KR20130122632A - Clec-2의 핵산 모듈레이터 - Google Patents

Clec-2의 핵산 모듈레이터 Download PDF

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줄리아나 엠. 레이저
산조이 케이. 마한티
사무엘 씨. 울프
캐서린 씨. 레딕
크리스토퍼 피. 루스코니
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레가도 바이오사이언스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CLEC-2와 결합하고 CLEC-2의 작용을 조절하는 리간드를 제공한다. 여기에 기술된 핵산 CLEC-2 리간드는 CLEC-2 매개 혈소판 응집을 저해할 수 있으며, 또한 혈전 형성, 종양 전이, 림프관 신생, HIV 전염, 염증성 반응, 사이토카인 생성 및 식세포작용 같은 CLEC-2 매개 과정을 조절하는 용도를 제공한다. 또한, 본 발명에서는 시험관 내 및 생체 내 및 생체 외 모두에서 CLEC-2 리간드의 활성을 가역할 수 있는 모듈레이터 분자를 기술하였다.

Description

CLEC-2의 핵산 모듈레이터{NUCLEIC ACID MODULATORS OF CLEC-2}
관련 출원
본 출원은 2010년 10월 14일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/393,191호에 대하여 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 참조로 여기에 포함되었다.
기술분야
본 발명은, 일반적으로 CLEC-2 단백질의 활성과 결합하고 이를 조절하는 핵산 리간드를 포함하는 약리 시스템에 관한 것이다. 이 핵산 리간드는 또한 핵산 리간드의 활성을 저해하는 모듈레이터(modulator)를 사용하여 활성적으로 가역 (reversible)하여 그 약리적 효과를 중화하므로써 CLEC-2 작용을 회복한다. 본 발명은 또한 핵산 리간드 및/또는 모듈레이터를 포함하는 조성물뿐만 아니라 이러한 제제와 조성물을 CLEC-2 매개 장애를 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
최근에 C-타입 렉틴(lectin) 유사 수용체 2 (CLEC-2)가 생물정보학 방법을 사용하여 확인되었으며 혈소판 수용체로 인정되고 있다(O'Callaghan, C.A., Current Opinion of Pharmacology, 2009; 9:90-95.). CLEC-2는 세포외 C-타입 렉틴 유사 도메인 및 단일 hemITAM (면역수용체 티로신계 활성화 모티프) YXXL 모티프를 함유하는 짧은 세포질 도메인을 갖는 타입 2 막통관 단백질이다. 세포질 YXXL 모티프에서 티로신 7의 인산화는 Src 키나제의 활성화에서 리간드 결합으로 촉발되고, 다음으로 PLCγ2 같은 일련의 하향류(downstream) 시그널링 단백질을 인산화한다. CLEC-2와 상호작용하여 그의 생리적 신호전달 작용을 매개할 수 있는 자연적으로 발생한 2가지 단백질: 내생성 단백질 포도플라닌(podoplanin)과 뱀의 독 단백질 로도사이틴(rhodocytin)이 있으며, 이들은 모두 응집과 분비의 강한 자극을 포함한, 혈소판 활성화를 촉발한다. Inoue-Suzuki 등은 Kato와 협력하여 포도플라닌으로 유도된 혈소판 응집의 특성이 로도사이틴 유도성 혈소판 응집과 매우 유사하고 포도플라닌의 수용체인 CLEC-2를 동정한다고 보고하였다(Inoue-Suzuki, K.O. et. al., J. Thromb. Haemost. 2011; 9 (suppl 1): 44-55). 이들은 또한 로도사이틴으로 유도된 혈소판 응집이 CRP에 의해 유도된 혈소판 응집과 비교하여 TxA2 생성과 액틴(actin) 중합에 상당히 의존한다는 것을 입증하였다(Inoue, K. et. al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 256: 114-120). 로도사이틴과 포도플라닌은 모두 마이크로몰의 친화도로 CLEC-2와 직접 상호작용한다(Kato, Y. et. al., Cancer Sci, 2008; 99:54-61; Ozaki, Y, et.al., J. Throm. Hemost, 2008; 7.191-194). CLEC-2는 포도플라닌에 의해 종양세포에 결합하는 것으로 나타났으며, 마우스 실험 결과는 CLEC-2 시그널링이 종양 전이를 촉진할 수 있음을 시사하였다 (Watson, A. A., et al., Biochemistry, 2009; 48: 10988-10996).
CLEC-2는 또한 혈전 형성의 전파에서 생체 내 정상적 지혈 및 혈전증에 연관되어 있다(Spalton, J.C., J. Throm. Hemost, 2009; 7: 1192-1199; Watson, A.A., et al., Biochemistry, 2009; 48:10988-10996). 혈관벽 손상 시 상피하 세포외 매트릭스 단백질의 노출이 혈소판 활성화와 응집을 촉발한다. 최근, 항-CLEC-2 항체 처리가 순환하는 혈소판에서 수일 동안 단백질을 감소시키는 것이 마우스 실험에서 확인되었다. CLEC-2 결핍 마우스는 생체 외 및 생체 내에서 심각한 혈소판 응집물 형성을 보였다(May, F., et al., Blood, 2009; 114:3464-3472). 생체 외 및 생체 내의 유동 조건 하에서 혈전형성은 마우스의 CLEC-2가 결핍되었을 때 심각하게 결함이 생긴다. CLEC-2 결핍 마우스는 αIIbβ3 저해제 또는 GP1bα 저해제로 처리된 마우스와 비교하여 출혈시간에서 약간의 증가를 나타내었다(May, F., et al., Blood, 2009; 114:3464-3472; Kunicki, T., Blood, 2009; 114:3364-3365).
CLEC-2는 또한 혈소판과 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)의 결합을 매개하는 것이 확인되었다. 혈소판 상의 CLEC-2 수용체와 HIV-1의 결합은 HIV-1의 혈소판에 의한 파괴를 방지하고 그의 전달을 촉진하기 위해 혈소판을 사용하도록 할 수 있다(Chaipan, C. et al., J. Virol. 2006; 80 (18): 8951-8960). CLEC-2 수용체 시그널링은 또한 골수성 수지상세포에서 염증반응 조절에 연관되어 있다(Mourao-Sa, D. et.al., 2011 Eur. J. Immun. 41:3040-3053).
따라서, CLEC-2 매개 장애를 치료하기 위한 치료제와 방법이 필요하다.
본 원에서는 CLEC-2를 특이적으로 저해하는 핵산 리간드, 이 리간드를 동정 및/또는 특성화하는 방법, 및 이 리간드를 사용한 치료방법을 기술하였다.
일 측면에서, 단리된 핵산 서열을 포함하는 CLEC-2 리간드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다. 일 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 2'-플루오로-2'데옥시피리미딘 뉴클레오티드이다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 리간드의 단리된 핵산 서열은 리보뉴클레오티드와 2'-플루오로-2'데옥시피리미딘 뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 적어도 하나의 스템(stem)과 적어도 하나의 루프(loop)를 포함하는 2차 구조를 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 5' - 3' 방향으로: 5-10 염기쌍(bp) 길이의 제1 스템; 서열 5'-GNC-3'을 포함하는 제1 트리뉴클레오티드 루프; 4 bp 길이의 제2 스템(여기에서 제2 스템은 스템의 염기에 동요 쌍(wobble pair)을 포함한다); 및 뉴클레오티드 서열 5'-YUYNNRYU-3'을 포함하는 제2 루프를 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 길이는 약 20 내지 약 100 뉴클레오티드(nt)이다. 다른 구체예에서, 리간드의 길이는 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 40, 또는 약 30 내지 약 35 nt이다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 길이는 약 30 nt, 31 nt, 32 nt, 33 nt, 34 nt 또는 35 nt이다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 서열번호: 4-93으로 구성되는 군에서 선택된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 핵산 서열 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다.
일 구체예에서, 리간드는 CLEC-2 단백질 또는 그의 단편에 결합한다. 다른 구체예에서, 리간드는 CLEC-2의 가용성 도메인에 결합한다. 또다른 구체예에서, 리간드는 CLEC-2 세포외 도메인에 결합한다. 또다른 구체예에서, 리간드는 CLEC-2 Gln58-Pro230 도메인에 결합한다. 일 구체예에서, 리간드는 CLEC-2 단백질(서열번호: 1)에 특이적으로 결합한다. 또다른 구체예에서, 리간드는 CLEC-2의 세포외 도메인(서열번호: 2)에 특이적으로 결합한다.
일 구체예에서, 리간드는 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 하나 이상의 뉴클레오티드는 변성된다. 또다른 구체예에서, 뉴클레오티드 변성은 안정화 변성이다. 또다른 구체예에서, 변성은 리간드의 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성을 증가시킨다. 또다른 구체예에서, 변성은 생체 내에서 리간드의 생체이용률(bio-availability)을 증가시킨다.
일 구체예에서, 리간드는 그의 3' 말단에 역위(inverted) 티민을 포함한다.
일 구체예에서, 리간드는 약 20 나노몰(nM) 이하의 CLEC-2에 대한 해리상수("Kd")를 가진다.
일 구체예에서, 리간드는 0을 초과하나 약 100 마이크로몰(μM) 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 나노몰(nM) 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 500 피코몰(pM) 미만, 약 300 pM 미만, 약 250 pM 미만, 또는 약 200 pM 미만의 CLEC-2에 대한 해리상수를 가진다. 일 구체예에서, 리간드는 약 0.1 내지 10 nM 또는 약 0.5 내지 약 5 nM 범위의 CLEC-2에 대한 해리상수를 가진다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 CLEC-2의 변이체와 결합하여 그의 작용을 감소하거나 저해하며, 여기에서 CLEC-2 변이체는 CLEC-2 아미노산 서열(서열번호: 1 또는 서열번호: 2)과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% 일치한다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드와 CLEC-2의 결합은 CLEC-2의 활성 입체구조(conformation)를 안정화한다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 리간드와 CLEC-2의 결합은 CLEC-2의 비활성 입체구조를 안정화한다.
일 구체예에서, 리간드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변성 당 및/또는 변성 염기를 포함한다. 다른 구체예에서, 변성은 2'-안정화 변성이다. 또다른 구체예에서, 2'-안정화 변성은 뉴클레오티드 당 고리 상의 2'-플루오로 변성이다.
일 구체예에서, CLEC-2의 핵산 리간드는 가역적이며, 여기에서 CLEC-2에 결합된 CLEC-2 리간드는 결합되지 않을 수 있다. 또다른 구체예에서, CLEC-2에 결합된 CLEC-2 리간드는 CLEC-2 리간드 모듈레이터 존재 하에서 CLEC-2에 결합하지 않는다.
일 측면에서, CLEC-2 리간드와 결합하는 모듈레이터가 제공되며, 여기에서 모듈레이터는 CLEC-2 리간드의 활성을 부분적으로 또는 완전하게 회복한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 DNA 서열, RNA 서열, 폴리펩티드 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, 모듈레이터는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 2'-0-메틸-2'데옥시 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 및 2'-0-메틸-2'데옥시 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 핵산 모듈레이터이다. 또다른 구체예에서 핵산 모듈레이터는 적어도 하나의 변성 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 변성 리보뉴클레오티드를 포함한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 적어도 일부의 CLEC-2 핵산 리간드에 상보하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 모듈레이터는 적어도 일부의 CLEC-2 핵산 리간드에 상보하는 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드의 적어도 일부의 루프에 상보하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드의 적어도 일부의 스템에 상보하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드의 적어도 일부의 스템 및 CLEC-2 리간드의 적어도 일부의 루프에 상보하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64 및 서열번호: 65로 구성되는 군에서 선택된 서열과 80% 초과, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62, 서열번호: 63, 서열번호: 64 및 서열번호: 65로 구성되는 군에서 선택된 서열을 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 리보자임, DNA자임(DNAzyme), 펩티드 핵산(PNA), 모폴리노 핵산(MNA), 및 잠금(locked) 핵산(LNA)으로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터가 적어도 일부의 CLEC-2 핵산 리간드에 상보하는 핵산을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 리보자임, DNA자임, 펩티드 핵산(PNA), 모폴리노 핵산(MNA), 및 잠금 핵산(LNA)으로 구성되는 군에서 선택되고, 여기에서 모듈레이터는 특히 적어도 일부의 CLEC-2 핵산 리간드와 결합하거나 상호작용한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 핵산 결합 단백질 또는 펩티드, 소분자, 올리고사카라이드, 핵산 결합 리피드, 폴리머, 나노입자, 및 마이크로스피어(microsphere)로 구성되는 군에서 선택되고, 여기에서 모듈레이터는 적어도 일부의 CLEC-2 핵산 리간드와 결합하거나 상호작용한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 서열 길이가 약 10 nt 내지 약 30 nt, 약 10 nt 내지 약 25 nt, 약 10 nt 내지 약 20 nt, 약 10 nt 내지 약 15 nt, 또는 약 15 nt 내지 약 20 nt인 단리된 핵산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 서열 길이가 약 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 또는 20 nt인 단리된 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드 및/또는 핵산 모듈레이터 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변성된다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 2' 하이드록실 위치에 변성을 포함한다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 리간드에 존재하는 변성은 2'-플루오로로 구성되는 군에서 선택된다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 CLEC-2 리간드 뉴클레오티드는 2'-플루오로-2'데옥시사이티딘 또는 2'-플루오로-2'데옥시유리딘이다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 모듈레이터 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 사이토신, 2'-O-메틸 유리딘, 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 구아노신 또는 2'-O-메틸 티미딘이다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 2' 플루오로 사이티딘, 2' 플루오로 유리딘, 2' 플루오로 아데노신 또는 2'-플루오로 구아노신이다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 모듈레이터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 변성은: 5-플루오로유라실, 5-플루오로사이토신, 5-브로모유라실, 5-브로모사이토신, 5-클로로유라실, 5- 클로로사이토신, 5-요오도유라실, 5-요오도사이토신, 5-메틸사이토신, 5-메틸유라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록시네틸) 유라실, 5-카복시메틸아미노 메틸 티오유리딘, 5-카복시메틸아미노메틸유라실, 디하이드로유라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜틸아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 6-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸유라실, 5- 메톡시아미노메틸-2-티오유라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸유라실, 5-메톡시유라실, 5-메톡시사이토신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 유라실 옥시아세트산 (v), 부톡소신(butoxosine), 슈도유라실, 쿠에오신(queosine), 2-티오사이토신, 5-메틸 티오유라실, 2-티오유라실, 4-티오유라실, 5-메틸유라실, 유라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 유라실 옥시아세트산 (v), 5-메틸 티오유라실, 3-(3-아미노-3-N 카복시프로필)유리딘 (acp3U), 및 2,6-디아미노퓨린으로 구성된 군에서 선택된 변성을 포함한다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 적어도 하나의 변성된 당 잔기를 포함한다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드에 대한 모듈레이터의 결합은 CLEC-2 리간드 내에서 자살(suicide) 위치를 노출시켜서, CLEC-2 리간드의 2차 구조를 교란하고 뉴클레아제에 의해 핵산 CLEC-2 리간드의 파괴를 증가시킨다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드- CLEC-2 컴플렉스에 대한 모듈레이터의 결합은 CLEC-2 리간드와 CLEC-2의 결합을 감소시키거나 제거한다.
다른 측면에서, CLEC-2 리간드의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 핵산 리간드는 CLEC-2와 특이적으로 결합하고 CLEC-2 매개 장애를 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 혈소판 응집을 매개하는 CLEC-2의 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 혈소판 활성화와 분비를 매개하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 혈전 형성을 전파하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 내생성 단백질 포도플라닌과 상호작용하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 종양 세포와 상호작용하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 포도플라닌에 의해 종양 세포를 결합하고 혈소판을 종양 부위에 유인하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 종양 세포와 상호작용하는 CLEC-2 능력을 저해하여 전이를 억제한다. 일 구체예에서, 리간드는 종양세포와 상호작용하는 CLEC-2 능력을 저해하여 종양 세포의 성장인자 방출 능력을 감소시킨다. 일 구체예에서, 리간드는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 상호작용하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 HIV 전염(dissemination)을 촉진하는 CLEC-2 능력을 저해한다. 일 구체예에서, 리간드는 매개된 염증 반응, 사이토카인 생산, 혈소판-단핵구 상호작용 및 혈소판 부착을 시그널링하는 CLEC-2 능력을 저해한다.
일 구체예에서, 핵산 CLEC-2 리간드가 투여된 숙주에게 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 투여하여 CLEC-2 핵산 리간드의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터, 또는 그의 유도체일 수 있고, 특정 구체예에서는 핵산 CLEC-2 리간드의 일부에 상보한다.
다른 측면에서, CLEC-2 리간드를 사용하여 CLEC-2 작용을 조절하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, CLEC-2 작용을 조절하는 방법은 숙주에 치료학적으로 유효량의 CLEC-2 리간드를 투여하는 것을 포함한다. 또다른 구체예에서, 이 방법은 또한 CLEC-2 리간드 모듈레이터를 사전에 CLEC-2 리간드가 투여된 숙주에 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, CLEC-2 매개 질환 또는 장애의 치료방법 또는 개선방법을 제공한다.
일 구체예에서, 이 방법은 CLEC-2에 결합하는 CLEC-2 리간드의 치료학적으로 유효한 투여량을 이를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 숙주는 혈소판 매개 장애로 진단된다.
일 구체예에서, 혈소판 매개 질환 또는 장애는 심혈관 장애, 뇌혈관 장애, 말초혈관 장애, 급성 관동맥 증후군, 당뇨관련장애, 및 암으로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, 뇌혈관 장애는 혈전증, 혈전색전증 또는 일과성 허혈발작(TIA)이다. 또다른 구체예에서, 급성 관동맥 증후군은 관동맥 혈전증, 불안정 협심증 또는 심근경색증으로 인한 것이다. 또다른 구체예에서, 당뇨관련장애는 당뇨성 망막병증, 당뇨성 혈관병증, 죽상동맥경화증, 허혈성 뇌졸중, 말초혈관질환, 급성 신장 손상 또는 만성 신부전이다. 일 구체예에서, 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 고환암, 췌장암, 뇌암, 뼈암 및 간암에서 선택된다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 비경구 투여, 정맥내 주사, 피내 전달, 관절강내 전달, 활액내 전달, 척추강내, 동맥내 전달, 심장내 전달, 근육내 전달, 피하 전달, 안와내 전달, 낭내 전달, 척수강내 전달, 흉골내 전달, 국소 전달, 경피 패치 전달, 직장 전달, 구강 전달, 질 또는 요도 좌약제에 의한 전달, 복막 전달, 경피 전달, 비강 스프레이에 의한 전달, 외과적 임플란트에 의한 전달, 체내 수술 페인트, 주입 펌프에 의한 전달 또는 카테터에 의한 전달에 의해 투여된다.
다른 측면에서, 혈소판 작용을 조절하는 CLEC-2 리간드를 투여하여 이를 필요로 하는 숙주를 치료하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 치료학적 유효량의 CLEC-2를 투여한다.
일 구체예에서, 치료학적 유효 투여량은 혈소판 부착 및/또는 응집 및/또는 분비를 감소 또는 저해한다.
일 측면에서, CLEC-2와 결합하는 핵산 리간드의 치료학적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 측면에서, CLEC-2와 결합하는 핵산 CLEC-2 리간드의 활성을 반전하는 모듈레이터의 치료학적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 약학 조성물은 CLEC-2 리간드와 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함한다. 또다른 구체예에서, 약학 조성물은 정맥내 주사에 적합한 액체이다. 또다른 구체예에서, 약학 조성물은 피하 주사에 적합한 액체 또는 분산액이다.
일 측면에서, CLEC-2 핵산 리간드 및/또는 CLEC-2 핵산 리간드의 활성을 조절하는 모듈레이터의 치료학적 유효량을 포함하는 키트를 제공한다.
일 구체예에서, 키트는 CLEC-2 리간드를 포함한다. 또다른 구체예에서, 키트는 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 포함한다. 또다른 구체예에서, 키트는 CLEC-2 리간드와 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 모두 포함한다.
여기에 기술된 핵산 리간드에 대한 방법, 약학 조성물 및 용도는 항-혈소판 또는 항혈전 요법을 필요로 하는 장애 또는 치료요법에서 사용하기 위한 조절가능한 치료법으로서 제공된다. 특정 구체예에서, 치료는 경피적 중재를 포함한 외과적 중재이다. 방법은 CLEC-2에 대한 핵산 리간드를 이를 필요로 하는, 관동맥, 뇌혈관 또는 말초혈관 시스템의 폐색성 혈전 질환 또는 장애를 앓고 있거나 그 위험이 있는 숙주에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로, 핵산 리간드 또는 그의 모듈레이터가 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하는 약학 조성물을 제공한다. 모듈레이터를 함유하는 조성물은 리간드의 활성을 조절하여 출혈 위험이 있는 숙주의 응고 상태를 조절하기 위해 핵산 리간드가 제공된 숙주에게 투여하도록 디자인될 수 있다.
일 측면에서, CLEC-2 리간드가 CLEC-2 작용을 활성화하는지 억제하는지를 측정하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, CLEC-2 작용은 CLEC-2 의존성 또는 CLEC-2 매개 혈소판 응집이다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 리간드가 CLEC-2 의존성 혈소판 응집을 활성화하는지 측정하는 방법을 제공한다. 또다른 구체예에서, 방법은 시험관 내에서 수행된다.
일 구체예에서, 방법은 다음을 포함한다:
(a) CLEC-2 리간드와 혈액 샘플을 혼합하여 처리된 혈액 샘플을 제조하고;
(b) 처리된 혈액 샘플을 촉진제(facilitator) 분자와 접촉시키고;
(c) 접촉 후의 혈소판 응집물 형성을 측정하고;
(d) (c) 단계에서 검출된 혈소판 응집물 형성의 정도를 CLEC-2를 결합하고 촉진제 분자와 그의 상호작용을 저해하기 위해 CLEC-2 리간드가 사용되지 않은 대조용 혈액 샘플로 얻어진 혈소판 응집물 형성 정도와 비교한다.
일 구체예에서, 촉진제 분자는 고체 지지체에 고정화된다.
일 구체예에서, 촉진제 분자는 CLEC-2 활성제이다. 또다른 구체예에서, 촉진제 분자는 로도사이틴(rhodocytin). 또다른 구체예에서, 촉진제 분자는 포도플라닌이다.
일 구체예에서, CLEC-2의 활성제와 조합하여 사용할 경우, 촉진제 분자는 가용성 콜라겐이다. 또다른 구체예에서, 가용성 콜라겐은 콜라겐 타입 I, II 또는 III이다. 또다른 구체예에서, 방법은 CLEC-2 활성제를 혈액 샘플에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 활성제는 로도사이틴이다.
일 구체예에서, 혈액 샘플은 전체 혈액(whole blood)이다. 또다른 구체예에서, 혈액 샘플은 혈소판풍부혈장(PRP)이다. 또다른 구체예에서, 혈액 샘플은 세척된 혈소판이다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 핵산 CLEC-2 리간드이다. 또다른 구체예에서, 핵산 CLEC-2 리간드는 서열번호: 8 또는 서열번호: 9 또는, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9에서 유도된 서열을 포함한다.
도 1은 SELEX 핵산 리간드 선택과정의 다이아그램이다.
도 2는 Sel2 선택에 대한 1-10 라운드의 조건을 나타낸 것이다.
도 3은 CLEC-2 리간드 선택에 대한 결합의 농축을 나타낸 것이다.
도 4는 선택 CLEC-2 핵산 리간드의 결합 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 S2-20 T10과 RB 587의 예상된 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 축퇴성(degenerate) 선택의 특이적 조건을 나타낸 것이다.
도 7은 S2-20 축퇴성 선택 서열 보존을 나타낸 것이다.
도 8은 CLEC-2 리간드와 모듈레이터 사이의 상보성 영역을 나타낸 것이다.
도 9a-b는 CLEC-2 리간드의 로도사이틴으로 유도된 WP 혈소판 응집의 그래프이다.
도 10a-c는 CLEC-2 리간드의 존재 하, 또는 CLEC-2 리간드와 CLEC-2 리간드 모듈레이터의 존재 하에서 로도사이틴으로 유도된 혈소판 응집의 그래프이다.
도 11a-b는 로도사이틴으로 유도된 인간 P-셀렉틴(selectin) 발현의 그래프이다.
도 12a-b는 시험관 내 유동 기반 혈소판 부착 에세이의 결과를 나타낸 것이다.
핵산 리간드는, 또한 "앱타머(aptamer)"라고도 불리며, 목적하는 타겟 분자와 결합할 수 있는 특이적 3차원 형태를 갖는, 비자연적으로 발생한 단일가닥 핵산이다. 펩티드와 단백질에 결합하는 리간드에 있어서, 모노클론 항체가 그의 타겟 단백질에 결합하여 단백질 작용의 저해를 유발할 수 있는 것처럼 리간드와 그의 타겟 단백질의 결합은 단백질 작용의 저해를 유발할 수 있다. 핵산 리간드의 독특한 특징은 왓슨-크리크(Watson-Crick) 염기 짝짓기에 의해 리간드에 혼성화 (hybridize)하는 상보성 올리고뉴클레오티드의 형태로 이들에 대한 활성 조절제를 생성하는 능력이다. 이러한 활성 조절제는 기본적으로 리간드 활성 구조를 변화시켜서 이들의 약리학적 활성을 중화한다. 본 발명은 CLEC-2의 생물학적 작용 및 상호작용을 매개하기 위해 CLEC-2에 대한 핵산 리간드를 포함하는 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다. CLEC-2 핵산 리간드의 활성을 조절할 수 있는 모듈레이터를 추가로 제공한다.
정의
여기에서 사용된 이하의 정의는 달리 표시되지 않는 한 적용된다.
중량, 시간, 투여량 등의 측정값을 지칭할 때 여기에서 사용된 "약"이란 용어는 특정된 양으로부터 ±20% 또는 ±10%, ±5%, ±1%, 또는 ±0.1%의 차이를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 차이는 기술된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.
"핵산 리간드"는, 또한 여기에서 "리간드" 또는 "앱타머"로서 지칭될 수 있으며, 3차 구조를 형성할 수 있고 타겟 분자와 상호작용하는 핵산이다. "CLEC-2 핵산 리간드" 또는 "CLEC-2 리간드" 또는 "항CLEC-2 리간드" 또는 "핵산 CLEC-2 리간드"는 CLEC-2 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 앱타머를 지칭한다. CLEC-2 단편은 가용성 단편일 수 있으며, 예컨대 세포외 도메인(ECD) 또는 그의 단편이다. 선택적으로, CLEC-2 리간드는 세포 표면에서 발현되거나 혈소판과 연결된 것으로 확인된 CLEC-2 분자와 결합한다. CLEC-2 단백질은 세포에서 내생적으로 발현되거나 재조합 수단에 의해 발현될 수 있다. 이 용어들은 생리적 환경에서 의도된 타겟 분자와 복합체를 형성할 수 있는 특이적 결합 영역을 가지는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 타겟 분자에 대한 리간드의 결합 친화성은 리간드와 타겟 분자 간 상호작용의 해리상수(Kd)로 정의된다. 전형적으로 리간드의 그의 표적에 대한 Kd는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM이다. 결합 특이성은 리간드와 그 환경 하의 다른 물질 또는 일반적으로 연관되지 않은 분자와 관련한 해리상수와 비교된 타겟에 대한 리간드의 비교 해리상수로 정의된다. 전형적으로, 타겟에 대한 리간드의 Kd는 연관되지 않은 물질 또는 그 환경에서의 수반 물질과 관련한 Kd 보다 10-배, 50-배, 100-배, 또는 200-배 미만일 것이다.
여기서 사용된, 상동성 영역이라는 문맥에서, "실질적으로 상동인" 서열이란 특정 분자 내에서 왓슨-크리크 염기 짝짓기에 의해 동일한 2차 구조를 형성하는 것이다. 특정 구체예에서, 서열이 특정된 리간드에 대하여 적어도 80%, 85% 이상의 서열 동일성(identity), 예를 들어 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유하는 경우에 서열은 "실질적으로 상동"이다. 명확히 하기 위해 이러한 "실질적으로 상동인" 서열은 또한 특정한 서열에 대하여 "적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는" 서열, 또는 서열이 특정 리간드 서열에 대하여 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있는 서열로서 기술할 수 있다. 특정된 길이, 예를 들어 50 미만 뉴클레오티드의 핵산 리간드라는 문맥에서, 상동성 서열은 어떠한 영역에서도 왓슨-크리크 결합이 특이적 영역 내에서의 서열 동일성과 상관없이 동일한 2차 구조를 형성하는 것을 알 수 있다.
본 원에서 제출한 서열 목록은 1차 서열만을 제공한다(특별한 변성을 갖지 않는 뉴클레오티드 서열 제공). 본 명세서와 제출된 서열 목록에 제공된 각각의 서열은 여기에 기술된 변성의 조합을 가질 수 있다. 표 1-4에 기술된 변성을 갖는 서열들은 특이적 "클론명" 또는 "명칭"과 각각 연결되며, 이것은 특별히 정의된 변성을 갖는 핵산 서열에 대한 규정된 설명을 제공한다.
"리간드 모듈레이터 쌍(pair)" 또는 "리간드 모듈레이터 쌍"은 타겟 분자에 대하여 특정화된 리간드, 및 타겟과 리간드의 상호작용이 조절되도록 리간드의 2차 및/또는 3차 구조를 변경한 리간드 모듈레이터를 포함하는 것을 의미한다. 모듈레이터는 리간드의 일부에 상보하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 모듈레이터는 리간드의 입체구조를 변화시켜서 리간드의 타겟 결합능을 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지, 또는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내의 생리적 조건 하에서 10% 내지 100% 범위의 백분율로 감소시킬 수 있다.
"모듈레이터", "해독제(antidote)", "레귤레이터" 또는 "조절제"는 여기에 기술된 리간드 또는 앱타머를 결합할 수 있고 바람직한 방법으로 리간드와 그의 타겟 분자 간의 상호작용을 (예를 들어, 리간드의 구조를 변성하여)변성하는 임의의 약학적으로 허용가능한 물질을 지칭한다.
여기에서 사용된 "조절한다"는 활성의 감소, 증가 또는 기타 측정가능한 변화를 의미한다.
"숙주"란 포유동물을 지칭하고 인간과 인간이 아닌 포유동물을 포함한다. 숙주의 예는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 돼지, 래빗, 고양이, 개, 염소, 말, 양, 소 및 사람을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
여기에서 사용된 "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 미국 연방 또는 주 정부의 관리당국에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 일반적으로 인정된 사람에게 사용하기 위한 약전에 열거된 것을 의미한다.
약학적으로 유효한 투여량은 질환 상태의 발생을 예방, 저해, 또는 치료(증상을 일정 범위까지 완화하는)하는데 필요한 투약량이다. 약학적으로 유효한 투약량은 질환의 종류, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료하고 있는 포유동물 종류, 고려 중인 특정 포유동물의 신체적 특징, 동시 투약, 및 의료분야에 숙련된 사람들이 인식할 수 있는 기타 인자들에 따라 다르다. 일반적으로, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 체중/일의 활성성분 양을 핵산 리간드와 모듈레이터의 효능에 따라 투여한다.
"안정화된 핵산 분자"는 안정화되지 않은 핵산 분자와 비교하여 생체 내에서 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의해)쉽게 분해되지 않는 핵산 분자를 지칭한다. 안정화란 길이 및/또는 이차 구조의 작용 및/또는 올리고뉴클레오티드 골격의 당 또는 포스페이트 부분 내에서 화학적 치환의 포함일 수 있다. 안정화는, 예를 들어 분자를 안정화할 수 있는 이차 구조를 조절하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 3' 말단이 상부 영역에 상보성이면 이 부분은 폴드-백 (fold back)되어 분자를 안정화하는 "스템 루프" 구조를 형성할 수 있다.
"결합 친화성"과 "결합 활성"이란 용어는 리간드 분자의 타겟과 결합하거나 결합하지 않는 성향을 지칭한다. 이러한 상호작용의 에너지학은 "결합 활성"과 "결합 친화성"에서 중요한데, 왜냐하면 이들이 상호작용하는 파트너의 필요 농도, 이 파트너들이 결합할 수 있는 비율, 및 용액중 결합 분자와 자유 분자의 상대 농도를 정하기 때문이다. 에너지학은 특히 해리상수 Kd의 측정으로 특성화될 수 있다.
여기서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"이란 용어는 포유동물 질환의 처리를 의미하며: 예를 들어, (a) 임상적 증상이 발생하지 않게 하는, 질환의 방지; (b) 질환의 저해, 즉 임상 증상 진행의 정지, 개선, 감소 또는 억제; 및/또는 (c) 질환의 완화, 즉 임상 증상의 퇴행 유발을 포함한다. 당업자라면 인체 의학에 있어서 최종 유도 결과 또는 결과들은 미지이고 잠재적이거나, 환자는 결과 또는 결과들의 발생 후까지 확신할 수 없기 때문에 "예방"과 "억제"를 항상 구별할 수 없다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 여기에서 사용된 "예방"이란 용어는 "치료"의 요소로서 여기에서 정의된 "방지"와 "억제" 모두를 포함하는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 "방지"는 "예방"을 포함하는 의미이다.
"유효량"이란 용어는 처치되고 있는 장애 또는 질환 상태를 치료하는데 충분한 용량을 의미한다. 이것은 환자, 질환 및 사용되고 있는 치료방법에 따라 달라질 수 있다.
여기에서 사용된 CLEC-2 핵산 리간드 "변이체"는 본질적으로 CLEC-2 핵산 리간드와 동일한 작용을 수행하고 실질적으로 동일 구조를 포함하는 변이체를 포함한다.
CLEC -2
CLEC-2는 간세포 표면과 몇몇의 조혈세포, 예를 들어 단핵구, 수지상세포, NK 세포, 및 과립구 상에서 발현된 막관통 단백질이다. 조혈세포와 간 시누소이드 (sinusoidal) 상피세포 중에서 CLEC-2 단백질은 특별히 혈소판과 거핵구성 세포에서 발현된다(Chaipan et al., 2006; J Virol, 80:8951-8960). CLEC-2는 Src와 Syk 키나제에 의해 혈소판 활성화를 매개하는 것으로 입증되었다.
처음에는 CLEC-2의 외인성 리간드만이 동정되었다. 이들은 뱀독, 로도사이틴(aggretin), 및 HIV-1을 포함하였고, 이들은 모두 혈소판을 활성화하여 혈소판 응집을 활성화하는 것으로 나타났다. CLEC-2 결핍은 출혈시간 증가와 폐색성 동맥 혈전 형성 방지와 연관되어 있다(May et al., 2009, Blood, 114:3464-3472). May 등은 또한 마우스의 항-CLEC-2 항체 처리가 CLEC-2의 완전하고 매우 특이적인 손실을 순환하는 혈소판에서 수일 동안 유발하여 혈소판 응집에서 심각한 결점을 수반하는 것을 증명하였다.
최근에 Ozaki 등(2010; J. Throm Haemos., 7:191-194)이 동정한 내인성 CLEC-2 리간드가 포도플라닌이다. 포도플라닌은 종양 유도 혈소판 응집과 종양 전이와 연관된 시알로당단백질이다(sialoglycoprotein). 포도플라닌은 림프계 내피와 신장 포도사이트(podocyte)에서 고도로 발현된다. 포도플라닌의 발현은 혈관내피에서는 검출되지 않는다. 포도플라닌과 CLEC-2의 상호작용은 발달과정에서 혈액과 림프관의 분리에 중요하다. 연구 결과, 포도플라닌과 CLEC-2가 모두 결핍된 마우스는 출혈 표현형과 비정형 혈관연결을 보이는 것으로 나타났다(Schacht, V., et.al., 2003, EMBO, J. 22:3546-3556; Suzuki-Inoue K. et al., 2010, J. Biol. Chem, 285:24494-24507). 연구 결과들은 수용체가 종양세포 확산을 심각하게 촉진하는 것으로 알려진 과정인 종양세포 유도 혈소판 활성화를 매개하므로 CLEC-2가 혈행성 종양 전이를 담당할 수 있음을 시사하고 있다(Honn et al., 1992, Cancer Metastasis Rev, 11:325-351; Nieswandt et al., Cancer Res, 1999, 59:1295-1300).
전체 길이의 CLEC-2 단백질 아미노산 서열(GenBank 기탁번호 AAF36777)을 이하에 나타내었다:
CLEC-2(서열번호: 1)
Figure pct00001
약 58-229개의 아미노산을 포함하는 CLEC-2의 세포외 도메인(ECD)을 이하에 나타내었다.
CLEC-2(Gln58-Pro229)(서열번호: 2)
Figure pct00002
N-터미널 His10 tag에 융합된 CLEC-2의 세포외 도메인(ECD)(서열번호: 3)은 여기에 기술된 핵산 리간드를 선택하기 위해 사용되었고 58-229개 아미노산을 포함하며 이하에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00003

CLEC -2 핵산 리간드의 개발
CLEC-2 단백질과 특이적으로 결합하는 핵산 리간드는 SELEX 방법을 사용하여 동정되었다. SELEX에 의해 처음으로 얻어진 리간드를 충분히 특성화하여 CLEC-2 리간드에 대한 특성을 이해하였다. 이러한 특성화는 서열화, 보존 서열을 결정하기 위한 서열 정렬, 이차 구조 예측, 및 특이적으로 CLEC-2를 결합 및 저해하는 바람직한 작용에 가장 중요한 리간드 영역을 확인하기 위한 트렁케이션(truncation) 및돌연변이 분석을 포함한다.
SELEX는 지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 증폭(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)을 지칭한다. 이 방법은 타겟 분자에 대하여 매우 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관 내 증폭을 가능하게 한다. SELEX 방법은, 예를 들어 미국특허 제5,475,096호 및 제5,270,163호(WO 91/19813 참조)에 기술되어 있다.
그의 가장 기본적 형태에 있어서, SELEX 방법은 다음과 같은 일련의 단계들로 규정될 수 있다:
1) 상이한 서열의 핵산 캔디데이트 혼합물을 제조한다. 캔디데이트 혼합물은 일반적으로 고정된 서열 영역(즉, 캔디데이트 혼합물의 성분들 각각은 동일 위치에서 동일 서열을 함유한다)과 랜덤화된 서열의 영역을 포함한다. 고정된 서열 영역은, (a) 하기한 증폭단계에 사용하거나, (b) 타겟에 결합하는 것으로 알려진 서열을 모사하거나, (c) 캔디데이트 혼합물 중에서 핵산의 주어진 구조적 배열의 농도를 증가시키기 위해서 선택된다. 랜덤 서열은 전체적으로 랜덤화(즉, 임의의 위치에서 염기를 발견할 가능성은 1/4이다)되거나 부분적으로만 랜덤화(예를 들어, 임의 위치에서 염기를 발견할 가능성이 0 내지 100%에서 선택될 수 있다)될 수 있다.
2) 캔디데이트 혼합물은 타겟과 캔디데이트 혼합물의 성분 간의 결합에 유리한 조건 하에서 선택된 타겟과 접촉된다. 이러한 환경 하에서 타겟과 캔디데이트 혼합물의 핵산 간의 상호작용은 타겟과 타겟에 대한 가장 강력한 친화성을 가지는 핵산 간의 핵산-타겟 복합체를 형성하는 것으로 생각될 수 있다.
3) 타겟에 대한 가장 높은 친화성을 가지는 핵산을 타겟에 대한 더 낮은 친화성을 가지는 핵산으로부터 분리한다. 캔디데이트 혼합물 중에는 가장 높은 친화성 핵산에 대한 서열이 극도로 적은 수(및 아마도 한 분자의 핵산)만이 존재하기 때문에, 일반적으로 캔디데이트 혼합물 중의 핵산의 상당량(약 5 내지 50%)이 분리하는 동안 유지되도록 분리 기준을 정하는 것이 바람직하다.
4) 타겟에 대한 상대적으로 높은 친화성을 가지므로 분리하는 동안 선택된 핵산들을 증폭하여 타겟에 대해 상대적으로 높은 친화성을 가지는 핵산 중에 농축된 새로운 캔디데이트 혼합물을 얻는다.
5) 상기한 분리 및 증폭 단계를 반복하여 새로 형성된 캔디데이트 혼합물은 점점 덜 약하게 결합하는 서열을 함유하고, 타겟에 대한 핵산의 평균 친화도는 일반적으로 증가하게 된다. SELEX 방법은 타겟 분자와 가장 높은 친화성 상호작용이 가능한 특이적 이차 및 3차 구조로 폴딩하는 원래의 캔디데이트 혼합물로부터의 핵산 서열을 나타내는 하나 또는 소수의 독특한 핵산을 함유하는 캔디데이트 혼합물을 얻게 된다.
CLEC-2에 특이적인 핵산 리간드는, 예를 들어 미국특허 제7,087,735호에 기술된 바와 같은 SELEX 방법을 사용하여 분자의 세포외 도메인을 나타내는 짧은 펩티드에 대해 SELEX를 수행하여 생성될 수 있다. 선택적으로 CLEC-2에 특이적인 핵산 리간드는, 예를 들어 미국특허 제6,730,482호에 기술된 바와 같은 SELEX 방법을 사용하여 온전한 혈소판, 단백질에 농축된 혈소판 막 분획에서, 정제된 CLEC-2에 서, 또는 CLEC-2 수용체를 특이적으로 과발현하는 세포주에서 SELEX를 수행하여 단리할 수 있다.
또한, SELEX 방법은, 예를 들어 미국특허 제5,780,228호에 기술된 바와 같은 경쟁적 친화성 용출방법을 사용하여 특이적 CLEC-2 핵산 리간드를 단리하는 것에 관한 것일 수 있다.
특정 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드는 생리적 조건 하에서 CLEC-2 수용체에 결합한다. 생리적 조건은 전형적으로 염 농도와 용액의 pH와 관련되어 있다. 시험관 내에서 생리적 조건은 전형적으로 15OmM NaCl, 2mM CaCl2, 2OmM HEPES를 함유하는 pH가 약 7.4인 완충액으로 반복된다. 특정 구체예에서, 원상태의 전형적으로 불활성화된 혈소판은 상기한 바와 같이 사용되어 핵산 리간드의 개체군을 스크린하여 농축된 개체군을 제공하고, 이것은 혈소판에서 발견된 단백질에 대한 리간드를 함유한다. 이후에, 농축된 개체군은 목적하는 CLEC-2 수용체를 과발현하는 안정한 세포주 또는 일시적으로 단백질로 형질감염된 세포주에 대해 사용된다. 이차 스크리닝은 세포들로부터 단리된 수용체 또는 리간드 경쟁 시험에 의한 전체 세포에 대한 변성된 SELEX 방법을 사용하거나 세포 내 시그널링 경로에 대한 효과를 확인하여 수행할 수 있다.
리간드는 또한 혈소판풍부혈장(Platelet Rich Plasma) 또는 세척된 혈소판 제조물에서 수행된 광선투과 응집측정계(Light Transmittance Aggregometry) 또는 전체 혈액에서 수행된 임피던스(Impedance) 응집측정계 또는 로도사이틴에 의해 혈소판을 활성화한 다음 항-CD62P (P-Selectin), 항-PAC1 (활성화된 GPIIbIIIa) 또는 항-피브리노겐을 포함하는 혈소판 활성화와 응집의 마커로 염색하여 혈소판풍부혈장 또는 전체 혈액 또는 세척된 혈소판에서 수행된 FACS 같은 혈소판 작용 에세이에서 혈소판 응집의 저해에 대해 스크린할 수 있다. 제공된 핵산 리간드의 CLEC-2에 대한 특이성은 또한 제공된 수용체의 기지 작용물질로 촉발된 세포내 시그널링을 차단하는 리간드 능력으로 구별될 수 있다. 또한, 제공된 핵산 리간드의 CLEC-2에 대한 특이성은 또한 응집이 CLEC-2 이외의 수용체를 활성화하는 작용물질로 촉발되는 경우 혈소판 응집에 대한 효과의 결핍으로 구별될 수 있다.
여기에 기술된 리간드는 단리된 핵산 서열을 포함하며, 이것은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 변성된 리보핵산 또는 데옥시리보핵산을 사용하여 합성될 수 있다. 여기에 기술된 특정 구체예에서, 핵산의 서열은 RNA 서열로 기재된다. 마찬가지로, 여기에 기술된, 핵산 리간드가 먼저 DNA 분자로서 확인된 특정 구체예에서, 핵산의 서열은 DNA 서열로 기재된다. DNA 서열로서 텍스트 형태로 나타낸 뉴클레오티드의 서열은 본래 상응하는 RNA 서열의 표시를 제공하며, 여기에서 DNA 서열 내의 티민(T)은 유리딘(U)으로 대체되어 뉴클레오티드의 상응하는 RNA 서열을 얻는 것이 알려져 있다. 마찬가지로, RNA 서열로서 텍스트 형태로 나타낸 서열은 본래 상응하는 DNA 서열의 표시를 제공하며, 여기에서 RNA 서열 내의 유리딘(U)은 티민(T)으로 대체되어 상응하는 DNA 서열을 얻는 것이 알려져 있다.
타겟에 대한 리간드의 결합친화성은 Kd로 정의할 수 있다. 이러한 해리상수의 값은 실시예 1에 기술된 방사능리간드 결합방법과 같은 공지된 방법에 의해 직접 측정할 수 있다.
일부 구체예에서, CLEC-2에 대한 리간드 결합의 Kd는 약 1nM 내지 약 100 nM, 약 10 nM 내지 약 50 nM 또는 약 0.1 nM 내지 약 20 nM의 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, CLEC-2에 대한 리간드 결합의 Kd는 연관되지 않은 단백질 또는 이 환경에서의 다른 수반 물질에 대한 리간드 결합의 Kd 보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 미만이다. 연관되지 않은 단백질은 또한 또다른 혈소판 활성화 또는 부착 수용체 같은 CLEC-2에 존재하는 것들에 연관된 모티프를 갖는 단백질일 수 있다.
이하에서 더욱 상세히 언급되는 바와 같이, SELEX 방법으로 얻어지고 동정된 리간드의 결합활성은 추가로 변성되거나 다양한 조작방법으로 강화될 수 있다.
일부 구체예에서, 리간드는 CLEC-2의 세포외 도메인과 상호작용한다. 리간드는 내인성 리간드와 CLEC-2 수용체의 결합을 방해할 수 있다. 특정 구체예에서, 리간드는 CLEC-2 수용체에 의해 세포외 시그널링을 저해할 수 있다. 리간드는 또한 수용체의 입체구조, 예를 들어 다이머 입체구조를 안정화하거나 교란하여 수용체가 포도플라닌 같은 내인성 리간드와 상호작용하는 능력을 감소시킨다. 특정 구체예에서 리간드는 혈소판 응집 및/또는 활성화 및/또는 혈소판 부착 및/또는 혈소판 분비에 영향을 줄 수 있다.
여기에 기술된 핵산 리간드는 활성적 가역제(reversible agent)로 작용할 수 있다. 이것은 환자에게 투여한 후, 2차 제제의 투여로 직접 조절될 수 있는 제제이거나 약학적으로 활성인 분자이다. 이하에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 2차 제제는, 여기에서 모듈레이터로 지칭되며, 리간드의 약리학적 활성을 정지하거나 미세조정할 수 있다. 그 결과, 리간드의 약리학적 활성은, 예를 들어 약물 청소 이외의 방법으로 반전될 수 있다.
여기에 기술된 CLEC-2 리간드는 바람직하게 CLEC-2 세포외 도메인 (ECD) (아미노산 잔기 Gln58-Pro230; 서열번호: 2)을 특이적으로 결합하는 핵산 리간드이다. CLEC-2 리간드는 실시예 1과 이하에서 더욱 상세히 설명된 SELEX 방법을 사용하여 선택되고 변성하여 안정성, CLEC-2에 대한 친화성 및/또는 CLEC-2 활성을 조절하는 능력을 증가시켰다.
여기에 기술된 방법에 따라 단리된 리간드를 여기에서 실시예 2에 제공된 표 1-2에 나타내었다.
여기에 기술된 바와 같이, CLEC-2와 결합하는 앱타머를 실시예 1-2에 기술된 바와 같이 단리하고 서열화하여 20개의 독특한 서열을 동정하였다. 클론, S2-20을 CLEC-2 의존성 혈소판 응집의 고친화성 저해제로서 동정하였다. 이 클론을 또한 실시예 3-5에 기술된 SELEX 선택 서열의 트렁케이트되고/되거나 돌연변이된 버젼의 생성으로 특성화하였다. mfold 서버(mfold.bioinfo.rpi.edu)에서 입수할 수 있는 소프트웨어를 사용한, 클론 S2-20(서열번호: 8 또는 서열번호: 9)에 대한 2차 구조분석은 CLEC-2 리간드(앱타머)가 약 6 bp 길이의 제1 스템을 가지는 컨센서스 구조를 예측하였으나, 데이터는 제1 스템의 길이가 5 내지 10 bp의 범위일 수 있고 CLEC-2에 대해 높은 친화성을 유지할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 앱타머의 제1 스템은 약 3 bp 내지 약 15 bp, 또는 약 4 bp 내지 약 12 bp, 또는 약 5 bp 내지 약 10 bp의 범위일 수 있다. 제1 스템은 약 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp 또는 15 bp의 길이를 가질 수 있는 것으로 예상된다. 돌연변이 분석에서 제1 루프 구조의 제2 위치에서 돌연변이의 내성(tolerance)이 나타났으나 CLEC-2 리간드 구조는 또한 서열 5'-GAG-3'을 갖는 제1 루프를 가지는 것으로 예측되었다. 따라서, CLEC-2 리간드의 제1 루프는 N이 A, T, C, G 또는 U일 수 있는 5'-GNC-3' 컨센서스 서열을 포함하는 것으로 예상된다. 제1 루프에 대한 3'은 스템의 염기에 동요(wobble) 염기쌍을 갖는 약 4 bp 길이의 제2 스템이나, 이 길이는 약 3 bp 내지 7 bp 또는 4 bp 내지 약 6 bp로 변화할 수 있다. 제2 스템에 대한 3'은 서열 5'-CUCAUAUU-3'을 갖는 제2 루프 구조이다. 돌연변이 분석에서는 바람직한 루프 2 컨센서스 서열이 Y가 피리미딘이고 R이 퓨린이며 N이 A, G, C, T 또는 U인 5'-YUYNNRYU'-3'일 수 있는 것으로 나타났다. S2-20에서 유도된 트렁케이트 CLEC-2 리간드 중에서 S2-20 T10(서열번호: 22) 및 RB587(서열번호: 24)이 이러한 리간드의 예이다.
컨센서스 구조의 결정은 리간드 구조와 작용을 증가하거나 감소시킬 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 동정하는 리간드의 조작을 용이하게 한다. 이것은 특이적 스템과 루프 구조에 대한 뉴클레오티드 첨가, 결실 및 치환을 보다 효율적으로 확인하고 시험할 수 있게 한다.
또한 컨센서스 이차 구조에 대한 지식은 리간드 구조와 작용에 유해할 수 있는 변성을 피하게 한다. 예를 들어, 임의의 변성은 스템 또는 루프 영역 내의 2'-플루오로와 같이 컨센서스 2차 구조 내에서 보존될 수 있다. 이러한 예에서, 리간드의 스템 또는 루프에서 2'-플루오로의 제거는 활성의 손실을 유발할 수 있다.
일 구체예에서, 리간드는 SELEX 방법을 사용하여 선택된 핵산 분자이고 트렁케이트 및 그의 실질적으로 상동인 서열을 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 상동 영역이란 문맥에서, "실질적으로 상동인" 서열은 특정 분자 내에서 왓슨-크리크 염기쌍에 의해 동일한 2차 구조를 형성하는 것이다. 또다른 구체예에서, SELEX 방법을 사용하여 선택된 리간드는 서열번호: 5-59, 또는 서열번호: 9-14, 16-22, 24, 33, 37, 38, 42, 44-48, 및 55-57로 구성되는 군에서 선택된 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열로 구성되는 군에서 선택된다. 또다른 구체예에서, 리간드는 생리적 조건 하에서 시험관 내 측정되었을 때 약 10 nM 미만 또는 약 5 nM 미만의 해리상수를 갖는 것들이다.
여기에 기술된 CLEC-2 리간드는 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 결실을 갖는 것으로 S2-20과 구별되는 서열을 포함하는 핵산 분자일 수 있다. CLEC-2 리간드는 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9 내에서 하나 이상의 결실의 조합을 삽입하여 제조될 수 있다.
여기에서 지칭된 CLEC-2 리간드는 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9의 5' 및/또는 3' 터미널에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 트렁케이트(결실)하여 생성된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, CLEC-2 리간드는 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9의 최초 (5') 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 뉴클레오티드를 결실하여 생성된 서열일 수 있다. 대안적 구체예에서, 나중 (3') 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 뉴클레오티드가 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9에서 결실된다. 또다른 구체예에서, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80, 또는 이들의 조합의 뉴클레오티드가 서열번호: 7, 서열번호: 8 또는 서열번호: 9에서 결실된다. 또다른 구체예에서, 결실된 서열의 조합은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드로 구성된다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 리간드는 서열번호: 24에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 일치하는 서열을 포함한다. 이 구체예에서, CLEC-2 리간드의 길이는 약 20 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 30 bp, 또는 약 27 bp 내지 33 bp의 범위이다. CLEC-2 리간드는 제1 스템, 5'-GNC-3'(여기에서 N은 G, A, T, C 또는 U이다)를 포함하는 제1 루프, 제2 스템 및 5'-CUCAUAUU-3' 또는 5'-YUYNNRYU'-3' (여기에서 Y는 피리미딘이고, R은 퓨린이고, N은 A, G, C, T 또는 U이다)을 포함하는 제2 루프를 포함하는 2차 구조를 가진다. 핵산 리간드 서열번호: 24에 대한 문맥에서, 상동성 서열은 특정 영역 내의 서열 동일성과 상관없이 왓슨-크리크 결합이 동일한 2차 구조를 형성하게 하는 임의의 영역 내에서 발견될 수 있다.
여기에 기술된 CLEC-2 리간드는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 CLEC-2 분자의 활성을 저해하는 작용을 한다. 다시 말해서, CLEC-2 리간드의 첨가는 CLEC-2 활성을 측정하도록 설계된 특정 에세이에서 CLEC-2 활성을 감소할 수 있다. 예를 들어, CLEC-2 리간드는 CLEC-2 작용을 저해한다. CLEC-2 리간드는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 CLEC-2 의존성 혈소판 작용을 저해하여 작용할 수 있다.
CLEC -2 핵산 리간드의 모듈레이터
일부 구체예에서, CLEC-2에 대한 핵산 리간드는 가역적이다. 일 측면에서, 본 발명은 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 핵산 리간드가 투여된 숙주에게 투여하여 CLEC-2에 대한 리간드의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
모듈레이터는 핵산 리간드와 결합할 수 있고 바람직한 방법으로 리간드와 그의 타겟 분자 간의 상호작용을 (예를 들어, 핵산 리간드의 구조를 변성하여)변성할 수 있거나, 또는 핵산 리간드를 분해하거나, 대사시키거나, 절단하거나 또는 화학적으로 변화시켜서 그의 생물학적 효과를 변성하는 약학적으로 허용가능한 제제를 포함할 수 있다.
여기에 기술된 CLEC-2 리간드의 핵산 모듈레이터는 표준 상보성 왓슨-크리크 염기쌍 규칙에 기초하여 디자인되었다(실시예 6 참조). CLEC-2 작용을 저해하는 것으로 입증된 CLEC-2 리간드에 상보하는 서열을 갖는 다양한 길이의 조절 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 합성된 모듈레이터 올리고뉴클레오티드 각각을 CLEC-2 리간드에 결합하는 그의 능력을, 예를 들어 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 시험한다. 이후, CLEC-2 리간드를 결합하는 모듈레이터 역시 CLEC-2 리간드의 활성을 가역할 수 있는지를 시험하는 것이 중요하다. 실시예 부분과 이하에서 상세히 기술된 바와 같이, 주어진 모듈레이터의 가역 활성은 CLEC-2 리간드의 항혈소판 활성을 평가하는 에세이에 의해 시험할 수 있다. CLEC-2 매개 혈소판 응집을 저해하는 CLEC-2 리간드를 확인하기 위해 수행된 에세이는 또한 CLEC-2 리간드와 결합하는 것으로 입증된 모듈레이터의 존재 하에 수행된다. 모듈레이터는 CLEC-2 리간드의 첨가 전, 동시 또는 후에 에세이 혼합물에 첨가할 수 있다. 모듈레이터의 가역 활성은, 예를 들어 세척 혈소판 응집 시험, 전체 혈액, 혈소판풍부혈장, 또는 세척 혈소판 제조물에서의 로도사이틴- 또는 포도플라닌-유도 혈소판 응집 에세이, CLEC-2 리간드 존재 하에서 P-셀렉틴 발현을 평가하는 로도사이틴 또는 포도플라닌으로 수행된 유동 세포계수 에세이, 및 시험관 내 유동 기반 혈소판 부착 에세이를 사용하여 입증될 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB581은 RB587의 프라이머 서열 3' 16 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 루프 2, 스템 2 및 스템 1, 또는 그의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587 (서열번호: 24)의 대략 14-31 또는 14-26 또는 16-31 또는 18-31 또는 21-31 또는 16-26 또는 16-29 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB582는 RB587의 프라이머 서열의 내부 16 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 루프 2, 스템 2 및 스템 1의 일부, 또는 이들의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587 (서열번호: 24)의 대략 14-31 또는 14-29 또는 14-27 또는 16-29 또는 16-27 또는 19-29 또는 21-31 또는 21-29 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB583은 RB587의 프라이머 서열의 내부 15 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 루프 1, 스템 2 및 루프 2, 또는 이들의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587 (서열번호: 24)의 대략 7-21 또는 9-21 또는 9-17 또는 7-19 또는 7-17 또는 7-14 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB584는 RB587의 프라이머 서열의 내부 16 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 스템 1의 일부, 루프 1, 스템 2 및 루프 2의 일부, 또는 이들의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587 (서열번호: 24)의 대략 1-21 또는 1-19 또는 1-14 또는 4-14 또는 4-19 또는 4-21 또는 6-21 또는 6-14 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB585는 RB587의 프라이머 서열의 5' 18 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 스템 1, 루프 1, 스템 2 및 루프 2의 일부, 또는 이들의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587 (서열번호: 24)의 대략 1-21 또는 1-18 또는 1-16 또는 1-14 또는 4-21 또는 4-18 또는 4-14 또는 6-14 또는 6-18 또는 6-21 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
바람직한 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드의 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드 서열에 적어도 부분적으로 상보하는 핵산 서열이다. 도 8(및 표 4 참조)에 나타낸 바와 같이, CLEC-2 리간드 RB587의 모듈레이터는 RB587의 상이한 영역에 혼성화하도록 디자인되었다. RB586은 RB587의 프라이머 서열의 5' 13 염기에 상보하며, 혈소판 응집 에세이에서 CLEC-2 리간드 저해활성의 중화 및 겔 이동성 시프트 에세이에 의해 측정된 바와 같이 CLEC-2에 대한 RB587의 결합을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명에서는 CLEC-2 리간드의 동일 영역에 상보하거나 혼성화할 수 있는 모듈레이터를 제공하였다. 이와 같이, 여기에 기술된 모듈레이터는 스템 1, 루프 1, 및 스템 2, 또는 이들의 일부를 포함하는 CLEC-2 핵산 리간드의 영역에 혼성화할 수 있다. 특정한 일 예로서, 여기에 기술된 모듈레이터는 CLEC-2 리간드 RB587(서열번호: 24)의 대략 1-13 또는 1-10 또는 6-13 위치의 염기에 상응하는 영역에 혼성화할 수 있다. 또한, 모듈레이터와 CLEC-2 리간드의 특이적 상호작용은 CLEC-2 폴리펩티드에 대한 CLEC-2 리간드 결합의 감소를 일으킨다. 게다가, 모듈레이터는 CLEC-2 리간드에 의한 CLEC-2 타겟 단백질 작용의 저해를 억제하거나 가역할 수 있다.
모듈레이터의 대체 실시예는 다음을 포함한다: 핵산 리간드 서열(리보자임 또는 DNA자임 포함)의 적어도 일부에 상보하는, 올리고뉴클레오티드 또는 그의 유사체. 다른 예는 펩티드 핵산(PNA), 모폴리노 핵산(MNA), 또는 잠금 핵산(LNA); 핵산 결합 단백질 또는 펩티드; 올리고사카라이드; 소분자; 또는 핵산 결합 폴리머, 리피드, 나노입자 또는 마이크로스피어 기반 모듈레이터를 포함한다.
모듈레이터는 고도의 특이성과 바람직한 친화도를 갖는 특정 핵산 리간드에 결합하도록 디자인될 수 있다. 모듈레이터는 또한, 결합시 리간드의 구조가 더 활성이거나 덜 활성인 형태로 변성되도록 디자인할 수 있다. 예를 들어, 모듈레이터는 타겟 핵산 리간드에 결합할 때, 그 리간드의 2차 및/또는 3차 구조를 변경하여 리간드가 그의 타겟 분자에 더이상 결합할 수 없거나 친화도가 더 작은 그의 타겟 분자에 결합하도록 디자인할 수 있다. 선택적으로, 모듈레이터는 결합시 리간드의 3차원 구조를 변경하여 타겟 분자에 대한 리간드의 친화도가 강화되도록 디자인할 수 있다. 즉, 모듈레이터는 결합시 구조 모티프를 변성하여 리간드의 친화도가 증가되도록 디자인할 수 있다. 또다른 구체예에서, 리간드/모듈레이터 쌍은 주목하는 타겟에 결합할 수 없는 핵산 리간드 분자에 대한 모듈레이터 결합이 리간드 내에서 구조 모티프의 생산을 유발하여 리간드가 그의 타겟 분자에 결합하도록 디자인된다.
모듈레이터는 또한 특정 핵산 리간드 또는 충분한 친화도를 갖는 핵산 리간드 세트에 비특이적으로 결합하여 복합체를 형성하도록 디자인될 수 있다. 이러한 모듈레이터는 일반적으로 전하-전하 상호작용으로 핵산과 결합할 수 있다. 이러한 모듈레이터는 또한 하나 이상의 핵산 리간드와 동시에 결합할 수 있다. 모듈레이터는 하나 이상의 핵산 리간드에 결합할 때 핵산 리간드의 구조가 그의 활성 형태로부터 심각하게 변화되지 않고, 모듈레이터가 핵산 리간드와 그의 타겟 분자의 결합을 차단하거나 입체적으로 방해하도록 디자인될 수 있다.
뉴클레오티드 모듈레이터는 리간드 분자에 효과적으로 결합하게 하는 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 길이는 약 10 뉴클레오티드(nt) 내지 약 30 nt 범위, 약 10 nt 내지 약 20 nt 범위, 또는 약 15 nt부터 가능하다. 뉴클레오티드 모듈레이터의 길이는 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt, 27 nt, 28 nt, 29 nt 또는 30 nt일 수 있다. 당업자라면 30 nt 초과의 길이를 갖는 뉴클레오티드 모듈레이터를 예상할 수 있다.
여기에 기술된 핵산 리간드는 활성 3차 구조를 가지며, 이것은 적절한 안정한 2차 구조의 형성으로 영향받을 수 있다. 그러므로, 상보성 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와 핵산 리간드 간의 듀플렉스 형성 메카니즘이 2개의 짧은 선형 올리고리보뉴클레오티드들 간의 듀플렉스 형성과 유사하지만, 이러한 상호작용을 디자인하는 규칙과 이 생성물의 형성 역학은 모두 분자내 리간드 구조에 의해 영향받을 수 있다.
핵산 리간드와 올리고뉴클레오티드 모듈레이터 사이의 초기 염기쌍 형성의 핵형성 속도는 안정한 최종 듀플렉스의 형성에서 중요한 역할을 하며, 이 단계의 속도는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터를 핵산 리간드에 존재하는 단일가닥 루프 및/또는 단일 가닥 3' 또는 5' 테일에 타겟팅하여 크게 증강된다. 발생하는 분자 내 듀플렉스의 최적 형성에 있어서, 자유 에너지는 타겟팅된 핵산 리간드 내에서 존재하는 분자 내 듀플렉스의 형성과 관련하여 분자 내 듀플렉스의 형성에 이상적으로 유리하다.
여기에 기술된 모듈레이터는 일반적으로 타겟팅된 핵산 리간드 서열의 적어도 일부에 상보하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 모듈레이터 올리고뉴클레오티드는 타겟 리간드의 약 6 nt(뉴클레오티드) 내지 25 nt, 8 nt 내지 20 nt, 또는 10 nt 내지 15 nt에 상보하는 서열을 포함할 수 있다. 모듈레이터 올리고뉴클레오티드의 길이는 여기에 기술된 방법과 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 타겟 리간드와 목적하는 효과를 고려하여 용이하게 최적화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 D 또는 L 입체화학을 가지는 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물로 제조할 수 있다. 자연적으로 발생하는 뉴클레오사이드는 D 배열 (configuration)로 존재한다.
올리고뉴클레오티드 모듈레이터가 핵산 리간드의 적어도 일부에 상보하는 서열을 포함하지만 절대 상보성은 필요하지 않다. 여기에서 지칭된 "핵산 리간드의 적어도 일부에 상보하는" 서열이란 핵산 리간드와 혼성화할 수 있는 충분한 상보성을 가지는 서열이다. 혼성화 능력은 상보성 정도와 핵산의 길이 모두에 좌우될 수 있다. 일반적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드가 클수록 타겟 리간드와의 염기 미스매치가 더 많아져서 이것은 안정한 듀플렉스(또는 경우에 따라 트리플렉스)를 함유하여 형성할 수 있다. 당업자라면 혼성화 복합체의 녹는점을 측정하는 표준방법을 사용하여 미스매치의 허용수준을 확인할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들의 키메릭 혼합물 또는 유도체 또는 변성 형태일 수 있다.
모듈레이터는 핵산 골격과 개별 핵산의 구조 모두에서 변성을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 모듈레이터는 리간드 내의 적어도 하나의 루프 영역에 상보하는 핵산이다. 다른 구체예에서, 모듈레이터는 리간드 내의 적어도 하나의 스템 영역에 상보하는 핵산이다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 적어도 하나의 루프 영역과 하나의 인접 스템 영역에 상보하는 핵산이다. 일부 구체예에서, 모듈레이터는 생리적 조건에서 리간드의 일부에 혼성화하는 적어도 하나의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 모듈레이터의 목적하는 작용에 따라 모듈레이터를 핵산 리간드의 2차 및/또는 3차 구조를 교란하거나 안정화하도록 디자인할 수 있다.
일부 구체예에서, 모듈레이터는 리간드 상에서 "자멸(suicide) 위치"에 결합하여 리간드의 서열을 교란하도록 디자인된다. 자멸 위치는 효소적 분해(cleavage)에 반응하는 리간드의 단일가닥 부분이다. 예시적인 일 구체예에서, 자멸 위치는 모듈레이터가 리간드에 결합 시 단일가닥으로 되고 불안정하게 되어 혈액 또는 간 엔도뉴클레아제 같은 순환 내의 효소에 의한 리간드 분해를 증강시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 모듈레이터는 리간드가 더 이상 그의 타겟과 상호작용할 수 없게 된 후 리간드에 결합한다.
일부 구체예에서, 모듈레이터 서열은 적어도 하나의 변성 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 변성이며, 이것은 2'-O-메틸 사이토신, 2'-O-메틸 유리딘, 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 구아노신, 2' 플루오로 사이티딘, 또는 2' 플루오로 유리딘을 포함할 수 있다.
다양한 전략들을 사용하여 핵산 리간드 내에서 올리고뉴클레오티드 모듈레이터가 결합하는 최적 부위를 결정할 수 있다. 상보성 올리고뉴클레오티드가 핵산 리간드를 "에워싸게" 되는 실험적 전략을 사용할 수 있다. 이 방법에 따르면, 약 15 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 올리고뉴클레오티드)를 사용할 수 있으며, 이들은 리간드 상에서 약 5 뉴클레오티드로 엇갈린다(예를 들어, 1-15, 6-20, 11-25 등의 리간드에 상보하는 올리고뉴클레오티드). 혼성화의 효능에 대한 핵산 리간드의 3차 구조의 영향은 예측이 어려울 수 있으므로 실험적 전략이 특히 효과적일 수 있다.
실시예 6과 8에 기술된 것과 같은 에세이는 핵산 리간드의 완전한 결합을 얻는데 필요한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량(molar excess)을 특히 강조하여 특이적 핵산 리간드에 혼성화하는 상이한 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하는데 사용할 수 있다. 그의 타겟 분자로부터 핵산 리간드의 해리속도를 증가시키거나 그의 타겟 분자와 리간드의 결합속도를 증가시키는 상이한 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 작용은, 예를 들어 BIACORE 에세이를 사용하는 표준 운동역학 시험을 수행하여 측정할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드의 5-50 배 몰 과량 이하가 리간드와 그의 타겟 분자 간의 상호작용을 바람직한 방법으로 변성하는데 필요할 정도로 선택할 수 있다.
선택적으로, 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와의 결합을 촉진하기 위해서 타겟팅된 핵산 리간드는 단일가닥 테일(3' 또는 5')을 포함하도록 변성될 수 있다. 적합한 테일은 1 내지 20 뉴클레오티드, 1 내지 10 뉴클레오티드, 1 내지 5 뉴클레오티드 또는 3 내지 5 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 테일은 또한 변성될 수 있다(예를 들어, 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 변성, 이들은 2'-O-메틸 사이토신, 2'-O-메틸 유리딘, 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 구아노신, 2' 플루오로 사이티딘, 또는 2' 플루오로 유리딘을 포함할 수 있다). 테일 리간드는 (예를 들어, 하기한 실시예에 기술된 바와 같이)결합 및 바이오에세이에서 시험되어 단일가닥 테일의 첨가가 핵산 리간드의 활성 구조를 교란하지 않는 것을 증명할 수 있다. 테일 서열과, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5 염기쌍을 형성할 수 있는 일련의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)를 디자인하고 단지 테일 리간드와 결합하는 이들의 작용뿐만 아니라 그의 타겟 분자로부터의 리간드의 해리 속도 또는 그의 타겟 분자와 리간드의 결합 속도를 증가시키는 작용을 시험할 수 있다. 스크램블(Scramble)된 서열 대조군을 사용하여 효과가 듀플렉스 형성 때문이며, 그리고 비특이적 효과가 아님을 증명할 수 있다.
다른 구체예에서, 모듈레이터는 리보자임이거나 DNA자임이다. 효소 핵산들은 타겟 RNA 또는 DNA에 먼저 결합하여 작용한다. 이러한 결합은 타겟 RNA를 분해하는 작용을 하는 분자의 효소 부분에 근접하여 유지되는 효소 핵산의 타겟 결합부위를 통해서 발생한다. 그러므로, 효소 핵산이 먼저 상보성 염기 짝짓기(pairing)에 의해 타겟 RNA 또는 DNA를 인식하여 결합하고, 일단 정확한 부위에 결합하면 효소적으로 작용하여 타겟 RNA를 절단하여 RNA 리간드가 불활성화한다. 적어도 5 종류의 리보자임이 있으며, 각각은 상이한 종류의 특이성을 나타낸다. 예를 들어, 그룹 I 인트론은 약 300 내지 >1000 뉴클레오티드의 크기이고 절단 부위의 5' 인접 타겟 서열 내에 U를 필요로 하며 절단 부위의 5'-측에서 4-6 뉴클레오티드와 결합한다. 다른 종류는 RNaseP RNA (M1 RNA)이며, 약 290 내지 400 뉴클레오티드의 크기이다. 세 번째 종류는 해머헤드 리보자임(Hammerhead Ribozyme)이며, 이들은 약 30 내지 40 뉴클레오티드의 크기이다. 이들은 절단 부위의 5' 인접 타겟 서열 UH(여기서 H는 G가 아님)를 필요로 하며, 절단 부위의 양측에서 다양한 수의 뉴클레오티드를 결합한다. 네 번째 종류는 헤어핀(Hairpin) 리보자임이며, 약 50 뉴클레오티드의 크기를 가진다. 이들은 절단 부위의 3' 인접 타겟 서열 GUC를 필요로 하며 절단 부위의 5'-쪽에서 4 뉴클레오티드와 절단 부위의 3'-쪽에 가변적인 수를 결합한다. 다섯 번째 그룹은 헤파티티스 델타 바이러스(Hepatitis Delta Virus, HDV) 리보자임이며, 약 60 뉴클레오티드의 크기이다. DNA자임은 단일가닥이고, RNA와 DNA 모두를 절단한다. DNA자임의 일반적 모델이 제안되어있으며, "10-23" 모델로 알려져 있다. "10-23" 모델에 따른 DNA자임은 15 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인을 가지며, 각각 7 내지 9 뉴클레오티드의 2개 기질-인식 도메인이 측면에 있다.
다른 구체예에서, 모듈레이터 자체는 핵산 리간드이다. 이 구체예에서, 목적하는 치료 타겟에 결합하는 제1 리간드가 생성된다. 제2 단계에서, 제1 리간드에 결합하는 제2 리간드는 여기에 기술된 SELEX 방법 또는 다른 방법을 사용하여 생성되고, 치료 리간드와 타겟 간의 상호작용을 조절한다. 일 구체예에서, 제2 리간드는 제1 리간드의 효과를 불활성화한다.
다른 예시적인 구체예에서, 모듈레이터는 PNA, MNA, LNA, 또는 PCO를 포함하는 모듈레이터이다. 올리고뉴클레오티드 모듈레이터의 핵염기(nucleobase)는 핵염기 간 결합, 예를 들어 펩티딜 결합(펩티드 핵산(PNA)의 경우에서처럼; Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497 및 미국 특허 제5,539,082호) 및 모폴리노 결합(Qin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11(2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997); Taylor et al., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169 (1996)), 또는 다른 자연적 또는 변성된 결합에 의해 연결될 수 있다. 올리고핵염기(oligonucleobase)는 또한 잠금 핵산(LNAs)일 수 있다. Nielsen et al., J Biomol Struct Dyn 17, 175(1999); Petersen et al., J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen et al., Bioconjug Chem 11, 228 (2000).
PNA는 올리고뉴클레오티드와 유사하지만 조성이 다른 화합물이다. PNA에서, 올리고뉴클레오티드의 데옥시리보스 골격은 펩티드 골격으로 대체된다. 펩티드 골격의 서브유니트 각각은 자연적으로 발생하는 또는 비자연적으로 발생하는 핵염기에 결합한다. PNA는 종종 N-(2-아미노에틸)글리신 단위체로 구성되는 비키랄성 (achiral) 폴리아미드 골격을 가진다. 퓨린 또는 피리미딘 염기는 각 단위체에 메틸렌 카보닐 링커(1-3)에 의해 결합되어 상보성 핵산을 타겟팅한다. PNA는 상보성 RNA 또는 DNA에 평행 또는 비평행 배향으로 왓슨-크리크 염기쌍 규칙에 따라 결합한다. PNA 올리고머의 비전하 성질은 자연적인 호모듀플렉스와 비교하여 혼성화 PNA/DNA(RNA) 듀플렉스의 안정성을 증가시킨다.
모폴리노 핵산은 모폴리노 서브유니트로부터 조립되기 때문에 그렇게 명명되었으며, 각각은 6원의 모폴린 고리에 연결된 4개의 유전적 염기(아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민) 중 하나를 포함한다. 4가지 서브유니트 타입의 서브유니트를 특정한 순서로 비이온성 포스포로디아미데이트 서브유니트 간 결합으로 연결하여 모폴리노 올리고를 얻는다.
LNA는 이것을 모듈레이터를 위한 프라임 캔디데이트가 되게 하는 특징을 가지는 일종의 DNA 유사체이다. LNA 모노머는 RNA-모노머와 구조적으로 유사한 바이사이클릭 화합물이다. LNA는 DNA와 RNA의 대부분의 화학적 특성을 공유하고 수용성이며, 전기영동, 에탄올 침전 등에 의해 분리할 수 있다(Tetrahedron, 54, 3607-3630 (1998)). 그러나, LNA 모노머를 DNA 또는 RNA 올리고에 도입하므로써 상보성 DNA 또는 RNA와의 듀플렉스의 높은 열 안정성을 얻고, 동시에 왓슨-크리크 염기쌍 규칙을 따른다.
슈도사이클릭 올리고핵염기(PCO)는 또한 모듈레이터로서 사용될 수 있다(미국 특허 제6,383,752호 참조). PCO는 이들의 3'-3' 또는 5'-5' 말단에 의해 결합된 2개 올리고뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. PCO 세그먼트들 중 하나("작용 세그먼트")는 약간의 작용성(예를 들어, 타겟 RNA에 대한 상보성)을 가진다. 다른 세그먼트("보호 세그먼트")는 (작용 세그먼트에 결합되어 있는 말단에 따라)작용 세그먼트의 3'- 또는 5-' 터미널 말단에 상보한다. 작용 세그먼트와 보호 세그먼트 간의 상보성 결과, PCO는 타겟 핵산(예를 들어, RNA)이 없을 때에 분자 내 슈도사이클릭 구조를 형성한다. PCO는 3'-3' 또는 5'-5' 결합의 존재와 분자 내 슈도사이클릭 구조의 형성으로 인하여 종래의 올리고뉴클레오티드 보다 안정하다. 마우스에서의 약동학, 조직 분포 및 안정성 시험에서는 PCO가 일반적으로 PS-올리고뉴클레오티드 보다 더 높은 생체내 안정성을 가지며, 그와 비슷한 약동학 및 조직 분포 프로필을 가지지만, 선택된 조직으로부터 신속하게 제거되는 것으로 나타났다. 형광단(fluorophore)과 소광제 분자가 적절하게 본 발명의 PCO에 연결될 경우, 분자가 직선 배열일 때 분자는 형광을 내지만, 사이클릭 배치에서는 형광이 소광된다. 이러한 특징을 사용하여 잠재적인 모듈레이터인 PCO를 스크린할 수 있다.
다른 예시적인 구체예에서, 모듈레이터는 펩티드를 포함하는 모듈레이터이다. 핵산 리간드의 펩티드 포함 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 유사체에 대한 모듈레이터의 대체 분자 종류이다. 이 종류의 모듈레이터는 타겟 핵산 리간드의 충분히 활성인 올리고뉴클레오티드 모듈레이터가 타겟과 올리고뉴클레오티드 모듈레이터 사이의 핵형성을 촉진하는 충분한 단일가닥 영역의 결여로 인하여 단리될 수 없을 때 특히 유용하다. 또한, 펩티드 모듈레이터는 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와는 다른 생체내이용률과 약동학을 제공한다. 예시적인 일 구체예에서, 모듈레이터는 프로타민(protamine)(Oney 등, 2009, Nat. Med. 15:1224-1228)이다. 프로타민은 물에 녹으며, 열에 의해 응고하지 않고, 아르기닌, 알라닌 및 세린을 포함한다(또한 대부분 프롤린과 발린을 포함하고, 다수가 글리신과 이소루이신을 포함한다). 모듈레이터는 또한 프로타민 변이체(예를 들어, Wakefield 등, J. Surg. Res. 63:280 (1996) 참조)와, 미국 특허출원 공개 제20040121443호에 기술된 것과 같은 프로타민의 변성 형태를 포함한다. 다른 모듈레이터로는, 예를 들어 미국 특허 제6,624,141호와 미국 특허출원 공개 제20050101532호에 기술된 것과 같은 프로타민 단편이 있다. 모듈레이터는 또한, 일반적으로 헤파린, 다른 글라이코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 또는 프로티오글리칸(예를 들어, 미국 특허 제5,919,761호 참조)의 활성을 조절하는 펩티드를 포함한다. 예시적인 일 구체예에서, 모듈레이터는 폴리-L-리신 및 폴리-L-오르니틴과 같은 전하-전하 상호작용을 안정화하는 양이온-NH 그룹을 함유하는 펩티드이다.
타겟 핵산 리간드에 결합하여 그의 활성을 조절할 수 있는 펩티드를 단리하기 위한 몇몇 전략을 이용할 수 있다. 예를 들어, 비드에 고정된 인코딩 펩티드 조합 라이브러리가 기술되어 있으며, 바이러스 RNA 서열을 결합하고 바이러스 RNA와 상기 RNA 특이적으로 결합하는 바이러스 조절 단백질 사이의 상호작용을 교란할 수 있는 펩티드를 포함하는 것이 입증되었다(Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999, 96: 12997). 이러한 라이브러리를 사용하여 핵산 리간드의 모듈레이터를 타겟 핵산 리간드에 표지물을 부착하고 라이브러리의 일부 성분과 핵산 간의 결합이 유리한 조건 하에서 표지된 타겟과 비드에 고정된 펩티드 라이브러리를 함께 인큐베이션하여 단리할 수 있다. 핵산 리간드와 특정 펩티드의 제공된 비드 상에서의 결합이 핵산 리간드 상에서 표지물에 의해 비드가 "발색"되게 하므로 간단한 비드의 단리에 의해 타겟을 결합할 수 있는 펩티드를 동정할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법으로 단리된 펩티드와 타겟 핵산 리간드 간의 직접적 상호작용은 핵산 리간드의 모듈레이터를 동정하기 위해 기술된 결합 에세이를 사용하여 확인 및 정량할 수 있다. 상기 펩티드의 타겟 핵산 리간드의 활성을 조절하는 능력은 적절한 생체에세이로 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 모듈레이터는 단백질이다. 예를 들어, 특정 구체예에서 핵산 리간드는 비오틴 분자에 연결된다. 예를 들어, 스트렙타바딘(streptavadin) 또는 아비딘을 투여하여 리간드에 결합하고 리간드의 효과를 역전시킨다(Savi et al., J Thrombosis and Haemostasis, 6: 1697-1706 참조). 아비딘은 새, 파충류 및 양서류의 난관에서 생산되는 테트라머 단백질로, 그의 난백에 침전된다. 스트렙타비딘은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 정제된 테트라머 단백질이다. 테트라머 단백질은 4개의 동일한 서브유니트(호모테트라머)를 함유하며, 각각은 비오틴(비타민 B7, 비타민 H)에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있다. CLEC-2 핵산 리간드의 단백질 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드에 의해 결합된 CLEC-2 도메인의 가용성 부분일 수 있다. 예를 들어, CLEC-2 폴리펩티드의 ECD 또는 그의 단편은 세포 결합되거나 자연적인 CLEC-2에 결합하는 CLEC-2 핵산 리간드와 경쟁하여 자연적인 CLEC-2 분자와 CLEC-2 핵산 리간드의 결합을 반전할 수 있다.
추가 구체예에서, 모듈레이터는 올리고사카라이드를 포함하는 모듈레이터이다. 올리고사카라이드는 핵산과 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 항생제 아미노글리코시드는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 생성물이며, 다양한 리보자임, 리보솜의 RNA 성분, 및 HIV-1의 TAR 및 RRE 서열 같은 RNA 분자의 다양한 어레이와 특이적으로 상호작용한다. 따라서, 올리고사카라이드는 핵산에 결합하여 핵산 리간드의 활성을 조절하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 모듈레이터는 작은 분자를 포함하는 모듈레이터이다. 리간드와 타겟 사이에 삽입되거나, 리간드와 타겟 사이의 결합을 교란 또는 변성하는 작은 분자는 치료학적 조절제로서 사용될 수 있다. 이러한 작은 분자들은 리간드와 작은 분자를 가지는 것과 가지지 않는 타겟 사이의 결합 변화를 측정하는 에세이에서 캔디데이트를 스크린하거나, 작은 분자를 가진 것과 가지지 않는 타겟에 대한 리간드의 생물학적 효과의 차이를 측정하는 생체 내 또는 시험관 내 에세이를 사용하여 동정할 수 있다. 작은 분자가 바람직한 효과를 나타내는 것이 확인되면 조합적 접근과 같은 기술을 사용하여 목적하는 조절 효과를 위한 화학적 구조를 최적화할 수 있다.
추가의 예시적인 구체예에서, 모듈레이터는 폴리머, 지질, 나노입자 또는 마이크로스피어와 결합하는 핵산이다. 다른 비제한적 실시예에서, 모듈레이터는 다음으로 구성되는 군에서 선택할 수 있다: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (EDOPC); 디라우로일에틸포스파티딜콜린 (EDLPC); EDLPC/EDOPC; 피리디늄 계면활성제; 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 (DOPE); (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (GAP-DLRIE) + 중성 코리피드(co-lipid) 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) (GAP-DLRIE/DOPE); (±)-N,N-디메틸-N-[2-(스퍼민 카복사미도)에틸]-2,3-비스(디올레일옥시-1-프로판이미늄 페타하이드로클로라이드 (DOSPA); 디라우로일에틸포스파티딜콜린 (EDLPC); 에틸디미리스토일 포스파티딜콜린 (EDMPC); (±)-N,N,N-트리메틸-2,3-비스(z-옥타데크-9-엔-오일옥시)-1-프로판아미늄 클로라이드 (DOTAP); (±)-N-2-(2-하이드록시에틸)-N,N-디메틸-2,3-비스(테트라데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (DMRIE); (±)-N,N,N-트리메틸-2,3-비스(z-옥타데크-9-엔일옥시)-1-프로판아미늄 클로라이드 (DOTMA); 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실-아미드 (DOGS); 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스퍼밀아미드 (DPPES); 1,3 디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필-아미드 (DOSPER); 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민 (TMTPS); 테트라메틸테트라올레오일 스퍼민 (TMTOS); 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민 (TMTLS); 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민 (TMTMS); 테트라메틸디올레일 스퍼민 (TMDOS); 디파이타노일포스파티딜-에탄올아민 (DPhPE); 및 (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(도데실옥시)-1-프로판아미늄 브로마이드 (GAP-DLRIE).
알코올); 아크릴 또는 메타크릴 폴리머; Newkome 덴드리머(dendrimer); 폴리페닐렌; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DAB); 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB); 알부민; 산 처리된 젤라틴; 폴리리신; 폴리오르니틴; 폴리아르기닌; DEAE-셀룰로스; DEAE-덱스트란; 및 폴리(N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트); 및 폴리프로필아민(POPAM).
일 구체예에서, 모듈레이터는 키토산과 키토산 유도체에서 선택된다. 키토산 유도체는 수용성 키토산 나노입자를 포함한다(미국 특허 제6,475,995호; 미국 특허출원 제2006/0013885호; Limpeanchob et al., (2006) Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles; Nareusan University Journal 14(2):27-34 참조). 키토산 폴리머(본질적으로 반복 글루코사민 모노머로 구성된 거대 폴리아민 폴리머)의 폴리캐티온 성질을 고려할 때, 키토산을 사용하여 리간드를 숙주에 주사한 후에 리간드를 생체 내에서 고분자전해질 복합체 내로 응집하거나/응집하고 캡슐화(encapsulation)할 수 있다. 이것은 부분적으로 키토산에서 발견된 1차 아민과 리간드의 포스포디에스테르 골격의 상호작용에 기초한다.
다른 구체예에서, 모듈레이터는 다음으로 구성되는 군에서 선택된다: 1,5-디메틸-1,5-디아자운데카메틸렌 폴리메토브로마이드; 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머; 폴리-L-리신; 폴리아미도아민 (PAMAM); β-사이클로덱스트린을 함유하는 폴리캐티온(polycation) (CDP); β-사이클로덱스트린을 함유하는 폴리캐티온(이미다졸 포함 변이체)(CDP-Im); 폴리포스포아미데이트 폴리머 (8kDa, 3OkDa) (PPA-DPA 8k, PPA-DPA 30k); 폴리브렌; 스퍼민; PEG-블록-PLL-덴드리머(dendrimer); 폴리에틸렌이민 (PEI); 만노스-PEI; 트랜스퍼린(transferin)-PEI; 리네라(linera)-PEI(lPEI); 젤라틴; 메타크릴레이트/메타크릴아미드; 폴리(베타-아미노 에스테르); 고분자전해질 복합체 (PEC); 폴리(비날리아민(vinalyamine)) (PVA); 콜라겐; 폴리프로필렌 이민 (PPI); 폴리알릴아민; 폴리비닐피리딘; 아미노아세탈화된 폴리(비닐
특정 구체예에서, 키토산 폴리머 상의 일차 아민은 수용성 및 전하 상태를 변경하기 위해 실질적으로 변성될 수 있다. 키토산 유도체는 상이한 정도의 4차화 반응으로 합성될 수 있는 트리메틸 키토산 클로라이드(TMC); 다양성(polyampholytic) 폴리머인 모노-카복시메틸레이티드 키토산(MCC); 글루타르알데히드 가교된 유도체 (CSGA); 티올레이티드 키토산 (Lee, 등, (2007) Pharm, Res. 24: 157-67); 글리콜 키토산(GC), 에틸렌 글리콜과 컨쥬게이트된 키토산 유도체 (Lee, 등, (2007) Int J Pharm.); [N-(2-카복시벤질)키토산 (CBCS) (Lin, 등, (2007) Carbohydr Res. 342(l):87-95); 베타-사이클로덱스트린-키토산 폴리머 (Venter, 등 (2006) Int J Pharm. 313(l-2):36-42); O-카복시메틸키토산; N,O-카복시메틸 키토산; 또는 키토산의 골격에 잔타에이트기를 삽입하여 화학적으로 변성된 키토산이다.
일 구체예에서, 비어있는 키토산 나노입자를 제조하여 모듈레이터로서 사용하였다. 분자량이 10,000 Da 내지 > 1,000,000 Da 범위에 있는 키토산 또는 키토산 유도체를 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 키토산은 500,000 Da 이하이다. 특정 구체예에서, 키토산은 100,000 Da 이하이다. 일부 구체예에서, 화합물은 10,000 내지 100,000 Da, 10,000 내지 90,000, 10,000 내지 80,000, 20,000 내지 70,0000, 30,000 내지 70,000, 약 30,000, 약 40,000, 약 50,000 또는 약 60,000 Da이다.
일부 구체예에서, 다른 정도의 탈아세틸화된 1차 아민을 함유하는 키토산 폴리머를 사용하였다. 이러한 구체예에서, 상이한 정도의 탈아세틸화 반응은 폴리머의 전하 상태를 변화시켜서 폴리머 결합특성을 변화시킨다. 키토산 나노입자가 리간드와 숙주에서 접촉할 때, 리간드는 나노입자 표면과 결합하여 트랩되거나, 또는 나노입자에 유입되어 이온성 상호작용에 의해 캡슐화된다.
다른 구체예에서, 모듈레이터는 포스페이트 폴리머 마이크로스피어이다. 특정 구체예에서, 모듈레이터는 미국 특허 제6,548,302호에 기술된 폴리(L-락티드-코-에틸-포스파이트) 또는 P(LAEG-EOP) 등과 같은 마이크로스피어의 유도체이다. 이러한 폴리머는 폴리머 골격의 일부로서 다양한 작용그룹을 함유하도록 제조할 수 있다. 일 예로, 폴리머는 생리적 pH에서 양전하를 가지는 4차 아민을 함유하여 하나 이상의 핵산을 접촉 시에 복합체를 만들거나 캡슐화할 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리머는 양전하를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 모듈레이터는 양이온성 분자이다. 특정 구체예에서, 리간드는 구아닌 쿼텟(quartet) (G-쿼텟 또는 G-쿼드러플렉스(quadruplex)) 구조를 형성한다. 이러한 구조는 양이온 분자에 의해 결합된다. 특정 구체예에서, 분자는 금속 킬레이트 분자이다. 일부 구체예에서 모듈레이터는 포르피린(porphyrin)이다. 일부 구체예에서, 화합물은 TMPyP4이다. Joachimi, 등, JACS 2007, 129, 3036-3037 및 Toro, 등, Analytical Biochemistry 2008, Aug 1, 379 (1) 8-15 참조.
모듈레이터는 일반적으로 결합 에세이, 분자 모델링 또는 생물학적 작용의 변성을 측정하는 생체 내 또는 시험관 내 에세이에 의해 동정할 수 있다. 일 구체예에서, 모듈레이터와 핵산의 결합은 겔 시프트(shift) 에세이로 측정된다. 다른 구체예에서 모듈레이터와 핵산 리간드의 결합은 BIACORE 에세이에 의해 측정된다.
표준 결합 에세이를 사용하여 모듈레이터를 동정하고 선택할 수 있다. 비제한적 예는 겔 시프트 에세이와 BIACORE 에세이이다. 즉, 시험 모듈레이터를 타겟팅되는 핵산 리간드와 시험 조건 또는 전형적인 생리적 조건 하에서 접촉시키고 시험 모듈레이터가 실제로 리간드와 결합하는지 측정한다. 핵산 리간드와 결합하는 것이 확인된 시험 모듈레이터는 적절한 생체에세이(리간드와 그의 타겟 분자에 따라 변경, 예를 들어 응고시험)로 분석하여 시험 모듈레이터가 그의 타겟 분자 상의 리간드에 의해 유발된 생물학적 효과에 영향을 미칠 수 있는지 측정할 수 있다.
겔 시프트 에세이는 결합능을 평가하는데 사용되는 공지된 기술이다. 예를 들어, CLEC-2에 대한 핵산 리간드를 먼저 CLEC-2 단백질 또는 그의 단편, 또는 CLEC-2 단백질 또는 단편을 함유하는 혼합물과 함께 인큐베이션한 다음, 전기영동에 의해 겔에서 분리한다. 단백질에 리간드가 결합하면서, 복합체의 크기가 더 커지고, 그에 따라 그의 이동이 CLEC-2 단백질의 부재 시 겔에서 대조군 레인에 적용될 수 있는 자유 리간드의 이동보다 지연될 것이다. 리간드는, 예를 들어 방사능 또는 비방사능 잔기로 표지되어 겔 내에서 리간드 CLEC-2 복합체를 검출할 수 있게 된다. 겔 시프트 에세이를 CLEC-2 결합활성을 갖는 리간드를 스크린하는데 사용하는 경우, 복합체를 겔에서 추출하고 단리된 리간드를 분석하여 목적하는 CLEC-2 결합활성을 갖는 리간드를 동정할 수 있다.
모듈레이터와 핵산 리간드의 결합이 자유 리간드의 이동성과 관련하여 핵산 리간드의 이동성을 지연하기 때문에 겔 시프트 에세이는 또한 핵산 리간드와 CLEC-2를 결합하는 모듈레이터를 스크린하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Rusconi et al., 2002, Nature, 419:90-94 참조).
추가적으로, 모듈레이터를 이러한 에세이 포맷에 첨가하여 CLEC-2 핵산 리간드와 CLEC-2의 결합을 차단하는 그의 능력을 스크린할 수 있다. 예를 들어, CLEC-2 리간드 혼합물을 증가한 양의 잠재적인 모듈레이터 존재 하에서 인큐베이션할 수 있다. 바람직한 활성을 갖는 모듈레이터는 겔 시프트 에세이에 의해 검출된 CLEC-2 리간드 복합체의 형성을 특이적으로 감소시킨다.
BIACORE 기술은 폴리펩티드-핵산 상호작용을 포함한 거대분자 상호작용을 확인하고 분석하는 신뢰성 있고 유용한 방법으로 당업자들에게 알려져 있다. 따라서, CLEC-2 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머 또는 리간드를 스크린하거나 동정하기 위해 이 기술을 사용할 수 있다. BIACORE 기술은 센서칩 (sensor chip) 표면에서의 결합을 측정하여 표면에 부착된 반응물이 분석의 특이성을 결정한다. 요컨대, CLEC-2 단백질 또는 단편이 센서칩 표면에, 예를 들어 히스티딘 태그(tag)에 의해 부착될 수 있다. 이후, 결합된 CLEC-2 단백질은 잠재적인 리간드 분자를 함유하는 용액에 노출된다. 핵산 리간드와 CLEC-2 단백질의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR) 시그널에서 즉각적인 변화를 일으킨다. 시그널은 표면에 결합한 분자의 질량에 정비례한다.
겔 시프트 에세이에서 기술된 바와 같이, BIACORE는 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 동정하거나 분석하는데 사용될 수 있다. 또한, 칩에 결합된 CLEC-2 단백질이 노출된 반응 혼합물은 증가한 양의 모듈레이터를 갖는 기지의 CLEC-2 리간드와 CLEC-2와 그 리간드 사이에서 생성된 상호작용에 대한 표준 BIACORE 분석으로 측정된 효과를 모두 함유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 또는 이들의 유사체, 펩티드, 폴리펩티드, 올리고사카라이드 또는 소분자가 타겟과의 상호작용이 변성되는 방법으로 리간드에 결합할 수 있는지를 측정할 수 있는 수많은 다른 에세이들이 있다. 예를 들어, 전기영동 이동성 시프트 에세이 (EMSAs), 적정 열량측정법, 섬광근접 에세이, 분석용 초원심분리를 사용한 침강평형 에세이 (예를 들어, www.cores.utah.edu/interaction 참조), 형광편광 에세이, 형광 비등방성(anisotropy) 에세이, 형광강도 에세이, 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 에세이, 니트로셀룰로스 필터 바인딩 에세이, ELISAs, ELONAs (예를 들어, 미국 특허 제5,789,163호 참조), RIAs, 또는 평형 투석 에세이를 시료가 핵산 리간드와 결합하는 능력을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 시료와 핵산 리간드 간의 상호작용을 직접적으로 측정하는 직접 에세이를 수행하거나, 그의 타겟으로부터 리간드를 대체하는 시료의 능력을 측정하는 경쟁 또는 대체 에세이를 수행할 수 있다(예를 들어, Green, Bell and Janjic, Biotechniques 30(5), 2001, p 1094 및 미국 특허 제6,306,598호 참조). 일단 캔디데이트 조절제가 확인되면, 그의 타겟에 대한 핵산 리간드의 활성을 조절하는 능력을 바이오에세이로 확인할 수 있다. 선택적으로, 시료가 리간드와 그의 타겟의 상호작용를 조절할 수 있는 것을 확인하면, 이러한 결합 에세이를 사용하여 시료가 직접적으로 리간드와 상호작용하는 것을 확인하여 이러한 상호작용의 친화성을 측정할 수 있다.
또다른 구체예에서, 질량 분석법(mass spectrometry)을 핵산 리간드에 결합하는 모듈레이터, 모듈레이터와 핵산 리간드 간의 상호작용 부위, 및 리간드에 대한 시료의 상대적 결합 친화성의 확인에 사용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,329,146호 참조). 이러한 질량 스펙트럼 방법은 또한 화학적 혼합물 또는 라이브러리, 특히 조합 라이브러리를 리간드의 모듈레이터로서 사용될 수 있는 선택된 타겟 리간드에 결합하는 개별 화합물에 대해 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 기술은 다수의 타겟 핵산 리간드를 동시에, 예를 들어 화합물의 조합 라이브러리에 대해 스크린하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 질량 스펙트럼 기술을 사용하여 복수의 분자종, 특히 "소(small)" 분자와 타겟 리간드 상의 분자 상호작용 부위 간의 상호작용를 확인할 수 있다.
다른 구체예에서, 핵산 리간드와 타겟 간의 상호작용을 변성하는데 있어서 모듈레이터의 효능을 평가하는 생체 내 또는 시험관 내 에세이는 치료되는 질환에 특이적이며, 핵산 리간드에 결합하는 모듈레이터의 동정에 사용될 수 있다. 잘 알려져 있으며 사용가능한 생물학적 특성들에 대한 간단한 표준 에세이들이 있다. 생물학적 에세이의 예는 특이적 적용에 대해서 특정 핵산 리간드를 기술하고 있는, 본 원에서 인용된 특허들에 개시되어 있다.
일 구체예에서, 모듈레이터는 10.0 마이크로몰(μM) 미만, 1.0 마이크로몰(uM), 바람직하게 0.1 μM 미만, 더욱 바람직하게 0.01 μM 미만의 모듈레이터 농도로 용액 중의 핵산 리간드에 실질적으로 결합하는 능력을 가진다. "실질적으로"라는 용어는 타겟 생물학적 활성의 적어도 50 % 감소가 타겟 존재 하에서 조절에 의해 관찰되는 것을 의미하며, 50% 감소는 여기에서 IC50값으로 지칭된다.
최적화 리간드 및 모듈레이터
치료제로서 사용하는데 적합한 리간드를 위하여, 리간드는 바람직하게 합성하는 비용이 들지 않고 숙주에서의 사용이 안전하며 생체내에서 안정하다. 야생형 RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제로의 분해에 대한 이들의 감수성 (susceptibility)으로 인하여 전형적으로 생체 내에서 안정하지 않다. 뉴클레아제 분해에 대한 저항성은 2'-위치에서 변성그룹의 결합으로 크게 증가시킬 수 있다.
2'-플루오로 또는 아미노 그룹은 리간드가 나중에 선택되는 올리고뉴클레오티드 풀(pool)에 포함될 수 있다. 본 발명에서, 2'-플루오로피리미딘은 시험관 내 전사반응에서 사용되어 리간드 선택을 위한 초기 올리고뉴클레오티드 풀을 생성한다(실시예 1 참조).
(예를 들어, SELEX에 의해)리간드와 (예를 들어, 서열 상보성에 기초한 디자인)모듈레이터의 초기 동정 후에 리간드와 모듈레이터를 변성시키고 조작하여 그의 바람직한 구조, 작용 및/또는 안정성을 다양한 방법으로 개선할 수 있다. 이것은, 예를 들어 특정한 당 잔기의 치환, 특정 영역의 조성과 크기 및/또는 리간드 내에서의 구조 변경, 및 모듈레이터에 의해 더 효과적으로 조절될 수 있는 리간드 디자인을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.
핵산 리간드의 디자인과 최적화는 리간드 2차 구조에 대한 평가뿐만 아니라 2차 구조와 모듈레이터 조절 간의 연관성을 포함한다. 핵산을 변성하는 일반적인 방법과는 달리, CLEC-2 단백질에 대한 리간드의 설계는 잠재적인 모듈레이터의 디자인에서 리간드에 대한 변화의 영향을 고려하는 것을 포함할 수 있다. 리간드가 트렁케이션에 의해 변성되면, 예를 들어 상응하는 모듈레이터는 트렁케이트된 리간드를 조절하도록 디자인되어야 한다.
SELEX 방법으로 동정된 리간드의 2차 구조는 당업자들에게 알려진 다양한 방법에 의해 추정될 수 있다. 예를 들어, 각 서열은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석될 수 있으며, 소프트웨어 프로그램의 예로는 Mfold (mfold.bioinfo.rpi.edu; Zuker, 2003, Nucleic Acids Res. 31:3406-3415 및 Mathews, et al., 1999, J. Mol. Biol. 288:911-940 참조)가 있다. 이어서, 선택된 다양한 서열의 비교 서열 분석을 사용하여 보존된 컨센서스 2차 구조성분에 기초한 서열을 정렬하여 CLEC-2 리간드에 대한 추정 2차 컨센서스 구조에 도달할 수 있다.
여기에 기술된 CLEC-2 핵산 리간드는 스템 및 루프 구조의 길이뿐만 아니라 전체 리간드 길이를 변화시켜서 변성할 수 있다. 예를 들어, 리간드 트렁케이션을 생성할 수 있으며, 여기에서 리간드의 5' 및/또는 3' 말단의 일부는 SELEX 방법에서 선택된 리간드로부터 제거된다. 리간드로 용인(tolerate)된 트렁케이션의 범위를 결정하기 위하여, 사용된 하나의 방법은 리간드의 5' 또는 3' 터미널 영역에 상보하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, DNA 올리고뉴클레오티드)를 가열 어닐링한 다음, 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 가지는 리간드와 가지지 않는 리간드의 결합을 비교할 수 있다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 가지는 리간드와 가지지 않는 리간드 간에 유의한 결합 차이가 관찰되지 않는다면, 리간드의 어닐링된 부분이 리간드와 타겟 단백질의 결합에 불필요한 것임을 시사한다. 이 방법은 다양한 길이의 리간드 5' 또는 3' 말단에 어닐링한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되어 완전한 작용 리간드를 제공하는 5' 및 3' 경계를 결정할 수 있다.
또다른 구체예에서, 디자인은 리간드 크기의 감소를 포함한다. 다른 구체예에서, 모듈레이터의 크기는 리간드의 크기와 관련하여 변경된다. 또다른 구체예에서, 구아닌 가닥은 4개 미만의 구아닌 또는 3개 미만의 구아닌 또는 2개 미만의 구아닌으로 감소되거나 구아닌이 없다. 그러나, 이러한 변화의 결합 효과는 적절한 활성을 제공하지만 모듈레이터에 의해 용이하게 중화되는 리간드를 생성하는 과제를 만족하여야 한다.
모듈레이터의 타겟팅에 있어서, 개선된 리간드는 또한 올리고뉴클레오티드 모듈레이터와의 결합을 촉진하기 위해서 단일가닥 테일(3' 또는 5')을 포함하도록 변성될 수 있다. 적합한 테일은 1 nt 내지 20 nt, 바람직하게 1 nt 내지 10 nt, 1 nt 내지 5 nt 또는 3 nt 내지 5 nt를 포함할 수 있고, 여기에서 테일 내 각 위치에서 뉴클레오티드는 A, C, G, T, 또는 U일 수 있다. 이러한 테일이 이하에 상세하게 기술한 바와 같이 변성된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있다.
테일된 리간드를 결합 및 (예를 들어, 하기한 바와 같은)바이오에세이에서 시험하여 단일가닥 테일의 첨가가 리간드의 활성 구조를 교란하지 않는 것을 입증할 수 있다. 테일 서열과, 예를 들어 1, 3 또는 5개 염기쌍을 형성할 수 있는 일련의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)를 디자인하여 타겟 분자로부터 리간드의 해리 속도 또는 리간드와 타겟 분자의 결합 속도를 증가시키는 그의 능력뿐만 아니라 테일 리간드만을 결합하는 그의 능력을 시험할 수 있다. 스크램블된 서열 대조군을 사용하여 효과가 듀플렉스 형성 때문이며 비특이적 효과가 아님을 증명할 수 있다.
CLEC-2 리간드는 또한 자멸 위치를 가지도록 디자인되어 짝지어진(paired) 모듈레이터에 의해 더 효과적인 조절이 가능하다. 모듈레이터에 의한 리간드의 결합 시에 자멸 위치는 단일가닥이 되고 불안정하게 되어 혈액 내에 자연적으로 존재하는 효소, 예를 들어 혈액 또는 간 엔도뉴클레아제에 의해 리간드의 분해가 가능하다. 이것은 순환(circulation)에서 활성 리간드의 효과적이고 실질적으로 즉각적인 제거 방법을 제공한다.
화학적 변성
핵산의 치료학적 사용에서 마주하게 되는 문제 중 하나는 핵산의 포스포디에스테르 형태의 올리고뉴클레오티드가 목적하는 효과가 나타나기 전에 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제와 같은 세포내 및 세포외 효소에 의해 체액 내에서 빨리 분해될 수 있다는 것이다. 핵산 리간드의 특정한 화학적 변성은 핵산 리간드의 생체내 안정성을 증가시키거나 또는 핵산 리간드의 전달을 강화 또는 매개할 수 있다. 또한, 특정한 화학적 변성은 타겟에 대한 핵산 리간드의 친화성을 필요한 구조성분의 핵산 리간드 내 형성을 안정화하거나 촉진하여, 또는 타겟 분자와의 추가의 분자 상호작용을 제공하여 증가시킬 수 있다.
리간드의 변성은 핵산 리간드 염기 또는 리간드 전체에 추가 전하를 포함하는 화학 그룹, 분극률, 소수성, 수소결합, 정전기적 상호작용 및 작용성을 제공하는 것들로, 이에 한정되지 않는다. 변성은 염기 잔기, 당 잔기, 또는 인산염 골격에서, 예를 들어 분자의 안정성과 목적하는 타겟에 대한 친화성 같은 특성을 개선하기 위해 일어날 수 있다. 이러한 변성은, 예를 들어 2'-위치 당 변성, 5-위치 피리미딘 변성, 8-위치 퓨린 변성, 엑소사이클릭 아민에서의 변성, 4-티오유리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-유라실의 치환, 골격 변성, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변성, 메틸레이션, 이소염기 이소사이티딘 및 이소구아니딘 등과 같은 특이한 염기쌍 조합이며, 이에 한정되지는 않는다. 변성은 또한 캡핑(capping)과 같은 3' 및 5' 변성을 포함할 수 있다.
SELEX 방법은 리간드에 개선된 특징, 예를 들어 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변성된 뉴클레오티드를 함유하는 고 친화성 핵산 리간드의 동정을 포함한다. 이러한 변성은 리보스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환이다. 변성된 뉴클레오티드를 함유하는 SELEX로 동정된 핵산 리간드는 피리미딘의 5- 및 2'-위치에서 화학적으로 변성된 뉴클레오티드 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있는 미국 특허 제5,660,985호에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변성된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 특이적 핵산 리간드를 기술하고 있다.
SELEX 방법은 미국 특허 제5,637,459호 및 제5,683,867호에 기술된 바와 같이 선택된 올리고뉴클레오티드와 다른 선택된 올리고뉴클레오티드 및 비올리고뉴클레오티드 작용 단위체의 조합을 포함한다. 미국 특허 제5,637,459호는 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변성된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 매우 특이적인 핵산 리간드를 기술하고 있다. SELEX 방법은 또한 선택된 핵산 리간드와 미국 특허 제6,011,020호에 기술된 진단 또는 치료 복합체 중의 친유성 또는 비면역원성 고분자량 화합물의 조합을 포함한다.
핵산 리간드를 SELEX 방법으로 유도하는 경우에, 변성은 SELEX 이전 또는 이후의 변성일 수 있다. SELEX 이전 변성은 타겟에 대한 특이성과 개선된 생체 내 안정성을 가지는 리간드를 얻을 수 있다. 2'-하이드록실 (2'-OH) 핵산 리간드에 대해 만들어진 SELEX 이후 변성은 핵산 리간드의 결합능에 부정적 영향을 미치지 않고 생체내 안정성을 개선할 수 있다. 일 구체예에서, 리간드의 변성은 분자의 3' 말단에서의 3'-3' 반전 포스포디에스테르 결합, 및 일부 또는 모든 뉴클레오티드의 2' 플루오로(2'-F), 2' 아미노(2'-NH2), 2'데옥시, 및/또는 2' O 메틸 (2'-OMe)을 포함한다.
여기에 기술된 리간드는 전사 라이브러리를 사용하여 SELEX에 의해 먼저 생산되며, 여기에서 C와 U 잔기는 2'-플루오로 치환되고 A와 G 잔기는 2'-OH였다.
특정 구체예에서, 리간드를 구성하는 핵산은 변성 당 및/또는 변성 염기를 포함한다. 특정 구체예에서, 변성은 2'-안정화 변성과 같은 안정화 변성을 포함한다. 일 구체예에서, 2'-안정화 변성은 당 고리 상의 2'-플루오로 변성을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 리간드 또는 모듈레이터, 또는 모두의 2'-하이드록실 함량을 감소하는 디자인을 포함한다. 다른 구체예에서, 리간드 또는 모듈레이터, 또는 모두의 2'-플루오로 함량을 감소하는 디자인을 포함한다. 다른 구체예에서, 리간드 또는 모듈레이터, 또는 모두의 2'-O-메틸 함량을 증가하는 디자인을 포함한다.
약학 조성물에서 리간드는 용해도 또는 생체내이용률을 개선하는 염 형태 같은 형태로 제공될 수 있다. 적합한 염은 소듐 및 칼륨 같은 무기 양이온을 포함한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당분야에서 공지된 표준 방법, 예를 들어 (예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems으로부터 상업적으로 입수가능한)자동 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.
리간드와 조절제(modifier)는 여기에서 당업자들이 용이하게 이해하는 약어를 사용하여 기술되었으며 다음과 같이 표시되었다: "rA"는 2'OH A 또는 아데노신이고; "A"는 2'-데옥시 A 또는 2'-데옥시아데노신이며; "mA"는 2'-O-메틸 A 또는 2'-메톡시-2'-데옥시아데닌; "rG"는 2'-OH G 또는 구아노신; "G"는 2'-데옥시 G 또는 2'-데옥시구아노신; "mG"는 2'-O-메틸 G 또는 2'-메톡시-2'데옥시구아노신; "fC"는 2'-플루오로 C 또는 2'-플루오로-2'데옥시사이티딘; "mC"는 2'-O-메틸 C 또는 메톡시-2'-데옥시사이티딘; "fU"는 2'-플루오로 U 또는 2'-플루오로-유리딘; "mU"는 2'-O-메틸 U 또는 2'-메톡시-유리딘이고; "iT"는 반전된 2'H T이다.
캐리어(Carrier)와의 커플링
여기에 기술된 리간드는 또한 생체내이용률 또는 안정성을 개선하는 변성을 포함할 수 있다. 이러한 변성은, 제한적인 것은 아니나 친수성 또는 소수성 잔기를 포함할 수 있는 담체 분자에 대한 컨쥬게이션을 포함할 수 있다.
CLEC -2 매개 장애를 치료하는 방법
일 구체예에서는 CLEC-2 매개 장애의 치료를 필요로 하는 숙주에게 여기에 기술된, 치료학적 유효량의 리간드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 투여하는 것을 포함하는 CLEC-2 매개 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
CLEC-2는 혈소판 응집의 매개체로서 처음 확인되었다(리뷰용으로 Suzuki -Inoue et al, 2011, J. Thromb Haemostasis, 9(Sl):44-55 참조). 나중에 CLEC-2가 혈전 형성과 안정화에 관여하는 것이 입증되었다. 따라서, CLEC-2의 작용 또는 활성을 저해할 수 있는 CLEC-2 리간드는 수많은 혈소판 매개 장애의 치료적 중재에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, CLEC-2 매개 장애는 혈관 장애를 포함한다. 또다른 구체예에서, 혈관 장애는 급성 관동맥 증후군, 혈전증, 혈전색전증, 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 말초혈관질환, 및 일과성 허혈발작으로 구성되는 군에서 선택된다. 여기에 기술된 조성물은 또한, 예를 들어 및 비제한적으로 일과성 허혈발작, 허혈성 뇌졸중, 및 색전증 같은 뇌혈관 장애의 치료에 유용하다.
일 구체예에서, CLEC-2 매개 장애는 당뇨관련장애이다. 일 구체예에서, 당뇨 관련장애는 당뇨성 망막병증, 당뇨성 혈관병증, 죽상동맥경화증, 허혈성 뇌졸중, 말초혈관질환, 급성 신장 외상 및 만성 신부전으로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, CLEC-2 매개 장애는 혈소판 매개 염증성 장애이다. 또다른 구체예에서, 혈소판 매개 염증성 장애는 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염 및 강피증으로 구성되는 군에서 선택된다.
일 구체예에서, CLEC-2 매개 장애는 암이다. 혈소판이 암 전이 및/또는 진행에 연관된다는 것은 오랫동안 제시되어 왔다(Nash et al., 202, Lancet Oncol, 3:425-430). 종양 세포를 둘러싸고 있는 혈소판 응집물은 이들을 전단응력과 혈액 중의 NK 세포로부터 보호할 수 있어서 종양 세포 둥지의 형성이 용이하다. 또한, 내인성 CLEC-2 리간드인 포도플라닌의 발견 이후, 실험 데이터들은 CLEC-2/포도플라닌이 항전이성 약물의 살아있는 타겟일 수 있음을 시사하였다. 예를 들어, 항-포도플라닌 블로킹 항체는 포도플라닌을 발현하는 종양 세포로 구성되는 전이성 폐 결절의 수를 상당히 억제하였다(Kato et al., 2008, Cancer Sci, 99:54-61).
여기에 기술된, CLEC-2 매개 혈소판 응집을 저해하는 것으로 나타난 CLEC-2 리간드는 종양 전이의 치료 및 저해에 있어서 치료학적 용도를 가진다. 일 구체예에서, 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 고환암, 췌장암, 뇌암, 뼈암 및 간암으로 구성되는 군에서 선택된다. 그러나, 여기에 기술된 CLEC-2 리간드가 전이되었거나, 당업자들에 의해 전이될 것으로 판단된 암을 치료 또는 저해하는데 유용할 수 있다.
일 구체예에서, CLEC-2 리간드는 혈소판 활성화의 개시를 저해한다. 다른 구체예에서, CLEC-2 리간드는 혈소판 활성화와 생성된 혈소판 염증전 반응을 저해한다. 다른 구체예에서, CLEC-2 리간드는 혈소판 부착을 저해한다. 다른 구체예에서, CLEC-2 리간드는 혈소판 응집을 저해한다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 리간드는 트롬빈 생성을 저해한다.
특정 구체예에서 여기에 기술된 CLEC-2 핵산 리간드를 그의 필요에 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈관성 문제, 특히 혈전성 또는 혈전색전성 문제의 형성을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드는 장기간 동안 제공된다. 일 예에서, CLEC-2 리간드 모듈레이터는, 예를 들어 치료가 두개 내 출혈 또는 위장관내 출혈을 포함하는 출혈을 유발하는 경우 응급 상황에서만 사용할 수 있을 뿐이다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 응급 수술이 CLEC-2 핵산 리간드 처치를 받은 환자에게 필요할 때 투여된다. 또다른 구체예에서, 모듈레이터는 CLEC-2 핵산 리간드의 농도를 조절하여서 처치의 지속 및 강도를 조절하기 위해 투여된다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드를 심폐 바이패스 시술 동안 혈소판 마취제로서 제공한다. 또다른 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드를 투여하여 경구 항-혈소판 약물의 트랜지션(transition) 오프 또는 경구 항-혈소판 약물에 대한 트랜지션 온 기간을 제공하며, 경구 항-혈소판 약제의 치료 농도가 확립되면 모듈레이터를 사용하여 CLEC-2 핵산 리간드를 반전시킨다.
여기에 기술된 방법은 다른 치료요법과 조합하여 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 숙주는 외과적 중재를 받기 위해 준비 중이거나 받는 중이며, 또는 폐색성 혈전 발생의 위험에서 외과적 중재를 받는다. 다른 구체예에서, 숙주는 혈액투석할 수 있는 혈관 이식을 받으며, 이것은 혈관과 혈소판 간의 상호작용으로 인한 폐색의 위험에서이다.
일 구체예에서 치료요법은 숙주를 치료학적으로 유효량의 항암제 또는 항혈전제로 치료하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 치료요법은 숙주를 HIV 항바이러스제, 면역모듈레이터, 및 항감염제로 구성되는 군에서 선택된 항HIV제의 치료학적으로 유효량으로 치료하는 것을 포함한다.
투여 및 약학 조성물
여기에 기술한 CLEC-2 핵산 리간드 또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터는, 제한적인 것은 아니나 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 조성물의 정확한 성질은 적어도 부분적으로, 안정한 변성과 같은 리간드 및/또는 모듈레이터의 성질, 및 투여 경로에 따라 달라진다. 모듈레이터를 함유하는 조성물은 CLEC-2 핵산 리간드의 활성을 조절하고, 따라서 투여된 CLEC-2 핵산 리간드의 항-혈소판 활성을 조절하도록 CLEC-2 핵산 리간드가 제공된 숙주에게 투여하기 위해 디자인될 수 있다.
약학적 또는 약리학적 조성물의 디자인 및 제조는 본 발명의 측면에서 당업자들에게 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주입가능 형태; 주사 전 액체 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태; 경구 투여용 정제 또는 기타 고체; 서방형 캡슐제; 경구 투여용 액체; 엘릭서제, 시럽제, 좌약제, 겔제, 또는 당업계에서 사용된 기타 형태, 예를 들어 점안액, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등으로 제조할 수 있다. 수술 분야에서 특별한 부위를 처치하는 외과의, 내과의 또는 건강관리 작업자에 의한, 식염수를 포함하는 세정제와 같은 멸균 제제의 사용은 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치, 미세입자 또는 스폰지에 의한 전달용으로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 국소 전달용 스텐트(stent) 같은 임플란트 의료 장치에 코팅될 수 있다.
CLEC-2 핵산 리간드 또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터를 포함하는 약학적으로 유용한 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체의 혼합으로 적어도 부분적으로 제제화될 수 있다. 이러한 담체의 예와 제제의 제조방법은 Remington에서 찾을 수 있다: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (Lippincott Williams & Wilkins, 2000) and Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th Ed. (Media, Pa.: Williams & Wilkins, 1995).
적합한 약학적 첨가제로는 안정화제, 산화방지제, 삼투압 조절제, 완충액, 및 pH 조절제, 예를 들어 비제한적인 예로 인산염 완충 식염수가 있다. 적합한 첨가물은 생리적 생체적합성 완충액(예를 들어, 트로메타민 하이드로클로라이드), 킬란트(chelant) (예를 들어, EDTA, DTPA 또는 DTPA-비스아미드) 또는 칼슘 킬레이트 복합체(예를 들어, 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아미드)의 첨가, 또는 임의로 칼슘염 또는 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨, 염화칼슘, 아스코르브산칼슘, 글루콘산칼슘 또는 락트산칼슘 등)의 첨가를 포함한다. 약학 조성물은 액체 형태로 사용하기 위해 포장할 수 있으며, 또는 동결건조할 수 있다.
효과적인 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 조성물을 형성하기 위해 이러한 조성물은 핵산 리간드 또는 모듈레이터의 유효량을 함유한다. 이러한 조성물은 하나 이상의 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 조성물은 전형적으로 약 0.1% 중량퍼센트 (wt%) 내지 약 50 wt%, 약 1 wt% 내지 약 25 wt%, 또는 약 5 wt% 내지 약 20 wt%의 활성제(리간드 또는 모듈레이트)를 함유한다.
여기에서는 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입 등의 비경구 투여용 약학 조성물을 제공한다. 비경구적 투여용으로는 무균 현탁액과 용액이 바람직하다. 일반적으로 적합한 보존제를 함유하는 등장성 제제는 정맥 내 투여가 바람직할 때 사용된다. 약학 조성물은 멸균하고/하거나, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤제 또는 에멀젼화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충액과 같은 보조제를 포함할 수 있다. 액체, 특히 주사가능한 조성물은, 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조할 수 있다. 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어 물, 완충수, 식염수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해하거나 혼합하여 주사가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 또한, 주사 전에 액체에 용해하는데 적합한 고체 형태를 제제화할 수 있다.
제제를 수성 환경에 잘 용해되도록 하기 위해, 계면활성제를 습윤제로 첨가할 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트 등이다. 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있으며, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토미움 클로라이드가 있다. 계면활성제로 제제에 포함될 수 있는 비이온성 계면활성제는, 예를 들어 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스 및 Pluronic F68 및/또는 Pluronic F127과 같은 플루론 계면활성제 (예를 들어, Strappe 등, Eur. J. of Pharm. Biopharm., 2005, 61 :126-133 참조)이며, 이에 한정되지는 않는다. 계면활성제는 단백질 또는 유도체의 제제 내에 단독으로 또는 다른 비율의 혼합물로 존재할 수 있다.
정제 또는 캡슐제 형태의 경구 투여에서 활성 약물성분은 경구용, 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체, 예를 들어 에탄올, 글리세롤, 물 등과 배합할 수 있다. 또한, 필요하다면 또는 원한다면, 적합한 결합제, 광택제, 붕해제 및 착색제를 혼합물에 포함시킬 수 있다. 적합한 결합제는 제한이 없으며, 예를 들어 전분, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸트 또는 소듐 알기네이트와 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등이다. 이러한 복약 형태에서 사용된 광택제는 제한이 없으며, 예를 들어 소듐 올리에이트, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등이다. 붕해제에는 제한이 없으며, 예를 들어 전분, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 잔탄검 등이다.
경구 투여에서 사용된 액체 형태에 있어서, 활성 약물성분은 적합하게 풍미된 현탁제 또는 분산제, 예를 들어 트라가칸트, 아카시아, 메틸 셀룰로스 등의 합성 및 천연 검에 배합시킬 수 있다. 사용가능한 다른 분산제는 글리세린 등이다.
활성 약물 성분을 함유하는 국소 제제는 당업계에 잘 알려진 다양한 담체 물질, 예를 들어 알코올, 알로에 베라 겔, 알란토인, 글리세린, 비타민 A와 E 오일, 미네랄 오일, PPG2 미리스틸 에테르 프로피오네이트 등과 혼합하여, 예를 들어 알코올 용액, 국소 클렌저, 클린싱 크림, 스킨젤, 스킨 로션, 및 크림제 또는 겔제의 샴푸를 형성한다.
리간드는 또한 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여할 수 있으며, 예를 들어 소형 단일라멜라 소포체(unilamellar vesicle), 거대 단일라멜라 소포체 및 다중라멜라 소포체 등이다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린 같은 다양한 인지질로부터 형성할 수 있다. 직접(예를 들어, 단독으로) 또는 리포좀 제제로 투여되는 활성제는, 예를 들어 미국 특허 제6,147,204호에 기술되어 있다.
리간드는 또한 표적화 약물 담체로서 가용성 폴리머와 결합할 수 있다. 이러한 폴리머는, 예를 들어 폴리비닐-피롤리돈, 피란 코폴리머, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아미드-페놀, 폴리하이드록시-에틸아스파트아미드페놀 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드 폴리리신이다. 또한, 리간드는 약물의 조절된 방출을 얻는데 유용한 생분해성 폴리머 종류와 (바람직하게 공유결합에 의해)결합할 수 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리옥사졸린, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오소에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로-피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 코폴리머가 있다. 콜레스테롤 및, 유사 분자가 핵산 리간드에 연결되어 생체내이용률을 증가시키고 지속할 수 있다.
본 발명의 모듈레이터를 포함하는 친유성 화합물과 비면역원성 고분자량 화합물을 사용을 위해 제제화하고 당분야에서 현재 알려진 또는 후속 개발된 다양한 기술로 제조할 수 있다. 전형적으로, 이들은 인지질, 예를 들어 디스테아로일 포스파티딜콜린으로부터 제조되며, 중성 지방, 예를 들어 콜레스테롤과, 양전하 화합물(예를 들어, 콜레스테롤의 스테릴아민 또는 아미노만노스 또는 아미노만니톨 유도체) 또는 음전하 화합물(예를 들어, 디아세틸 포스페이트, 포스파티딜 글리세롤) 등의 표면개질제와 같은 다른 물질을 포함할 수 있다. 다중라멜라 리포좀은 일반적인 방법, 즉 선택된 리피드를 적합한 용기 또는 관의 내부 벽에 침착시키고, 리피드를 적절한 용매로 용해시킨 다음, 용매를 증발시켜서 관 내부에 얇은 막을 형성하거나 스프레이 건조시켜서 형성할 수 있다. 이후, 수성층을 스월링(swirling) 또는 보텍싱 동작으로 관에 첨가하여 다중라멜라 리포좀 소포체(MLV)를 형성한다. 단일라멜라 리포좀 소포체(UV)는 MLV의 균질화, 초음파처리 또는 압출(필터에 의해)에 의해 형성시킬 수 있다. 또한, UV는 계면활성제 제거방법으로 형성시킬 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 복합체는 리포좀 표면과 결합된 표적화 핵산 리간드 및 캡슐화된 치료제 또는 진단제를 갖는 리포좀을 포함한다. 미리 형성된 리포좀을 변성하여 핵산 리간드와 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 양이온성 리포좀은 핵산과의 정전기적 상호작용에 의해 결합한다. 선택적으로, 콜레스테롤과 같은 친유성 화합물에 부착된 핵산은 미리 형성된 리포좀에 첨가되어 콜레스테롤이 리포좀막과 결합하게 된다. 선택적으로 핵산은 리포좀의 배합 동안 리포좀과 결합할 수 있다.
또다른 구체예에서, 스텐트 또는 의료장비는 CLEC-2 리간드 또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터를 포함하는 제제로 숙련된 기술자들에게 알려진 방법으로 코팅할 수 있다.
또한 치료 키트를 고려할 수 있다. 키트는 시약, 활성제, 및 방법을 실시하는데 필요할 수 있는 물질을 포함한다. 키트는 일반적으로, 적합한 용기 수단 내에, CLEC-2 리간드 및/또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터의 약학적으로 허용가능한 제제를 함유한다. 키트가 CLEC-2 리간드와 CLEC-2 모듈레이터를 모두 포함하는 경우, 일부 구체예에서 CLEC-2 모듈레이터는 키트 내에서 CLEC-2 리간드를 결합하는 모듈레이터이다. 키트는 단일 용기 장치를 가지거나/가지고, 각각의 화합물을 위한 개별 용기 장치를 가질 수 있다.
투여방법
숙주에게 본 발명의 CLEC-2 리간드 및/또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터를 투여하는 방법은 비경구(주사 또는 시간에 따른 단계적 주입), 정맥내, 피내, 관절내, 활액내, 척추 강내, 동맥내, 심장내, 근육내, 피하, 안와내, 관절낭내, 척수강내, 흉골내, 국소, 경피 패치, 직장, 구강, 질내 또는 요도 좌약제, 복막, 경피, 비강 스프레이, 외과 임플란트, 체내의 외과적 페인트, 주입 펌프 또는 카테터에 의해서 가능하며, 이에 한정되지는 않는다. 일 구체예에서, 약물 및 담체는 임플란트, 알약, 미립자, 마이크로스피어, 나노입자 또는 나노구 같은 서방 제형으로 투여된다. 일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드는 피하 주사 또는 (예를 들어, 삼투 펌프에 의한)피하 주입을 포함하는 침착에 의해 전달된다.
일 구체예에서, CLEC-2 핵산 리간드는 피하 투여로 전달되며 모듈레이터는 피하 또는 정맥내 투여로 전달된다.
본 발명의 리간드와 모듈레이터를 포함하는 치료 조성물은, 예를 들어 단일투여량의 주사 등에 의해, 정맥 내로 투여할 수 있다. 치료 조성물과 관련하여 사용된 "단일 투여량"이란 용어는 숙주를 위한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위체를 지칭하며, 각 단위체는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 결합하여 목적하는 치료효과를 생산하도록 계산된 활성물질의 미리 결정된 양을 함유한다.
또한, 비경구 투여를 위한 방법 중 하나는 완효성 또는 서방성 시스템의 이식을 적용하여 일정 수준의 용량이 유지되는 것을 보장한다.
예를 들어, 환부 관절의 사이질(interstitium)에 국소 투여하는 것을 제공한다. 국소 투여는, 예를 들어 시린지 또는, 니들(needle)과 같은 주사 장치를 함유하는 제품의 기타 부품과 같이 주사에 의해 가능하다. 시린지로부터의 투여속도는 시린지의 내용물을 분산하기 위해 필요한 시간 동안 조절된 압력으로 제어할 수 있다. 다른 예에서, 국소 투여는 주입으로 가능하며, 이것은 펌프 또는 다른 유사한 장치를 사용하여 촉진할 수 있다.
또한, 혈관 조직에 국소 투여하기 위한 비제한적이고 대표적인 방법이 제공되며; 이 방법은 (1) 핵산 리간드를 포함하는 겔로 혈관 조직을 생체내 전달을 위해 코팅하거나 함침시키고, 예를 들어 코팅되거나 함침된 관을 제거 또는 바이패스된 손상되거나 질환이 있는 혈관 조직 대신에 이식하고; (2) 카테터에 의해 전달을 목적하는 혈관에 전달하고; (3) 조성물을 환자에게 이식될 관에 펌핑하는 것을 포함한다. 선택적으로, 화합물은 세포에 마이크로주사 또는 리포좀 캡슐화에 의해 삽입될 수 있다.
또한, CLEC-2 리간드를 함유하는 약학 조성물로 스텐트와 같은 의료장비를 코팅하여 대상에게 CLEC-2 리간드를 투여하는 방법을 제공한다. 리간드의 적절한 방출과 투여를 가능하게 하는 코팅방법은 당업자들에게 공지되어 있다.
여기에 기술된 조성물을 위한 최적의 투약 요법은 당업자들에 의해 용이하게 구성될 수 있으며, 모듈레이터, 환자 및 목적하는 효과에 따라 변경될 수 있다. 유효량은 다양한 인자들, 예를 들어 개인의 증상, 체중, 성별, 연령 및 투여된 핵산 리간드의 양에 따라 변화될 수 있다. 다른 인자로는 투여방법이 있다.
약학적으로 유효한 용량은 질환의 종류, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유동물의 종류, 고려 중인 특정 포유동물의 신체적 특성, 동시 투약 및 의료분야의 당업자가 인식하는 기타 인자들에 따라 달라진다. 일반적으로 조성물은 체중에 대해 조절된 용량으로 조절되며, 예를 들어 용량은 약 1 μg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중의 범위이다. 보다 전형적으로, 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 보다 전형적으로 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 1.0 내지 약 5.0 mg/kg, 또는 약 1.0 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 3.0 mg/kg, 약 4.0 mg/kg, 약 5.0 mg/kg, 약 6.0 mg/kg, 약 7.0 mg/kg, 약 8.0 mg/kg, 약 9.0 mg/kg 또는 약 10.0 mg/kg이다. 전형적으로, 투약량은 초기에 약물의 혈장 농도를 약 0.002 μg/ml 내지 약 2000 μg/ml 약물, 보다 전형적으로 약 2.0 μg/ml 내지 약 400 μg/ml, 보다 전형적으로 약 10 μg/ml 내지 200 μg/ml, 또는 약 20 μg/ml 내지 약 100 μg/ml 약물, 약 20 μg/ml, 약 40 μg/ml, 약 60 μg/ml, 약 80 μg/ml, 약 100 μg/ml, 약 120 μg/ml, 약 140 μg/ml, 약 160 μg/ml, 약 180 μg/ml, 또는 약 200 μg/ml를 제공한다.
모듈레이터를 리간드가 이미 투여된 숙주에게 투여하는 경우, 모듈레이터 대 리간드의 비율은 리간드의 바람직한 저해 수준에 기초하여 조절할 수 있다. 모듈레이터 투약량은 리간드의 투약량과의 상관관계에 기초하여 계산할 수 있다. 일 구체예에서, 모듈레이터 대 리간드의 중량 대 중량 투약량 비율은 1:1이다. 다른 구체예에서, 모듈레이터 대 리간드의 비율은 1:1 초과, 예를 들어 2:1 또는 약 2:1, 3:1 또는 약 3:1, 4:1 또는 약 4:1, 5:1 또는 약 5:1, 6:1 또는 약 6:1, 7:1 또는 약 7:1, 8:1 또는 약 8:1, 9:1 또는 약 9:1, 10:1 또는 약 10:1 이상이다. 다른 구체예에서, 모듈레이터 대 리간드의 투약량 비율은 약 1:1 미만, 예를 들어 0.9:1 또는 약 0.9:1, 0.8:1 또는 약 0.8:1, 0.7:1 또는 약 0.7:1, 0.6:1 또는 약 0.6:1, 0.5:1 또는 약 0.5:1, 0.45:1 또는 약 0.45:1, 0.4:1 또는 약 0.4:1, 0.35:1 또는 약 0.35:1, 0.3:1 또는 약 0.3:1, 0.25:1 또는 약 0.25:1, 0.2:1 또는 약 0.2:1, 0.15:1 또는 약 0.15:1, 0.1:1 또는 약 0.1:1 또는 0.1:1 미만, 예를 들어 약 0.005:1 이하이다. 일부 구체예에서, 중량 대 중량 투약량 비율은 0.5:1 내지 0.1:1, 또는 0.5:1 내지 0.2:1, 또는 0.5:1 내지 0.3:1이다. 다른 구체예에서, 중량 대 중량 투여량 비율은 1:1 내지 5:1, 또는 1:1 내지 10:1, 또는 1:1 내지 20:1이다.
리간드는 매일 단일 투여, 격일 투여로 정맥 내로 투여하거나, 전체 1일 용량을 수회 분할된 투약량으로 투여할 수 있다. 리간드 및/또는 모듈레이터 투여는 1일 1회(q.d.), 1일 2회 (b.i.d.), 1일 3회 (t.i.d.) 또는 필요한 만큼 그 이상 제공할 수 있다. 그런 다음, 모듈레이터를 적합한 장치에 의해 제공하여 핵산 리간드의 효과를 모듈레이터의 투여에 의해 변경한다. 핵산 리간드는 주 2회, 매주, 2주 마다 또는 매월 피하로 투여할 수 있다. 일부 구체예에서, 리간드 또는 모듈레이터를 1일 1회 미만 투여한다. 예를 들어, 리간드는 격일, 3일 마다, 4일 마다, 매주 또는 매월 투여할 수 있다.
일 구체예에서, 다른 제제들의 동시투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 활성제가 별도 용량 제형인, 하나 이상의 활성제로의 병용치료에서, 활성제는 동시에 투여되거나 이들 각각은 별개의 엇갈린 시간에 투여될 수 있다.
조성물은 용량 제형과 화합할 수 있는 방법과 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여될 양은 치료할 숙주, 활성성분을 사용하는 숙주 시스템의 용량, 및 목적하는 치료효과 정도에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따르며, 특히 각 개인에 따른다. 그러나, 전신성 사용에 적합한 용량 범위를 여기에 기술하였으며, 투여 경로에 따라 달라진다. 투약에 적합한 요법 역시 가변적이지만, 처음 투여 후 한 시간 이상의 간격으로 후속 주사 또는 다른 투여방법으로 반복투여하는 것으로 정형화된다. 선택적으로, 혈액내 농도를 생체내 치료요법으로 특정된 범위로 유지하는데 충분한 연속 정맥 내 주입이 제공된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 제2 제제가 사용될 경우, 제2 제제는 별개 용량 형태로 또는 화합물 또는 조성물과의 단일 용량의 일부로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 하나 이상을 장애, 질환 또는 증상을 치료하기 위해 단독 투여(monotherapy) 적용에서 사용할 수 있지만, 이것은 또한 병용 투여에서 사용할 수 있으며, 여기에서 본 발명의 화합물 또는 조성물(치료제)의 사용은 동일 및/또는 다른 종류의 장애, 증상 및 질환을 치료하는 하나 이상의 다른 치료제와 조합된다. 병용 요법은 둘 이상의 치료제를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 치료제는 어떤 순서로도 투여할 수 있다. 선택적으로, 다수의 치료제를 환자에게 투여할 수 있는 단일 조성물로 조합할 수 있다.
CLEC-2 리간드 및, CLEC-2 리간드 모듈레이터의 특성화 방법
일 측면에서 본 발명은 CLEC-2의 활성제 또는 저해제로서 작용할 수 있는 CLEC-2 리간드를 특성화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 CLEC-2 매개 혈소판 응집에 대한 CLEC-2 활성을 평가한다. 일 구체예에서, 에세이는 시험관 내 또는 생체 외에서 전체 혈액 유동에 기초한 혈소판 부착 에세이를 사용하여 수행된다.
다양한 시험으로부터 CLEC-2가 콜라겐 코팅된 표면에 대한 초기 혈소판 부착에 필요하지 않을 수 있지만 CLEC-2는 혈소판 응집과 혈전 성장의 안정화에 필요할 수 있는 것으로 나타났다. 혈전증에서 CLEC-2의 역할은, 예를 들어 마우스에서 CLEC-2 키메라를 사용하여 시험되었다. 이 시험은 CLEC-2가 시험관 내와 생체 내 모두에서 혈전 안정화에 관여되어 있다는 것을 시사하고 있다(Suzuki-Inoue, K. et al., 2010, J. Biol. Chem. 285, 24494-24507). 시험관 내 혈소판 응집물 안정화에서 CLEC-2 수용체의 역할은 또한 최근에 전체 혈액 관류 에세이를 사용하여 입증되었으며, 여기에서 CLEC-2 고갈 혈소판은 콜라겐 코팅 표면에 정상적으로 부착될 수 있었지만, 이후의 안정한 혈소판 응집물 형성은 중간체 하에서 높은 전단력으로 강력하게 손상되었다(May, F. et.al., 2009 Blood, 114:3464-3472). 이러한 연구를 통해 콜라겐과 접촉하지 않는 성장하고 있는 혈전에 모아진 혈소판에서 GPVI의 작용을 '담당(take over)'하여 CLEC-2가 혈전 증식에 기여할 수 있다는 가설이 세워졌다(Neswandt, B. et. al., 2011, J. Throm. Haemost, 9, suppl 1:92-104). 다시 말해서, 콜라겐 코팅된 표면에 대한 혈소판의 부착과 초기 혈전 형성은 GPVI에 의존하지만, 혈소판의 추가 응집, 즉 혈전을 형성하는 것은 CLEC-2가 필요하다.
유동 조건 하에서 콜라겐 코팅된 표면상의 혈소판 부착은 시험관 내와 생체 내 혈전 증식과 안정성 연구에 일반적으로 사용되고 있다. 이러한 유동 실험은, 예를 들어 BioFlux™(Fluxion Biosciences, South San Francisco, CA, 미국)같은 장비를 사용하여 수행되며, 이것은 시험관 내 모델에서 생리적 전단흐름을 에뮬레이션하는 기능을 제공하면서, 높은 스루풋(throughput) 웰 플레이트 포맷을 제공하기도 한다.
현재, 전체 혈액을 사용하는 시험관 내 유동 기반 혈소판 부착 에세이가 CLEC-2 매개 혈소판 응집물 형성의 활성제 또는 저해제를 동정하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 일 구체예에서, 전체 혈액의 전단 흐름에 영향을 받는 표면은 CLEC-2 의존성 혈소판 응집물 형성을 효과적으로 자극하는 것으로 알려진 로도사이틴으로 코팅된다. 실시예 10(도 12a)에 기술된 바와 같이, 로도사이틴으로 코팅된 표면의 사용으로 유동 조건 하에 전체 혈액 내에서 혈전 내 활성화된 혈소판의 축적이 뒷받침된다. 이후, 에세이 방법을 CLEC-2 의존성 혈소판 응집물 형성의 추정되는 저해제 또는 활성제 존재 하에 수행한다. 예를 들어, 전체 혈액 샘플을 CLEC-2를 결합하는 것으로 알려진 화합물(예를 들어, 여기에 기술된 CLEC-2 리간드 중 어느 하나)과 인큐베이션한다. CLEC-2 리간드의 존재 및 부재 하에서 혈소판 응집물 형성을 비교할 수 있다. CLEC-2 의존성 혈소판 응집물 형성의 저해제는 CLEC-2 리간드의 부재 하에서 혈소판 응집물 형성의 수준과 비교하여 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%까지 혈소판 응집물 형성의 수준을 저감하는 CLEC-2 리간드이다.
이 에세이는 또한 CLEC-2 리간드의 모듈레이터를 동정하는데 사용될 수도 있다. 실시예 10에 기술된 바와 같이, 전체 혈액 샘플은 CLEC-2 리간드의 존재 하, CLEC-2 리간드 모듈레이터의 추가 존재 하 또는 부재 하에서 인큐베이션할 수 있다. CLEC-2 리간드의 작용적 모듈레이터인 화합물은 CLEC-2 리간드의 활성을 반전하게 된다. 예를 들어, CLEC-2 리간드가 혈소판 응집물 형성의 수준을 저감하는 경우, CLEC-2 리간드의 작용적 모듈레이터를 첨가하여 CLEC-2 리간드 만의 존재하에서 보여진 수준과 비례하여 혈소판 응집물 형성을 증가시킨다.
CLEC-2 리간드의 작용을 특성화하는데 유용한 두 번째 전략에 있어서, 전체 혈액을 사용하는 시험관 내 유동 기반 혈소판 부착 에세이를 수행하며, 여기에서 전체 혈액은 가용성 콜라겐 타입 I(콜라겐 I)으로 코팅된 표면에 노출된다. 예를 들어, 실시예 10(도 12b)은 BIOFLUX를 사용하여 수행된 에세이를 나타내며, 여기에서 웰은 가용성 래트-테일 콜라겐 I으로 코팅된다. 이 전략에서, 전체 혈액 샘플은 가용성 콜라겐 I으로 코팅된 표면을 흘러가기 전에 로도사이틴과 함께 인큐베이션된다. 샘플 중 로도사이틴의 존재는 로도사이틴이 없는 혈액의 유동시 형성된 혈소판 응집물과 비교하여 가용성 콜라겐 I 코팅된 표면에서 거대 혈소판 응집물의 형성을 유발한다. CLEC-2 매개 혈소판 응집물 형성을 활성화하거나 저해하는 CLEC-2 리간드의 능력을 시험하기 위해 전체 혈액 샘플을 혈액 유동 단계 전에 CLEC-2 리간드와 인큐베이션한다. CLEC-2 리간드와의 인큐베이션은 로도사이틴과의 인큐베이션 전 또는 후에 수행할 수 있다. 선택적으로 CLEC-2 리간드와 로도사이틴은 동시에 혈액 샘플에 첨가된다. 상기한 바와 같이, 이후 CLEC-2 리간드의 존재 및 부재 하에서 혈소판 응집물 형성을 비교할 수 있다. CLEC-2 의존성 혈소판 응집물 형성의 저해제는 CLEC-2 리간드의 부재 하에서 혈소판 응집물 형성의 수준과 비교하여 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%까지 혈소판 응집물 형성의 수준을 저감하는 CLEC-2 리간드이다. 또한, CLEC-2 리간드 모듈레이터는 상기한 바와 같이 CLEC-2 매개 혈소판 응집물 형성에 대한 CLEC-2 리간드의 효과를 반전하는 그의 능력으로 특성화될 수 있다. CLEC-2 리간드의 작용적 모듈레이터인 화합물은 CLEC-2 리간드의 활성을 반전한다. 예를 들어, CLEC-2 리간드가 혈소판 응집의 수준을 저감하는 경우, CLEC-2 리간드의 작용적 모듈레이터의 첨가로 CLEC-2 리간드 만의 존재 하에서 보여지는 수준에 비례하여 혈소판 응집물 형성이 증가한다.
CLEC-2 리간드와 CLEC-2 리간드 모듈레이터의 작용적 활성을 특성화하는 이러한 에세이 방법들이 전체 혈액 샘플을 사용하는 것에 제한되지는 않는다. 혈액 샘플은, 특정 구체예에서 하나 이상의 자연적 혈액 성분들을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은, 특정 구체예에서 하나 이상의 인공적 혈액 성분들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 유동 에세이에서 사용된 혈액 샘플은 전체 혈액 또는 혈소판풍부혈장 또는 세척된 혈소판을 포함하는 샘플이다.
CLEC-2 리간드와 모듈레이터의 작용적 활성은 다양한 세포주, 예를 들어 내피세포, 수지상세포, 백혈구, 단핵구, 호중구, 대식세포, 림프구, 면역세포, 즉 천연 킬러 T 세포, B 세포를 사용하여 시험될 수 있다. 다양한 작용 에세이는 혈소판-혈소판 상호작용, 혈소판-단핵구 상호작용, 혈소판 백혈구 상호작용, 칼슘 시그널링, 세포 부착 에세이, 분비 에세이, LPS 유도 염증 에세이, 세포 이동 에세이, Syk 및 Srk 인산화반응 에세이, 리간드 결합에 대한 ELISA 에세이, 유동세포분석 기반 수용체 수용 에세이 또는 진단성 마커 에세이를 포함한다. 앱타머 리간드와 시험될 수 있는 CLEC-2 수용체 모듈레이터의 시약 및 합성 등가물은 가교된 항체, CLEC-2 수용체의 동종친화성(homophilic) 상호작용 시험, 소분자 저해제 및 활성제, 펩티드, 단백질, 모노클론 항체, 리포단백질, 지질화 펩티드 등이다.
다음 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시하기 위한 것이다. 이러한 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: CLEC-2에 대한 핵산 리간드의 동일성 확인
SELEX 방법은 하기 도 1에서 설명되고 예시된 바와 같이 CLEC-2와 결합한 리간드를 얻기 위하여 사용되었다.
캔디데이트 DNA 라이브러리는 템플레이트 DNA 올리고 1 nmol 및 5' DNA 프라이머 올리고 1.5 nmol을 가열 어닐링(heat annealing) 및 스냅-쿨링 (snap-cooling)하여 생성하였다. 캔디데이트 혼합물을 디자인하기 위한 Sel2 DNA 템플레이트 올리고의 서열은: 5'-TCTCGGATCCTCAGCGAGTC GTCTG(N40)CCGCA TCGTCCTCCC TA-3'(서열번호 4) (N40은 동일 몰량의 A, T, G 및 C로 합성된 40개의 연속된 뉴클레오티드를 의미한다)이고, 5' 프라이머 올리고 및 3' 프라이머 올리고는 각각, 5'-GGGGGAATTC TAATACGACT CACTATAGGG AGGACGATGC GG-3'(T7 프로모터 서열은 굵은 활자 부분이다), 및 5'-TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG-3'이다. 반응물에 엑소-클레노우(Exo-Klenow)를 채우고, 최종 2mM 농도로 EDTA를 첨가하여 중단시켰으며, PCI (페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1))로 추출한 후, 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 추출하였다. 추출물을 탈염시키고 농축하여 결합하지 않은 뉴클레오티드를 아미콘 10 스핀 컬럼 (Amicon 10 spin column)으로 제거하였다. DNA 템플레이트는 2'-플루오로피리미딘 출발 라이브러리를 만들기 위해 전사반응에서 이용되었다. 시험관 내 전사 조건은 4O mM Tris-HCl pH 8.0, 4% PEG-800, 12 mM MgCl2, 1 mM 스퍼미딘(spermidine), 0.002% 트리톤(Triton), 5 mM DTT, 1 mM rGTP, 1 mM rATP, 3 mM 2'F-CTP, 3 mM 2'F-UTP, 8 μg/mL 무기 파이로포스파타아제(pyrophosphatase), 0.5μM DNA 라이브러리, 및 Y639F 돌연변이 T7 폴리머라제이다. 전사반응물은 37℃에서 밤새 인큐베이션되었으며, DNase의 처리, 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 2회 추출, 아미콘 10 스핀 컬럼을 이용한 농축 후 12% 변성(denaturing) PAGE 겔에서 정제되었다. RNA를 겔에서 용출하고, 완충액를 교환한 후 아미콘 10 스핀 컬럼에서 TE (10 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EDTA) 세척으로 농축되었다.
CLEC-2 선별은 ~1014의 서로 다른 2'-플루오로피리미딘 RNA 서열의 복합체 (complex) 라이브러리로 출발하였다. 복합체 RNA 풀(pool)은 자성 스트렙타비딘 비드에 고정된 비오틴-PEG6-His6 펩티드에 대해 프리클리어(preclear)하였다. 프리클리어된 RNA를 정제된 N-터미널 His10 태그된 재조합 CLEC-2 단백질(서열번호 3)에 결합하였다. 정제된 히스티딘-태그 CLEC-2 단백질은 R&D Systems(Minneapolis, MN(미국), 카탈로그 번호 1718-CL-050)으로부터 얻었으며, Gln58-Pro229 잔기를 포함한다.
CLEC-2 리간드 선별을 결합 완충액 “F”에서 수행하였다. 결합 완충액 F는 20mM HEPES pH 7.4, 50mM NaCl, 2mM CaCl2, 및 0.01% BSA로 구성된다. 3 라운드에서 출발하여 0.0024% 효모 tRNA를 라운드 결합 반응물에 포함시켰다. 단백질-RNA 복합체는 25mm 니트로셀룰로스 디스크에서 분리하여 세척하였다. 결합된 RNA는 니트로셀룰로스 디스크를 추출하고 PCI(25:24:1)에서 인큐베이션하였다. 물을 첨가하여 수성층(aqueous phase)을 추출한 후, 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 추출하였다. 얻어진 결합된 RNA를 에탄올 침전시켰다. 침전된 RNA의 ¼은 3' 프라이머에 가열 어닐링되었고 AMV RT를 사용하여 역전사되었다. 전체 RT 반응이 PCR에서 5' 및 3' 프라이머와 표준 PCR 조건으로 사용되어, 다음 라운드의 RNA 생성을 위한 DNA 템플레이트를 생성하였다. 선별의 각 라운드를 위한 특정 조건을 도 2에 나타내었다.
CLEC-2에 대한 리간드 라이브러리의 농축(enrichment)을 직접결합시험 (direct binding studies)에서 SELEX의 각 라운드로부터의 방사능 표지된 리간드 RNA 및 가용성 CLEC-2를 이용하여 모니터링하였다. 결합 시험은, 결합 완충액 F 중의 CLEC-2의 연속 희석액에 첨가된 미량의 P32 말단-표지된 RNA로 수행되었다. 결합 시험을 위한 방사능 표지된 RNA를 조제하기 위해 100 피코몰의 RNA를 박테리아 알칼리 포스파타아제로 50 ℃에서 1시간 동안 탈인산화하였다. 반응물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1) 및, 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 추출한 후, 에탄올 침전시켰다. 3 피코몰의 탈인산화된 RNA는 공급된 완충액으로 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 그리고, 20 μCi의 γ-P32-ATP로 말단 표지되었으며, 이어서 Biorad MicroBio Spin P-30 스핀 컬럼으로 세척되었다. 말단 표지된 RNA는 2000 cpm/μL의 최종농도로 희석되었고 65 ℃에서 5 분간 열 변성되었다. RNA 및 CLEC-2 희석액은 사용 전에 37℃에서 평형화시켰다. RNA(5 μL)는 다양한 농도의 CLEC-2 (15μL)에 37 ℃에서 첨가되었으며, 5 내지 15분 동안 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 복합화된 RNA/CLEC-2 단백질 혼합물을 96웰 진공 매니폴드 시스템에서 Genescreen Plus Nylon 멤브레인과 겹쳐진 Protran BA95 니트로셀룰로스 멤브레인에 로딩하고 세척하였다. 멤브레인을 포스포이미저(phosphorimager) 스크린에 노출하여 스캐닝한 후, Molecular Dynamics Storm 840 Phosphorimager로 정량하였다. 결합된 부분은 니트로셀룰로스 상의 계수를 총 계수로 나누고 기본값에 대하여 조정하여 계산하였다. CLEC-2 선별의 결합에 대한 농축을 도 3에 나타내었다.
실시예 2: CLEC -2 핵산 리간드의 서열화 및 동정
실시예 1에 기술된 SELEX 실험의 라운드 10의 항-CLEC-2 농축 리간드 라이브러리를 나타내는 최종 PCR 산물을 EcoR1 및 BamH1으로 분해하고 정제 키트로 세척한 후 선형 pUC19 벡터에 방향성 클로닝하였다. 박테리아 콜로니를 단일 클론들에 스트리킹하였고, 5 mL의 오버나잇 배양물을 단일 콜로니로부터 접종하였다. 플라스미드 DNA를 단일 콜로니로부터 Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep 키트를 사용하여 제조하고 벡터 프라이머를 사용하여 서열화하였다. 총 42 클론을 서열화하였고 20 클론이 독특한 서열을 나타내었다. 이러한 독특한 서열 각각을 (실시예 1의 방법에 따른)CLEC-2 친화도 및 (실시예 8의 방법에 따른)로도사이틴으로 유발된 CLEC-2 의존성 혈소판 응집을 저해하는 능력에 대하여 평가하였다. 20 클론에 대해 얻어진 데이터를 분석한 후, 리간드 S2-20을 CLEC-2 의존성 응집의 고친화도 저해제로 동정하였고 하기한 바와 같이 충분히 특성화하였다.
DNA 랜덤 영역, 상응하는 RNA 랜덤 영역, 전체 길이 DNA, 전체 길이 RNA 및 앱타머 S2-20의 변성을 갖는 전체 길이 RNA의 서열을 표 1에 기재하였다. 전체 길이란 랜덤 영역에 플랭킹하는 고정 서열 부분의 서열뿐만 아니라 SELEX 방법에서 사용된 리간드 라이브러리의 랜덤 부분에서 유도된 서열을 포함하는 SELEX 방법에서 얻어진 서열을 지칭한다.
표 1: CLEC-2 리간드 S2-20의 서열
Figure pct00004
서열번호란 "변성된 서열"이란 제하의 컬럼에서 기술된 리간드의 변성되지 않은 버젼을 지칭하며; 서열은 5'-3' 방향으로 기재되었다.
rG=2'리보 G; rA=2'리보 A; fC=2'-플루오로 C; fU=2'-플루오로 U
CLEC-2에 대한 항CLEC-2 리간드의 친화도는 직접 결합 시험에 의해 실시예 1에 기술된 방사능표지된 미량 리간드 RNA와 가용성 CLEC-2를 사용하여 측정되었다. CLEC-2에 대한 항CLEC-2 리간드, S2-20의 친화도는 높았으며, ~1.4 nM의 Kd였다.
실시예 3: 항- CLEC -2 리간드 서열의 트렁케이션 탐지
S2-20의 잠재적인 2차 구조에 대한 스크리닝은 mfold 서버(mfold. bioinfo.rpi.edu)를 사용하여 수행되었다. 이 방법의 설명은 서버 사이트뿐만 아니라 문헌[M. Zuker (2003) "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction." Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15 및 D.H. Mathews, et al. (1999) "Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure" J. Mol . Biol . 288, 911-940]에서 확인된다. 항CLEC-2 리간드 S2-20에 대한 일련의 트렁케이트 화합물을 생성하였고(표 2), CLEC-2에 대한 이들의 친화도를 측정하였다(표 2). RB 587을 제외하고, 모든 트렁케이트를 시험관 내에서 DNA 템플레이트로부터 전사하였다. RB 587을 Mermade 12 DNA/RNA Synthesizer에서 idT 프리로딩 CPG로 합성하였다. S2-20 전체 길이 앱타머, S2-20 T10 트렁케이트, 및 RB587에 대한 결합 데이터를 도 4에 나타내었다.
표 2: S2-20 트렁케이션
Figure pct00005
서열번호란 "변성된 서열"이란 제하의 컬럼에서 기술된 리간드의 변성되지 않은 버젼을 지칭하며; 서열은 5'-3' 방향으로 기재되었다.
rG=2'리보 G; rA=2'리보 A; fC=2'-플루오로 C; fU=2'-플루오로 U
트렁케이트 S2-20 T10 및 RB587의 2차 구조를 도 5에 나타내었다. 5' 및 3' 말단의 예상된 경계는 스템 1과 작용적 항CLEC-2 리간드를 형성하기에 충분하였다. S2-20 T5에서처럼 스템 1의 3' 부분이 제거되면 CLEC-2에 대한 결합이 없어진다. S2-20 T7 및 S2-20 T8에 대한 결합 데이터는 스템 1이 5 염기쌍의 길이일 수 있고 여전히 필적할 만한 결합 친화도를 보유할 수 있음을 나타내고 있다. S2-20 T6 ext8 및 S2-20 T6 ext1O으로 입증된 바와 같이, 6 염기쌍에서 8-10 염기쌍으로 스템 1을 연장하는 것 또한 고친화도로 CLEC-2를 결합하였다. 따라서, 스템 1은 유사한 결합 친화도를 갖는 5-10 염기쌍의 길이일 수 있다.
스템 2는 바람직한 하부의 동요염기쌍을 갖는 4 염기쌍 스템이다. S2-20 T11은 스템 2의 하부 염기쌍이 U-G에서 C-G로 변경되는 단일 치환을 가진다. 이러한 치환은 잘 용인(tolerate)되지 않으며, 이것은 Kd의 심각한 증가(약 30배)로 입증된다.
실시예 4: 항 CLEC -2 리간드 서열의 돌연변이 탐지
루프 영역 내에 뉴클레오티드 돌연변이를 함유하는 S2-20 트렁케이트에 대한 일련의 돌연변이 화합물들을 생성하고 이들의 CLEC-2에 대한 결합 친화도를 측정하였다(표 3). RB588을 제외하고, 모든 돌연변이 트렁케이트를 시험관 내에서 DNA 템플레이트로부터 전사하였다. RB588을 Mermade 12 DNA/RNA Synthesizer에서 idT 프리로딩 CPG로 합성하였다.
표 3: S2-20 돌연변이
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
서열번호란 "변성된 서열"이란 제하의 컬럼에서 기술된 리간드의 변성되지 않은 버젼을 지칭하며; 서열은 5'-3' 방향으로 기재되었다.
rG=2'리보 G; rA=2'리보 A; fC=2'-플루오로 C; fU=2'-플루오로 U
트렁케이트 S2-20 서열의 2차 구조(도 5)는 2개 루프 구조가 있음을 나타내고 있으며, 여기에서 루프 1은 5'-GAC-3'이고 루프 2는 5'-CUCAUAUU-3'이다. 돌연변이 분석을 수행하므로써 루프 구조의 더 철저한 정의가 결정될 수 있다.
루프 1 염기 1에서, A (mut 25), C (mut 7), 또는 U (mut 33) 중 하나로의 치환은 허용되지 않았다. Mut 7은 기본적으로 CLEC-2 단백질에 대한 특이적 결합을 가지지 않았으며 화학적으로 합성된 버젼(RB588)이 추가 시험에서 음성 대조군으로 사용되었다. 루프 1의 제2 염기는 G (mut 31) 또는 U (mut 8)로의 치환을 용이하게 허용하여 이 위치가 퓨린 또는 피리미딘을 허용할 수 있음을 나타내었다. 이중 돌연변이(mut 1) 결합 데이터는 단일 포인트 돌연변이 데이터와 일치하였다. 루프 1의 제3 염기는 C인 것이 바람직하다. C의 다른 피리미딘 U (mut 26)로의 치환은 잘 허용되지 않았고 G (mut6)로의 치환도 허용되지 않았다. 이 데이터를 고려하면 루프 1은 컨센서스 서열 5'-GNC-3'(여기에서, "N"은 4 염기(A, G, C, T 또는 U) 중 어느 하나를 나타낸다)를 가지는 것으로 기술할 수 있다.
루프 2는 5'-CUCAUAUU-3' 서열을 갖는 8 염기 루프이다. 돌연변이 분석에서는 피리미딘이 염기 루프에 바람직한 것으로 나타났다. U (mut 17)로의 치환은 잘 허용되었으나 친화도에서 약간의 손실이 관찰되었다. 염기 1의 G (mut 9)로의 치환은 잘 허용되지 않았다. A (mut 10) 또는 C (mut 18)로의 치환이 허용되지 않았기 때문에 루프 2의 제2 염기에 U가 바람직하다. 피리미딘은 루프 3의 제3 염기에 바람직하고(mut 19), 퓨린으로의 치환(mut 11)은 잘 허용되지 않았다. 루프 2 염기 4는 퓨린(mut 20) 또는 피리미딘(mut 12) 치환을 허용할 수 있다. 이 위치가 퓨린 또는 피리미딘을 허용할 수 있지만 염기의 결실은 허용되지 않았다(mut 28). 염기 5는 유사한 결합 친화도로 A (mut 13) 또는 C (mut 21)로의 치환이 허용되었다. 또한, G (mut 32)로의 치환도 허용되었다. 이 위치가 치환을 용이하게 허용할 수 있지만, 이 위치에서의 결실은 허용되지 않는다(mut 37). 퓨린은 루프 2 염기 6에 바람직하다. 퓨린 치환(mut 22)은 허용되었으나, 어떤 피리미딘 치환도 허용되지 않았다(mut 14 및 mut 27). 피리미딘은 루프 2 염기 7에 바람직하다(mut 23). 염기 7에서 A (mut 15)로의 치환은 Kd를 증가시켰다. 돌연변이 15(Kd ~30nM)의 결합이 생성된 수많은 다른 돌연변이 구조물보다 상당히 양호하지만 이 위치에서 퓨린은 피리미딘보다 덜 바람직하다. U가 루프 2 염기 8에 바람직하다. 이 U의 C (mut 24) 또는 A (mut 16)로의 치환은 잘 허용되지 않았다.
이 데이터에 기초하여 바람직한 루프 2 컨센서스 서열은 다음과 같이 기재할 수 있다: 5'-Y U Y N N R Y U-3'(여기에서 "Y"는 피리미딘을 나타내고 "R"은 퓨린을 나타내며 "N"은 4 염기들 중 하나를 나타낸다).
실시예 5: 축퇴 ( Degenerate ) SELEX
S2-20 CLEC-2 리간드 서열 내 주요 뉴클레오티드를 동정하기 위해 축퇴 SELEX를 수행하였다. 축퇴 SELEX를 위한 출발 템플레이트 올리고는 계획적으로 N40 영역에 도입된 축퇴를 갖는 S2-20 서열이다. S2-20 축퇴 템플레이트 올리고의 합성은 원래 염기 60%와, S2-20 랜덤 영역 서열 전체에서 남아있는 3 염기 각각 13.3%였다. SELEX의 선택압에 S2-20 서열의 축퇴 버젼을 도입하여 뉴클레오티드 치환이 CLEC-2와의 결합에 바람직한 것을 결정할 수 있다. S2-20 축퇴 RNA 출발 풀(pool)은 CLEC-2에 대한 나이브(naive) Sel 2 같은 유사한 결합을 갖는다. 4 라운드의 선별 후에 축퇴 선별에서의 라운드 4 RNA 풀의 결합 친화도는 원래 선별로부터의 라운드 10 RNA와 비교할 만하다. 축퇴 S2-20 선별을 위한 특이적 조건을 도 6에 나타내었다. 라운드 3으로부터의 43 앱타머와 라운드 4로부터의 46 앱타머를 클론하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 서열화하였다.
출발 축퇴 풀을 초기 서열의 60% 보존으로 디자인하였다. 각 위치에서의 치환 빈도율을 분석하여 염기들이 치환을 용이하게 허용하는 지를 측정할 수 있다. 랜덤 영역의 라운드 3과 라운드 4 서열 모두에 대한 개별 위치에서 각 뉴클레오티드의 빈도를 도 7에 나타내었다. 서열의 랜덤 영역 내 최초 24 뉴클레오티드가 잘 보존되었다. 염기 위치 25-40은 디자인된 60%의 기준과 비교하여 상당히 낮은 보존을 함유하였다. 이 데이터는 CLEC-2에 결합하는데 필요한 최소 기본 영역을 나타내는 트렁케이션 데이터와 일치하였다.
축퇴 선별 분석에서는 또한 스템 1이 동요염기쌍을 허용할 수 있을 뿐만 아니라 스템 구조를 취하는 일부 최소한의 풀린 염기들이 온전히 남아있는 것으로 나타났다. 트렁케이트 데이터와 일치하는 스템 2는 축퇴 선별에서 잘 보존되었고, 스템 하부의 U-G 염기쌍은 100% 빈도로 유리하였다.
루프 1에 있어서, 루프의 제1 염기(G)는 5' 고정 영역에서 유도되고, 그 결과 그 위치에서는 어떠한 돌연변이도 나타나지 않았다. 루프 1 염기 2 (A)에서 A에 대한 선호도가 있는 것으로 보였으나, 다른 치환들이 관찰되었으며 이 위치에서 A의 재현(representation)은 SELEX가 라운드 3에서 라운드 4로 진행될 때 감소하는 것으로 보였다. 돌연변이 데이터와 일치하여 루프 1의 제3 염기에서 C는 라운드 3과 라운드 4 모두에서 100%의 서열로 보존되었다. 루프 2에 있어서, 축퇴 선별 결과를 실시예 3의 돌연변이 데이터와 비교하였을 때 비슷한 관찰결과를 보였다.
전반적으로, CLEC-2와의 결합에 연관된 랜덤 영역 부분(랜덤 영역의 염기 1-24)은 원래의 S2-20 서열에 고도로 집중되었다. 최소 구조에 필수적이지 않은 랜덤 영역의 남은 염기들(염기 25-40)은 더욱 더 분지되었다.
실시예 6: 항 CLEC -2 리간드 서열용 조절제
리간드는 핵산 모듈레이터 또는 조절제를 디자인하기 위해 필요한 정보를 상보성 왓슨-크리크 염기짝짓기 규칙에 기초하여 이들에 대해 인코딩한다. 제공된 조절제의 유효성은 조절제를 사용한 핵화 동안 리간드의 타겟 영역에 대한 접근성뿐만 아니라 리간드와 전체 듀플렉스 형성 전에 분해를 필요로 하는, 조절제 내의 제한된 내부 2차 구조 또는 그의 부재를 포함한 다양한 인자들에 따라 달라진다. 핵산 모듈레이터와 결합하는 바람직한 영역인 항CLEC-2 리간드의 영역을 정의하기 위해 일련의 조절제들(표 4 및 도 8 참조)을 RB587에 대해 디자인하였다.
6개 조절제(RB581-586) 모두의 효능을 시험하기 위해 겔 시프트 에세이를 사용하였다. 이 에세이에서, RB587은 γ-P32-ATP로 말단 표지되었고 소량으로 표지되지 않은 RB587에 첨가한 다음, 완충액 또는 다양한 몰비의 6개 조절제 중 하나와 인큐베이션하였다. 보다 구체적으로, 표지되지 않은 RB587의 몰 농도는 1 μM로 일정하게 유지되었으며, 일정 범위의 조절제(8 μM 내지 0.25 μM)를 반응에 첨가하여 1:8 내지 1:0.25의 RB587 대 조절제의 몰비 범위가 되게 하였다. 반응물을 15분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 16% 천연 폴리아크릴 아미드/0.5 x TBE/2 mM CaCl2 겔에 로딩하여 3시간 동안 10 W로 작동하였다. 이후, 겔을 꺼내어 사란(Saran) 랩으로 싸서 포스포이미저 스크린에 1시간 동안 광밀(light-tight) 카세트 내에서 노출하고 Storm 840으로 스캔하였다. 얻어진 스캔은 RB587 만의 원래 위치를 나타내었고, 조절제의 다양한 몰량을 더한 RB587은 조절제와 리간드의 혼성화로 인해 상향 이동하였다. RB587의 자연적 폴딩을 교란하는데 필요한 조절제의 최소 몰 비율 결과를 표 4에 나타내었다. 항CLEC-2 리간드, RB587의 2차 구조는 조절제를 사용하여 효과적으로 변성시킬 수 있다.
표 4: 조절제
Figure pct00009
서열번호란 "변성된 서열"이란 제하의 컬럼에 기술된 모듈레이터의 변성되지 않은 버젼을 지칭하며; 서열은 5'-3' 방향으로 기재되었다.
mU=2'-O-메틸 유리딘; mA=2'-O-메틸 아데노신; 2'-O-메틸 구아노신; mC=2'-O-메틸 사이토신
실시예 7 항 CLEC -2 리간드의 항혈소판 활성을 평가하는 방법
세척된 혈소판 제조( WP ) 및 응집 시험:
세척된 인간 혈소판은 기본적으로 Mustard 등(1972; Br.J.Haematol 22, 193-204)에 설명된 바와 같이 제조되었다. 간단히 말하면, 인간 혈액을 산/시트레이트/덱스트로스(ACD) 완충액 (85 mM 소듐 시트레이트, 65 mM 시트르산, 및 110 mM 글루코스)의 1/6의 부피에 수집하고, 37℃ 수조에서 30 분간 동안 정치한 다음, 실온에서 250 x g로 16 분간 원심분리하였다. 혈소판풍부혈장을 꺼내어 실온에서 13 분동안 2200 x g로 원심분리한 후 40 mL의 HEPES-완충된, 10 U/mL 헤파린 및 5 μM (최종농도)의 프로스타글란딘 I2(PGI2)를 함유한 티로드(Tyrode) 용액(136.5 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 12 mM NaHCO3, 0.43 mM NaH2PO4, 5.5 mM 글루코스, 5 mM HEPES pH 7.4, 0.35% 소혈청알부민)에 재현탁하였다. 혈소판 현탁액을 10 분 동안 37 ℃ 수조에서 인큐베이션하고, 5 μM(최종농도)의 PGI2를 첨가한 후 혼합물을 1900 x g에서 8분 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠릿(pellet)을 5 μM(최종농도)의 PGI2를 함유한 40 mL의 HEPES-완충 티로드 용액에 재현탁하였고, 37 ℃ 수조에서 10 분 동안 인큐베이션하고, 8 분 동안 1900 x g으로 원심분리하였다. 펠릿을 0.1 U/mL의 감자 아피라아제(apyrase)를 함유하는 HEPES-완충 티로드 용액에서 3 x 108 혈소판/mL의 밀도로 재현탁한 후, 응집측정 시험에서 사용하기 전에 37℃ 수조에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
로도사이틴[아그레틴(Aggretin);프랑크푸르트 대학병원에서 구입]-유도 WP 혈소판 응집을 교반(1200 rpm) 및 세척된 혈소판(425 μl의 세척된 혈소판, 25 μl의 피브리노겐, 25 μl의 저해제 또는 대조군 및 25 μl의 로도사이틴)의 0.5 ml 현탁액을 통과하는 빛의 투과를 광-응집측정기(Chrono-Log Corp. Havertown, PA, 미국)로 37 ℃에서 측정하여 결정하였다. 기기의 기준선은 0.5 ml의 HEPES-완충된 티로드 용액을 사용하여 정했다. 응집 측정 전에, 혈소판 현탁액은 1 mg/ml 피브리노겐 최종 농도로 보충되었다. 혈소판 응집은 (70-90% 사이의 응집율을 얻기 위해) 지시된 로도사이틴 농도를 첨가하여 개시되었으며, 광 투과는 적어도 6분 동안 지속적으로 기록하였다. 항CLEC-2 리간드 또는 대조군의 로도사이틴 유도성 혈소판 응집 차단 능력을 스크리닝하기 위하여, 항CLEC-2 리간드를 목적하는 최종 농도를 얻기 위한 희석도로 혈소판 현탁액에 첨가하고, 로도사이틴 첨가 전 3분 동안 인큐베이션하여 로도사이틴의 첨가 후 4 내지 6 분 동안 반응을 기록하였다.
로도사이틴의 효능을 각각의 도너(donor)에 대하여 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl 완충액에서 약 3-60 nM 범위의 로도사이틴 연속 희석을 사용한 용량반응곡선에서 얻어진 응집율의 최대 범위로부터 측정하여, 적절한 한계농도(challenge concentration)를 결정하였다. 항CLEC-2 리간드의 로도사이틴 유도성 혈소판 응집 저해능력은 상기한 바와 같이 WP 조제물에서 넓은 범위의 항CLEC-2 리간드 농도를 사용하여 시험되었다. 도 9a 및 9b는 CLEC-2 리간드의 로도사이틴 유도성 WP 혈소판 응집 그래프를 나타낸 것이다. S2-20(트레이스(Trace) 2 및 트레이스 6; 1 μM 및 0.5 μM); RB587 (트레이스 1 및 트레이스 5; 1 μM 및 0.5 μM); RB588 (트레이스 3 및 트레이스 7; 1 μM 및 0.5 μM); 및 대조군(트레이스 4 및 트레이스 8; 20 nM 로도사이틴). 로도사이틴 첨가 6분 후의 지점을 굵은 하향 화살표로 트레이스 상에 표시하였다. 도 9a와 도 9b에서 보이는 바와 같이 S2-20과 RB587 앱타머는 약 20-30 nM의 로도사이틴 작용물질의 존재 하에서 로도사이틴 유도성 WP 응집을 저해하는데 충분히 효과적이었다.
실시예 8 로도사이틴 유도성 혈소판 응집 에세이에서 항 CLEC -2 리간드 S2 -20 전체 길이 클론과 RB587 트렁케이트의 항혈소판 활성을 평가하는 방법
세척된 인간 혈소판은 기본적으로 상기한 바와 같이 제조되었다. 로도사이틴의 효능을 각각의 도너(donor)에 대하여 약 3-60 nM의 로도사이틴 연속 희석을 사용한 용량반응곡선에서 얻어진 응집율의 최대 범위로부터 측정하여, 실시예 7에 기술한 바와 같이 적절한 한계농도를 결정하였다. 로도사이틴 유도성 혈소판 응집을 저해하는 항CLEC-2 리간드의 능력을 상기한 바와 같이 WP 제조물에서 시험하였다. S2-20과 RB587의 용량반응분석 데이터를 도 10a와 10b에 나타내었다. 도 10a는 세척된 인간 혈소판에서 CLEC-2 핵산 리간드 S2-20 클론의 다양한 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 로도사이틴 유도성 혈소판 응집의 그래프이다. 도 10b는 세척된 인간 혈소판에서 CLEC-2 핵산 리간드 RB587과 불활성 돌연변이 RB588의 다양한 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 로도사이틴 유도성 혈소판 응집의 그래프이다. 기본적으로, 로도사이틴 첨가 6분 후에 0.5 μM S2-20 또는 RB587의 존재 하에서 응집의 충분한 저해가 관찰되었다.
WP 에서 CLEC -2 핵산 리간드의 핵산 모듈레이터 시험을 위한 로도사이틴 유도성 혈소판 응집 에세이:
세척된 인간 혈소판(WP)을 상기한 바와 같이 제조하였다. 넓은 범위의 CLEC-2 핵산 리간드 농도를 시험하였을 때 IC95 - 100값이 얻어진다. IC95 - 100값은 주어진 농도의 챌린지 작용물질로 유도된 응집을 약 95-100%까지 저해하는데 필요한 저해제의 농도를 나타낸다. 모듈레이터를 그의 항혈소판 활성의 가역성에 대해 시험하는 경우, 혈소판을 3분 동안 2-4 μM CLEC-2 앱타머(IC95 -100) 또는 완충액-F와 인큐베이션한 다음, 로도사이틴 첨가 전 10분 동안 다양한 몰 농도의 모듈레이터(4:1; 2:1; 1:1 모듈레이터:앱타머)를 첨가하고 6분 동안 반응을 기록하였다. 도 10c는 세척된 인간 혈소판에서 CLEC-2 핵산 리간드 RB587 단독, 또는 CLEC-2 리간드 모듈레이터 RB581, RB582, RB583, RB584, RB585, 및 RB586과의 조합물의 다양한 농도에 대한 대조군의 백분율로 표시된 로도사이틴 유도성 혈소판 응집의 그래프이다.
실시예 9: 유동세포분석(P- Selectin ; CD62 -P 발현)과 로도사이틴(아그레틴)을 사용한 혈소판 활성 작용 분석
유동세포분석 시험:
P-selectin 특이적 항체를 사용한 유동세포분석을 수행하여 로도사이틴 유도성 인간 P-selectin 발현을 저해하는 CLEC-2 앱타머의 능력을 평가하였다. 혈소판 표면 상에서 P-selectin 발현은 혈소판 활성화의 마커이다. 세척된 인간 혈소판 현탁액(밀도 3 x 108 세포/mL)을 티로드 완충액에 1/10으로 희석하여 37 ℃로 유지하였다. 완충액 F 중의 각 시험 화합물(SEL2 Pool, S2-20, S2-20 T4, S2-20 T5, S2-20 T6; RB587, 및 RB588 20 μM 저장용액) 5 μL를 5 mL 시험관에 첨가하였다. 즉시, 50 μL의 희석된 혈소판을 첨가하고 천천히 혼합하였다. 시험관을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 2.5 μL의 로도사이틴(3.331 μM의 저장용액을 20 mM Tris, 50 mM NaCl 완충액, pH 8.0으로 제조)을 각각의 시험관에 첨가하여 혼합하고 다시 5분 동안 인큐베이션하였다. 시험관을 얼음 위에 옮겨서 일분 동안 저온 냉장하였다. 20μL의 CD62P-PE 항체(Becton Dickinson; Cat # 550561)를 각 튜브에 첨가하고 20분 동안 빙냉 하에서 인큐베이션하였다. 각 시험관 내의 혈소판 현탁액을 추가로 0.6 mL의 빙냉 PBS로 희석하여 FACS-Calibur에서 분석하였다.
FACS - Calibur 를 사용한 CD62 발현의 검출
2개의 별도 점도표(dot plot)(one log SSC 대 FSC 및 log FSC 대 FL2-H)와 히스토그램을 흐름 시각영역에 만들었다. 혈소판을 SSC 대 FSC의 점도표를 사용하여 확인하였다(기기는 적절한 시각으로 조절됨). 혈소판 주위에 관심 영역 1(R1)을 만들었다(즉, 혈소판으로 계수되는 파편성 유기물 입자를 방지하기 위한 것임). 영역 1(R1)의 혈소판은 점도표 FSC 대 FL2-H(대조군을 사용하여 조절된 FL2)에서 관찰되었다. 혈소판은 또한 수산정(counts) 대 FL2-H를 플롯팅한 히스토그램에 표시되었다. 쿼드런트(quadrant) 통계 마커를 FSC 대 FL2-H 점 블로트(dot blot) 상에 대조군 튜브를 사용하여 정하고 통계적 매개변수를 정의하였다(대조군: 깨끗한 혈소판). 휴면(resting) 대조군(+ 항체)으로 출발한 모든 샘플을 수집하였다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여 대조군(150 nM 로도사이틴 활성화; 총 100% 활성화로 처리된 우측 하부 사분면)의 %로 플롯팅되었다.
상기한 FACS 분석을 사용하여 앱타머 S2-20, RB587, 및 S2-20의 3 트렁케이트가 WP에서 로도사이틴 유도성 P-selectin 발현을 저해하는 능력을 시험하였다. 얻어진 데이터를 도 11a 및 11b에 나타내었고, 이것은 세포유동분석과 P-selectin-PE 항체를 사용한 로도사이틴 유도성 인간 P-selectin 발현의 그래프이다. 활성은 세척된 인간 혈소판 내에서 2 μM의 CLEC-2 핵산 리간드 S2-20 클론과 트렁케이트(도 11a) 및 세척된 인간 혈소판에서 2 μM의 CLEC-2 핵산 리간드 RB587 및 불활성 돌연변이 RB588(도 11b)에 대한 대조군의 %로서 표시되었다.
CLEC-2 리간드 S2-20, RB587, S2-20-T4, 및 S2-20-T6는 각각 인간 WP의 표면에서 로도사이틴 유도성 P-selectin 발현을 상당히 저감할 수 있지만, CLEC-2와 결합하지 않은 트렁케이트 S2-20-T5와 RB588은 저해 활성을 나타내지 않았으므로 CLEC-2에 대한 리간드 친화도와 CLEC-2 활성 저해 간의 상관관계가 입증되었다.
실시예 10: Bioflux ™ 200 ( Fluxion Biosciences , Inc .)을 사용한 CLEC -2 앱타머 활성에 대한 전체 혈액 중에서의 시험관 내 유동 기반 혈소판 부착 에세이
CLEC-2 리간드를 CLEC-2 매개 혈소판 응집을 저해하는 그의 능력에 대해 시험관내 유동 기반 혈소판 부착 에세이를 사용하여 전체 혈액 존재 하에서 특성화하였다.
관류 및 유동 실험을 위한 전체 혈액 제조
혈액을 건강한 지원자로부터 PPACK(0.3 mM) 항응고제에 19G x 3/4" 니들을 사용하는 60mL의 시린지로 채취하였다. 혈액을 즉시 4μM의 칼세인-AM(Invitrogen P/N C3100 MP)으로 37 ℃에서 1시간 동안 형광 표지하였다 (칼세인-AM은 혈액에 매우 조심스럽게 첨가되어 혼합을 위해 수 회 튜브를 뒤집었으며 혈액은 채취 후 3.5 시간 내에 사용되었다). 섬유성 콜라겐 또는 로도사이틴 코팅된 웰로 실험을 수행하는 경우, 실험은 200 μl의 표지된 혈액을 주입구 웰에 첨가하여 개시되었고, 관류는 BiofluxTM 소프트웨어를 사용하여 37 ℃에서 5 dyn/cm2의 전체 혈액 유동 세팅을 사용하여 바로 시작되었다. 실험을 래트 꼬리 콜라겐 코팅된 표면으로 수행하는 경우, 전체 혈액은 165 nM 로도사이틴으로 2분 동안 활성화된 다음, 200 μl의 표지된 활성화 혈액을 주입구 웰에 첨가하여 실험을 개시하였고, 관류는 BiofluxTM 소프트웨어를 사용하여 37 ℃에서 5 dyn/cm2의 전체 혈액 유동 세팅을 사용하여 바로 시작되었다. 데이터(혈소판 응집물의 형광 이미지)는 간헐촬영 형광 도립현미경(Axiocam Charged-Coupled Device 카메라에 부착된 Zeiss 200M Axiovert Microscope 및 Axiovision 소프트웨어)을 사용하여 총 6-10분의 지속기간 동안 매 6초 마다 수집되었다. 시험 요소들(CLEC-2 앱타머 RB587, 및 불활성 리간드 대조군 RB588)을 시험하는데 있어서, 200 μL의 표지된 혈액을 앱타머(또는 완충액-F; 10 μL의 부피)의 지시된 농도와 3-5분 동안 실온에서 주입 웰에 첨가하기 전에 인큐베이션하였다. 태그 이미지 파일(tagged image file)(tiff) 포맷화 이미지를 사용하여 Bioflux MontageTM 소프트웨어로 형광강도를 계산한 다음, 데이터 표를 Microsoft Excel로 보내어 Graphpad Prism을 사용하여 그래프를 그렸다(도 12a 및 도 12b).
로도사이틴 코팅 표면 실험:
로도사이틴은 CLEC-2 의존성 혈소판 응집을 효과적으로 자극한다(실시예 7: 도 9 및 10). 본 발명자들은 CLEC-2 앱타머 활성을 유동 조건 하에서 시험하기 위해 로도사이틴 코팅 표면에서 혈소판 응집 형성을 분석하였다. 유동 실험에서는 Bioflux 48 웰 플레이트(P/N 900-0017)가 일반적으로 사용되었다. 로도사이틴으로의 코팅에 있어서, 플레이트를 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl 완충액으로 5분 동안 5 dyn/cm2로 준비한 다음, 50 μg/ml의 희석된 로도사이틴을 배출 웰로부터 10분 동안 5 dyn/cm2로 관류하였다. 섬유성 콜라겐 코팅된 플레이트를 대조군으로 사용하였다. 콜라겐 코팅에 있어서, 플레이트를 0.02 M 아세트산으로 5분 동안 5 dyn/cm2로 준비한 다음, 25 μg/ml의 희석된 섬유성 콜라겐(Chrono-Log P/N 385)의 0.02 M 아세트산 용액을 배출 웰로부터 10분 동안 5 dyn/cm2로 관류하였다. 유동을 중지시키고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 코팅 단백질을 PBS로 5 dyn/cm2에서 10분 동안 세척하였다. 플레이트를 5% w/v BSA/PBS로 주입 웰(1 ml)을 완전히 채워서 차단하고 채널에 5 dyn/cm2로 15분 동안 관류하였다. 유동을 중지시키고, 플레이트를 실온에서 추가 10분 동안 인큐베이션하였다. 모든 웰에서 과량의 PBS BSA를 제거하고 플레이트를 실온에서 동일자에 사용하기 위해 유지하거나 4 ℃에서 PBS BSA 중에 최대 2일 동안 보관하였다.
도 12a는 유동성 전체 혈액에 노출된 로도사이틴 코팅 표면상의 혈소판 축적에 대한 CLEC-2 리간드 효과의 동영상 스틸 형광 종말점 이미지를 나타낸 것이다(A= 50 μg/ mL 로도사이틴 코팅; B= 25 μg/mL 섬유성 콜라겐 코팅 대조군; C 내지 F는 50 μg/mL 로도사이틴 코팅으로 코팅, C= 3 μM RB587; D= 3μM RB588; E=4 μM RB588; 및 F= 4μM RB587로 코팅). 그래프 G는 Fluxion Montage™ 소프트웨어로 계산된 부착성 혈소판 표면 범위 데이터의 측정을 나타낸 것이다. 이 데이터는 로도사이틴으로 코팅된 표면상에서 불활성 돌연변이 RB588의 최대 반응율로서 표시되었다. 도 12a에서 보이는 바와 같이, 로도사이틴은 전체 혈액에서 유동 조건 하에 혈소판 응집물 내에서의 활성화된 혈소판의 축적을 지원하였다. 불활성 돌연변이 대조군 RB588이 아니라 RB587이 특이적으로 이 활성을 차단하였다(도 12a, 패널 C와 D 및 F와 E 비교).
가용성 래트 꼬리 콜라겐-I 코팅 표면의 실험:
본 발명자들은 또한 유동 하 비활성화된 혈소판과 비교하여 래트 꼬리 콜라겐 코팅 표면상에서 거대 혈소판 응집물을 형성하는 로도사이틴(CLEC-2 특이적 작용물질)으로 활성화된 혈소판의 능력을 분석하였다. 이후, 이 방법에서 RB587을 사용하여 CLEC-2의 가능한 작용을 분석하였다. 에세이에서, 플레이트는 상기한 바와 같이 100 μg/mL 가용성 래트 꼬리 콜라겐 I (Invitrogen; Cat#A10483-01)으로 코팅되었다. 플레이트를 0.02 M 아세트산으로 5분 동안 5 dyn/cm2에서 준비한 다음, 25 μg/ml의 희석된 섬유성 콜라겐(Chrono-Log P/N 385) 또는 100 μg/mL 가용성 래트 꼬리 콜라겐의 0.02 M 아세트산 용액을 배출 웰로부터 10분 동안 5 dyn/cm2로 관류하였다. 유동을 중지시키고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 코팅 단백질을 PBS로 5 dyn/cm2에서 10분 동안 세척하였다. 플레이트를 5% w/v BSA/PBS로 유입 웰(1 ml)을 완전히 채워서 차단하고 채널에 5 dyn/cm2로 15분 동안 관류하였다. 유동을 중지시키고, 플레이트를 실온에서 추가 10분 동안 인큐베이션하였다. 모든 웰에서 과량의 PBS BSA를 제거하고 플레이트를 동일자에 사용하기 위해 실온에서 유지하거나 4 ℃에서 PBS BSA 중에 최대 2일 동안 보관하였다.
도 12b는 로도사이틴 작용물질 처리의 존재 및 부재 하에서 유동성 전체 혈액에 노출된 래트 꼬리 가용성 콜라겐 코팅 표면상의 혈소판 축적에 대한 CLEC-2 리간드 효과의 동영상 스틸 형광 종말점 이미지를 나타낸 것이다(A= 25 μg/mL 섬유성 콜라겐; B= 100 μg/mL 래트 꼬리 콜라겐; C= 100 μg/mL 래트 꼬리 콜라겐 + 165 nM 로도사이틴 처리; D= 100 μg/mL 래트 꼬리 콜라겐 + 완충액 F; E= 100 μg/mL 래트 꼬리 콜라겐 + 3 μM RB587 + 165 nM 로도사이틴 처리; F= 100 μg/mL 래트 꼬리 콜라겐 + 3 μM RB588 + 165 nM 로도사이틴 처리). 그래프 G는 Fluxion Montage™ 소프트웨어로 계산된 부착성 혈소판 범위 데이터의 측정을 나타낸 것이다. 이 데이터는 로도사이틴의 존재 하에서 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅된 표면상에서 불활성 돌연변이 RB588의 최대 반응율로서 표시되었다. 도 12b에서 보이는 바와 같이, 로도사이틴 작용물질의 존재가 처리되지 않은 전체 혈액과 비교하여 래트 꼬리 콜라겐 코팅된 표면에 결합하는 혈소판 응집물 크기를 상당히 증가시켰다. 전체 혈액을 RB587로 사전 인큐베이션한 후, 로도사이틴 활성화할 경우, 혈소판 응집물 크기가 감소되어 로도사이틴의 부재 하에서 가용성 래트 꼬리 콜라겐으로 나타낸 기준선 응집물까지 복구된다(도 12b-이미지 B, D, E, 및 그래프 G). 불활성 돌연변이 대조군 RB588은 혈소판 응집물 크기에 대한 효과가 없다(도 12b, 패널 F).
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Rusconi, Christopher P. <120> NUCLEIC ACID MODULATORS OF CLEC-2 <130> 10815-8013.WO00 <140> Not yet assigned <141> Filed herewith <150> US 61/393,191 <151> 2010-10-14 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Ile Thr Leu Asn Ile Lys Thr Arg Lys 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ile Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Trp Trp Arg Val 20 25 30 Met Ala Leu Ile Leu Leu Ile Leu Cys Val Gly Met Val Val Gly Leu 35 40 45 Val Ala Leu Gly Ile Trp Ser Val Met Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg Cys 65 70 75 80 Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly His 85 90 95 Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys 100 105 110 Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr 115 120 125 Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile 130 135 140 Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu 145 150 155 160 Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn Met 180 185 190 Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Cys Glu Asn 195 200 205 Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys Val Asp 210 215 220 Gln Leu Pro 225 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Asp Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu 1 5 10 15 Gln Gln Leu Ala Lys Arg Cys Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Gly Thr Phe Lys Gly His Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp 35 40 45 Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr 50 55 60 Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu 65 70 75 80 Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His 85 90 95 Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp 100 105 110 Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Lys Gly Asn 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auucccgcgc auc 33 <210> 46 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 46 gggaugcgga cugggcucac auucccgcgc auc 33 <210> 47 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 47 gggaugcgga cugggcucau guucccgcgc auc 33 <210> 48 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 48 gggaugcgga cugggcucau acucccgcgc auc 33 <210> 49 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 49 gggaugcgga cugggcucau auccccgcgc auc 33 <210> 50 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 50 gggaugcgaa cugggcucau auucccgcgc auc 33 <210> 51 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 51 gggaugcgga uugggcucau auucccgcgc auc 33 <210> 52 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 52 gggaugcgga cugggcucau cuucccgcgc auc 33 <210> 53 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 53 gggaugcgga cugggcucua uucccgcgca uc 32 <210> 54 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 54 gggaugcgga cugggcucau uucccgcgca uc 32 <210> 55 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 55 gggaggacga ugcggucugg gcucauauuc ccgcgcauc 39 <210> 56 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 56 gggaggacga ugcgggcugg gcucauauuc ccgcgcauc 39 <210> 57 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 57 gggaggacga ugcggacugg gcucagauuc ccgcgcauc 39 <210> 58 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 58 gggaugcgua cugggcucau auucccgcgc auc 33 <210> 59 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 59 gggaugcgga cugggcucaa uucccgcgca uc 32 <210> 60 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 60 gaugcgcggg aauaug 16 <210> 61 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 61 ugcgcgggaa uaugag 16 <210> 62 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 62 aauaugagcc caguc 15 <210> 63 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 63 uaugagccca guccgc 16 <210> 64 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 64 augagcccag uccgcauc 18 <210> 65 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 65 cccaguccgc auc 13 <210> 66 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 66 gggggaattc taatacgact cactataggg aggacgatgc ggtaatacga ctcactatag 60 ggaggacgat gcgg 74 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <400> 67 tctcggatcc tcagcgagtc gtctg 25 <210> 68 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligomer <220> <223> RB587 <220> <221> misc_feature <222> (1),(4),(6),(7),(11),(12),(13),(25),(27) <223> G is a 2'ribo G <220> <221> misc_feature <222> (2),(8),(17),(19),(29) <223> A is a 2'ribo A <220> <221> misc_feature <222> (5),(9),(14),(16),(22),(23),(24),(26),(28),(31) <223> C is a 2'-fluoro C <220> <221> misc_feature <222> (3),(10),(15),(7),(18),(20),(21),(30) <223> U is a 2'-fluoro U <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> n is an inverted deoxythymidine <400> 68 gaugcggacu gggcucauau ucccgcgcau cn 32

Claims (22)

  1. 리간드가 적어도 하나의 스템(stem) 구조와 적어도 하나의 루프(loop) 구조를 형성하는 핵산 서열을 포함하는, CLEC-2와 결합하는 핵산 서열 리간드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염.
  2. 제1항에 있어서, 5' - 3' 방향으로: 5-10 염기쌍(bp) 길이의 제1 스템; 서열 5'-GNC-3'을 포함하는 제1 트리뉴클레오티드 루프; 4 염기쌍 길이의 제2 스템(여기에서 제2 스템은 스템의 염기에 동요 쌍(wobble pair)을 포함한다); 및 뉴클레오티드 서열 5'-YUYNNRYU-3'을 포함하는 제2 루프를 포함하는 리간드.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 7 또는 서열번호: 8 또는 서열번호: 9와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 리간드.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호: 24와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 리간드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, CLEC-2와 약 0.1 nM 내지 10 nM 범위의 해리상수로 결합하는 리간드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 리간드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 약학 조성물.
  7. 제1 핵산 서열을 포함하는 CLEC-2 리간드에 특이적으로 결합하는, 제2 핵산 서열을 포함하는 모듈레이터.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 리간드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 치료학적으로 유효량을 CLEC-2 매개 장애의 치료를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 것을 포함하는, CLEC-2 매개 장애의 치료방법.
  9. 제8항에 있어서, CLEC-2 매개 장애가 혈소판 매개 장애인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 혈소판 매개 장애가 혈관 장애, 심혈관 장애, 말초혈관 장애, 뇌혈관 장애, 혈소판 매개 염증성 장애, 당뇨관련장애, 암 및 HIV 감염으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  11. 제10항에 있어서, 혈관 장애가 급성 관동맥 증후군, 혈전증, 혈전색전증, 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 말초혈관질환, 및 일과성 허혈발작으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  12. 제10항에 있어서, 뇌혈관 장애가 일과성 허혈발작, 허혈성 뇌졸중 및 색전증(embolism)으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  13. 제10항에 있어서, 혈소판 매개 염증성 장애가 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염 및 강피증으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  14. 제10항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 전립선암, 고환암, 췌장암, 뇌암, 뼈암 및 간암으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  15. 제10항에 있어서, 당뇨관련장애가 당뇨성 망막병증, 당뇨성 혈관병증, 죽상동맥경화증, 허혈성 뇌졸중, 말초혈관질환, 급성 신장 손상 또는 만성 신부전으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
  16. (a) CLEC-2 리간드와 혈액 샘플을 혼합하여 처리된 혈액 샘플을 제조하고;
    (b) 처리된 혈액 샘플을 촉진제(facilitator) 분자와 접촉시키고(여기에서 촉진제 분자는 고체 지지체 상에 고정된다);
    (c) 접촉 후의 혈소판 응집물 형성을 측정하고;
    (d) (c) 단계에서 검출된 혈소판 응집물 형성의 정도를, CLEC-2 리간드가 없는 대조용 혈액 샘플을 사용하여 촉진제 분자와 접촉하였을 때 얻어진 혈소판 응집 정도와 비교하는 것을 포함하는, CLEC-2 리간드가 CLEC-2 의존성 혈소판 응집물 형성을 활성화하거나 저해하는지를 측정하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 촉진제 분자가 CLEC-2의 활성제인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 촉진제 분자가 가용성 콜라겐 타입 I, II 또는 III이고, 로도사이틴(rhodocytin)을 혈액 샘플에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (b)이전에, 처리된 혈액 샘플 및, 조절 리간드 분자를 결합할 수 있는 모듈레이터 분자를 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. CLEC-2 리간드와 약학 첨가제를 포함하는 키트.
  21. 제20항에 있어서, CLEC-2 리간드와 특이적으로 결합하는 모듈레이터를 추가로 포함하는 키트
  22. CLEC-2 리간드에 특이적으로 결합하는 모듈레이터를 포함하는 키트.
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