PT2143792E

PT2143792E - Arn cíclico em cadeia simples, e método para a sua produção

Info

Publication number: PT2143792E
Application number: PT87643037T
Authority: PT
Inventors: Hidekazu Toyobuku; Hiroshi Abe; Yoshihiro Ito; Naoko Abe
Original assignee: Riken; Otsuka Pharma Co Ltd; Hayashi Kasei Co Ltd
Priority date: 2007-05-09
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2014-04-03
Also published as: CO6241167A2; CN101679962A; AR072034A1; ES2446040T3; TW200909577A; SI2143792T1; US20190292538A1; US20180073020A1; IL201975A0; MX2009011101A; CA2685994A1; IL201975A; CY1115283T1; RU2009145502A; BRPI0811440A2; JP2008278784A; UA101806C2; EP2143792A1; DK2143792T3; NZ581251A

Description

ΕΡ 2 143 792/ΡΤ

DESCRIÇÃO "ARN cíclico em cadeia simples, e método para a sua produção"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um ARN circular em cadeia simples, a um método de produção do ARN, e a uma composição farmacêutica compreendendo o ARN.

Anterioridade

Os métodos de interferência de ARN convencionais são geralmente classificados em dois grupos: um método utilizando ARN em cadeia dupla sintetizados quimicamente e um método utilizando vectores plasmídicos. 0 método de interferência de ARN que utiliza vectores plasmídicos é amplamente utilizado no campo da biotecnologia, principalmente em experiências básicas de biologia. Contudo, quando o método de interferência de ARN é aplicado ao desenvolvimento de preparações farmacêuticas, o método que utiliza vectores plasmídicos tem um problema de segurança para o corpo humano. Portanto, é provável que seja preferível a utilização dos ARN em cadeia dupla sintetizados quimicamente.

Contudo, existe o problema de que os ARN em cadeia dupla sintetizados quimicamente são instáveis in vivo, nomeadamente, susceptíveis a degradação por enzimas (nucleases) em células. Para resolver este problema, foram desenvolvidas cadeias de ARN com ácidos nucleicos não naturais de modo a melhorar a estabilidade dos ARN em cadeia dupla em células; contudo, existe um outro problema de que a sua actividade biológica se reduz enquanto a estabilidade é melhorada. Adicionalmente, a toxicidade causada por ácidos nucleicos não naturais é desconhecida. Portanto, permanece difícil conseguir a aplicação a preparações farmacêuticas.

As formas de um ARN em cadeia dupla utilizáveis para o método de interferência de ARN incluem um ARN em cadeia dupla possuindo extremidades lisas ou extremidades protuberantes, um ARN possuindo uma estrutura em "gancho de cabelo" (em inglês "hairpin") com uma ansa em cada extremidade do ARN em cadeia 2 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ dupla (JP2003-502012A) , um ácido nucleico circular que contém aproximadamente 19 pares de bases, duas ansas, e opcionalmente polinucleótidos quimicamente modificados (JP2006-271387A), e similares. Contudo, este ácido nucleico circular não é sujeito a testes para o efeito de interferência de ARN.

Em adição, é divulgado um ácido nucleico quimérico de ARN-ADN com formato de haltere (JP11-137260A(1999) ) . Este ácido nucleico não se destina a utilização em interferência de ARN. A porção de ARN do ácido nucleico com formato de haltere é clivada por uma enzima em células, e a resultante porção de ADN anti-sentido liga-se a um ARNm em células para o inibir. JP11-13726OA(1999) divulga que um ácido nucleico possui uma resistência elevada a enzimas que degradam ácido nucleico em células e permanece estável em células até a ribonuclease H actuar, devido à sua estrutura com formato de haltere. Divulga também que, como um oligonucleótido de cadeia simples contendo a porção de ADN anti-sentido apenas pode ser libertado no citoplasma das células após clivagem da porção de ARN complementar com o efeito de ribonuclease H, crê-se que o efeito anti-sentido por dose é aumentado.

Adicionalmente, relativamente ao método de síntese de um ácido nucleico circular possuindo uma estrutura com formato de haltere, por exemplo, é divulgado que são sintetizados oligonucleótidos lineares, são formadas uma região de haste e uma região de ansa em "gancho de cabelo" para obter um oligonucleótido com formato de haltere cortado, em que um local do oligonucleótido circular alvo com formato de haltere (a extremidade oposta da região de ansa em "gancho de cabelo" anterior) não é ligada, e a extremidade 5' é ligada a uma ligase para preparar um ácido nucleico circular com formato de haltere (JP11-137260(1999)). É um objecto da presente invenção proporcionar um ARN circular em cadeia simples e um método para a sua produção.

Divulgação da Invenção

Os presentes inventores verificaram agora que, surpreendentemente, um ARN circular em cadeia simples pode ser obtido com um alto rendimento sintetizando separadamente uma cadeia de sentido directo e uma cadeia anti-sentido, ambas 3 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ compreendendo uma sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados em cada extremidade, e deixando ligase actuar sobre os nucleótidos em ambas as extremidades simultaneamente, e que o ARN circular em cadeia simples obtido exerce um efeito de interferência de ARN sustentado ou de libertação lenta. Com base nestas verificações científicas, os presentes inventores realizaram a presente invenção.

Mais especificamente, a presente invenção inclui o seguinte: (1) Um ARN circular em cadeia simples possuindo um efeito de interferência de ARN sustentado ou de libertação lenta, caracterizado por o ARN circular em cadeia simples compreender uma sequência de cadeia de sentido directo, uma sequência de cadeia anti-sentido complementar à sequência de cadeia de sentido directo, duas sequências de ansa, idênticas ou diferentes, entre a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido, que ligam as duas cadeias, em que a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido estão emparelhadas formando uma haste, e em que cada uma das duas sequências de ansa possui 6 a 9 nucleótidos de comprimento. (2) 0 ARN circular em cadeia simples de acordo com (1) acima, em que a expressão de um ARN alvo é 0,4 ou menos, 24 horas após a introdução do ARN circular em cadeia simples em células eucariotas, comparativamente com células de controlo cujo nível de expressão do ARN alvo é estabelecido como 1. (3) O ARN circular em cadeia simples de acordo com (1) ou (2) acima, do qual 70% ou mais são retidos após 8 horas em soro humano. (4) Um método de produção do ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma de (1) a (3) acima, compreendendo a síntese de uma cadeia de sentido directo e uma cadeia anti-sentido, ambas compreendendo uma sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' e na extremidade 3', e simultaneamente a ligação do nucleótido na extremidade 5' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo, ao nucleótido na extremidade 3' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na 4

ΕΡ 2 143 792/PT cadeia anti-sentido, e vice versa, utilizando uma ligase, em que a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia de sentido directo e a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia anti-sentido estão ligadas uma à outra para formar uma ansa, a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia de sentido directo e a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia anti-sentido estão ligadas uma à outra para formar uma ansa, e a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido estão emparelhadas formando uma haste. (5) 0 método de acordo com (4) acima, compreendendo ainda a fosforilação de cada extremidade 5' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo e da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido. (6) 0 método de acordo com (4) ou (5) acima, em que as sequências de ansa são idênticas, ou diferentes uma da outra. (7) 0 método de acordo com qualquer um de (4) a (6) acima, em que o comprimento da haste é de 19 a 31 nucleótidos. (8) Um método de supressão da expressão de um gene que codifica uma proteína in vitro, compreendendo a introdução do ARN circular em cadeia simples, de acordo com qualquer um de (1) a (3) acima, em células derivadas do ser humano, e o corrompimento de um ARN alvo pelo ARN circular em cadeia simples para inibir a tradução do ARN alvo na proteína de uma maneira sustentada. (9) Um método de supressão da expressão de um gene que codifica uma proteína, compreendendo a introdução in vitro do ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer um de (1) a (3) acima, em células de um animal não humano ou de plantas, e o corrompimento de um ARN alvo pelo ARN circular em cadeia simples para inibir a tradução do ARN alvo na proteína de uma maneira sustada. (10) Uma composição farmacêutica compreendendo o ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma de (1) a (3) acima, como ingrediente activo. 5 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ

Como aqui se utiliza, a expressão "ARN circular em cadeia simples" pode ser referida como ARN com formato de haltere. Um ARN com formato de haltere ARN refere-se a um ARN circular em cadeia simples, em que uma cadeia de sentido directo e uma cadeia anti-sentido estão emparelhadas por complementaridade para formar uma haste, são formadas ansas em ambos os lados da haste por uma sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados, e o formato global do ARN circular em cadeia simples é o de um haltere.

De acordo com a presente invenção, o ARN sintético com formato de haltere, que é excelente em estabilidade, sustentabilidade e propriedade de libertação lenta, pode ser produzido eficientemente.

Em particular, o ARN com formato de haltere para utilização no método de interferência de ARN pode ser produzido por ciclização de duas cadeias de ARN. Como ambas as extremidades estão fechadas num formato de ansa, não possui extremidade de ARN e portanto não é provável que sirva como substrato para enzimas, exonuclease (ARNase) e similares, excepto quanto a enzimas específicas tais como Dicer, em células. Assim, é menos susceptível a degradação enzimática e tem uma estabilidade significativamente aumentada na célula. Como resultado, não há necessidade de utilizar ácidos nucleicos não naturais para melhorar a estabilidade.

Adicionalmente, o ARN com formato de haltere é especificamente reconhecido por enzimas in vivo tais como Dicer em células, e as regiões de ansa de ambos os lados são clivadas para formar um ARN em cadeia dupla de tipo de ocorrência natural (Figura 1). Como resultado, pode ter actividade equivalente à de um ARN em cadeia dupla, e exerce um efeito mais sustentável ou de libertação lenta do que o efeito de interferência de ARN pelos ARN em cadeia dupla convencionais. 0 ARN com formato de haltere da presente invenção é também mais estável do que os ARN em cadeia dupla convencionais em soro humano. 6 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma vista esquemática do ARN com formato de haltere da presente invenção. A Figura 2 mostra a estrutura dos ARN e uma imagem de electroforese de cada ARN. A Figura 3 mostra a estrutura de ARNip e de ARN com formato de haltere. A Figura 4 mostra imagens de electroforese dos ARN com formato de haltere e dos ARN em cadeia dupla lineares clivados por Dicer. A Figura 5 mostra um efeito de interferência de cada ARN com formato de haltere 24 horas após a transfecção. A Figura 6 mostra um efeito de interferência de ARN sustentável do ARN com formato de haltere. A Figura 7 mostra a estabilidade do ARN com formato de haltere em soro humano.

Melhor Modo para a Realização da Invenção 0 ARN circular em cadeia simples da presente invenção inclui uma sequência de cadeia de sentido directo homóloga da sequência de nucleótidos de um ARN alvo ou uma sua parte, uma sequência de cadeia anti-sentido que é complementar à sequência de cadeia de sentido directo e é capaz de emparelhar com ela, e sequências de ansa que não podem formar emparelhamentos entre as cadeias. A cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido são emparelhadas para formar uma haste. 0 comprimento da haste, não limitado especificamente, pode ser determinado dependendo do tipo, estrutura, ou similares, de um ARN alvo. Por exemplo, a haste é composta por 19 a 31 pares de bases, preferivelmente 21 a 25 pares de bases, mais preferivelmente 22 a 24 pares de bases, e ainda mais preferivelmente 23 pares de bases. 7 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ

As sequências nucleotídicas com nucleótidos desemparelhados estão presentes na extremidade 5' e na extremidade 3' tanto da cadeia de sentido directo como da cadeia anti-sentido. 0 nucleótido na extremidade 5' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo e o nucleótido na extremidade 3' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido estão ligados formando uma ansa. 0 nucleótido na extremidade 3' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo e o nucleótido na extremidade 5' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido estão ligados formando uma ansa. 0 comprimento da ansa é de 6 a 9 bases. Portanto, a totalidade do ARN circular em cadeia simples é preferivelmente composta por 42 a 80 bases.

Quando a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia de sentido directo é representada por A, a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia anti-sentido é representada por B, a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia de sentido directo é representada por C, e a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia anti-sentido é representada por D, por exemplo, se o comprimento da ansa é de 20 bases, então A tem 1 a 19 bases de comprimento, B tem 19 a 1 bases de comprimento, C tem 19 a 1 bases de comprimento, e D tem 1 a 19 bases de comprimento. Portanto, o nucleótido na extremidade 5' de A e o nucleótido na extremidade 3' de B estão ligados formando uma ansa de 20 bases, e o nucleótido na extremidade 3' de C e o nucleótido na extremidade 5' de D estão ligados formando uma ansa de 20 bases. Embora ansas de 20 bases não façam parte da presente invenção, aplica-se o mesmo principio a ansas de 6 a 9 bases. É preferível que as sequências, que não podem formar emparelhamentos umas com as outras, variem de comprimento entre A e B, e entre C e D, por exemplo, em 1 base, 2 bases ou 3 bases ou, alternativamente, que as sequências tenham o mesmo comprimento. Portanto, por exemplo, quando o comprimento da ansa é de 8 bases, é preferível que A tenha 3 a 5 bases de comprimento, B tenha 5 a 3 bases de comprimento, C tenha 5 a 8 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ 3 bases de comprimento e D tenha 3 a 5 bases de comprimento. Quando o comprimento da ansa é de 9 bases, é preferível que A tenha 3 a 6 bases de comprimento, B tenha 6 a 3 bases de comprimento, C tenha 6 a 3 bases de comprimento e D tenha 3 a 6 bases de comprimento.

Em adição, as sequências de nucleótidos da ansa formada por A e B e da ansa formada por C e D, podem ser idênticas ou diferentes. O ARN circular em cadeia simples da presente invenção pode ser utilizado para o método de interferência de ARN. A interferência de ARN é também conhecida como iARN (em inglês, RNAi), e é um fenómeno em que uma molécula de ARN pequena possuindo uma sequência complementar a um ARN alvo se liga ao ARN alvo, desse modo degradando o ARN alvo ou suprimindo a tradução do ARN alvo. A cadeia anti-sentido do ARN com formato de haltere possui uma sequência complementar a um ARN alvo (por exemplo, ARNm ou o ARN seu precursor). Adicionalmente, as sequências nucleotídicas com nucleótidos desemparelhados incluem, mas não se lhes limitam, UUCAAGAGA e UGUGCUGUC (M. Miyagishi et al., Oligonucleotides 2003, Vol. 13: pp. 1-7).

Além disso, a ansa no ARN com formato de haltere pode ser quimicamente modificada. Por exemplo, a estabilidade in vivo do ARN com formato de haltere pode ser melhorada através da modificação com polietilenoglicol cujo peso molecular é de aproximadamente 2000 a 5000. A ansa do ARN com formato de haltere é clivada por uma enzima do tipo Dicer em células para ser removida. Portanto, crê-se que o polietilenoglicol tem pouco efeito quando a haste exerce o seu efeito de interferência de ARN como ARNip ou ARNmi (em inglês, siRNA ou miRNA).

Com o ARN com formato de haltere da presente invenção, a expressão de um ARN alvo em células, em que o ARN com formato de haltere foi introduzido, é preferivelmente de 0,4 ou menos, 24 horas após a introdução do ARN com formato de haltere nas células, comparativamente com células de controlo (sem o ARN 9 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ com formato de haltere introduzido) cujo nível de expressão do ARN alvo é estabelecido como 1.

De acordo com a presente invenção, as células são células eucariotas, preferivelmente células animais e células vegetais. A expressão de um ARN alvo pode ser confirmada por, por exemplo, transformação das células com um gene repórter (e.g., o gene da luciferase, da -galactosidase, da -glucuronidase ou da proteína verde fluorescente (GFP)), e medição da coloração ou da fluorescência da proteína derivada do gene repórter para examinar o nível de inibição da expressão de um ARN alvo pelo ARN com formato de haltere, em que o ARNm do gene repórter pode ser utilizado como ARN alvo.

Adicionalmente, o ARN com formato de haltere da presente invenção é caracterizado por 70% ou mais serem retidos sem serem degradados após 8 horas em soro humano. Por exemplo, isto pode ser confirmado por incubação do ARN com formato de haltere em soro humano e medição do peso molecular utilizando electroforese ou similares, para testar se é degradado ao longo do tempo. O método de produção do ARN circular em cadeia simples com formato de haltere da presente invenção inclui a síntese de uma cadeia de sentido directo e de uma cadeia anti-sentido, ambas compreendendo uma sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' e na extremidade 3', e que ligam simultaneamente o nucleótido na extremidade 5' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo, ao nucleótido na extremidade 3' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido, e vice versa, utilizando uma ligase. A cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido podem ser desenhadas para suprimir a função de um gene alvo, com base na sequência de nucleótidos do gene alvo. Os desenhos podem ser confirmados produzindo múltiplas cadeia de sentido directo e anti-sentido e testando para cada uma a eficiência da supressão. Por exemplo, pode ser aplicado o desenho utilizando um algoritmo para o desenho de ARNip ou similar 10 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ (Referências: J.A. Jaeger et al., Methods in Enzymology (1989) 183: 281-306; D.H. Mathews et al., J. Mol. Biol. (1999) 288: 911-940). Aquando do desenho, é preferível que as cadeias não suprimam a expressão de genes que não de um gene alvo, os genes possuindo sequências similares ao gene alvo (o que é conhecido como efeito de alvos alternativos ("off-target"). Os comprimentos das cadeias de sentido directo e anti-sentido são preferivelmente desenhados na gama de, por exemplo, 19 a 31 bases, preferivelmente 21 a 25 bases, mais preferivelmente 22 a 24 bases, e ainda mais preferivelmente 23 bases. O gene alvo inclui, mas não se lhes limita, o gene abl/bcr para leucemia, o gene VEGF para degenerescência macular relacionada com a idade e o gene HCV para a hepatite.

Uma sequência que subsequentemente forma uma ansa, por exemplo a sequência UUCAAGAGA acima, é dividida em dois fragmentos numa posição arbitrária para formar uma sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados (em que a sequência tem 9 bases, e quando dividida em dois fragmentos, como descrito acima, a diferença de comprimento está preferivelmente na gama de 1 a 3 bases) . Uma sequência é desenhada de modo a que um fragmento esteja ligado à extremidade 3' da cadeia anti-sentido, e o outro esteja ligado à extremidade 5' da cadeia de sentido directo. Através do mesmo método, é desenhada outra sequência de modo a que um fragmento esteja ligado à extremidade 3' da cadeia de sentido directo, e o outro esteja ligado à extremidade 5' da cadeia anti-sentido. Os ácidos nucleicos em cadeia simples possuindo estas duas sequências desenhadas são sintetizados separadamente. Ao fazer isto, é preferível realizar a fosforilação da extremidade 5' utilizando um reagente químico de fosforilação. Adicionalmente, o método da invenção requer o desenho de uma sequência para formar uma ansa, cujo comprimento seja de 6 a 9 bases.

Existem vários métodos para a síntese de ácidos nucleicos tais como o método de síntese da transcrição in vitro, métodos que utilizam plasmídeos ou vectores virais, e métodos que utilizam cassetes de PCR. Embora um método de síntese de ácidos nucleicos não seja especificamente limitado, um método de síntese química é preferido em termos de elevada pureza, 11 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ capacidade para produzir em grandes quantidade, segurança na utilização in vivo, capacidade de modificação química, e similares. Os exemplos de métodos de síntese química incluem, mas não se lhes limitam, o método do H-fosfonato e do fosforoamidito. Para este fim, podem ser utilizados sintetizadores automáticos de ácido nucleico comercialmente disponíveis.

As extremidades das sequências nucleotídicas com nucleótidos desemparelhados em ambas as extremidades da cadeia de sentido directo e da cadeia anti-sentido são ligadas com uma ligase (por exemplo, ARN-ligase de T4 ou ADN-ligase de T4) para formar duas ansas simultaneamente. As condições reaccionais incluem, por exemplo, incubação num tampão contendo polietilenoglicol (PEG), BSA e similares, durante 20 horas a uma temperatura baixa. O ARN circular em cadeia simples com formato de haltere sintetizado pode ser recolhido e purificado por métodos ordinários (por exemplo, cromatografia líquida de alta resolução e método de PAGE).

Adicionalmente, o ARN circular em cadeia simples pode ser quimicamente modificado com polietilenoglicol (PEG) ou similares, em que a modificação química é preferivelmente realizada na região da ansa. Para a ligação, ambas as extremidades de PEG são modificadas para introduzir um grupo funcional reactivo com os grupos amino nas bases, tais como um grupo formilo ou um grupo éster de N-hidroxissuccinimida. 0 método de interferência de ARN utilizando o ARN com formato de haltere produzido pelo método acima é aqui descrito adiante.

De acordo com a presente invenção, o ARN circular em cadeia simples da presente invenção pode ser introduzido em células in vitro e corromper um ARN alvo para inibir a tradução do ARN alvo numa proteína de uma maneira sustentada, em que células humanas ou células animais não humanas ou vegetais podem ser utilizadas como as células.

Quando o método de interferência de ARN é realizado in vitro, o ARN com formato de haltere é introduzido em células, por exemplo, através do método de electroporação, do método de 12 ΕΡ 2 143 792/PT micro-injecção, do método de lipofecção ou de transfecção com fosfato de cálcio. 0 ARN com formato de haltere introduzido em células é clivado por Dicer nas células para gerar um ARN em cadeia dupla (ARNip) que possui um efeito de interferência de ARN (Figura 1). As extremidades do ARNip podem ser extremidades lisas ou extremidades protuberantes. 0 ARNip transforma-se em cadeia simples para formar um complexo ARN-nuclease (complexo de silenciamento induzido por ARN, ou, RISC, do inglês "RNA induced silencing complex), que reconhece um ARNm alvo possuindo uma sequência complementar ao ARNip, e degrada o ARNm alvo, desse modo suprimindo a expressão do gene alvo correspondente. 0 ARN circular em cadeia simples da presente invenção pode ser utilizado em quaisquer células vegetais, e células animais (por exemplo, humanas, de animais de estimação, mamíferos incluindo animais domésticos). São expectáveis amplas aplicações nos campos da medicina e da agricultura. Por exemplo, o ARN circular em cadeia simples da presente invenção pode ser utilizado para vários fins incluindo elucidação da função de um gene ou de uma proteína específicos em plantas ou animais, ou ao nível celular da planta ou do animal, utilizando por exemplo métodos de "knockout".

Em adição, a presente invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo o ARN circular em cadeia simples como ingrediente activo. A quantidade do ARN circular em cadeia simples formulado na composição farmacêutica pode ser ajustada de acordo com o tipo e a finalidade da composição. Por exemplo, a quantidade do ARN inclui, mas não se lhes limita, 1% em peso, 3% em peso, 5% em peso, 10% em peso, 20% em peso, 30% em peso, 40% em peso, 50% em peso, 60% em peso, 70% em peso, 80% em peso, 90% em peso ou 100% em peso relativamente à quantidade total da composição.

Os exemplos da composição farmacêutica da presente invenção incluem preparações líquidas (tais como uma solução, uma suspensão, uma emulsão) , preparações sólidas (tais como 13 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ uma preparação criodessecada susceptível de ser reconstituída antes do uso), preparações encapsuladas em lipossomas (preferivelmente, lipossomas catiónicos). Em adição, a via de administração preferida é uma administração parentérica, que inclui, por exemplo, administração local por aplicação da preparação directamente nu local afectado, administração pulmonar, administração transmucosa tal como administração nasal, e administração intravenosa. A composição farmacêutica da presente invenção pode incluir excipientes (solução salina, água esterilizada, solução de Ringer e similares), agentes tamponantes, agentes de tonicidade, agentes estabilizantes, e similares, dependendo das formulações ou das formas de dosagem.

Adicionalmente, a dosagem da composição farmacêutica da presente invenção pode variar dependendo do sexo, peso, idade, gravidade, sintomas, ou similares, de um paciente. A composição farmacêutica da presente invenção é aplicável, por exemplo, ao tratamento de doenças tais como cancros (e.g., supressão de funções de genes ou proteínas que são especificamente expressos em células cancerosas). A presente invenção será adiante adicionalmente descrita especificamente através dos seguintes exemplos. Contudo, deverá entender-se que o âmbito da presente invenção não está limitado aos exemplos específicos.

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de um ARN com formato de haltere

Os ARN 5'-fosforilados que servem como matéria-prima para os ARN com formato de haltere foram todos sintetizados num sintetizador de ADN (GeneWorld H8-SE) de acordo com o método do fosforoamidito. Utilizaram-se TBDMS protegidos (Proligo Corp.) para amiditos de ARN, e utilizou-se o Chemical Phosphorilation Reagent (Glen Research Corp.) para a 5'-fosforilação. A desprotecção foi realizada através do método ordinário, seguida de purificação por PAGE. As sequências do ARN sintetizado estão apresentadas em SEQ ID NO: 1 (cadeia de sentido directo, 28 mero), SEQ ID NO: 2 14 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ (cadeia anti-sentido, 28 mero), SEQ ID NO: 3 (56 mero), e na

Figura 2. Adicionalmente, nas sequências de ARN apresentadas na Figura 2, as sequências sublinhadas são sequências que formam a região de ansa de um ARN com formato de haltere.

Subsequentemente, a reacção enzimática foi realizada na mistura de ARN em cadeia dupla 2 μΜ, ARN-ligase de T4 a 2,0 unidades/μΐ, BSA a 0, 006%, PEG6000 a 25%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM e ATP 1 mM num volume total de 25 μΐ.

Mais especificamente, primeiro, o ARN em cadeia dupla 5'-fosforilado foi dissolvido em 12,5 μΐ de um tampão (tampão 2 x) contendo Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), MgCl2 20 mM, DTT 20 mM e ATP 2 mM, numa concentração de 4 μΜ. A solução foi aquecida a 65°C durante 5 minutos, e depois foi lentamente arrefecida à temperatura ambiente. Subsequentemente, adicionaram-se a solução de BSA, a solução de PEG6000 e a ARN-ligase de T4 (Takara Bio Inc.) para formar a composição e o volume reaccional acima. A solução foi então incubada a 11°C durante 20 horas. O ARN foi recolhido por precipitação em etanol e analisado por PAGE.

As amostras em cada pista de PAGE na Figura 2 são como se segue.

Pista 1: mistura da cadeia de sentido directo de 28 bases e da cadeia anti-sentido de 28 bases (marcador)

Pista 2: ARN de 57 bases (marcador)

Pista 3: ARN com formato de haltere formado a partir da cadeia de sentido directo de 28 bases e da cadeia anti-sentido de 28 bases

Pista 4: ARN com formato de haltere formado a partir de 56 bases (cadeia simples)

Pista 5: cadeia de sentido directo de 28 bases tratada com ARN-ligase (referência)

Pista 6: cadeia anti-sentido de 28 bases tratada com ARN-ligase (referência) O ARN com formato de haltere na Pista 4 foi produzido por síntese de uma cadeia simples possuindo 56 bases (SEQ ID NO: 3), formação de uma região de haste e uma região de ansa 15 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ em "gancho de cabelo", e ligação do primeiro nucleótido e do último nucleótido com ligase de T4. A banda circundada por um circulo na Pista 3 representa o ARN com formato de haltere produzido pelo método da presente invenção, e o rendimento foi de aproximadamente 80%. O ARN com formato de haltere na Pista 4 teve um rendimento de aproximadamente 5% ou menos.

Exemplo 2: Exame do comprimento da haste do ARN com formato de haltere

Os ARN representados pelas SEQ ID NO: 4 a 13 foram sintetizados através do sintetizador de ADN anterior. As SEQ ID NOS: 4 e 5 formam um ARN em cadeia dupla que forma 18 pares de bases (siRNA-1), SEQ ID NOS: 6 e 7 forma um ARN com formato de haltere cujo comprimento de haste é de 19 bases (Db-19), SEQ ID NOS: 8 e 9 formam um ARN com formato de haltere cujo comprimento de haste é de 23 bases (Db-23), SEQ ID NOS: 10 e 11 formam um ARN com formato de haltere cujo comprimento de haste é de 27 bases (Db-27) , e SEQ ID NOS: 12 e 13 formam um ARN com formato de haltere cujo comprimento de haste é de 31 bases (Db-31) (Figura 3).

Foi realizada uma reacção enzimática na composição de ARN em cadeia dupla 2 μΜ, ARN-ligase de T4 a 1,0 unidades/μΐ, BSA a 0,006%, PEG6000 a 25%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM e ATP 1 mM num volume reaccional que varia de 1,5 a 2,5 ml.

Mais especificamente, o ARN em cadeia dupla 5'- fosforilado foi dissolvido num tampão (tampão 2 x, metade da quantidade da solução reaccional final) contendo Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), MgCl2 20 mM, DTT 20 mM e ATP 2 mM, numa concentração de 4 μΜ. Aqueceu-se a solução a 65°C durante 5 minutos e depois arrefeceu-se lentamente à temperatura ambiente. Subsequentemente, adicionaram-se a solução de BSA, a solução de PEG6000 e a ARN-ligase de T4 (Takara Bio Inc.) para formar a composição e o volume reaccional acima. A solução foi então incubada a 11°C durante 20 horas. 0 ARN foi recolhido por precipitação em álcool a partir da solução reaccional, e os produtos ciclizados foram isolados 16 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ utilizando PAGE. As bandas contendo os alvos foram visualizadas pelo método de sombreamento de UV ("UV Shadowing", excisadas, esmagadas em pequenos pedaços, e extractadas 3 vezes com 4 ml de um tampão de eluição (NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM (pH 8,0)). O extracto foi dessalinizado com um cartucho Sep-Pak (eluído com 6 ml de acetonitrilo a 50% em água), condensado com um evaporador centrífugo, e adicionalmente submetido a precipitação em álcool na presença de acetato de amónio. Os alvos foram quantificados por medição dos espectros UV.

Adicionaram-se duas unidades de ColdShock-DICER (Takara Bio Inc.) a 2 pg de cada um dos ARN com formato de haltere anteriores num tampão contendo Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), NaCl 150 mM e MgCl2 2,5 mM (volume reaccional: 20 μΐ), e incubou-se depois a solução resultante a 37°C. Após 1, 6 e 18 horas, recolheram-se 3 μΐ da solução reaccional para amostra. Cada amostra foi misturada com 2 μΐ de solução de EDTA 120 mM para terminar a reacção enzimática. Estas foram então analisadas por PAGE nativa (PAGE a 10%, TBE 1 x) (depois de serem coradas com SYBR Green I 1 x, foram obtidas imagens das amostras e estas foram quantificadas num BioRad Molecular Imager FX). A Figura 4 mostra a PAGE de cada ARN com formato de haltere. Como controlo, foi examinada uma reacção de clivagem utilizando como substrato o ARN em cadeia dupla antes de da reacção de formação do haltere, pelo mesmo método. Como resultado, a reacção de clivagem de Db-19 prosseguiu aproximadamente 5% após 1 hora, e foi confirmada a produção de ARN em cadeia dupla de 20 bases de comprimento. Os fragmentos de clivagem de Db-19 na gama de 20 bases mantinham quase o mesmo nível de concentração após 6 e 18 horas. Pelo contrário, quase 100% do controlo incluindo a cadeia linear de 19 pares de bases (Linear) foram clivados após 1 hora, e foram observados os ARN em cadeia dupla de 20 bases de comprimento. Subsequentemente, os ARN em cadeia dupla do produto foram degradados e desapareceram ao longo do tempo. Com Db-23, foram clivados aproximadamente 8% após 1 hora, e foram produzidos ARN em cadeia dupla de 20 bases de comprimento. Confirmou-se que à medida que o comprimento de haste aumenta, a velocidade da clivagem após 1 hora aumenta para 10% e 20% em Db-27 e Db-31, respectivamente. Após 18 horas, aproximadamente 75% de Db-19 permanecem intactos enquanto o Db-31 desapareceu 17 ΕΡ 2 143 792/PT completamente. A partir destes resultados, foi revelado que os ARN com formato de haltere com comprimento de haste mais curto são mais estáveis contra uma enzima.

Exemplo 3: efeito de interferência de ARN do ARN com formato de haltere 0 efeito de interferência de ARN dos ARN com formato de haltere anteriores (Db-19, Db-23, Db-27 e Db-31) foi avaliado numa experiência de inibição da expressão do gene repórter de luciferase de pirilampo, pGL3.

Cultivaram-se células NIH 3T3 (Riken Cell Bank) em meio DMEM (GIBCO) contendo FCS a 10% a 37°C em C02 a 5%, e uma aliquota de 100 μΐ da cultura foi inoculada em cada poço de uma placa de 96 poços numa concentração de 1,6 x 104 células/poço. A amostra foi adicionalmente cultivada a 37°C em 5% de C02 durante 39 horas para originar aproximadamente 70% de confluência. As células foram então co-transfectadas com 2 tipos de vectores plasmidicos (pGL3-Control e pRL-TK (como padrão interno), da Promega Corp.) e cada tipo de ARN, utilizando o reagente de transfecção GeneSilencer (Genlantis Inc.) de acordo com o protocolo afixado ao reagente de transfecção. As condições de concentração no momento da transfecção são as seguintes. 0,2 pg de pGL3-Control/ 0,02 pg de pRL-TK/ 25 nM de ARN (Volume Final de 100 pl)

GeneSilencer 1 pl Meio DMEM 25 pl solução diluída de ARNip 2,5 pl Meio DMEM 15 pl ARN (5 pmol/pl) 0,5 pl pGL3-Control (1 pg/pl) 0,2 pl pRL-TK (0,1 pg/pl) 0,2 pl 44,4 pl

Após a transfecção, a cultura foi incubada a 37°C em 5% de C02 durante 4 horas. Adicionaram-se então a cada poço 100 pl de meio DMEM contendo 20% de soro. Após incubação 18 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ adicional a 37°C durante 20 horas, as células foram solubilizadas para quantificar o nivel de expressão de luciferase utilizando o sistema de ensaio de repórter Dual-luciferase Repórter Assay System (Promega Corp.) de acordo com o protocolo afixado (Condições: a quantidade de reagente: 30 μΐ, tempo de atraso: 2 segundos, tempo de leitura: 10 segundos. Equipamento: Wallac ARVO SX 1420 Multilabel Counter).

Para comparação, avaliou-se um controlo (apenas tampão) pelo mesmo método. A intensidade de fluorescência da luciferase de pirilampo foi corrigida para a intensidade de fluorescência da luciferase de Renilla como padrão interno. Os resultados estão mostrados na Figura 5. Após 24 horas, entre os ARN com formato de haltere, o Db-23 apresentou a maior actividade, e exibiu um efeito de inibição de apenas 0,24. A partir destes resultados, o comprimento mais preferido para a cadeia dupla foi estabelecido em 23 bases.

Exemplo 4: Sustentabilidade do efeito de interferência de ARN

Comparou-se a sustentabilidade do efeito de interferência de ARN de Db-23 e de siRNA-1.

Cultivaram-se células NIH 3T3 em Meio de Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Invitro/Gibco) numa câmara humidificada com 5% de CO2. 40 horas antes da transfecção, semearam-se células 70% confluentes em placas de 96 poços a uma densidade de 1.6 x 104 células por poço (100 μΐ). A co-transfecção de plasmídeos repórter e ARN foi realizada com GeneSilencer (Gene Therapy Systems, Inc.) como descrito pelo fabricante para linhas celulares aderentes. Por poço, aplicaram-se 16 ng/μΐ ou

1.6 ng/μΐ de pGL3-Control (Promega Corp.), 1,6 ng/μΐ de pRL-TK (Promega Corp.) e 25 nM de ARN formulado com o reagente de transfecção (100 μΐ) . Após 4 h de incubação, adicionaram-se 100 μΐ de FCS a 2 0% em DMEM. Para uma incubação prolongada mais longa o que 3 dias, o meio foi substituído conforme necessário. A expressão da luciferase foi monitorizada após 24 horas, 72 horas e 120 horas com o sistema de ensaio de repórter Dual-Luciferase Repórter Assay System (Promega Corp.) de acordo com as instruções fornecidas no contador Wallac ARVO 19 ΕΡ 2 143 792/ΡΤ SX 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer, Inc.) (Fig. 6). Utilizou-se uma amostra sem ARN como controlo. O Db-23 e o siRNA-1 apresentaram ambos um nível quase igual de actividade de luciferase após 24 horas. Contudo, após 120 horas, o Db-23 apresentava um efeito de supressão da expressão génica superior. A partir destes resultados, foram demonstrados tanto o efeito de libertação lenta como o efeito de activação de longa duração do ARN com formato de haltere.

Exemplo 5: Estabilidade do ARN com formato de haltere em soro humano

Foi comparada a estabilidade de Db-23 e de ARNip em soro humano. Misturaram-se 4 μΐ de ARNcd pré-hibridado (siRNA-1, 20 μΜ) ou ARN com formato de haltere (Db-23, 20 μΜ) em tampão de hibridação (acetato de potássio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM (pH 7,4), acetato de magnésio 2 mM), com 32 μΐ de PBS, 4 μΐ de Soro Humano Normal (Chemicon International, Inc.), e incubou-se a 37°C. Tomaram-se alíquotas (5 μΐ) após 0,5, 1, 1,5, 3, 8 e 20 horas. A reacção foi analisada por PAGE a 15% nativa, corou-se com SYBR Green I e visualizou-se com Molecular Imager FX (BioRad Laboratories, Inc.).

Como resultado, até 50% de ARNip foram degradados após 3 horas, enquanto 80% ou mais de Db-23 permaneciam ainda após 3 horas, e 70% ou mais mesmo após 8 horas. Portanto, pode ser esperada uma alta estabilidade de Db-23 in vivo.

Aplicabilidade Industrial A presente invenção pode ser utilizada como molécula de ácido nucleico aplicável a organismos vivos e pode produzir a molécula com elevado rendimento. 20

ΕΡ 2 143 792/PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> RIKEN

Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

Hayashi Kasei Co., Ltd. produção <120> ARN circular em cadeia simples e método para a sua

<130> PH-3542PCT <150> JP 2007-125045 <150> 2007-05-09 <160> 13 <170> Patentln version 3.4 <210 > 1 <211> 28 <212> ARN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 1 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaa 28 <210> 2 <211> 28 <212> ARN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 2 gagaucgaag uacucagcgu aaguucaa 28 <210> 3 <211> 56 <212> ARN <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 3 gagacuuacg cugaguacuu cgauucaaga gaucgaagua cucagcguaa guucaa <210> 4 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 4 gugcgcugcu ggugccaacu u 21 56 21

ΕΡ 2 143 792/PT <2 10 > 5 <2 11 > 21 <2 12 > ARN <2 13 > Artificial <2 20 > <2 23 > Sintético <4 00 > 5 guuggcacca gcagcgcacu u 21 <210> 6 <211> 28 <212> ARN <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 6 28 gagagugcgc ugcuggugcc aacuucaa 28 <210> 7 <211> 28 <212> ARN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 7 28 gagaguuggc accagcagcg cacuucaa 28 <210> 8 <211> 32 <212> ARN <213> Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 8 32 gagaagugcg cugcuggugc caacccuuuc aa 32 <210> 9 <211> 32 <212> ARN <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 9 gagaagggug ggcaccagca gcgcacuuuc aa 32 <210 > 10 <211> 36 <212> ARN <213> Artificial 22

ΕΡ 2 143 792/PT <220> <223> Sintético <400> 10 gagaaaagug cgcugcuggu gccaacccua uuucaa 36 <210 > <211 > 11 36 <212> <213> ARN Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 11 gagaauaggg uuggcaccag cagcgcacuu uuucaa 36 <210 > <211> <212> <213> 12 40 ARN Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 12 gagaucaaag ugcgcugcug gugccaaccc uauucuucaa 40 <210> <211 > <212> <213> 13 40 ARN Artificial <2 2 0 > <223> Sintético <400> 13 gagagaauag gguuggcacc agcagcgcac uuugauucaa 40

Lisboa, 2014-03-27

Claims

ΕΡ 2 143 792/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. ARN circular em cadeia simples possuindo um efeito de interferência de ARN sustentado ou de libertação lenta, caracterizado por o ARN circular em cadeia simples compreender uma sequência de cadeia de sentido directo, uma sequência de cadeia anti-sentido complementar à sequência de cadeia de sentido directo, duas sequências de ansa idênticas ou diferentes entre a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido, que ligam as duas cadeias, em que a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido estão emparelhadas formando uma haste, e em que cada uma das duas sequências de ansa possui 6 a 9 nucleótidos de comprimento.
2. ARN circular em cadeia simples de acordo com a reivindicação 1, em que a expressão de um ARN alvo é de 0,4 ou menos, 24 horas após a introdução do ARN circular em cadeia simples em células eucariotas, comparativamente com células de controlo cujo nível de expressão do ARN alvo é estabelecido como 1.
3. ARN circular em cadeia simples de acordo com a reivindicação 1 ou 2, do qual 70% ou mais são retidos após 8 horas em soro humano.
4. Método de produção do ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo a síntese de uma cadeia de sentido directo e de uma cadeia anti-sentido, ambas compreendendo uma sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' e na extremidade 3', e a ligação simultânea do nucleótido na extremidade 5' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo, com o nucleótido na extremidade 3' da sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido, e vice versa, utilizando uma ligase, em que a sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia de sentido directo e a sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia anti-sentido estão ligadas uma à outra formando uma ansa, a sequência nucleotídica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 3' da cadeia de ΕΡ 2 143 792/ΡΤ 2/2 sentido directo e a sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na extremidade 5' da cadeia anti-sentido estão ligadas uma à outra formando uma ansa, e a cadeia de sentido directo e a cadeia anti-sentido estão emparelhadas formando uma haste.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo adicionalmente a fosforilação de cada extremidade 5' da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia de sentido directo e da sequência nucleotidica com nucleótidos desemparelhados na cadeia anti-sentido.
6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que as sequências de ansa são idênticas ou diferentes uma da outra.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que o comprimento de haste é de 19 a 31 nucleótidos.
8. Método de supressão da expressão de um gene que codifica uma proteína, in vitro, compreendendo a introdução do ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em células derivadas do ser humano, e o corrompimento de um ARN alvo pelo ARN circular em cadeia simples para inibir a tradução do ARN alvo na proteína de uma maneira sustentada.
9. Método de supressão da expressão de um gene que codifica uma proteína, compreendendo a introdução in vitro do ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em células de um animal não humano ou vegetais, e o corrompimento de um ARN alvo pelo ARN circular em cadeia simples para inibir a tradução do ARN alvo na proteína de uma maneira sustentada.
10. Composição farmacêutica compreendendo o ARN circular em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como ingrediente activo. Lisboa, 2014-03-27