Isto poderia, claro, refletir simplesmente um recrutamento mais eficiente de complexos ribonucleoproteicos contendo ARNmi ou ARNsi a locais de ligação de ARN com maior afinidade. Contudo, enquanto que RISC parece funcionar como uma verdadeira enzima de clivagem de ARN quando apresentada com locais alvo de ARN totalmente complementares (Hutvágner et al, Science 297:2056-2060 (2002)), especula-se que discordâncias nos locais alvo que previnem a clivagem, tais como uma saliência de ARN central, possam congelar RISC no lugar do alvo de ARN discordante. Desta forma, os alvos de ARN discordados centralmente podem reduzir a concentração eficaz do seu complexo cognato RISC e reduzir, assim, a eficiência com que a expressão do ARNm é inibida. 37 ΕΡ1504126Β1

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. Não constitui uma parte integrante do documento de patente europeu. Embora a compilação das referências tenha sido feita com grande cuidado, não são de excluir erros ou omissões e o EPO não aceita qualquer responsabilidade a esse respeito.

Documentos de patentes citados na descrição • US 6506559 B [0004] • US P6506559 B [0024]

Literatura de não patentes citada na descrição • LAGOS-QUINTANA et al. Science, 2001, vol. 294, 853-858 [0002] [0009] [0028] [0029] [0043] • LAU et al. Science, 2001, vol. 294, 858-862 [0002] [0003] [0029] [0043] • LEE; AMBROS. Science, 2001, vol. 294, 862-864 [0002] [0029] • AMBROS. Cell, 2001, vol. 107, 823-826 [0002] [0004] • LEE et al. Science, 2001, vol. 294, 862-864 [0003] LAGOS-QUINTANA et al. Science, 2002, vol. 294, 858-858 [0003] MOURELATOS et al. Genes Dev., 2002, vol. 16, 720-728 [0003] [0043] TANG et al. Genes Dev., 2003, vol. 17, 49-63 [0003] REINHART et al. Genes Dev., 2002, vol. 16, 1616-1626 [0003] LEE et al. Cell, 1993, vol. 75, 843-854 [0003] [0030] [0042] REINHART et al. Nature, 2000, vol. 403, 901-906 [0003] WIGHTMAN et al. Cell, 1993, vol. 75, 855-862 [0003] [0030] [0042] SLACK et al. Mol. Cell, 2000, vol. 5, 659-669 [0003] 38 [0030] ΕΡ1504126Β1 • SHARP. Genes Dev., 2001, vol. 15, 485-490 [0004] • HUTVAGNER et al. Curr. Opin. Genet. Dev., 2 0 02, vol. 12, 225-232 [0004] [0053] • ZAMORE et al. Science, 2002, vol. 296, 1265-1269 [0004] • ELBASHIR et al. Nature, 2001, vol. 411, 494-498 [0005] • FIRE et al. Nature, 1998, vol. 391, 806-811 [0005] • HAMMOND et al. Nature, 2000, vol. 404, 293-295 [0005] [0036] • ZENG et al. RNA, 2003, vol. 9, 112-123 [0009] [0014] [0024] [0039] [0040] [0041] [0044] [0047] [0048] • LAGOS-QUINTANA et al. Science, 2001, vol. 294, 853 [0013] • LAU et al. Science, 2001, vol. 294, 858 [0013] • LEE; AMBROSE. Science, 2001, vol. 294, 362 [0013] • ZENG et al. Mol. Cell, 2002, vol. 9, 1327-1333 [0024] [0042] [0043] [0044] • COBURN et al. J. Virol., 2002, vol. 76, 9225-9231 [0024] • MALIM et al. Nature, 1989, vol. 338, 254-257 [0025] [0026] [0035] • BOGERD et al. Crrnl. J. Virol., 1998, vol. 72,8627-8635 [0025] [0026] [0031] • HOPE et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, vol. 87, 7787-7791 [0025] [0031] • CULLEN. Cell, 1986, vol. 46, 973-982 [0025] • SUNÉ et al. Mol. Cell. Biol., 1997, vol. 17, 6029-6039 [0026] • WIEGAND et al. Mol. Cell. Biol., 2002, vol. 22, 245- 256 [0026] [0033] [0051] • KANG ; CULLEN. Genes Dev., 1999, vol. 13, 1126-1139 [0027] [0031] • OLSEN ; AMBROS. Dev. Biol., 1999, vol. 216, 671-680 [0032] 39 ΕΡ1504126Β1 MALIM et al. Nature, 1989, vol. 333, 254-257 [0035] ZAMORE et al. Cell, 2000, vol. 101, 25-33 [0036] WAGNER ; GARCIA—BLANCO. Mol. Cell. Biol., 2001, vol. 21, 3281-3288 [0037] HARBORTH et al. J. Cell Sei., 2001, vol. 114, 4557- 4565 [0038] • DEMBURG et al . Cell, 2002, vol. 111, 159-162 [0042] • LAGOS-QUINTANA. Science, [0048] 2001, , vol. 294, 853-858 • HUTVÁGNER et [0053] [0055] al. Science, 2002 , vol. 297, 2056-2060 • GITLIN et al. Nature, 2002, vol. 418, 320-434 [0054]

Lisboa, 23 de Maio de 2014 40

Claims (12)

1. ΕΡ1504126Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de inibir a expressão de um gene que compreende introduzir numa célula de planta ou numa célula animal humana ou não humana isolada uma construção de ADN que compreende um promotor indutivel ou constitutivo funcional em dita célula operativamente ligado a um ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotidica que codifica, como parte de uma sequência codificada mais longa, um precursor do ARNmi, dito precursor do ARNmi compreendendo uma estrutura de loop em grampo e compreendendo em dito grampo de dita estrutura de loop em grampo uma sequência complementar a uma porção de um transcrito de ARN de dito gene, em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo tem cerca de 19-45 pares de bases de comprimento e o grampo de dita estrutura de loop em grampo compreende cerca de 4-25 nucleotideos, em que, após a introdução de dita construção em dita célula: (i) dita sequência nucleotidica é transcrita, (ii) o transcrito resultante de dita sequência nucleotidica é processado de modo que dito precursor do ARNmi é excisado de dito transcrito de dita sequência nucleotidica, (iii) dito precursor do ARNmi é processeado de modo que um ARNmi maduro com cerca de 21 ou 22 nucleotideos de comprimento é excisado de dito precursor do ARNmi e (iv) é efetuada a inibição da expressão de dito gene. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dito loop de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi compreende uma sequência correspondente ao ARNmi que ocorre naturalmente. 1 ΕΡ1504126Β1 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que a base de dito grampo de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi compreende uma região com as bases emparelhadas com pelo menos 3 pares de bases de comprimento. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dito promotor é um promotor baseado na polimerase II. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dita célula é uma célula cultivada. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dita célula é uma célula animal humana ou não humana isolada. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dita célula é uma célula de planta. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1 em que dito ARNmi maduro induz a degradação de dito transcrito de ARN de dito gene. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8 em que dito transcrito de ARN de dito gene é um ARNm:
2. 10. O método de acordo com a reivindicação 1 em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi inclui pelo menos uma saliência.
3. 11. O método de acordo com a reivindicação 6 em que dita construção está presente num vetor virai ou um plasmídeo.
4. 12. O método de acordo com a reivindicação 1 em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi compreende 6-15 nucleotideos. 2 ΕΡ1504126Β1
5. 13. Uma composição compreendendo um veículo e uma construção de ADN que compreende um promotor indutível ou constitutivo operativamente ligado a um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica, como parte de uma sequência codificada mais longa, um precursor do ARNmi, dito precursor do ARNmi compreendendo uma estrutura de loop em grampo e compreendendo em dito grampo de dita estrutura de loop em grampo uma sequência complementar a uma porção de um transcrito de ARN de um gene alvo, em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo tem cerca de 19-45 pares de bases de comprimento e o grampo de dita estrutura de loop em grampo compreende cerca de 4-25 nucleotídeos, em que dita construção é tal que, no momento da introdução de dita construção numa célula que compreende dito gene alvo, dito precursor do ARNmi é transcrito como parte de um transcrito de dita sequência codificada mais longa que é processada de modo que dito precursor do ARNmi é excisado do mesmo, dito precursor do ARNmi é depois processado de modo que um ARNmi maduro com cerca de 21 ou 22 nucleotídeos de comprimento é excisado de dito precursor do ARNmi, e é efetuada a inibição da expressão de dito gene alvo.
6. 14. Uma célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada compreendendo uma construção de ADN compreendendo um promotor indutível ou constitutivo funcional em dita célula operativamente ligado a um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica, como parte de uma sequência codificada mais longa, um precursor do ARNmi, dito precursor do ARNmi compreendendo uma estrutura de loop em grampo e compreendendo em dito grampo de dita estrutura de loop em grampo uma sequência complementar a uma porção de um transcrito de ARN de um gene em dita célula, em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo tem cerca de 19- 3 ΕΡ1504126Β1 45 pares de bases de comprimento e o loop de dita estrutura de loop em grampo compreende cerca de 4-25 nucleotideos, em que dita construção é tal que, no momento da introdução de dita construção em dita célula, dito precursor do ARNmi é transcrito como parte de um transcrito de dita sequência codificada mais longa que é processada de modo que dito precursor do ARNmi é excisado do mesmo, dito precursor do ARNmi é depois processado de modo que um ARNmi maduro com cerca de 21 ou 22 nucleotideos de comprimento é excisado de dito precursor do ARNmi, e é efetuada a inibição da expressão de dito gene.
7. 15. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que dito loop de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi compreende uma sequência correspondente a um ARNmi que ocorre naturalmente.
8. 16. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que a base de dito grampo de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi compreende uma região com bases emparelhadas com pelo menos 3 pares de bases de comprimento.
9. 17. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que dito promotor é um promotor baseado na polimerase II.
10. 18. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que dito ARNmi maduro induz a degradação de dito transcrito de ARN de dito gene. 4 ΕΡ1504126Β1
11. 19. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que dito grampo de dita estrutura de loop em grampo de dito precursor do ARNmi inclui pelo menos uma saliência.
12. 20. A célula de planta ou célula animal humana ou não humana isolada de acordo com a reivindicação 14 em que dita célula é uma célula de planta presente numa planta. Lisboa, 23 de Maio de 2014 5