CN106535917A - 用于抑制α‑1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种经由RNA干扰机制来抑制AAT基因表达的RNA干扰触发物。本发明还关于一种药物组合物，其包含该AAT RNAi触发物以及能够改良该RNAi触发物在体内向肝细胞递送的赋形剂。该AAT RNAi触发物在体内向肝细胞的递送使得AAT基因表达得到抑制且使α1‑抗胰蛋白酶缺陷及相关疾病得到治疗。

Description

用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法
背景技术
α-1抗胰蛋白酶缺陷是一种遗传性常染色体共显性基因病症，其导致α1-抗胰蛋白酶(A1AT)产生不足，从而引起肺病及肝病且发病频率为每1,500至3,500位个体中约有1例。α-1抗胰蛋白酶缺陷最通常会影响全世界具有欧洲血统的人。
α-1抗胰蛋白酶(α1-抗胰蛋白酶、α-1蛋白酶抑制剂、A1AT或AAT)是属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)超家族的蛋白酶抑制剂。正常的AAT蛋白主要在肝中由肝细胞合成且分泌至血液中。其生理学功能为抑制嗜中性粒细胞蛋白酶(neutrophil protease)以保护宿主组织以免在炎性阶段受到非特异性损伤。A1AT缺陷(AATD)在临床上最重要的形式由Z突变引起。Z突变型等位基因(PiZ)经由单一点突变使得突变型PiZ蛋白倾向于在肝细胞内质网中异常折叠，从而导致细胞内滞留。循环性蛋白酶活性丧失使得肺易受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶所致的损伤，从而导致肺气肿发展。每周使用纯化人AAT来对AATD进行AAT增强治疗得到正常的AAT血浆水平，且预防受影响个体的肺损伤。
尽管给予纯化AAT能缓解由内源分泌AAT丧失所引起的肺损伤，但AATD患者仍易患由过量异常折叠AAT蛋白的蓄积所引起的内质网肝贮积病。12％至15％的AATD患者还发生肝病，其可能严重或致命、甚至于在婴儿期发生。在AATD患者中，AAT蛋白在肝细胞中的细胞内累积会诱导肝细胞损伤及死亡，以及慢性肝损伤。临床表现包括慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、转氨酶升高(transaminitis)、胆汁郁积、纤维化及甚至暴发性肝衰竭。
目前不存在用于防止由AATD所致的肝病发作或减缓其进展的特定治疗。因为由AATD造成的肝损伤经由功能获得机制发生，所以抑制或AAT基因表达将适用于防止AAT蛋白在肝中累积，藉此提供对AATD的治疗性治疗。已经显示双链RNA分子(dsRNA)及其他RNAi触发物会以高度保守的调控机制阻断基因表达，其称为RNA干扰(RNAi)。本发明提供用于抑制AAT基因体内表达的AAT RNA干扰(RNAi)触发物及其组合物。本发明亦提供使用AAT RNAi触发物以治疗AATD及由AATD引起的病状及疾病(诸如慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌及暴发性肝衰竭)的方法。
发明概述
本发明提供能够选择性地且有效地减少AAT表达的α-1抗胰蛋白酶(AAT)基因特异性RNA干扰(RNAi)触发分子。使用AAT RNAi触发物提供一种用于治疗性治疗与α-1抗胰蛋白酶缺陷相关的疾病的方法。此类方法包括向人类或动物给予靶向AAT的RNAi触发物。
在一个实施方式中，本发明提供用于抑制人类AAT基因表达的RNAi触发分子。该RNAi触发物包含至少两个相互部分、实质上或完全互补的序列。在一个实施方式中，两个RNAi触发物序列含有包含第一序列的正义链及包含第二序列的反义链。在另一实施方式中，两个RNAi触发物序列包含两条共同包含第一序列的正义链，及包含第二序列的反义链，其中正义链与反义链一起形成部分双链体(meroduplex)(表2及表4)。AAT RNAi触发物正义链包含与AAT mRNA至少一部分具有至少90％相同性的序列。表1至表5中展示示例性AAT RNAi触发物正义链、反义链、序列对及部分双链体。
在一个实施方式中，反义链包含与由该AAT基因编码的mRNA的一部分互补的核苷酸序列，且互补区域的长度最佳小于30个核苷酸。此外，较佳的是，本文所述的本发明RNAi触发物的长度(双链体长度)在约16至30个核苷酸的范围内，尤其在约18至28个核苷酸的范围内。尤其适用于本发明上下文的是约17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。正义链与反义链可具有相同长度或其可具有不同长度。例如，正义链与反义链的长度均可为19、20、21、22、23或24个核苷酸。举例而言，正义链的长度可为21个核苷酸，而反义链的长度为23个核苷酸。19、21、22或23个核苷酸的双链体段为最佳。RNAi触发物在递送至表达AAT基因的细胞时会抑制该AAT基因的体外或体内表达。
根据需要局部还是全身治疗以及待治疗的区域，可用许多方式给予本文所述的RNAi触发分子或药物组合物。给予可为局部的(例如藉由经皮贴片)、经肺，例如藉由吸入或吹入粉末或气溶胶，包括藉由喷雾器：气管内、鼻内、经表皮及经皮、经口或非经肠。非经肠给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内注射或输注；皮下，例如经由植入式装置；或颅内，例如脑实质内、鞘内或脑室内给药。
可使用本领域中所知的任何已知寡核苷酸递送技术将本文所述的RNAi触发分子递送至目标细胞或组织。核酸递送方法包括(但不限于)封装于脂质体中、藉由离子电渗或藉由掺入其他载剂，诸如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊，及生物黏性微球粒、蛋白性载体或DPC(WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169及WO 2012/083185，其各自以引用的方式并入本文中)。在一个实施方式中，AAT RNAi触发物与体内递送化合物一起提供。较佳的体内递送化合物包括MLP递送聚合物。
在另一较佳实施方式中，本发明的特征在于将AAT RNAi触发物体内递送至肝细胞的组合物，其包含：本文所述的AAT RNAi触发物，其偶联于含有至少20个碳原子的疏水基团诸如胆固醇(RNA触发物-偶联物)。
附图说明
图1.表1.靶向AAT mRNA的RNAi触发物的核心序列。
图2.表2.含有5'及3'延伸的RNAi触发序列。大写字母表示核糖核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。
图3.表3.规范的(canonical)AAT siRNA RNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。
图4.表4.AAT部分双链体RNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。
图5.表5.AAT UNA RNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，后接有“UNA”的大写字母A、C、G、U表示2',3'-断(解锁)RNA核苷酸模拟物，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。
图6A-E.适用于体内递送本文所述的AAT RNAi触发物的MLP聚合物的列表。
图7.描绘使用不同浓度的所示RNAi触发物在体外Hep3B细胞中的相对AAT表达的图。
图8.描绘用盐水或SEQ ID 52/63的AAT RNAi触发物(AD00370)及MLP递送聚合物(MLP)治疗的PiZ小鼠的相对血清AAT水平的图。
图9.将肝中的Z-AAT累积可视化的PAS-D染色。肝切片来自(A)在研究第1天处死的PiZ小鼠；(B)接受四次每两周一次的盐水载剂静脉内剂量的PiZ小鼠；(C)接受四次每两周一次的8mg/kg Luc-RNAi触发物对照物+8mg/kg MLP递送聚合物的静脉内剂量的PiZ小鼠；(D)接受四次每两周一次的8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物的静脉内(IV)剂量的PiZ小鼠。
图10.来自PiZ小鼠的肝的可溶性及不溶性部分的Western印迹(Western blot)分析。五周龄小鼠接受每两周一次的盐水、Luc-UNA(8mg/kg SEQ ID 59/78与8mg/kg MLP递送聚合物)或AAT-UNA(8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物)的静脉内剂量，持续8周。
图11.来自PiZ小鼠的肝的可溶性及不溶性部分的Western印迹分析。五周龄小鼠接受四次每两周一次的盐水、Luc-UNA(8mg/kg SEQ ID 59/78与8mg/kg MLP递送聚合物)或AAT-UNA(8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物)的静脉内剂量，持续8周。
图12.展示六月龄雌性PiZ小鼠的小球(globule)尺寸的柱状图，这些小鼠已接受单次的盐水、Luc-UNA RNAi触发物(8mg/kg SEQ ID 59/78与8mg/kg MLP递送聚合物)或AAT-UNARNAI触发物(8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物)的静脉内剂量。将肝切成切片、在福尔马林中处理以便组织学观测，并用PAS-D染色以便对小球尺寸及由小球覆盖的肝面积进行数字化定量。
图13.展示在灵长类动物中重复给予AAT-RNAi触发物及MLP递送聚合物之后的AAT敲除的图。向两只猴子各自给予2.0mg/kg MLP递送聚合物(MLP递送肽)+4.0AAT-RNAi触发物SEQID 52/63(AAT-UNA)或3mg/kg MLP递送聚合物(MLP递送肽)+6mg/kg RNAi触发物SEQ ID52/63(AAT-UNA)。第一剂在第1天给予。剂量均相隔六周。
发明详述
附表1至5涉及用于形成根据本发明的AAT RNAi触发分子的较佳分子及序列。本文所述的AAT RNAi触发分子包含一或两条正义链、及反义链，其各自含有约18个核碱基的核心序列。反义链核心序列与AAT mRNA中存在的核苷酸序列(目标序列)互补。正义链核心序列可与反义核心序列具有相同长度或其可具有不同长度。RNAi触发物的正义与反义核心序列退火形成互补性双链体区域或双螺旋结构。在互补性双链体区域内，正义链核心序列与反义核心序列至少90％互补或100％互补。对于部分双链体(meroduplex)RNAi触发物，正义链核心序列内部带切口，且提供两个一起与反义链核心序列杂交的正义链序列。另外，正义链及反义链可独立地在其核心序列的5'端、其核心序列的3'端或其核心序列的5'端与3'端含有1至6个核碱基的延伸。反义链延伸若有的话则可能与AAT mRNA的相应核苷酸或与正义链的任何相应核苷酸互补或不互补。类似地，正义链延伸若有的话则可能与AAT mRNA的相应核苷酸或与反义链的任何相应核苷酸一致或不一致。当递送至细胞时，本文所述的AAT RNAi触发物“敲除”或抑制正常或Z突变型等位基因AAT基因的表达。
所描述的AAT RNAi触发物及方法可用以治疗患有将受益于AAT表达减少或抑制的疾病或病症的对象。向对象给予治疗有效量的任何一或多种所述AAT RNAi触发物。对将受益于AAT基因表达减少及/或抑制的对象的治疗包括治疗性及/或预防性治疗。对象可为人类、患者或人类患者。所述AAT RNAi触发分子可用以提供对突变型AAT表达相关疾病的治疗性治疗的方法。这些方法包括向人类或动物给予靶向AAT的RNAi触发物。
表1中展示AAT RNAi触发物正义链及反义链核心序列。表2提供本文所述的具有5'或3'延伸的RNAi触发物正义及反义链的说明性实例。本文提供具有经修饰的核苷酸的RNAi触发物正义及反义链，且具体揭示于附表3至5中，提供了本发明的经修饰的RNAi触发物正义及反义链的说明性实例。表2至5中所示的经修饰的RNAi触发物链与表1中所示的未经修饰的核心序列的关系由核心SEQ ID号表示。本发明的RNAi触发物的这些成分的修饰在本文中作为修饰及/或修饰模式的实例来提供。
RNAi触发物(RNAi trigger，亦称为dsRNAi触发物)经由RNA干扰(RNAi)的生物过程来抑制基因表达。RNAi触发物包含双链RNA或RNA样结构，其通常含有15-50个碱基对，较佳地18-26个碱基对，且具有与细胞内经表现的目标基因中的编码序列至少90％互补的核碱基序列。RNAi触发物包括(但不限于)：短干扰性RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)及切丁酶(dicer)底物(美国专利第8,084,599号、第8,349,809号及第8,513,207号)。
本文所述的RNAi触发物通过使反义链与一条正义链(对于规范的siRNA RNAi触发物及UNA RNAi触发物)或两条正义链(对于部分双链体RNAi触发物)退火来形成。在一个较佳实施方式中，AAT RNAi触发物反义链包含SEQ ID No:1、2、3、4及5中所描绘的核酸序列。相应AAT RNAi触发物正义链包含SEQ ID No:8、9、10、11及12中所描绘的核酸序列。因此，本发明的AAT RNAi触发分子尤其可包含选自由以下SEQ ID对组成的群的序列对：1/8、2/9、3/10、4/11及5/12。表1至5中提供互补对或部分双链体(meroplex)(RNAi触发物)，如由SEQ ID对或SEQ ID部分双链体所示。
如下文详述，本文所述的RNAi触发分子正义链及反义链各自包含核心序列及可选的，5'延伸、3'延伸，或5'延伸与3'延伸。如本文所用，在正义链核心序列或反义链核心序列的5'端或3'端的延伸包含1至5个核苷酸。正义链上的延伸核苷酸可能与或可能不与相应反义链中的核苷酸(核心序列核苷酸或延伸核苷酸)互补(碱基配对)。相反地，反义链上的延伸核苷酸可能与或可能不与相应正义链中的核苷酸(核心序列核苷酸或延伸核苷酸)互补(碱基配对)。
在一个实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子包含具有1至5个核苷酸长、较佳地1至2个核苷酸长的3'延伸的反义链。在一个实施方式中，反义链延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或与相应AAT mRNA序列互补的核苷酸。在另一实施方式中，反义链延伸由dTdT或dTsdT组成，其中dT表示脱氧胸苷核苷酸，sdT表示具有5'硫代磷酸酯的脱氧胸苷核苷酸。
在另一较佳实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子包含具有1至5个核苷酸长、较佳地1至2个核苷酸长的3'延伸的正义链。在一个实施方式中，反义链延伸核苷酸中的一或多者包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸，或对应于AAT mRNA序列中核苷酸的核苷酸。在一个较佳实施方式中，3'正义链延伸由Af(invdT)组成，其中Af表示2'-氟代腺苷核苷酸，invdT表示反向(3'-3'-连接)脱氧胸苷核苷酸。
在一个实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子包含具有1至5个核苷酸长、较佳地1至2个核苷酸长的5'延伸的反义链。在一个实施方式中，反义链延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或胸苷核苷酸或与相应AAT mRNA序列互补的核苷酸。在一个较佳实施方式中，反义链延伸由dT组成。
在另一较佳实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子包含具有1至5个核苷酸长、较佳地1至3个核苷酸长的5'延伸的正义链。在一个实施方式中，正义链延伸核苷酸中的一或多者包含尿嘧啶或腺苷核苷酸或对应于AAT mRNA序列中核苷酸的核苷酸。在一个较佳实施方式中，正义链延伸由5'UAU或5'uAu组成，其中u表示2'O-甲基-修饰的尿苷核苷酸。
本文所述的RNAi触发分子可在各正义链及反义链上独立地含有3'及/或5'延伸。在一个实施方式中，正义链与反义链均含有3'及5'延伸，各自如上所述。在一个实施方式中，一条链的一个或多个3'延伸核苷酸与另一条链的一或多个5'延伸核苷酸碱基配对。在另一实施方式中，一条链的一个或多个3'延伸核苷酸与另一条链的一个或多个5'延伸核苷酸并不碱基配对。RNAi触发物的正义及反义链可能含有或可能不含有相同数目的核苷酸碱基。反义及正义链可形成双链体，其中5'端仅具有钝端，3'端仅具有钝端、5'与3'端均为钝端，或5'与3'端均不为钝端。在另一实施方式中，延伸中的核苷酸中的一或多者含有硫代磷酸酯、磷硫酰、反向脱氧核苷酸(3'至3'连接)核苷酸或经核糖核苷酸或脱氧核苷酸修饰。
在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的正义及反义链含有不同数目的核苷酸碱基。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的正义链5'端与反义链3'端形成钝端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的正义链3'端与反义链5'端形成钝端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的两端均形成钝端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的两端均非钝端。如本文所用，钝端系指双链触发分子的末端，其中两条经退火的链的末端核苷酸互补(形成互补碱基对)。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的正义链5'端与反义链3'端形成翻口端(frayed end)。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的正义链3'端与反义链5'端形成翻口端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的两端形成翻口端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi触发物的两端均非翻口端。如本文所用，翻口端系指双链触发分子的末端，其中两条经退火的链的末端核苷酸不互补(即形成非互补碱基对)。如本文所用，突出部分为在双链RNAi触发分子一条链的末段的一个或多个不成对核苷酸的段。不成对核苷酸可在正义链或反义链上，从而产生3'或5'突出部分。在一些实施方式中，RNAi触发分子含有：钝端及翻口端、钝端及5'突出端、钝端及3'突出端、翻口端及5'突出端、翻口端及3'突出端、两个5'突出端、两个3'突出端，或5'突出端及3'突出端。
在一个较佳实施方式中，本发明的AAT RNAi触发分子包含选自由以下组成的群的序列对：SEQ ID NO:15/23、15/24、16/28、17/30、18/31、19/36及19/38。在另一较佳实施方式中，本发明的AAT部分(双链体)RNAi触发分子包含选自如下的部分双链体：SEQ ID NO:15/25/41、15/26/42、15/27/43、16/29/44、18/32/45、18/33/46、18/34/47、18/35/48及19/37/49。
RNAi触发物(亦称为dsRNAi触发物)经由RNA干扰(RNAi)的生物过程来抑制基因表达。RNAi触发物包含双链RNA或RNA样结构，其通常含有15-50个碱基对及较佳地18-25个碱基对，且具有与细胞内表达的目标基因中的编码序列一致(完全互补)或几乎一致(基本上互补)的核碱基序列。RNAi触发物包括(但不限于)：短干扰性RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体、含解锁核酸的dsRNA及切丁酶底物(美国专利第8,084,599号、第8,349,809号及第8,513,207号)。
本文所述的AAT RNAi触发分子可包含天然存在的核苷酸或可包含至少一种经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。本文所述的RNAi触发物正义及反义链可通过本领域中成熟的方法来合成及/或修饰。
核苷酸碱基(或核碱基)为杂环嘧啶或嘌呤化合物，其为所有核酸的成分且包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)。核苷为某些嘧啶或嘌呤碱基的核糖基或脱氧核糖基衍生物。其因缺乏磷酸化而成为与核苷酸相关的糖基胺或N-糖苷。其亦常规地包括核苷类似物中，其中糖基基团连接于碳而非氮(‘C-核苷’)。核苷酸是通过用磷酸酯化核苷的3'或5'羟基在形式上获得的化合物。其为核酸单体。
如本文所用，“G”、“C”、“A”、“U”及“T”或“dT”各自一般而言表示分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶及脱氧胸苷作为碱基的核碱基、核苷、核苷酸或核苷酸模拟物。并且，如本文所用，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”亦可指经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，如下文进一步详述，或替代性置换部分。包含此类置换部分的序列为本文所述的实施方式。
对于本文所述的RNAi触发分子，核苷或核苷酸碱基可由含磷酸酯(天然)或不含磷酸酯(非天然)的共价核苷间键连接，即RNAi触发分子可具有天然或非天然的寡核苷酸主链。在另一实施方式中，RNAi触发物在两个核苷酸碱基间含有非标准(非磷酸酯)键。
在一个较佳实施方式中，RNAi触发分子的一或多个核苷酸为经修饰的核苷酸。在另一实施方式中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的核苷酸经修饰。经修饰的核苷酸包括(但不限于)：2'修饰、2'-O-甲基核苷酸(在本文中以核苷酸序列中的小写字母‘n’表示)、2'-脱氧-2'-氟代核苷酸(在本文中以Nf表示，在本文中亦以2'氟代核苷酸表示)、2'-脱氧核苷酸(在本文中以dN表示)、2'-氨基核苷酸、2'-烷基核苷酸、末端3'至3'连接、反向脱氧胸苷(在本文中以invdT表示)、包含5'-硫代磷酸酯基的核苷酸(在本文中以在核苷酸的前的小写字母‘s’表示，如在sN中)、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯基、包含非天然碱基的核苷酸、锁核苷酸、桥连核苷酸、肽核酸、2',3'-断核苷酸模拟物(解锁核苷酸，在本文中以NUNA表示)、吗啉基核苷酸及无碱基核苷酸。不必要使既定化合物中的所有位置均得到均匀修饰。相反地，可将一个以上修饰加入单一RNAi触发物化合物中或甚至其单一核苷酸中。可将核糖2'修饰与经修饰的核苷连接组合。
较佳经修饰的核苷间连接或主链包括(例如)硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸及手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰基烷基磷酸酯(thionoalkyl-phosphonates)、硫羰基烷基磷酸三酯，及具有正常3'-5'连接的硼代磷酸酯、其2'-5'连接的类似物及具有反极性的那些，其中相邻核苷单元对为3'-5'连接至5'-3'或2'-5'连接至5'-2'。亦包括多种盐、混合盐及无酸形式。
较佳的不包括磷原子的经修饰的核苷间连接或主链(即寡核苷)具有通过短链烷基或环烷基糖间连接、混合杂原子及烷基或环烷基糖间连接或一或多个短链杂原子或杂环糖间连接形成的主链。其包括具有吗啉基连接的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜及砜主链；甲醛乙酰基(formacetyl)及硫代甲醛乙酰基主链；含亚甲基甲醛乙酰基及硫代甲醛乙酰基的主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基及亚甲基肼基主链；磺酸酯及磺酰胺主链；酰胺主链；及具有混合N、O、S及CH2组成部分的其他物质。
在另一实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子为具有经修饰的核苷酸的规范siRNA。表3中展示适于形成具有经修饰的核苷酸的AAT规范siRNA RNAi触发物的示例性序列。示例性AAT规范siRNA RNAi触发物为以下SEQ ID对：50/62、50/63、53/67、54/69、55/70、56/75及56/77。
在另一实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发分子为具有经修饰的核苷酸的部分双链体。表4中展示适于形成具有经修饰的核苷酸的AAT部分双链体RNAi触发物的示例性序列。示例性AAT部分双链体RNAi触发物为以下SEQ ID部分双链体：50/64/81、50/65/82、50/66/83、53/68/84、55/71/85、55/72/86、55/73/87、55/74/88及56/76/89。
AAT RNAi触发物反义链较佳地含有至少一个“解锁核苷酸”(UNA)、AAT UNA RNAi触发物。UNA为无环RNA模拟物，亦称2',3'-断-RNA，其中不存在C2'-C3'核糖键。由于不存在核糖2',3'键，UNA为可挠的，从而可调节亲和力及特异性。UNA显示对互补链的结合亲和力减小，导致双链体的热稳定性降低。UNA可位于沿着RNAi触发物的碱基链的任一处。本文所述的RNAi触发物较佳含有位于位置6或7(编号包括5'dT核苷酸延伸)的UNA。表5中展示适于形成AAT UNA RNAi触发物的示例性序列。示例性AAT UNA RNAi触发物为以下SEQ ID对：51/63、52/63、57/77及58/77。
经修饰的核碱基包括其他合成及天然的核碱基，诸如5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤(包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基及其他8-取代腺嘌呤及鸟嘌呤、5-卤代，尤其5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代脲嘧啶类及胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤及8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鸟嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
在一个实施方式中，本文所述的AAT RNAi触发物包含偶联于RNAi触发物的靶向部分。我们已发现RNAi触发物偶联于靶向部分(其中靶向部分包含疏水基)或半乳糖簇有助于RNAi触发物体内靶向肝脏。RNAi触发物-靶向部分偶联物通过将RNAi触发物共价连接于靶向部分来形成。可将靶向部分连接于RNAi触发物正义链或反义链的3'或5'端。较佳将靶向部分连接于RNAi触发物正义链5'端。
在一个实施方式中，靶向部分由疏水基组成。更特定言的，RNAi触发物靶向部分由具有至少20个碳原子的疏水基组成。用作靶向部分的疏水基在本文中称为疏水性靶向部分。疏水性靶向部分较佳为仅含有碳及氢原子的烃。然而，可允许维持疏水性的取代或杂原子，例如氟。适于用作靶向部分的疏水基可选自由以下组成的群：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可为直链、支链或环状，胆固醇、胆固醇衍生物、固醇、类固醇及类固醇衍生物。示例性的适合的疏水基可选自包含以下的群：胆固醇、胆固醇衍生物、二胆固醇、生育酚、二生育酚、二癸基、二(十二烷基)、二(十八烷基)、二(十二烷基)、二(十八烷基)、类异戊二烯及胆酰胺。
在另一实施方式中，靶向部分包含半乳糖靶向部分或半乳糖簇靶向部分。如本文中使用，半乳糖簇包含具有二至四种通常三种末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖以及与对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖的衍生物。适用于将寡核苷酸及其他分子体内靶向肝脏的半乳糖或半乳糖簇为本领域所熟知。
本领域常见的其他术语包括三天线半乳糖、三化合价半乳糖及半乳糖三聚体。较佳的半乳糖衍生物为N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。其他对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的糖类可选自包含以下的清单：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基半乳糖胺。
在一个实施方式中，靶向部分偶联于AAT RNAi触发物正义链的5'端。在另一较佳实施方式中，靶向部分偶联于具有UAU延伸的AAT RNAi触发物正义链的5'端。较佳靶向部分为胆固醇基衍生物。较佳UAU延伸为uAu延伸。在又一实施方式中，胆固醇基衍生物经由接头连接于AAT RNAi触发物正义链的5'端。示例性接头包括烷基及PEG基。较佳PEG接头为三甘醇连接。
具有胆固醇基靶向部分的示例性AAT RNAi触发物包括：以下SEQ ID对或部分双链体：50/63、56/77、50/64/81、50/65/82、50/66/83、53/68/84、55/71/85、55/72/86、55/73/87、55/74/88、56/76/89、51/63、52/63、57/77及58/77。
本文所述的RNAi触发分子可合成为在5'端具有反应性基团，诸如胺基。反应性基团随后可用于使用本领域中典型的方法来连接靶向部分。
如本文所用，术语“序列”指由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸链。然而，如本文详述，该“构成序列的链”亦可包含修饰，如经修饰的核苷酸及核苷酸模拟物。
如本文所用，且除非另有规定，否则术语“互补/互补性”当用于相对于第二核苷酸序列(例如RNAi触发物反义链)来描述第一核苷酸序列(例如RNAi触发物正义链或AAT mRNA)时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，且包括天然或经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，只要满足上述关于其杂交能力的要求。完美或完全互补是指第一多核苷酸的连续序列中所有碱基均将与第二多核苷酸的连续序列中相同数目的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。部分互补是指在核碱基序列杂交对中存在一或多个不匹配碱基对。如本文所用的基本互补，当涉及本文所述的RNAi触发物时，是指在核碱基序列在杂交对中存在1至3个不匹配碱基对。关于在RNAi触发物的正义链与反义链之间或在RNAi触发物的反义链与AAT mRNA的序列之间的碱基匹配，在本文中可使用术语“互补”、“完全互补”及“基本上互补”。
我们描述用于抑制细胞、细胞群、组织或对象中的AAT表达的组合物及方法，该方法包括：向对象给予治疗有效量的本文所述的AAT RNAi触发物，由此抑制对象中的AAT表达。沉默、减少、抑制、下调或敲除基因表达(只要其指AAT基因)是指当用本文所述的AAT RNAi触发物处理AAT基因转录的细胞、细胞群、组织或对象时，与未如此治疗的第二细胞、细胞群、组织或对象相比，该细胞、细胞群、组织或对象中ATT基因的表达减少，所述减少可通过从细胞、细胞群、组织或对象中ATT基因转录的RNA水平或自mRNA翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚单位的水平测得。
此外，本发明涉及一种抑制细胞、组织或生物体中的AAT基因表达的方法，其包括以下步骤：将如本文定义的RNAi触发物引入该细胞、组织或生物体中；及将该细胞、组织或生物体维持足以达成AAT的mRNA转录物降解的时间，由此抑制给定细胞中的AAT表达。
在一些实施方式中，我们描述药物组合物，其包含至少一种所述的AAT RNAi触发物。这些药物组合物尤其适用于抑制细胞、组织或生物体中的AAT基因表达。所述的药物组合物可用以治疗患有将受益于AAT表达减少或抑制的疾病或病症的对象。所述的药物组合物可用以治疗处于产生将受益于AAT表达减少或抑制的疾病或病症的风险中的对象。将受益于AAT表达减少或抑制的疾病及/或病症可选自包含以下的清单：AATD、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌和暴发性肝衰竭。较佳地，对象为哺乳动物，最佳为人类患者。在一个实施方式中，该方法包括向待治疗哺乳动物给予包含本文所述的AAT RNAi触发分子的组合物。上述药物组合物亦可包含一或多种药学上可接受的赋形剂(包括载剂、运载体、稀释剂及/或递送聚合物)。
在另一实施方式中，本发明提供治疗、预防或管理与AATD相关(包括AATD)的临床表现的方法。所述方法包括向需要此治疗、预防或管理的对象给予治疗或预防有效量的一或多种本文所述的AAT RNAi触发物。较佳地，该对象为哺乳动物，最佳为人类患者。在一个实施方式中，该方法包括向待治疗哺乳动物给予包含本文所述的AAT RNAi触发分子的组合物。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”及其类似术语在本发明的上下文中是指减轻或缓解与AATD相关的病症。
所述的AAT RNAi触发物及方法可用以治疗或预防患有将受益于AAT表达减少或抑制的疾病或病症的对象的至少一种症状。向该对象给予治疗有效量的任何一或多种所述RNAi触发物，藉此治疗该症状。向该对象给予预防有效量的任何一或多种所述RNAi触发物，藉此预防该至少一种症状。
在一些实施方式中，相对于未接受该AAT RNAi触发物的对象，经给予所述AAT RNAi触发物的对象的AAT的基因表达水平及/或mRNA水平减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。对象的基因表达水平及/或mRNA水平可在对象的细胞、细胞群及/或组织中减小。在一些实施方式中，相对于未接受AAT RNAi触发物的对象，经给予所述AAT RNAi触发物的对象的AAT蛋白水平减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。对象的蛋白水平可在对象的细胞、细胞群、组织、血液及/或其他体液中减少。基因表达、mRNA或蛋白水平的减少可通过任何在本领域中已知的方法来评估。AAT mRNA水平及/或蛋白水平的减小或降低在本文中总称为AAT减少或降低或AAT表达抑制或减少。
当提及RNAi触发物时，“引入细胞中”是指将RNAi触发物功能性递送至细胞中。功能性递送是指将RNAi触发物递送至细胞且具有预期生物活性，即对基因表达的序列特异性抑制。给予至哺乳动物血管系统的许多分子(包括RNAi触发分子)通常会由肝自身体清除。RNAi触发物由肝脏清除，但RNAi触发物降解或以其他方式处理以从身体移除且其中RNAi触发物不导致基因表达的序列特异性抑制，这不被视为功能性递送。
给药途径为使RNAi触发物接触身体的路径。一般而言，给予药物及核酸以治疗哺乳动物的方法为本领域中所熟知，且可应用于本文所述的组合物的给予。本发明的化合物可经由任何适合途径、以针对具体途径适当定制的制剂来给予。因此，本发明的化合物可藉由注射给予，例如静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹膜内给予。因此，本发明亦提供包含药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
可使用本领域中已知的寡核苷酸递送技术将本文所述的AAT RNAi触发分子或组合物递送至细胞、细胞群、组织或对象。一般而言，在本领域中已知的任何适用于递送核酸分子(体外或体内)的方法均可适用于本发明的RNAi触发物。举例而言，递送可藉由局部给予(例如直接注射、植入或局部给予)、全身性给予，或皮下、静脉内、经口、腹膜内，或非经肠途径，包括颅内(例如脑室内、脑实质内及鞘内)、肌肉内、经皮、气道(气雾剂)、经鼻、经直肠或局部(包括经颊及舌下)给予来实现。在某些实施方式中，藉由皮下或静脉内输注或注射来给予组合物。
RNAi触发物可与脂质、纳米粒子、聚合物、脂质体、微胞、DPC或本领域中可用的其他递送系统组合。RNAi触发物亦可化学偶联于靶向部分、脂质(包括(但不限于)胆固醇及胆固醇基衍生物)、纳米粒子、聚合物、脂质体、微胞、DPC(WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO2011/104169及WO 2012/083185，其各自以引用的方式并入本文中)，或本领域中可用的其他递送系统。
如本文所用，“药物组合物”包含药理学有效量的至少一种RNAi触发物及药学上可接受的载剂及可选的赋形剂。一或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)为除活性医药成分(API，治疗产品，例如AAT RNAi触发物)以外的已适当评价安全性且有意地包括在药物递送系统中的物质。在预期剂量下赋形剂不会发挥或不会意欲发挥治疗作用。赋形剂可用于a)帮助在制造期间加工药物递送系统，b)保护、支持或增强API的稳定性、生物利用度或患者可接受性，c)有助于产品鉴别，及/或d)在储存或使用期间增强API的总体安全性、效用、递送的任何其他属性。
赋形剂包括(但不限于)：吸收促进剂、防黏剂、消泡剂、抗氧化剂、黏合剂、黏合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、着色剂、递送增强剂、聚葡萄糖、右旋糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填料、香料、助流剂、保湿剂、润滑剂、油类、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、缓释基质、甜味剂、增稠剂、张力剂、运载体、憎水剂及润湿剂。药学上可接受的赋形剂可为或可不为惰性物质。
药物组合物可含有其他在药物组合物中常见的其他附加组分。药学上活性物质可包括(但不限于)：抗瘙痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂(例如抗组织胺、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦设想表达或包含本文定义的RNAi触发物的细胞、组织或离体器官可用作“药物组合物”。如本文所用，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简单地“有效量”是指产生所需药理、治疗或预防结果的RNAi触发物的量。
在一个实施方式中，将AAT RNAi触发物-靶向部分偶联物与MLP递送聚合物(赋形剂)共给予。共给予是指将AAT RNAi触发物及递送聚合物给予哺乳动物以使其同时存在于哺乳动物中。AAT RNAi触发物-靶向部分偶联物与递送聚合物可同时给予或其可依次递送。对于同时给予，其可在给予之前混合。对于依次给予，可首先给予AAT RNAi触发物-靶向部分偶联物或递送聚合物。
在一个较佳实施方式中，本发明的特征在于将AAT RNAi触发物递送至体内肝细胞的药物组合物，其包含：a)AAT RNAi触发物与含有至少20个碳原子的疏水基诸如胆固醇的偶联物(RNA触发物-偶联物)，及b)MLP递送聚合物。MLP递送聚合物及RNA触发物-偶联物分别合成，且可在独立容器或单一容器中提供。在一个较佳实施方式中，AAT RNAi触发物不偶联于递送聚合物。
MLP递送聚合物
如本文所用的蜂毒素样肽MLP为小型两亲性膜活性肽，其包含约23至约32个来源于天然存在的蜂毒肽即蜂毒素的氨基酸，如WO 2012/083185中所述。天然存在的蜂毒素含有26个氨基酸，且在氨基末端主要具有疏水性且在羧基末端主要具有亲水性(阳离子性)。本文所述的MLP可自生物来源分离得到或其可为合成的。合成聚合物是通过化学方法“人工”调配或制造且并非通过天然存在的生物过程产生。如本文所用，MLP涵盖可见于例如以下物种的毒液中的蜂毒素家族的天然存在的蜂毒肽：小蜜蜂(Apis florea)、意大利蜂(Apismellifera)、中华蜜蜂(Apis cerana)、排蜂(Apis dorsata)、额斑黄胡蜂(Vespulamaculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、黄脚虎头蜂(Vespa velutina)、长脚蜂属物种(Polistes sp.)HQL-2001及亚非马蜂(Polistes hebraeus)。如本文所用，MLP亦涵盖具有与天然存在的蜂毒素肽一致或类似的氨基酸序列的合成肽。示例性MLP氨基酸序列包括图6中所示的那些。除保留蜂毒素固有的高膜活性的氨基酸以外，亦可将1至8个氨基酸添加至肽的氨基或羧基末端。特定言的，可将半胱氨酸残基加至氨基或羧基末端。图1中的清单并非穷举，可容易地设想其他保守性氨基酸取代。合成MLP可含有天然存在的L型氨基酸或对映异构的D型氨基酸(反构型，inverso)。然而，MLP应含有基本上所有L型或所有D型氨基酸，但可具有附于氨基或羧基末端的相反立体中心的氨基酸。MLP氨基酸序列亦可逆转(reversed)(逆向，retro)。逆向MLP可具有L型氨基酸或D型氨基酸(逆式反构型，retroinverso)。除遮蔽剂以外MLP可具有修饰基团，其增强组织靶向或有助于体内循环，连接于肽的氨基末端或羧基末端。然而，如本文所用，MLP不包括含有两种以上相互共价连接彼此或与另一聚合物或支架共价连接的MLP肽的链或聚合物。
在一个实施方式中，MLP包含小蜜蜂(小的或矮的蜜蜂)蜂毒素、意大利蜂(西方或欧洲或大的蜜蜂)、排蜂(巨大蜜蜂)、中华蜜蜂(东方蜜蜂)或其衍生物。较佳MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Xaa18-Trp-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26，其中：
Xaa1为亮氨酸、D-亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、二甲基甘氨酸、甘氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，
Xaa2为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa3为甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸，
Xaa5为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa7为赖氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
Xaa10为丙氨酸、苏氨酸或亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa12为甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，
Xaa15为苏氨酸或丙氨酸，
Xaa17为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa18为丝氨酸或半胱氨酸，
Xaa20为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa21为赖氨酸或丙氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，
Xaa23为赖氨酸或丙氨酸，
Xaa24为精氨酸或赖氨酸，
Xaa25为赖氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺，
Xaa26为可选的且若有的话则为谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺-NH2或半胱氨酸-NH2；且
且Xaa21、Xaa23及Xaa25中的至少两者为赖氨酸。
在另一实施方式中，MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：
Xaa1为亮氨酸、D-亮氨酸、正亮氨酸或酪氨酸，
Xaa2为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa3为甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸，
Xaa5为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa7为赖氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
Xaa10为丙氨酸、苏氨酸或亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa12为甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，
Xaa15为苏氨酸或丙氨酸，
Xaa17为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa20为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，且
Xaa26为谷氨酰胺或半胱氨酸。
在另一实施方式中，MLP包含以下序列：Xaa1-Xaa2-Gly-Ala-Xaa5-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa11-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：
Xaa1、Xaa2、Xaa5、Xaa17及Xaa20独立地为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，且
Xaa26为谷氨酰胺或半胱氨酸。
在另一实施方式中，MLP包含：Leu-Ile-Gly-Ala-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Ale-Thr-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Asn-Lys-Arg-Lys-Gln。
本文所述的MLP具有膜活性，因此能够破坏质膜或溶酶体/胞吞膜。如本文所用，膜活性肽为表面活性的两亲性肽，其能够在生物膜上诱导以下作用中的一或多者：允许非膜可渗透性分子进入细胞或穿过膜的膜改变或破坏、在膜中形成孔、膜分裂、或膜破坏或溶解。如本文所用，膜或细胞膜包含脂质双层。膜改变或破坏在功能上可由肽在至少一种以下分析中的活性来定义：红血球溶解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞溶解及胞内释放。将优先地引起质膜上的胞内体或溶酶体破坏的肽视为具有胞内溶解性。膜活性肽对细胞膜的影响可为短暂的。膜活性肽对膜具有亲和力且会导致双层结构发生变性或变形。RNAi触发物递送至细胞由以下介导：MLP破坏或去稳定化质膜或内囊膜(诸如胞内体或溶酶体)，包括在膜中形成孔，或破坏胞内体或溶酶体囊泡，藉此允许囊泡的内容物释放至细胞质中。
MLP的膜活性经可逆地遮蔽以得到MLP递送聚合物。经由遮蔽剂可逆地连接MLP的伯胺来实现遮蔽。
遮蔽剂的必要的特征在于，呈聚集形式时，其会抑制MLP的膜活性且提供体内肝细胞靶向。如本文所用，若经修饰的MLP(MLP递送聚合物)不显示膜活性且显示细胞特异性(即肝细胞)体内靶向，则MLP经遮蔽。若将遮蔽剂连接于肽的键断裂引起MLP上的胺恢复，藉此恢复膜活性，则MLP经可逆地遮蔽。遮蔽剂的必要特征在于，遮蔽剂经由生理学上不稳定的可逆键共价结合于MLP。藉由使用生理学上不稳定的可逆连接或键，遮蔽剂可自MLP体内裂解，藉此使MLP失去遮蔽且使失去遮蔽的MLP恢复活性。将足够数目的遮蔽剂连接于MLP以实现所需的不活化程度。藉由连接遮蔽剂来修饰MLP的所需水平使用适当的肽活性分析来容易地测定。举例而言，若MLP在既定分析中具有膜活性，则将足够水平的遮蔽剂连接于MLP以在该分析中实现所需水平的膜活性抑制。较佳修饰MLP肽群体上≥80％或≥90％的伯胺基团，通过在无任何遮蔽剂存在下肽上伯胺的量来测定。亦为遮蔽剂的较佳特征的是，遮蔽剂连接于肽减少聚合物的正电荷，因此形成更中性的递送聚合物。需要遮蔽肽保留水溶性。
MLP递送聚合物包含通过肽上的伯胺与含脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体的遮蔽剂的反应可逆修饰的MLP，其中该可逆修饰在生理学上不稳定，如2012/083185中所述。
如本文所用，遮蔽剂包含较佳地中性(不带电)的具有ASGPr配体及胺反应性基团的化合物，其中胺反应性基团与肽上的胺的反应使得ASGPr配体经由可逆的生理学上不稳定的共价键连接于肽。若修饰基团的裂解恢复了该胺，则胺经可逆地修饰。较佳的含ASGPr配体的遮蔽剂具有中性电荷且包含ASGPr配体，诸如半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，其具有双取代的顺丁烯二酸酐胺反应性基团。膜活性多胺可在过量遮蔽剂存在下偶联于遮蔽剂。可在给予递送聚合物之前，从偶联的递送聚合物移除过量遮蔽剂。
半乳糖及半乳糖衍生物已经由其与肝细胞表面上表达的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)的结合而用于将分子体内靶向肝细胞。如本文所用，ASGPr配体(或ASGPr配体)包含半乳糖及对ASGPr的亲和力等于或大于半乳糖的半乳糖衍生物。半乳糖靶向部分对ASGPr的结合有助于递送聚合物对肝细胞的细胞特异性靶向及递送聚合物向肝细胞中的胞吞。ASGPr配体可选自包含以下的群：乳糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基-半乳糖胺(Iobst,S.T.及Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr配体可为单体的(例如具有单个半乳糖胺)或多聚的(例如具有多个半乳糖胺)。
较佳遮蔽剂包含中性亲水性双取代的烷基顺丁烯二酸酐：
其中R1包含不带电的脱唾液酸糖蛋白受体配体。较佳烷基为甲基或乙基。经取代的烷基顺丁烯二酸酐的实例由2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐衍生物组成。中性亲水性2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐衍生物如下形成：通过中性亲水基经由2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐γ-羧基连接于2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐来形成。
其中R1包含中性ASGPr配体且n＝0或1。在一个实施方式中，ASGPr配体经由短PEG接头连接于酐。
ASGPr配体经由对ASGPr的亲和力来提供靶向功能。较佳ASGPr配体含有对ASGPr具有亲和力的糖类，包括(但不限于)：半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺及半乳糖衍生物。本领域中熟知对ASGPr具有亲和力的半乳糖衍生物。
本发明包括组成如下的偶联物递送系统：
N-T及MLP-(L-M)x，
其中N为AAT RNAi触发物，T包含具有20或20个以上碳原子的疏水基，MLP为如本文所述的蜂毒素样肽，且M含有经由生理学上不稳定的可逆马来酰胺键L与MLP共价连接的如本文所述的ASGPr配体。L裂解恢复MLP上未经修饰的胺。x为大于1的整数。更特定言的，x值大于MLP群体上伯胺数目的80％及最多达100％。如本文所用，MLP-(L-M)x为MLP递送聚合物。
足够百分比的MLP伯胺经修饰以抑制肽的膜活性且提供肝细胞靶向。较佳地，x值大于MLP群体上伯胺数目的80％且更佳大于90％，所述伯胺数目通过在无任何遮蔽剂存在下MLP群体上的胺量来测定。应注意，单个MLP通常含有3至5个伯胺(氨基端(若未经修饰)且通常含有2至4个赖氨酸残基)。呈未经修饰的状态时，MLP具有膜活性。然而，MLP递送聚合物MLP-(L-M)x不具有膜活性。藉由连接M对MLP伯胺的可逆修饰可逆地抑制MLP膜活性或使MLP膜活性失活。在可逆键L裂解时，未经修饰的胺恢复，藉此使MLP还原至其未经修饰的膜活性状态。MLP-(L-M)x(即一种ASGPr靶向可逆地遮蔽的膜活性聚合物)及T-N(即一种RNAi触发物-偶联物)为分别合成或制造。T与N均不直接或间接地共价连接于MLP、L或M。对于RNAi-触发物的体内肝递送，不需要RNAi触发物或RNAi-触发物-偶联物与遮蔽或失去遮蔽的聚合物的静电性或疏水性缔合。遮蔽聚合物及RNAi-触发物偶联物可在同一容器中或在独立容器中提供。其可在给予的前便经组合、共给予或依次给予。
在一个方面中，我们描述了用于抑制AAT基因表达的药物组合物，其包含本文所述的AAT RNAi触发物。
在一个实施方式中，RNAi触发物在未经缓冲的溶液中给予。在一个实施方式中，未经缓冲的溶液为盐水或水。在一个实施方式中，RNAi触发物与缓冲溶液一起给予。在一个实施方式中，缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在另一实施方式中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
根据本文所述的方法及用途给予所述AAT RNAi触发物可使患有将受益于AAT表达抑制或减少的病症(诸如AATD)的对象的此类疾病或病症的严重度、病征、症状及/或标记物减少。可例如藉由量测疾病进展、疾病缓解、症状严重度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物水平或适于对正在进行治疗或针对性预防的既定疾病的任何其他合适可量测参数来评估疾病的治疗或预防功效。
如本文使用的“治疗有效量”包括当给予患有AATD的对象时，AAT RNAi触发物或共同治疗足以有效治疗疾病(例如通过减小、改善或维持现有疾病或一或多种病征来达成)的量。“治疗有效量”可视AAT RNAi触发物、共同治疗、如何给予该触发物、疾病及其严重度及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗(若有的话)的类型及待治疗对象的其他个体特征而变化。
如本文使用的“预防有效量”包括当给予患有AATD但尚末(或目前)经历或呈现疾病症状的对象及/或处于产生AATD的风险中的对象时，AAT RNAi触发剂或共同治疗足以预防或改善疾病或疾病的一或多种症状的量。改善疾病包括减缓疾病过程或减小以后产生的疾病的严重度。
在一个实施方式中，剂量可为：0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95、0.975、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mg/kg。介于所述值之间的值亦为本发明的部分。
在另一实施方式中，剂量可为：0.1至50、0.25至50、0.5至50、0.75至50、1至50、1.5至50、2至50、2.5至50、3至50、3.5至50、4至50、4.5至50、5至50、7.5至50、10至50、15至50、20至50、20至50、25至50、25至50、30至50、35至50、40至50或45至50mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.1至45、0.25至45、0.5至45、0.75至45、1至45、1.5至45、2至45、2.5至45、3至45、3.5至45、4至45、4.5至45、5至45、7.5至45、10至45、15至45、20至45、20至45、25至45、25至45、30至45、35至45或40至45mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.1至40、0.25至40、0.5至40、0.75至40、1至40、1.5至40、2至40、2.5至40、3至40、3.5至40、4至40、4.5至40、5至40、7.5至40、10至40、15至40、20至40、20至40、25至40、25至40、30至40或35至40mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.1至30、0.25至30、0.5至30、0.75至30、1至30、1.5至30、2至30、2.5至30、3至30、3.5至30、4至30、4.5至30、5至30、7.5至30、10至30、15至30、20至30、20至30、25至30mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.1至20、0.25至20、0.5至20、0.75至20、1至20、1.5至20、2至20、2.5至20、3至20、3.5至20、4至20、4.5至20、5至20、7.5至20、10至20或15至20mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.01至10、0.05至10、0.1至10、0.2至10、0.3至10、0.4至10、0.5至10、1至10、1.5至10、2至10、2.5至10、3至10、3.5至10、4至10、4.5至10、5至10、5.5至10、6至10、6.5至10、7至10、7.5至10、8至10、8.5至10、9至10或9.5至10mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.01至5、0.05至5、0.1至5、0.2至5、0.3至5、0.4至5、0.5至5、1至5、1.5至5、2至5、2.5至5、3至5、3.5至5、4至5或4.5至5mg/kg。
在另一实施方式中，剂量可为：0.01至2.5、0.05至2.5、0.1至2.5、0.2至2.5、0.3至2.5、0.4至2.5、0.5至5、1至2.5、1.5至2.5或2至2.5mg/kg。
在一个实施方式中，一次性给予AAT RNAi触发物。在另一实施方式中，重复给予AATRNAi触发物(即重复剂量方案或多剂量方案)。对于重复给予，可每天一次、每隔一天、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每四(4)周至十四(14)周一次、每月两次、每月一次、每两月一次、每三个月以下一次或每四个月或更长时间一次对对象给予AAT RNAi触发物。介于上述值之间的值亦为本发明的部分。在另一实施方式中，必要时可给予AAT触发物。在另一实施方式中，初始治疗方案可包括以初始时间间隔重复给予及以较小频率进行后续给予。举例而言，在每周或每两周一次给予一至六个月之后，其后可每月一次或更少地进行给予。初始时间间隔可为设定的给药次数、设定的时间跨度，或直至量测到确定的AAT降低为止。对于任何给药方案，无论单次或重复，可使用任一上述量。对于重复给药，相同剂量或不同剂量可用于各次给药。
本发明亦提供包含至少一种本文所述的RNAi触发物的细胞。细胞较佳为哺乳动物细胞，诸如人类细胞。此外，包含本文定义的RNAi触发分子的组织及/或非人类生物体为本发明的实施方式，藉此该非人类生物体尤其适用于研究目的或适用作研究工具，例如在药物测试中。
上文提供的本发明的实施方式及条目现说明于以下非限制性实施例中。
实施例
实施例1.RNAi触发物序列的鉴别。
用于鉴别前导UNA以靶向AAT的选择方法以计算机模拟(in silico)方法开始，以在AAT基因变体中鉴别保守序列。起初针对在11种已知的人类AAT变体中具有精确互补序列的17-核苷酸序列中筛选AAT cDNA序列。淘汰已知具有制造挑战的序列，诸如具有五(5)个或五个以上连串的鸟嘌呤或胞嘧啶者，及基于已知siRNA参数预测为具有较差RNAi活性的那些。亦淘汰包括单核苷酸多态性(SNP)且其中在19聚体序列的2至18位的主要等位基因频率大于0.2的序列。接着对序列进行交叉物种反应性分析以选择将与食蟹猴(cynomolgus monkey)AAT交叉反应的候选物。计算机模拟分析得到840种19聚体序列，及939种17聚体序列。接着评价这些序列的特异性以避免针对人类及食蟹猴基因组的脱靶作用。淘汰在含脱靶基因的任一siRNA链的2-7位含有保守miRNA种子区的序列。接着选择47种候选序列以用于产生RNAi触发分子。
实施例2.RNAi触发物的合成。
A)合成。在用于寡核苷酸合成的固相上根据亚磷酰胺技术合成RNAi触发分子。根据规模，使用MerMade96E(Bioautomation)或MerMade12(Bioautomation)。在由控制孔玻璃(CPG，对于dT为且对于反向dT为获自Prime Synthesis公司，阿斯顿(Aston)，PA，USA)制成的固体支持物上进行合成。所有2'-修饰的RNA亚磷酰胺以及辅助试剂均购自赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific，密尔沃基(Milwaukee)，WI，USA)。特定而言，使用以下2'-O-甲基亚磷酰胺：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2'-O-甲基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5'-O-二甲氧基-三苯甲基-N4-(乙酰基)-2'-O-甲基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2'-O-甲基-鸟苷-3'-O-(2-氰基-乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺及5'-O-二甲氧基-三苯甲基-2'-O-甲基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2'-脱氧-2'-氟-亚磷酰胺携带与2'-O-甲基RNA酰胺(amidite)相同的保护基。5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-断-尿苷、2'-苯甲酰基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺购自连接技术有限公司(Link Technologies LTD，苏格兰)。将所有酰胺均溶解于无水乙腈(50mM)中且添加分子筛为了在寡聚物的5'端引入TEG-胆固醇，采用来自GRC公司(Glen Research，斯特灵(Sterling)，VA，USA)的1-二甲氧基三苯甲基氧基-3-O-(N-胆固醇基-3-氨丙基)-三甘醇-甘油基-2-O-(2-氰基乙基)-(N,N,-二异丙基)-亚磷酰胺。在未对合成循环进行任何修饰的情况下引入5'-修饰。将5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT，250mM于乙腈中)用作活化物溶液。连接时间为10分钟(RNA)、180秒(胆固醇)、90秒(2'OMe及UNA)及60秒(2'F及DNA)。为了引入硫代磷酸酯连接，采用100mM 3-苯基1,2,4-二噻唑啉-5-酮(POS，获自PolyOrg公司，莱明斯特(Leominster)，MA，USA)于无水乙腈中的溶液。参见表1-5(图1-5)。关于
B.支持物结合寡聚物的切割及脱保护。在固相合成结束之后，在室温下用1:1体积的40重量％甲胺于水中的溶液及28％氢氧化铵溶液(Aldrich)处理经干燥的固体支持物2小时。蒸发溶液且使固体残留物在水中重构(参见下文)。
C.纯化。藉由使用Waters XBridge BEH300C4 5u制备柱及Shimadzu LC-8系统的反相HPLC纯化含有寡聚物的粗胆固醇。缓冲剂A为100mM TEAA(pH 7.5)且含有5％乙腈，且缓冲剂B为100mM TEAA且含有95％乙腈。采用45％B至55％B的梯度，历时25分钟。记录在260nm下的UV迹线。接着在使用填充有Sephadex G-25介质的GE Healthcare XK 16/40柱的尺寸排阻HPLC上，用100mM碳酸氢铵(pH 6.7)及20％乙腈的运行缓冲剂，运行适当部分。藉由使用TKSgel SuperQ-5PW 13u柱及Shimadzu LC-8系统的阴离子交换HPLC纯化其他粗寡聚物。缓冲剂A为20mM Tris、5mM EDTA(pH 9.0)且含有20％乙腈，缓冲剂B与缓冲剂A相同并添加有1.5M氯化钠。采用32.5％B至42.5％B的梯度，历时25分钟。记录在260nm下的UV迹线。汇集适当部分，接着在如对含有胆固醇的寡聚物所用的所述尺寸排阻HPLC上运行。
D.退火。藉由在0.2×PBS(磷酸盐缓冲盐水，1×，康宁公司(Corning，Cellgro)中合并等摩尔的RNA溶液(正义及反义)来混合互补链以形成RNAi触发物。将此溶液放入70℃热混合器中，加热至95℃，保持在95℃5分钟，且缓慢冷却至室温。一些RNAi触发物经冻干且储存在-15℃至-25℃下。藉由在UV-Vis光谱计上在0.2×PBS中量测溶液吸光度来测定双链体浓度。接着将在260nm下的溶液吸光度乘以转换因子及稀释因子以测定双链体浓度。除非另有说明，否则所有转换因子均为0.037mg/(mL·cm)。对于一些试验，采用0.0502mg/(mL·cm)的转换因子。
实施例3.蜂毒素样肽(MLP)递送聚合物。
A)蜂毒素样肽(MLP)的合成。所有MLP均使用本领域中标准的肽合成技术制备。适合的MLP可为所有L-型基酸、所有D型氨基酸(反构型)。与L或D型无关地，MLP序列可逆转(逆向)。
B)CDM-NAG(N-乙酰半乳糖胺)的合成。向CDM(300mg，0.16mmol)于50mL二氯甲烷中的溶液中添加乙二酰氯(2g，10重量当量)及二甲基甲酰胺(5μl)。使反应进行过夜，此后藉由旋转蒸发来移除过量乙二酰氯及二氯甲烷以得到CDM酰氯(CDM acid chloride)。将酰氯溶解于1mL二氯甲烷中。向此溶液中添加含1.1摩尔当量(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷(即氨基双乙氧基-乙基NAG)及吡啶(200μl，1.5当量)的10mL二氯甲烷。接着搅拌该溶液1.5小时。接着移除溶剂，并将所得固体溶解于5mL水中，且使用反相HPLC以0.1％TFA水/乙腈梯度进行纯化。
R1包含中性ASGPr配体。较佳地遮蔽剂不带电。
n为1至10的整数。如上所示，PEG间隔基可位于酐基与ASGPr配体之间。较佳的PEG间隔基含有1-10个亚乙基单元。替代性地，可在酐与N-乙酰半乳糖胺之间使用烷基间隔基。
n为0至6的整数。
可在酐与N-乙酰半乳糖胺之间使用其他间隔基或接头。然而，亲水性、中性(较佳地不带电的)间隔基或接头为较佳。
C)MLP递送聚合物(即遮蔽)的形成。使MLP与CDM-NAG遮蔽剂反应以得到MLP递送聚合物。首先将MLP组分在HEPES水溶液(钠盐，GMP级，约430mg/mL)中溶解至最终浓度8.5mg/mL。接着将MLP溶液冷却至4℃，且检查外观(无可见微粒的透明至浅黄色溶液)且藉由UV分光光度测定法检测浓度。在4℃下将CDM-NAG溶解于水中，至约75mg/mL的最终浓度。检查溶液外观(无可见微粒的透明至浅黄色溶液)且藉由UV分光光度测定法检测浓度。将溶液中的MLP与溶液中的CDM-NAG以CDM-NAG与MLP呈5:1(w/w)的比率混合。CDM-NAG溶液的添加速率为每分钟约0.3L，同时搅拌。在所有CDM-NAG溶液均已添加至MLP溶液中之后，搅拌混合物30分钟。为了稳定化MLP递送聚合物，藉由添加1M氢氧化钠水溶液将pH值增大至9.0±0.2。双取代的顺丁烯二酸酐遮蔽剂与肽的反应得到具有由以下表示的结构的化合物：
其中R为MLP，R1包括ASGPr配体(例如NAG)。
使用剩余游离胺的比色三硝基苯磺酸(TNBS)分析以确定MLP被CDM-NAG充分遮蔽，少于总数10％的MLP胺保持未经修饰。
藉由针对10mM、pH 9.2碳酸盐缓冲液进行渗滤以移除过量CDM-NAG来纯化MLP递送聚合物。渗滤方法交换约10倍体积的碳酸盐缓冲液/体积遮蔽MLP反应溶液且保持在2-8℃下。
组分 量(标称)
MLP-EX1乙酸盐 30g/L
CDM-NAGa 25g/L
碳酸钠 0.3g/L
碳酸氢钠 0.6g/L
水 1000g/L
a-假设五(5)个CDM-NAG部分/MLP
将MLP递送聚合物用聚葡萄糖进一步调配至10％w/v且储存在2℃至8℃下。对于一些试验，在使用之前冻干此溶液。
D)注射液。藉由混合RNAi触发物与MLP递送聚合物来形成注射液。将冻干的MLP递送聚合物溶解于水中，并与RNAi触发物混合。接着用生理盐水稀释该溶液至正确注射浓度。
实施例4.siRNA的体外筛选。
将藉由计算机模拟分析(实施例1)鉴别的候选序列筛选为经化学修饰的体外规范siRNA筛选。将计算机模拟鉴别的潜在AAT RNAi触发物中的四十六种合成为规范siRNA，并针对体外功效进行筛选。将人类肝细胞癌细胞株Hep3B细胞以约10,000个细胞/孔接种于96孔格式中。使用Lipofectamine RNAiMax(生命技术公司(Life Technologies)，0.3μL/孔)将46种siRNA中的每一者均以两种浓度即1nM及10nM进行一式三份地转染。转染后二十四小时，裂解细胞，产生cDNA(TaqMan Cells-to-CT Gene Expression套组，生命技术公司(LifeTechnologies))。藉由qRT-PCR与TaqMan化学基分析(生命技术公司)对人类AAT(分析ID：Hs01097800_m1)来评估AAT基因敲除，针对内源对照物人类亲环素A(PPIA，4326316E)进行标准化。在46种体外测试的siRNA中，五种显示至少80％的AAT敲除。对其进行选择以便进一步分析。使用相同的细胞及转染条件来产生十点的EC50曲线，siRNA浓度在0.001-1nM的范围内。另外，五种最有效的规范siRNA中的每一者经重新设计且合成为相应部分双链体RNAi触发物、UNA RNAi触发物及锁核酸(LNA)RNAi触发物。藉由体外敲除分析、藉由两点浓度(在1nM及0.1nM下)分析与十点ED50测定，再次考查所得RNAi触发物。选择其中最有效者用于进一步体内研究。其中最强效的SEQ ID 50/62靶向AAT mRNA中的第1142-1160位，且具有0.01nM的EC50。
血清因子VII(F7)活性测定。藉由将血液收集至微量离心管中来制备动物血清样本。用显色方法使用BIOPHEN VII套组(Hyphen BioMed/Aniara公司，梅森(Mason)，OH)按照制造商建议来测定血浆中的F7活性。使用Tecan Safire2酶标仪在405nm下测定比色显影的吸光度。
实施例5.小鼠AATD模型中RNAi触发物功效的体内分析。
为了评价候选RNAi触发物的体内功效，使用转基因PiZ小鼠模型(PiZ小鼠)。PiZ小鼠携带人类PiZ AAT突变型等位基因及模型人类AATD(Carlson等人，Journal of ClinicalInvestigation 1989)。如上所指出，针对与人类及食蟹猴AAT而非与大鼠或小鼠AAT的相互作用来计算机模拟选择AAT RNAi触发物。
使用MLP递送聚合物将胆固醇靶向性RNAi触发物递送至PiZ小鼠。各小鼠接受向尾静脉的200-250μL溶液的静脉内(IV)注射，该溶液含有8或2mg/kg RNAi触发物+8mg/kg MLP递送聚合物(分别为1:1或0.25:1w/w RNAi触发物:递送聚合物)的剂量。藉由使用hAAT ELISA(Abcam)分析小鼠血清，监测血清中的人类AAT蛋白(hAAT)含量直至hAAT表达水平返回至基线为止。对于标准化，将在某一时点的各动物的AAT水平除以该动物的治疗前表达水平(在这种情况下为在第1天时)，以测定“针对第1天标准化”的表达率。接着针对盐水对照组，通过将个体动物“针对第1天标准化”的比率除以盐水对照组中所有小鼠的平均“针对第1天标准化”的比率来标准化特定时点的表达。这使得各时点的表达相对于对照组中的表达标准化。实验误差以标准偏差形式给出。
mRNA定量。如下自PiZ小鼠肝分离RNA。在处死时，使用液氮将一至三片肝切片在1.5mL微量离心管中速冻。将各小鼠的一片肝切片转移至15mL锥形管中的2mL TRI Reagent RT(Molecular Research Center公司,辛辛那提(Cincinnati)，OH)中。按照制造商建议的方案分离总RNA。简言之，用组织均质机处理TRI Reagent RT中的肝切片，持续约30秒。将1mL匀浆添加至50μL 4-溴苯甲醚中，混合，并通过离心分离各相。移除0.25-0.5mL水相，用异丙醇沉淀，并离心。用75％乙醇洗涤所得沉淀且将其悬浮于0.3-0.7mL无核酸酶的水中。
使用高容量cDNA反转录套组(生物技术公司，格兰德艾兰(Grand Island)，NY)逆转录总RNA(约500ng)。接着1:5稀释cDNA，并使用5'核酸外切酶化学与用于人类α-1抗胰蛋白酶的市售FAM标记的分析物(Assay ID Hs01097800_m1,Life Technologies)、用于小鼠β-肌动蛋白的VIC标记的内源对照分析物(生命技术公司)及VeriQuest Master Mix(昂飞公司(Affymetrix)，圣克拉拉(Santa Clara)，CA)进行多重RT-qPCR。使用相对定量的比较性CT方法(Livak及Schmittgen，2001)来分析基因表达资料。
表7.PiZ小鼠体内过程。
实施例6.筛选AAT siRNA RNAi触发物及AAT敲除时程。
向如上所述的PiZ小鼠给予胆固醇偶联的规范siRNA RNAi触发物。各小鼠接受2mg/kgRNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平直至29天。表8中展示敲除水平及反应持续时间。在给予SEQ ID 50/63及SEQ ID 56/77之后，hAAT血清蛋白水平降低95％以上。
表8.在给予2mg/kg siRNA与8mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。针对第1天及盐水对照物标准化AAT水平。
实施例7.筛选AAT部分双链体RNAi触发物及AAT敲除时程。
向如上所述的PiZ小鼠给予胆固醇偶联的部分双链体RNAi触发物。各小鼠接受8或2mg/kg RNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平直至39天。表10中展示敲除水平及反应持续时间。
表9.在给予8mg/kg部分双链体RNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠体内的血清FVII水平。针对第3天及盐水对照物标准化FVII水平。
治疗 FVII活性
盐水 1.00±0.06
SEQ ID 61/80(FVII) 0.15±0.20
SEQ ID 50/64/81 1.18±0.17
SEQ ID 50/65/82 1.29±0.26
SEQ ID 50/66/83 1.12±0.47
SEQ ID 56/76/89 1.24±0.20
SEQ ID 55/72/86 1.33±0.09
表10.在给予8mg/kg部分双链体RNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。针对第1天及盐水对照物标准化AAT水平。
实施例8.体内筛选AAT UNA RNAi触发物及AAT敲除时程。
向如上所述的PiZ小鼠给予胆固醇偶联的UNA RNAi触发物。各小鼠接受8或2mg/kgRNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平40天。
表11.在给予8或2mg/kg UNA RNAi触发物与8mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。针对第1天及盐水对照物标准化AAT水平。
a规范siRNA对照物
在给予规范siRNA SEQ ID 50/63及UNA SEQ ID 52/63之后hAAT血清蛋白水平降低95％以上。注射后7天(第8天)观测到最大敲除。用UNA SEQ ID 52/63的情况下，敲除持续21天以上(第22天)保持80％以上的减少。UNA RNAi触发物的敲除持续时间长于具有相同序列SEQ ID 50/63的规范chol-siRNA。
实施例9.肝mRNA分析。
向如上所述的PiZ小鼠给予AAT RNAi触发物。各小鼠接受6mg/kg RNAi触发物与6mg/kgMLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。在第3天及第10天测定肝hAAT mRNA产生。mRNA水平降低与血清hAAT蛋白水平降低相关，除了mRNA减少比蛋白质减少早几天以外。在PiZ小鼠中，在SEQ ID 52/63与MLP递送聚合物的单次剂量之后第3天及第10天测定肝hAAT mRNA产生水平。观测到肝hAAT mRNA水平持续降低，其与观测到的血清hAAT蛋白水平降低相关。
表12.在给予6mg/kg SEQ ID 52/63RNAi触发物或siLuc siRNA对照物与6mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。针对第1天及盐水对照物标准化血清hAAT水平。
表13.在给予6mg/kg SEQ ID 52/63RNAi触发物或siLuc siRNA对照物与6mg/kg MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的肝hAAT mRNA水平。相对于小鼠β-肌动蛋白mRNA水平表述AATmRNA水平。
实施例10.SEQ ID 52/63RNAi触发物的体内剂量反应。
向如上所述的PiZ小鼠给予不同量的UNA SEQ ID 52/63。各小鼠接受SEQ ID 52/63与4或8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平35天。根据SEQ ID 52/63剂量与MLP递送聚合物的剂量，hAAT敲除水平在很大程度上具有剂量依赖性(图8)。
表14.针对第1天及盐水对照组标准化的PiZ小鼠中的血清hAAT水平
实施例11.SEQ ID 52/63RNAi触发物的体内剂量反应。
向如上所述的PiZ小鼠给予不同量的UNA SEQ ID 52/63。各小鼠接受SEQ ID 52/63与2、4或8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内(IV)剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平36天。增大的UNA剂量一般会引起所用各含量MLP递送聚合物赋形剂的敲除的水平及持续时间增大。
表15.在给予不同剂量的SEQ ID 52/63UNA RNAi触发物与不同剂量的MLP递送聚合物之后PiZ小鼠中的血清hAAT蛋白水平。针对第1天及盐水对照物标准化AAT水平。
实施例12.用SEQ ID 52/63RNAi触发物治疗的PiZ转基因小鼠的肝组织学。
为了进一步评价肝中hAAT敲除的功效，评估在给予SEQ ID 52/63RNAi触发物与MLP递送聚合物之后的雄性PiZ小鼠的肝样本的组织学变化。如上所述向PiZ小鼠给予UNA SEQ ID52/63。各小鼠接受每两周一次的8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物的静脉内(IV)剂量的给予，持续8周。每周对小鼠放血以监测血清中的hAAT水平，且在给予SEQ ID52/63与MLP递送聚合物后第57天将小鼠处死。收集肝样本，将其固定于10％中性缓冲的福尔马林中，并用石蜡包埋。藉由H&E染色评估炎性浸润。每两周一次用8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物注射8周的PiZ小鼠具有正常形态、无可测炎性浸润性及极罕见的小Z-hAAT小球。每两周一次用盐水注射的PiZ小鼠在受损或死亡肝细胞周围具有显著小球累积以及炎性浸润。Z-hAAT聚集通过对肝切片进行淀粉酶抗性过碘酸希夫(PAS-D)染色来可视化。在进行PAS染色之前，糖原经淀粉酶消化使Z-AAT蛋白累积或“小球”得到阳性染色。接受四次每两周一次的8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物的静脉内(IV)剂量历经8周过程的PiZ小鼠显示，与接受盐水或Luc UNA RNAi触发物59/78对照注射剂(荧光素酶RNAi触发物：dTCfgAfaGfUUNAAfcUfcAfgCfgUfaAfgdTsdT，SEQ ID 59；(Chol-TEG)uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)，SEQ ID 78)的PiZ小鼠相比，细胞内AAT小球减少。从用PAS-D染色的肝样品数字化定量小球数目、小球尺寸及由小球覆盖的肝的面积。较之注射盐水的对照物，以AAT-UNA治疗的小鼠的小球要少85％、小球要小85％，且由小球覆盖的肝的面积要小96％(图10)。
实施例13.分析PiZ小鼠肝组织中的可溶性及不溶性Z-hAAT蛋白。
进一步分析来自用SEQ ID 52/63RNAi效应物治疗的PiZ小鼠的均质化肝组织，以确定预期多为单体蛋白质的可溶性Z-hAAT，与不溶性Z-hAAT聚合物是否均有效减少。采用改进的Western印迹方案，以如前所述的非变性条件分离可溶性与不溶性Z-hAAT部分(Mueller等人，Molecular Therapy 2012)。经给予四次每两周一次的8mg/kg SEQ ID 52/63与8mg/kg MLP递送聚合物的静脉内(IV)剂量持续8周的PiZ小鼠显示，与经给予四次每两周一次的盐水静脉内(IV)剂量的PiZ小鼠相比，可溶性Z-hAAT减少99％且不溶性Z-hAAT减少79％(图11)。
表16.针对经注射盐水的小鼠标准化的PiZ小鼠的肝溶解产物中可溶性及不溶性Z-hAAT蛋白的平均水平
实施例14.在PiZ小鼠中单次注射SEQ ID 52/63RNAi触发物所致的反应的体内持续时间。
如上所述，向6月龄雌性PiZ小鼠给予盐水、8mg/kg Luc-UNA+8mg/kg MLP递送聚合物或8mg/kg AAT RNAi触发物SEQ ID 52/63+8mg/kg MLP递送聚合物的单次静脉内剂量。监测血清中的人类AAT蛋白水平29天。在指定时间，收集血样且藉由ELISA分析其hAAT。在给予触发物的前收集第1天样本。在mRNA分析中，在第3、8、15、22及29天中的每一天处死3至4只小鼠。对于处死的小鼠，进行心脏穿刺(cardic stick)以便AAT ELISA血清分离(200μl血清)。收集一半左侧肝叶且在液氮中速冻以便分离RNA。将左叶的其余部分包埋入石蜡块中以便进行以苏木色素染色为复染的PAS-D染色。经给予AAT RNAi触发物SEQ ID 52/63的小鼠内血清hAAT水平在第8天减少95％且至第29天仍保持减少，此时减少79％。在第3、8、15、22或29天，处死经给予AAT RNAi触发物SEQ ID 52/63的小鼠。在第29天，处死使经给予盐水或Luc-RNAi触发物(SEQ ID 59/78)的小鼠。藉由RT-qPCR测定肝中hAAT mRNA水平。经给予UNA SEQID 52/63的小鼠内hAAT mRNA在第3天减少97％且至第29天仍保持减少，此时水平降低56％。用PAS-D染色的肝样品来数字化定量小球尺寸及由小球覆盖的肝的面积。以AAT-UNA治疗的小鼠在第15天小球小了70％且在第29天小球小了62％。由小球覆盖的肝的面积在第15天减少83％且在第29天减少72％(图12)。
表17.在给予盐水、Luc-RNAi触发物SEQ ID 59/78或AAT RNAi触发物SEQ ID 52/63的一次注射之后PiZ小鼠中的血清hAAT水平。
表18.在给予盐水、Luc-RNAi触发物SEQ ID 59/78或AAT RNAi触发物SEQ ID 52/63的一次注射之后，PiZ小鼠中的相对hAAT mRNA水平。
实施例15.在藉由MLP递送聚合物递送AAT RNA触发分子之后灵长类动物中的α-1抗胰蛋白酶(AAT)的敲除。
如上所述制备MLP递送聚合物及RNAi触发物，并将其合并于的药学上可接受的缓冲剂中。在第1天，对食蟹猴(cynomolgus macaque)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))灵长类动物(雄性及雌性，3至9kg)以不同剂量组合共注射MLP递送聚合物与AAT UNA RNAi触发物SEQ ID 52/63。所注射的剂量组合为：2.0mg/kg MLP递送聚合物+4.0RNAi触发物(n＝3)、3mg/kg MLP递送聚合物+1.5mg/kg RNAi触发物(n＝2)、3.0mg/kg MLP递送聚合物+3.0mg/kg RNAi触发物(n＝3)、3.0mg/kg MLP递送聚合物+6.0mg/kg RNAi触发物(n＝2)、6.0mg/kgMLP递送聚合物+12mg/kgRNAi触发物(n＝3)(用0.050s转换因子确定RNAi触发物浓度)及12mg/kg MLP递送聚合物+6.0mg/kg RNAi触发物(n＝12)。对于各次注射，使用22至25号静脉导管将MLP递送聚合物+RNAi触发物(2ml/kg)注射于隐静脉中。在指定时点，抽取血样且分析其AAT及毒性标记物。自股静脉采血，且使灵长类动物在所有采血的前禁食隔夜。在Meriter实验室或BASi在自动化学分析器上进行关于血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及肌酸酐的血液测试。在Cobas Integra 400(罗氏诊断公司，Roche Diagnostics)上根据制造商建议测定AAT水平。在所有剂量组合下均观测到AAT显著敲除。在2mg/kg、3mg/kg或6mg/kg MLP的剂量下未观测到毒性，但在12mg/kg MLP下，在注射后肝酶(ALT及AST)以及BUN及肌酸酐有所升高。
表19.NHP的AAT敲除百分比
表20.尿素氮(mg/dL)
表21.肌酸酐(mg/dL)
表22.丙氨酸转氨酶(U/L)
表23.天冬氨酸转氨酶(U/L)
实施例16.重复给予。
以六周间隔给予食蟹猴灵长类动物以五剂RNAi触发物+MLP递送聚合物。各剂以MLP与RNAi触发物呈1:2的重量与重量比含有MLP递送聚合物及AAT-RNAi触发物SEQ ID 52/63。第一次注射在第1天。所注射的剂量组合为：2.0mg/kg MLP递送聚合物+4.0RNAi触发物(n＝2)及3mg/kg MLP递送聚合物+6mg/kg RNAi触发物(n＝2)。在整个研究过程中，以一定间隔采血，且如所述测定血清中的AAT水平。以六周间隔重复给药使血清AAT水平在对灵长类动物用3mg/kg MLP递送聚合物+6mg/kg RNAi触发物进行第一次治疗之后二至三十周减小约80-90％。在用2.0mg/kg MLP递送聚合物+4.0RNAi触发物对灵长类动物进行第一次治疗之后，血清AAT减小80％，且在第四次治疗之后减小85％。在用2.0mg/kg MLP递送聚合物+4.0RNAi触发物进行的各次治疗之后六周测定的血清AAT水平反弹小于各次其他治疗(图13)。
序列表
<110> 箭头药业股份有限公司(Arrowhead Madison Inc.)
C·I·伍德尔(Wooddell, Christine I)
D·L·路易斯(Lewis, David L)
D·H·维基菲尔德(Wakefield, Darren H)
S·B·坎纳(Kanner, Steven B)
L·埃尔米达(Almeida, Laurn)
<120> 用于抑制α-1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法
<130> 30624 US1
<150> 62013288
<151> 2014-06-17
<160> 184
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 1
ggaacuuggu gaugauau 18
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 2
gaucauaggu uccaguaa 18
<210> 3
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 3
acagccuuau gcacggcc 18
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 4
ucgaugguca gcacagcc 18
<210> 5
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 5
caaaggguuu guugaacu 18
<210> 6
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 6
cgaaguacuc agcguaag 18
<210> 7
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<400> 7
gaguuggcac gccuuugc 18
<210> 8
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 8
auaucaucac caaguucc 18
<210> 9
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 9
uuacuggaac cuaugauc 18
<210> 10
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 10
ggccgugcau aaggcugu 18
<210> 11
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 11
ggcugugcug accaucga 18
<210> 12
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 12
aguucaacaa acccuuug 18
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 13
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 14
gcaaaggcgu gccaacuca 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base = “2'-羟基相应核苷”
<400> 15
tggaacuugg ugaugauaut t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 16
tgaucauagg uuccaguaat t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 17
tacagccuua ugcacggcct t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 18
tucgaugguc agcacagcct t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 19
tcaaaggguu uguugaacut t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 20
tcgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 21
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(2)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 22
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 23
auaucaucac caaguuccat 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(22)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 24
uauauaucau caccaaguuc cat 23
<210> 25
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 25
uauauaucau ca 12
<210> 26
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 26
uauauaucau cac 13
<210> 27
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 27
uauauaucau cacc 14
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 28
uuacuggaac cuaugaucat 20
<210> 29
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 29
uauuuacugg aac 13
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 30
ggccgugcau aaggcuguat 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 31
ggcugugcuga ccaucgaat 20
<210> 32
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 32
uauggcugug cu 12
<210> 33
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 33
uauggcugug cug 13
<210> 34
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 34
uauggcugug cuga 14
<210> 35
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 35
uauggcugug c 11
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(19)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 36
aguucaacaa acccuuugat 20
<210> 37
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<400> 37
uauaguucaa caaa 14
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(22)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 38
uauaguucaa caaacccuuu gat 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(22)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 39
uaucuuacgcu gaguacuuc gat 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(22)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 40
uaugcaaagg cgugccaacu cat 23
<210> 41
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(10)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 41
ccaaguucca t 11
<210> 42
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(9)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 42
caaguuccat 10
<210> 43
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(8)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 43
aaguuccat 9
<210> 44
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(9)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 44
cuaugaucat 10
<210> 45
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(10)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 45
gaccaucgaa t 11
<210> 46
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(9)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 46
accaucgaat 10
<210> 47
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(8)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 47
ccaucgaat 9
<210> 48
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(11)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 48
ugaccaucga at 12
<210> 49
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222>(1)..(8)
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<400> 49
cccuuugat 9
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2'-脱氧-2'-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2'-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5'-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 50
tggaacuugg ugaugauaut t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 6
<223> /mod_base =“2'-3'断相应核苷酸”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 51
tggaacuugg ugaugauaut t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 7
<223> /mod_base =“2’-3’断相应核苷酸”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 52
tggaacuugg ugaugauaut t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 53
tgaucauagg uuccaguaat t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 54
tacagccuua ugcacggcct t 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 55
tucgaugguc agcacagcct t 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 56
tcaaaggguu uguugaacut t 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 6
<223> /mod_base =“2’-3’断相应核苷酸”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 57
tcaaaggguu uguugaacut t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 7
<223> /mod_base =“2’-3’断相应核苷酸”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 58
tcaaaggguu uguugaacut t 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 7
<223> /mod_base =“2’-3’断相应核苷酸”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 59
tcgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 60
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的反义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,21
<223> /mod_base =“5’-硫代磷酸酯相应核苷酸”
<400> 61
tgaguuggca cgccuuugct t 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 20
<223> /mod_base =“3'-3'-连接的脱氧胸苷”
<400> 62
auaucaucac caaguuccat 20
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 23
<223> /mod_base =“3'-3'-连接脱氧胸苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base = “胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 63
uauauaucau caccaaguuc cat 23
<210> 64
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 64
uauauaucau ca 12
<210> 65
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 65
uauauaucau cac 13
<210> 66
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 66
uauauaucau cacc 14
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 20
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 67
uuacuggaac cuaugaucat 20
<210> 68
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 68
uauuuacugg aac 13
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 20
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 69
ggccgugcau aaggcuguat 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 20
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 70
ggcugugcug accaucgaat 20
<210> 71
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 71
uauggcugug cu 12
<210> 72
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 72
uauggcugug cug 13
<210> 73
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 73
uauggcugug cuga 14
<210> 74
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 74
uauggcugug c 11
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10,12,14,16,18
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 20
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 75
aguucaacaa acccuuugat 20
<210> 76
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 76
uauaguucaa caaa 14
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 23
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 77
uauaguucaa caaacccuuu gat 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 23
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-TEG修饰的相应核苷酸”
<400> 78
uaucuuacgc ugaguacuuc gat 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 23
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇修饰的相应核苷酸”
<400> 79
uaucuuacgc ugaguacuuc gat 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2
<223> /mod_base =“2’-羟基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 4,6,8,10,12,14,16,18,20,22
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 23
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1
<223> /mod_base =“胆固醇-C6修饰的相应核苷酸”
<400> 80
uaugcaaagg cgugccaacu cat 23
<210> 81
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 11
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 81
ccaaguucca t 11
<210> 82
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 10
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 82
caaguuccat 10
<210> 83
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 9
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 83
aaguuccat 9
<210> 84
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 10
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 84
cuaugaucat 10
<210> 85
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 11
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 85
gaccaucgaa t 11
<210> 86
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 10
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 86
accaucgaat 10
<210> 87
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 9
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 87
ccaucgaat 9
<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7,9,11
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8,10
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 12
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 88
ugaccaucga at 12
<210> 89
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsRNA的正义链
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 2,4,6,8
<223> /mod_base =“2’-脱氧-2’-氟代相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 1,3,5,7
<223> /mod_base =“2’-O-甲基相应核苷”
<220>
<221> 修饰碱基
<222> 9
<223> /mod_base =“3’-3’-连接脱氧胸苷”
<400> 89
cccuuugat 9
<210> 90
<211> 26
<212> PRT
<213> 小蜜蜂(Apis Florea)
<400> 90
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 91
Ala Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 92
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 92
Cys Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 93
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 93
Phe Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 94
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 94
His Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 95
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 95
Ile Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 96
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 96
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 97
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Nle
<400> 97
Xaa Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 98
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 98
Val Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 99
Trp Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 100
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 100
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 101
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D型小蜜蜂蜂毒素序列
<400> 101
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 102
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 102
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 103
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 103
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Trp Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 104
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 104
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Thr Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 105
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 105
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Asn Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 106
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 106
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 107
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 107
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Ser Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 108
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 108
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Arg Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 109
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 蜂毒素样肽
<400> 109
Leu Ile Gly Ala Ile Leu His Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 110
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 110
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 111
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 111
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Leu Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 112
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 112
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Leu Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 113
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 113
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Cys Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 114
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 114
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Cys Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 115
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 115
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 116
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 116
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Leu Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 117
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 117
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Ala Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 118
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 118
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Ala Arg Lys Gln
20 25
<210> 119
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 119
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Ala Lys Gln
20 25
<210> 120
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 120
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Ala Gln
20 25
<210> 121
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 121
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Cys
20 25
<210> 122
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 122
Leu Leu Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 123
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 123
Leu Ile Gly Ala Leu Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 124
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 124
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Ala Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 125
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 125
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Ala Arg Lys Gln
20 25
<210> 126
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 126
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Leu Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 127
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 127
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Cys Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 128
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 128
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Ile Gly Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 129
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 129
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ala Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 130
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 130
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Ala Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Ala Asn Ala Arg Lys Gln
20 25
<210> 131
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 131
Tyr Ile Ala Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 132
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 132
Leu Leu Gly Ala Leu Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Leu Ser Trp Leu Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 133
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> 2, 5, 17, 20
<223> Xaa为Nle
<400> 133
Leu Xaa Gly Ala Xaa Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Xaa Ser Trp Xaa Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 134
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 134
Leu Val Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Val Ser Trp Val Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 135
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 135
Gly Leu Gly Ala Leu Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Leu Ser Trp Leu Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 136
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> 2, 5, 17, 20
<223> Xaa为Nle
<400> 136
Gly Xaa Gly Ala Xaa Leu Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Xaa Ser Trp Xaa Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 137
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 137
Cys Glu Asp Asp Leu Leu Leu Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Gly Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 138
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 138
Cys Leu Val Val Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Gly Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 139
<211> 26
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera)
<400> 139
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 140
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 140
Cys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 141
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Nle
<400> 141
Cys Xaa Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 142
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 142
Gly Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 143
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 143
Leu Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 144
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 144
Lys Leu Lys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu
1 5 10 15
Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 145
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 145
Lys Leu Lys Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu
1 5 10 15
Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 146
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 146
Cys Lys Leu Lys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 147
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为Nle
<400> 147
Cys Lys Leu Lys Xaa Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 148
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 148
Gly Lys Leu Lys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 149
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D型蜂毒素样肽
<400> 149
Cys Pro Ala Asn Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 150
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 150
Asp Glu Pro Leu Arg Ala Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr
1 5 10 15
Gly Leu Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25 30
<210> 151
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 151
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Cys
20 25
<210> 152
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 152
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Cys
20 25
<210> 153
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为Nle
<400> 153
Xaa Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Cys
20 25
<210> 154
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 154
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Lys Leu Lys Cys
20 25 30
<210> 155
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 155
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Pro Leu Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Gln Cys
<210> 156
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 156
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Lys Lys Lys Lys Lys
20 25 30
<210> 157
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 157
Tyr Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Gly Phe Lys Gly Cys
20 25 30
<210> 158
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 158
Cys Phe Lys Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu
1 5 10 15
Pro Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Cys
20 25 30
<210> 159
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 159
Phe Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 160
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 160
Leu Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys
20
<210> 161
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 161
Leu Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys
20
<210> 162
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 162
Leu Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Gly Glu
20
<210> 163
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转(reversed)及蜂毒素样序列
<400> 163
Gln Lys Arg Lys Asn Lys Ile Trp Ser Ile Leu Thr Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Ala Leu Val Lys Leu Ile Ala Gly Ile Leu
20 25
<210> 164
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 164
Lys Leu Lys Gln Lys Arg Lys Asn Lys Ile Trp Ser Ile Leu Thr Pro
1 5 10 15
Leu Gly Thr Ala Leu Val Lys Leu Ile Ala Gly Ile Leu
20 25
<210> 165
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 165
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Ser Arg Lys Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 166
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 166
Gly Ile Gly Ala Arg Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Arg Ile
1 5 10 15
Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 167
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 167
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ser Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Glu
20 25
<210> 168
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 168
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Gly Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 169
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 169
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 170
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 170
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Ser Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 171
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 171
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Arg Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 172
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 172
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 173
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 173
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Lys Lys Lys Gln Gln
20 25
<210> 174
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 174
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln Gly Ser Lys Lys Lys Lys
20 25 30
<210> 175
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 175
Lys Lys Gly Ile Gly Ala Ile Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro
1 5 10 15
Thr Leu Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 176
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 176
Gly Ile Gly Ala Ile Leu Glu Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Thr Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Asn Lys Arg Lys Gln
20 25
<210> 177
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 177
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg
20
<210> 178
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 178
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg
20
<210> 179
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蜂毒素样肽
<400> 179
Cys Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 180
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 180
Gln Gln Arg Lys Arg Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Gly
20 25
<210> 181
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 181
Gln Gln Arg Lys Arg Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Cys
20 25
<210> 182
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 182
Gln Gln Lys Lys Lys Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Cys
20 25
<210> 183
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 183
Gln Lys Arg Lys Asn Lys Ile Trp Ser Ile Leu Thr Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Ala Leu Val Lys Leu Ile Ala Gly Ile Gly
20 25
<210> 184
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 逆转及蜂毒素样序列
<400> 184
Gln Gln Arg Lys Arg Lys Ile Trp Ser Ile Leu Ala Ala Leu Gly Thr
1 5 10 15
Thr Leu Val Lys Leu Val Ala Gly Ile Cys
20 25

Claims (23)

1.一种RNA干扰(RNAi)触发分子，其能够抑制α-1抗胰蛋白酶基因的表达，其中所述RNAi触发分子包含正义序列及反义序列，其中所述反义序列依次包含SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸1-18。
2.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链进一步包含长度为1至5个核苷酸的3'延伸。
3.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述反义链的3'延伸包含dTdT或dTsdT。
4.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述正义链的3'延伸包含Af(invdT)。
5.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链进一步包含长度为1至5个核苷酸的5'延伸。
6.如权利要求5所述的RNAi触发分子，其中所述反义链的该5'延伸包含dT。
7.如权利要求5所述的RNAi触发分子，其中所述正义链的该5'延伸包含UAU或uAu。
8.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中靶向部分偶联于所述正义链的5'端。
9.如权利要求8所述的RNAi触发分子，其中所述靶向部分包含胆固醇基。
10.如权利要求9所述的RNAi触发分子，其中所述靶向部分包含胆固醇-三甘醇基。
11.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对：SEQ ID NO:1/8、2/9、3/10、4/11或5/12。
12.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对或部分双链体：SEQ ID NO:15/23、15/24、15/25/41、15/26/42、15/27/43、16/28、16/29/44、17/30、18/31、18/32/45、18/33/46、18/34/47、18/35/48、16/36、19/37/49或19/38。
13.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链含有一或多种经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。
14.如权利要求13所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对：SEQ ID NO:50/62、50/63、53/67、54/69、55/70、56/75或56/77。
15.如权利要求13所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列部分双链体：SEQ ID NO:50/64/81、50/65/82、50/66/83、53/68/84、55/71/85、55/72/86、55/73/87、55/74/88或56/76/89。
16.如权利要求13所述的RNAi触发分子，其中所述反义序列含有至少一个2',3'-断RNA核苷酸模拟物。
17.如权利要求16所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对：SEQ ID NO:51/63、52/63、57/77或58/77。
18.如权利要求13所述的RNAi触发分子，其中经修饰的核苷酸选自下组：2'-O-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、脱氧胸苷、反向脱氧胸苷、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、连接硫代磷酸酯的核苷酸及包含非天然碱基的核苷酸。
19.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的RNAi触发物酸分子，及MLP递送聚合物。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂、稳定剂及/或稀释剂。
21.一种抑制细胞、组织或生物体中的AAT基因表达的方法，其包括将如权利要求1所述的RNAi触发分子引入细胞、组织或生物体中。
22.如权利要求21所述的方法，其中抑制生物体中的AAT基因表达治疗、预防或控制由α-1抗胰蛋白酶缺陷引起的病理学病状或疾病。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述由α-1抗胰蛋白酶缺陷引起的病理学病状或疾病选自下组：慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌及暴发性肝衰竭。
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