CN113358617B - 胞外囊泡富集检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医疗检测技术领域，公开了一种胞外囊泡富集检测方法，该方法经DNA四面体合成、磁珠结合及提取外泌体后进行外泌体富集检测，该方法利用外泌体表面特异性蛋白，基于DNA折纸的适配体和免疫亲和磁珠的空间识别双重识别捕获的方法，进一步结合DNA荧光探针，从而实现外泌体的快速分离捕获，可用于定量检测外泌体。本发明适用于用作试剂盒实现外泌体富集分离与检测，对使其在疾病诊断、病理研究及新药开发等领域得到广泛应用具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，涉及外泌体富集检测方法，具体地说是一种胞外囊泡富集检测方法。
背景技术
外泌体(exosome)是指细胞向外分泌的小囊泡，即胞外囊泡，直径多介于30-150nm之间。外泌体中包含了蛋白质、脂质、核酸等物质，能够被受体细胞接收，实现细胞间的物质运输和信息传递。几乎所有的生物细胞在各种状态下都能释放外泌体，甚至包括一些微生物也会释放外泌体进行信号传递。外泌体中含有许多关键的蛋白质和特殊遗传物质，在细胞通讯和表观遗传调控中发挥着抗原呈递、免疫调节、组织发展、胞间通讯、介导肿瘤发生发展等重要作用。
近年来外泌体相关研究逐渐成为研究热点，大量研究报道了外泌体在肿瘤等疾病发生发展过程中的重要作用，并且由于外泌体在血液、尿液、唾液和脑脊髓液等体液中广泛存在，被认为是疾病诊断的新型生物标志物。而其中，高效、快速的外泌体检测分离是深入研究外泌体与人体病理生理过程相关性的前提，对相关疾病诊治研究意义重大。
目前最常用的外泌体分离方法主要有超滤离心法、PEG-base沉淀法、磁珠免疫法和超速离心法。尽管这些方法在外泌体分离应用中都取得一定的进展，但是仍然存在一些问题。例如，超滤离心法具有操作简单且不影响外泌体的生物活性的优势。但超滤该方法超滤过程中外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低，此外，外泌体膜之间也会发生互相黏附，致使低分离产量，甚至会出现错误的检测结果；PEG-base沉淀法中的聚乙二醇可竞争性结合游离水分子，从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出，该方法也存在一些问题：如外泌体的纯度和回收率低，机械力或化学添加物对外泌体产生破坏等；而磁珠免疫法则由于虽然免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点，是富集表征独特的外泌体的优选方法，但是此方法效率低，外泌体内含物的生物活性易受PH和盐浓度影响，不利于下游实验的进行。超速离心法一定程度规避方法的上述缺陷，但在时间、成本及外泌体的囊泡质量控制也有着明显不足。
DNA折纸技术，是将长链DNA反复折叠以构建各种微小的3D结构，包括微型生物传感器和药物递送容器，目前已有将该技术应用于外泌体检测，但使结构和构建规则复杂的DNA分子双螺旋链弯曲成特定形状是很难设计和可视化的，现有技术更侧重对外泌体的标记检测，其折纸结构在外泌体富集与分离方面效果不佳。
因此构建一种步骤精简、成本合理、能无需超高速离心就可实现外泌体快速、高质量分离检测的技术，有望进一步推动外泌体相关研究进展。促进该技术的推广，对使其在疾病诊断、病理研究及新药开发等领域得到广泛应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的，是要提供一种胞外囊泡富集检测方法，利用外泌体表面特异性蛋白，基于DNA折纸的适配体和免疫亲和磁珠的空间识别双重识别捕获的方法，进一步结合DNA荧光探针，从而实现外泌体的快速分离捕获，同时达到定量检测外泌体的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种胞外囊泡富集检测方法，该方法经DNA四面体合成、磁珠结合及提取外泌体后进行外泌体富集检测。
作为一种限定，所述DNA四面体合成是使DNA寡核苷酸链自组装为DNA四面体；所述DNA寡核苷酸链是三条修饰有适配体的DNA寡核苷酸链和一条待与链接链结合的DNA寡核苷酸链。
作为第三种限定，所述的胞外囊泡富集检测方法，包括依次进行的以下步骤：
S1.DNA四面体合成
将三条修饰有适配体的DNA寡核苷酸链和一条待与链接链结合的DNA寡核苷酸链加入单链自组装的离子缓冲液中，变性，退火使其自组装形成DNA四面体，备用；
S2.磁珠结合
活化磁珠后使其与适配体的抗体结合，得免疫磁珠，备用；
S3.提取外泌体
取细胞，分散，加入细胞裂解液，使细胞裂解，取上清，用于外泌体富集检测；
其中，上清中包含外泌体；
S4.外泌体富集检测
将DNA四面体、链接链、免疫磁珠和上清，25℃下孵育20min，富集外泌体，吸附免疫磁珠，完成外泌体分离检测。
其中，DNA四面体、链接链和上清，25℃下孵育20min，得免疫磁珠链接外泌体；
免疫磁珠也可后加入，即，外泌体富集检测：
将DNA四面体、链接链和上清，25℃下孵育20min，得Linker链接的DNA四面体及外泌体聚团，加入免疫磁珠，25℃下孵育20min，得免疫磁珠链接外泌体。
作为进一步限定，步骤S1中，
所述三条修饰有适配体的DNA寡核苷酸链的DNA序列分别为：5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACAAACCAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCA TAGTA-3’、
5’-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCTTCCAGTAATAGATGCGAGGGTC CAATAC-3’及
5’-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACAAATCCTGGGAATCTACTATGGCGG CTCTTC-3’；
所述待与链接链结合的DNA寡核苷酸链的DNA序列为：5’-CCCACCCCTCCGGTTAACCTCAGACTTAGGAACGACTTCCCACGTAGTG TCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’；
所述链接链Linker的DNA序列结构为：
5’-AAGAAGGGG-BHQ2-TTAATGGATT-CY5-GGAAGAA-3’。
作为进一步限定，所述适配体为CD9、CD91、CD63或EPCAM特异性适配体。
作为再进一步限定，所述链接链为位于DNA四面体顶点修饰有淬灭基团及荧光基团的游离延长链。
作为更进一步限定，步骤S3中，所述细胞为悬浮细胞或贴壁细胞。
本发明由于采用了上述技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
(1)本发明通过将DNA折纸技术与免疫磁珠技术相结合，利用DNA折纸技术构建修饰有核酸适配体、淬灭基团和链接链的DNA四面体结构，该DNA四面体识别外泌体的三维立体膜结构效果好，具有更强的空间识别效应，可以更好的特异性识别并结合外泌体；同时，淬灭基团的加入为外泌体的荧光检测与分离提供基础；链接链的加入使相邻DNA四面体结合，形成DNA四面体网，实现外泌体富集与多靶标检测；此外，利用构建免疫磁珠进行二次富集，相对于市面上存在的一些免疫磁珠外泌体提取试剂盒，该方法通过简单便宜的核酸序列，以及将外泌体率先富集，所以本方法仅需很少量的免疫磁珠，即可捕获大量的外泌体，更好的的控制成本较高的免疫蛋白与磁珠量的问题。
(2)本发明通过四面体和Linker特异性捕获，将外泌体聚团后，利用免疫磁珠直接分离出来，加入DNA酶裂解核酸，将外泌体释放，提供了一种无需在超高速离心的条件下即可进行的外泌体富集检测，该方法在同时在Linker上链接荧光基团与淬灭基团，实现对外泌体的高度特异性富集检测的同时，通过特异性酶的切割，达到外泌体富集分离检测的目的；
本发明的检测方法简单易操作，成本低，可用于制备检测试剂盒商业化应用，该方法实现了DNA折纸技术与免疫磁珠技术的结合，实现无需超高速离心的外泌体富集检测；本发明适于用作试剂盒实现外泌体富集分离与检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中胞外囊泡富集检测方法的原理图，图中DNAse1为DNA酶1，EV为外泌体，TDN为DNA四面体，Cy5为Cy5荧光基团，BHQ为淬灭基团；
图2为本发明实施例6中对DNA四面体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的结果图；
图3为本发明实施例6中DNA四面体链接效果的验证结果图，图中3A为单个DNA四面体透射电镜扫描图，图中3B为两个DNA四面体通过Linker链接后的透射电镜扫描图；
图4为本发明实施例6中DNA四面体富集外泌体效果的验证结果图，图中4A为Linker链接的DNA四面体及外泌体聚团的透射电镜扫描图，图中4B为免疫磁珠的透射电镜扫描图，图中4C为免疫磁珠链接外泌体的透射电镜扫描图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得，所用工艺如无特殊说明，均为本领域常规工艺方法。
实施例1一种胞外囊泡富集检测方法
实验材料：DNA核酸厂商为上海生工，磁珠厂商为赛默飞，抗体厂商为Proteintech，六孔板厂商为晶安生物J06001；
TM缓冲液：含20mM Tris及50mM MgCl。
图1为本实施例的实验原理图，本实施例的方法包括依次进行的以下步骤：
S1：DNA四面体合成：
设计四条DNA寡核苷酸链L1、L2、L3和L4，其中L1、L2和L3修饰有CD63适配体，用以组装成DNA四面体特异性底部，L4顶端有与链接链Linker结合的位点，待结合后形成伸出的游离链，起链接作用；
涉及的DNA序列见表1；
将四条DNA寡核苷酸链首先用DEPC水稀释到10μM；然后在TM缓冲液中混合4种寡核苷酸溶液；调整pH至8.0，用MJ微型个人热循环器(新加坡Bio-Rad实验室有限公司)加热至95℃，10min后，自然冷却至室温；然后立即放入4℃冰箱上过夜，使其可以增加组装效率，制得DNA四面体，如图3所示；
将DNA四面体分散在1×PBS(pH7.4)中，使终浓度为200nm，在4℃下贮存，备用。
表1涉及的DNA序列
S2：磁珠结合：
取1mL(10mg)磁珠，使用500μg蛋白质/mL/>磁珠，调整耦合过程中总体积，使最终/>磁珠浓度为50mg/mL；
S21、通过将小瓶滚动30min以上，将磁珠重新投入使用，并将1mL转移到新试管中；将试管放入磁铁中2min，取出上清液；
S22、从磁铁上取下试管，添加1mL 15mM MES缓冲液(pH 6.0)，涡流5–10秒；将试管放在磁铁上2min，然后去除上清液；
S23、重复步骤S22一次；
S24、在100μL 15mM MES缓冲液(pH值6.0)再次使用磁珠；
S25、加入100μL EDC，室温下在滚筒上培养30min；将试管放入磁铁中2min，然后去除上清液；
S26、添加400μg CD63抗体，在15mM MES缓冲液(pH 6.0)中稀释至500μL；在室温下在滚筒上孵育一夜；将试管放入磁铁中2min，然后取出上清液；
S27、从磁铁上取下试管，添加1mL PBS和0.1％Tween-20；将试管放在滚筒式搅拌机上10min；将试管放在磁铁上2min，然后去除上清液；
S28、重复步骤S27一次；
S29、在500μL 1×PBS(pH7.4)中再悬浮磁珠，添加0.1％Tween-20和0.1％牛血清白蛋白，得免疫磁珠，备用，使用时可稀释至所需浓度。
S3：提取外泌体：
取肺癌细胞A549贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水洗一次去除杂质，分散细胞，按照六孔板每孔加入100mL(6cm培养皿200uL)裂解液的比例加入裂解液，在冰上充分裂解25min后，10000g离心3min，提取上清，其中包含待富集的外泌体，可进行PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作验证提取结果。
S4：外泌体富集检测：
将DNA四面体、链接链、免疫磁珠和上清，25℃下孵育20min，实现DNA四面体与链接链结合，免疫磁珠与链接链结合，DNA四面体与上清中待富集的外泌体结合，实现富集外泌体，通过磁铁吸附免疫磁珠，完成外泌体分离检测。
实施例2一种胞外囊泡富集检测方法
实施例2为一种胞外囊泡富集检测方法，它与实施例1基本相同，不同之处在于步骤S3不同，其它步骤相同，本实施例的步骤S3具体为：
S3：提取外泌体：
取悬浮细胞，离心收集细胞，将细胞用力弹散，按照六孔板每孔细胞加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液，再轻弹以充分裂解细胞，充分裂解至无明显细胞沉淀，去除培养液，用PBS、生理盐水洗一次去除杂质，分散细胞，按照六孔板每孔加入100mL(6cm培养皿200uL)裂解液的比例加入裂解液，在冰上充分裂解25min后，10000g离心3min，提取上清，其中包含待富集的外泌体，可进行PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作验证提取结果。
实施例3-5胞外囊泡富集检测方法
实施例3-5分别为一种胞外囊泡富集检测方法，它们均与实施例1基本相同，不同之处在于实施例3-5中特异性适配体选择依次为CD9、CD91及EPCAM特异性适配体。
实施例6胞外囊泡富集检测方法的验证实验
一)DNA四面体的验证
对步骤S1制得的DNA四面体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，用以验证DNA四面体的分子量及组装效果，结果如图2所示，由图2可以看出，由单链DNA寡核苷酸链L1、L2、L3和L4四条单链，成功合成DNA四面体，四面体可以进行很好的组装，四条单链形成四面体组装效果好。
二)DNA四面体链接效果的验证
将步骤S1制得的DNA四面体置于透射电镜扫描，结果如图3A所示，Scale bar50nm，可以看出成功合成DNA四面体结构；
将Linker加入DNA四面体验证Linker链接效果，结果如图3B所示，Scale bar50nm，结果表明，Linker可将两个DNA四面体链接起来，为形成DNA四面体网及后续外泌体的聚集奠定了基础。
三)DNA四面体富集外泌体效果的验证
将步骤S4中，得到Linker链接的DNA四面体及外泌体聚团(简称：聚团)，置于透射电镜扫描，结果如图4A所示，Scale bar100nm，可以看出聚团可以很好的聚集在一起；
对免疫磁珠采用TEM透射电镜表征，结果如图4B所示，图4B表明免疫磁珠大小均匀，在1μm左右。
外泌体被免疫磁珠捕获的效果：对步骤S4中，得到的免疫磁珠链接外泌体，采用TEM透射电镜表征，由图4C，Scale bar250nm，可以看出，免疫磁珠链接外泌体中外泌体很好的附着在免疫磁珠表面。
外泌体用PKH67外泌体绿色荧光染料标记，而本实验设计的四面体顶端标记CY5，将步骤S4富集外泌体后，经吸附免疫磁珠，分离，得到Linker链接的DNA四面体及外泌体聚团，固定在共聚焦皿上，进行共聚焦成像，结果表明，外泌体富集成功。
需要注意，上述实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明所作的其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员都可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆大学
<120> 胞外囊泡富集检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acattcctaa gtctgaaaca aaccagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tatcaccagg cagttgacag tgtagcccgg ggtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcaactgcct ggtgggttaa cgacactacg aagctctcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccacccctc cggttaacct cagacttagg aacgacttcc cacgtagtgt cgtttgtatt 60
ggaccctcgc at 72
Claims (4)
1.一种胞外囊泡富集检测方法，其特征在于，该方法经DNA四面体合成、磁珠结合及提取外泌体后进行外泌体富集检测；
具体包括依次进行的以下步骤：
S1.DNA四面体合成
将三条修饰有适配体的DNA寡核苷酸链和一条待与链接链结合的DNA寡核苷酸链加入单链自组装的离子缓冲液中，变性，退火使其自组装形成DNA四面体，备用；
S2.磁珠结合
活化磁珠后使其与适配体的抗体结合，得免疫磁珠，备用；
S3.提取外泌体
取细胞，分散，加入细胞裂解液，使细胞裂解，取上清，用于外泌体富集检测；
S4.外泌体富集检测
将DNA四面体、链接链、免疫磁珠和上清，25℃下孵育20min，富集外泌体，吸附免疫磁珠，完成外泌体分离检测；
其中，步骤S1中，
所述三条修饰有适配体的DNA寡核苷酸链的DNA序列分别为：
5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACAAACCAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3’、
5’-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCTTCCAGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3’及
5’-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACAAATCCTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3’；
所述待与链接链结合的DNA寡核苷酸链的DNA序列为：
5’-CCCACCCCTCCGGTTAACCTCAGACTTAGGAACGACTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’；
所述链接链的DNA序列结构为：
5’-AAGAAGGGG-BHQ2-TTAATGGATT-CY5-GGAAGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的胞外囊泡富集检测方法，其特征在于，所述适配体为CD9、CD91、CD63或EPCAM特异性适配体。
3.根据权利要求1所述的胞外囊泡富集检测方法，其特征在于，所述链接链为位于DNA四面体顶点修饰有淬灭基团及荧光基团的游离延长链。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的胞外囊泡富集检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述细胞为悬浮细胞或贴壁细胞。
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