CN110073195B - 提取外泌体以及与之结合的生物大分子的方法以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从一种或多种生物样本中提取外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子的方法及其试剂盒。其中，所述与外泌体相结合的生物大分子包括核酸、蛋白质、脂质、和代谢物等，所述生物样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑髓液、乳液、泪液、以及条件培养基等。提取物可用于协助疾病的检测、预防、并理解疾病的生物学原理。本发明具有多项优势，提供的技术方案简单，成本低，实验耗时短，并能够满足工业上的大规模需求。

Description

提取外泌体以及与之结合的生物大分子的方法以及试剂盒
本专利申请要求于2016年11月23日提交的印度临时专利申请号201621040010的优先权。
技术领域
本申请涉及医学领域、细胞生物学领域、分子生物学领域以及遗传学领域，具体而言涉及检测、鉴定、诊断试剂盒以及细胞衍生囊泡的提取方法，更为具体地，涉及从生物样品中，例如细胞培养基、尿液、唾液、血清以及血液等，提取出外泌体，用于疾病检测、疾病预防以及理解疾病的生物学原理。
背景技术
外泌体是由细胞衍生出的微型囊泡体，当细胞内多囊泡体与细胞膜融合后，可形成纳米级微小囊泡，并由细胞分泌出去。几乎所有的有机体都能产生外泌体，外泌体内含有生物大分子(DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物等)。外泌体(大小为30-100nm)可代表一个小型化细胞(大小为5-10μm)。多囊泡体是一种次级内体区室的管腔内囊泡，外泌体则来源于多囊泡体以及多囊泡体与细胞膜的融合，这种融合使囊泡体被释放到细胞外区域。
外泌体曾经被认为是细胞产生的“垃圾袋”用来丢弃不需要的蛋白质。然而，外泌体越来越被视为具有重要的生理功能，尤其是在细胞通信方面。近年来，由肿瘤导致的树突细胞、肿瘤细胞以及恶性积液产生的外泌体被证实能够将抗原呈现给T细胞，并引领了众多研究将这些囊泡体作为生物标记用于诊断疾病，例如癌症、糖尿病、肝炎、阿兹海默症和帕金森症等。
在相关领域中，已知多种方法可以提取外泌体用于进一步分析其内含有的生物大分子物质，用于疾病诊断以及给药等。一些已知的外泌体提取方法包括超速离心、尺寸排除法色谱以及亲和层析等。实践上来说，这些方法全部需要很长的孵育反应时间，因此受到技术限制，并具有其他的缺点，例如消耗更多劳动力、耗时久、破坏外泌体的完整性并且成本高。
根据相关领域目前的情况，市场需要的是能够快速并且低成本提取外泌体的方法、步骤、试剂盒以及鉴定手段，其中提取方法需要较短或几乎不需要孵育反应时间，可以使用常见的实验室试剂和设备来完成，并且不需要高速度的离心，例如超速离心，而低速度离心是指离心力显著低于10,000×g的离心，以此便能提取得到高质量的外泌体。
鉴于此，本发明提供试新的试剂盒以及方法用于从血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑髓液、乳液、泪液以及条件培养基中提取外泌体以及与之结合的大分子，例如核算、蛋白质、脂质和代谢物等，以协助检测疾病、预防疾病并理解疾病的生物学原理。本发明具有重大意义，并能够解决长期以来存在的压力需求。
发明内容
本发明内容介绍了关于提取外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子的方法以及试剂盒。但是，本段内容不旨在揭露本创新的核心特征，也不旨在定义或限制本创新的范围。
本发明的目的是找到快速并精确的方法，可以从多种生物样本中，例如细胞系的条件培养基、血浆、血液、血清、唾液、尿液、脑髓液、乳液以及泪液等，提取出外泌体以及与外泌体相结合的分子，其中与外泌体相结合的分子包括核酸、蛋白质、脂质和代谢物等，以此协助检测疾病、预防疾病、并理解疾病的生物学背景。
本发明的一个方面是，提供一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒，其特征在于，所述方法包括：第一步先将大分子稳定剂加入到生物样本中，得到一种混合物，并混合均匀，或者，在第一步中，向所述生物样本中加入一种稀释液得到另一种混合物，并混合均匀，再向所述另一种混合物中加入大分子稳定剂，并混合含有所述生物样本、所述稀释液以及所述大分子稳定剂的混合物。所述方法的第二步包括向第一步得到的混合物中加入一种体积排斥聚合物，得到一种混合体。所述方法的第三步将第二步中得到的混合体放入一台式离心机中进行离心，预设的离心时间为10-20分钟，得到一种离心沉淀和一种离心上清液。所述方法的第四步包括弃去上清液，并用一种预设浓度的缓冲液清洗所述离心沉淀。所述方法的第五步，即是最后一步，包括利用一种预设浓度的缓冲溶液重悬所述离心沉淀，得到提取的细胞衍生囊泡体。所述细胞衍生囊泡体中外泌体的含量范围是2.2x1012-4.5x1014。
本发明提供的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案，其特征在于,所述生物样本为细胞体液，包括但不限于血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳液、关节滑液、脑髓液、汗液、泪液、阴道液或羊水；或者为用于培养以下细胞系但不限于以下细胞系的培养基：HEK293T细胞、LN229细胞、MCF7A细胞、SiHa细胞、HeLa细胞、C33a细胞、Caski细胞、A549细胞、A431细胞、或Jurket细胞。
本发明提供的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案，其另一特征在于，所述稀释液最好为质量浓度是1％(w/w)的磷酸盐缓冲液(PBS)，并以反应混合物体积40％(v/v)的比例添加使用。
本发明提供的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案，其另一特征在于，所述体积排斥聚合物最好是分子量范围为1000-5000Da，pH范围为7.2-7.6的聚乙二醇，加入到样本后的最终浓度为10-25％(w/v)。
本申请公开的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案中，其另一特征在于，所述大分子稳定剂含有分子通式为C6H12O7的有机化合物钠盐，所述有机化合物钠盐的摩尔浓度范围为20-50％，并以0.2-5％(w/v)的含量添加使用。
本申请公开的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案中，其另一特征在于，所述第五步结束时可得到从生物样本中提取的细胞衍生囊泡体，该提取物中含有外泌体标记蛋白，包括但不限于抗原CD63(CD63)，抗原CD9(CD9)和抗原CD81(CD81)。
本申请公开的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案中，其另一特征在于，从所述细胞衍生囊泡体提取物中提取得到的蛋白质量的范围为75μg-500μg每毫升所述生物样本，从所述细胞衍生囊泡体提取物中提取得到的RNA量的范围为250ng-450ng每毫升所述生物样本，从所述细胞衍生囊泡体提取物中提取得到的DNA量的范围为100ng-250ng每毫升所述生物样本。
本申请公开的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的方法以及试剂盒的技术方案中，其另一特征在于，所述血清至少去除了部分细胞衍生囊泡体。
本申请公开的从一种生物样本中提取细胞衍生的囊泡体的试剂盒的技术方案中，其特征在于，所述试剂盒含有一种溶液A，所述溶液A含有一种大分子稳定剂；一种溶液B，所述溶液B含有一种体积排斥聚合物；以及一种溶液C，所述溶液C含有一种含有缓冲溶液的稀释液。其中通过所述试剂盒提取得到的细胞衍生囊泡体含有外泌体，所述外泌体的量的范围为2.2x1012-4.5x1014。
本申请公开的外泌体以及与外泌体结合的生物大分子的提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒能够应用与癌症诊断以及其他疾病的诊断和检测，包括像肝炎、阿兹海默症以及糖尿病，并且能够应用于给药以及药物开发的方法中。
附图说明
本申请将结合附图对实施方式进行说明。在图中，标号的最左位数字代表了该标号最初出现的附图数字。同一数字在所有附图中表示具有相同特征或成分的组分。
图1展示了本发明的方法过程。
图1A展示了本发明从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的过程。
图1B展示了本发明得到一种无细胞衍生囊泡体血清的过程。
图2展示了在本发明的实施例中，按照本发明公开的方法和过程，从一种含有细胞培养基的生物样本中提取到的细胞衍生囊泡体的量。
图3展示了在本发明的实施例中，按照本发明公开的方法和过程，从一种含有血清的生物样本中提取到的细胞衍生囊泡体的量。
图4展示了在本发明的实施例中，按照本发明公开的方法和过程，从多种生物样本中提取到的细胞衍生囊泡体所含蛋白质的量。
图5展示了在本发明的实施例中，按照本发明公开的方法和过程，从多种生物样本中提取到的细胞衍生囊泡体所含核酸的量。
图6展示了在本发明的实施例中，按照本发明公开的方法和过程，从多种生物样本中提取到的细胞衍生囊泡体的电子扫描显微镜图像。
图7展示了通过乙酰胆碱比色法检测本发明的实施例中，从多种生物样本中提取得到的外泌体的提取比例。
图8展示了本发明的实施例中，从多种生物样本中得到的细胞裂解物和外泌体标记蛋白的蛋白质印记(Western blot)图像，用于了解所述外泌体的分布情况。
图9展示了本发明的实施例中，从多种生物样本中，通过不同的离心时长提取到的外泌体标记蛋白的蛋白质印记(Western blot)图像。
图10展示了本发明的实施例中所提取的细胞衍生囊泡体的生物相容性检测结果。
本申请的附图仅用于描述实施例，以展示为目的。在不偏离本发明的原理的条件下，本领域技术人员能够轻松地通过以下描述根据所述步骤做出其他实施例。
具体实施方式
将附图与实施方式的具体描述相结合阅读，能够更好地理解本发明。本发明所列举的实施例是出于展示目的，并不能将本发明限制于某一特定的设计或附图所示的设计。
本申请将结合附图对实施方式进行说明。在图中，标号的最左位数字代表了该标号最初出现的附图数字。同一数字在所有附图中表示具有相同特征或成分的组分。
本发明的一些实施例展示出了本发明的全部特征，将在此做详细描述。在描述中出现的词语像“包括”、“具有”、“含有”、“包含”以及类似形式的词语均表达相同的意思，并且为开放式的含有，即所含有的组分不是一个详尽的清单，或者说不限于已列出的项目。必须指出的是，单数形式的“一种”和“这种”包括引用的复数项目，除非文中有明确指示其为单数。
本申请所描述的示例性的实施例以及后文的权利要求在实际实施中可省略其中公开或未公开的一些特征、元素或步骤。例如，本申请描述中所提及的“一个实施例”、“一示范性实施例”等其他类似表达是指所描述的实施例可以包含有一个特定的特征、结构或特点，但并不是每一个实施例都需要包含这一特定的特征、结果或特点。本公开的实施例仅仅是示例性的展示多种形式或特征的组合。另外，上述词组不一定与一些实施例有关联。进一步地，当一种特定的特征、结构或特点与一个实施例相结合进行描述时，应当理解为，无论这一特征是否被详细描述，本领域的技术人员都能够将该特征、结构或特点与其他实施例相结合。
本申请不存在任何术语表示非权利要求保护的元素为核心或重要元素。本文出现的任何或全部示例或示例性的语言(例如，“例如”)仅是为了更好的阐述实施例，并不限定附属的权利要求的范围，除非在权利要求中阐明。
数值范围的详述仅作为一种速记方法，将每一个单独的参考数值囊括在该范围中，除非在文中特别指出，并且每一个数值都包含在本说明书中，以此假定每一个数值都详细记录在本申请中。需要理解的是，当给出一个特定的数值范围时，除非文中特指，否则直到该范围下限值的十分之一单位处，该范围的上限与下限值之间的所有数值以及其他列举的数值均包括在所述数值范围内。所有小于该范围的子范围也包括其中。子范围的上限与下限值也包括在其中，并同时受到所述范围的特殊排除限制。例如，一范围是“大约0.1％-大约5％”，或“大约0.1％-5％”可以理解为不仅包括大约为0.1％和大约为5％的数值，还包括个别的值(例如1％、2％、3％和4％)以及在该范围内的子范围(例如：0.1％-0.5％、1.1％-2.2％，3.3％-4.4％)。
本发明包含生物材料，即生物样本包括但不限于血液、血清、血浆、泪液、唾液、尿液、条件培养基等。所述生物样本能够普遍地在全印度领域内购买得到，这是已知常识。因此，根据《2002生物多样性法案》，如果有任何需要，与本申请相关的必要手续都将在专利基金下发前服从执行。
本申请涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。广泛地说，细胞衍生囊泡体的提取需要用到多种方法，例如超速离心、沉淀法与离心法、磁性免疫纯化、层析纯化等。本发明公开的提取方法包括了生物样本的沉淀法与离心法。本发明范围内对细胞衍生囊泡体的提取最优的实施方式是对外泌体的提取。外泌体是大小为30nm-100nm的囊泡体，在多囊泡体与细胞膜融合后由细胞分泌而出，或者由细胞膜直接分泌出细胞。外泌体在凝血、细胞间信号转导以及细胞废物处理方面具有重要作用。所以，越来越多的临床应用聚焦于外泌体，以此来了解疾病的预后与治疗，并将外泌体作为健康和病态的生物标记物。本发明涉及外泌体提取的方法与过程。
参照图1所示的从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的流程图，本发明涉及从不受限制的多种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法。一些生物样本示例包括但不限于从以下生物材料中获得的样本：全血、血清、血浆、尿液、唾液、痰液、乳液、腹水、关节滑液、羊水、精液、脑髓液、卵泡液以及泪液。用于提取细胞衍生囊泡体的不受限生物样本示例还包括条件细胞培养基，即用于培养细胞系的培养基，其中细胞系包括但不限于以下一种或几种：HeLa细胞、SiHa细胞、Me-180(人子宫颈表皮癌细胞)细胞、C33a(人宫颈癌细胞)细胞、人胚胎肾细胞293或HEK293、人乳腺癌细胞系、MCF-7细胞、或LN-229细胞。
在本发明的一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法，其中生物样本包括富含血清的条件细胞培养基。为了从所述富含原始血清的细胞培养基中得到条件细胞培养基，可进行以下步骤：
a)接种细胞，培养直至其倍数增殖，在收集条件培养基之前，最好让细胞在含有10％血清(无细胞衍生囊泡体)的培养基中达到2.5-3次倍增。另外，细胞最好在含有10％血清(无需去除细胞衍生囊泡体)的培养基中培养至70-80％融合，再在含有10％血清(无细胞衍生囊泡体)的培养基中最好培养2-3天，直至融合；
b)收集条件培养基；
c)离心，最佳条件为2000转/分，离心5分钟以去除细胞碎片；
d)将离心所得上清液转入干净的试管中；
e)收集所得的上清液最好在5000转/分的条件下离心20分钟；
f)再将离心所得的上清液收集到干净的试管中；
g)离心所得的上清液经0.22μm孔径的滤纸过滤，并保存在4℃。
在本发明的另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体，其中所述生物样本为通过无血清或低血清含量的培养基得到的条件细胞培养基。通过所述无血清或低血清含量的培养基得到所述条件细胞培养基的方法如下：
a)接种细胞，培养直至其倍数增殖，最好让细胞在含有10％血清的培养基中达到2.5-3次倍增，以此使得细胞融合至70-80％；
b)弃去细胞培养基，并以1×PBS清洗单层细胞两次；
c)再以无血清或含有2％血清(去除/非去除细胞衍生囊泡体)的培养基培养该单层细胞，最好让该细胞在此条件培养2-3天(直至达到100％融合)；
d)收集培养基；
e)最好在2000转/分的条件下离心收集的培养基5分钟，以去除细胞碎片；
f)离心后的上清液收集到干净的试管中；
g)最好再以5000转/分的条件离心收集的上清液20分钟；
h)将离心后的上清液收集到另一干净试管中；
i)最好将h)步收集的上清液通过孔径为0.22μm的滤纸过滤，将滤液于4℃保存。
参考图1，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法以及试剂盒。在本发明的一实施例中，所述方法的第一步包括向所述生物样本中加入大分子稳定剂，得到一种混合物，并混合所述混合物。所述生物样本包括但不限于以下多种生物样本：尿液、唾液、痰液、乳液、腹水、关节滑液、羊水、精液、脑髓液、卵泡液以及泪液，也包括条件细胞培养基，即用于培养细胞系的培养基。其中，所述细胞系的培养包括但不限于以下一种或几种细胞系的联合培养：HeLa细胞、SiHa细胞、Me-180Me-180(人子宫颈表皮癌细胞)细胞、C33a(人宫颈癌细胞)细胞、人胚胎肾细胞293(HEK293)、人乳腺癌细胞系或MCF-7、LN-229(人胶质瘤细胞)细胞。但是，所述生物样本不包括血清和血浆。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述生物样本的体积可以为至少15毫升、至少10毫升、至少5毫升、至少4毫升、至少2毫升、至少1毫升、至少500微升、至少200微升、至少100微升、或者至少50微升。
在一实施例中，本发明涉及在第一步时，向所述生物样本中加入大分子稳定剂。其中，所述大分子稳定剂含有低离液序列盐，用于提取细胞衍生囊泡体以及与之结合的生物大分子。低离液序列盐可促进水分子与水分子之间的相互作用，并使该作用力及其结构稳定。在外泌体的提取过程中，这种能够促进大分子间作用力稳定的物质有助于聚合物的形成并清除杂质。
在本发明的另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述生物样本为生物体液，包括但不限于以下体液：血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳液、关节滑液、脑髓液、汗液、泪液、阴道分泌液或羊水。所述方法的第一步包括向所述生物样本中加入稀释液，得到一混合物，并混合所述混合物，再向所述混合物中加入大分子稳定剂，并混合含有生物样本、稀释液以及大分子稳定剂的所述混合物。在本实施例中，所述生物样本包括但不限于牛血清、马血清、人血清、鸡血清以及猪血清。所述血清以及血浆也可以为不同年龄的生物血清，例如胎牛血清、小牛血清、新出生的小牛血清或成年牛血清。
在一最佳实施例中，本发明涉及从一些样本的血清或血浆中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法包括，第一步向所述生物样本中加入稀释液，得到一混合物，所述稀释液为等张溶液，有助于维持pH以及渗透压，最好为1％(w/w)的磷酸盐缓冲液，再向所述混合物中加入大分子稳定剂，并混合含有生物样本、稀释液以及大分子的混合物。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述低离液序列盐能够与金属离子结合以去除杂质，得到高纯度、完整的与生物大分子相结合的外泌体混合物。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述与金属离子相结合的低离液序列盐是化学通式为C6H12O6或C6H22O11之一的碳水化合物。
在一最佳实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述与金属离子相结合的低离液序列盐是化学式为C6H12O6或C6H22O11之一的碳水化合物，所述碳水化合物的使用浓度为1％-3％(w/v)摩尔浓度。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述与金属离子相结合的低离液序列盐是一种有机化合物盐，其化学通式为C6H12O7，即一条含有6个碳原子的碳链，连有5个羟基，其中一个碳端为羧基。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述化学式为C6H12O7的有机化合物盐以相对于大分子稳定剂20％-50％(w/w)的摩尔浓度进行使用，所述化学式为C6H12O7的有机化合物盐在生物样本中的最终浓度为0.2％to 5％w/v。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法中使用的与金属离子相结合的物质能够去除杂质，并有助于获得高纯度的外泌体以及与之相结合的生物大分子。所述与金属离子相结合的物质为有机化合物盐，所述的盐最好为钠盐。
在一实施例中，本发明涉及一种从生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法包括使用有机化合物钠盐与金属离子结合去除杂质，所述的盐无毒并且可以被生物降解。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法包括第二步，向第一步的混合物中加入体积排斥聚合物，得到一种混合体。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述方法包括沉淀法，使用体积排斥聚合物，包括但不限于环氧乙烷的聚合产物，用于从生物样本中提取外泌体。本领域技术人员应了解聚乙二醇(PEG)作为环氧乙烷的聚合产物，是一种理想的可以用于提取像外泌体这样的生物组分的沉淀剂，以此协助疾病检测、预防以及研究疾病的生物学原理。特别地，本发明使用的是某一特定浓度的低分子聚乙二醇混合物，这样生物样本就无须进行孵育，便能得到高保真的外泌体。PEG沉淀法是本领域技术人员已知的方法，操作简单，在环境温度下就可发生，并且沉淀动力过程迅速。本发明所述的试剂盒中也包含了某一特定浓度的低分子PEG用于外泌体提取。在现有技术中，许多发明都涉及到采用聚乙二醇沉淀法和离心法提取外泌体。但是，大部分现有技术需要两步离心，第一步为低速离心，第二步为高速离心。因此耗费实验时间，同时还需要一个孵育步骤。所以，市面上的试剂盒方法不能在快速完成外泌体提取的同时，还能保证外泌体的高纯度和高稳定性。另外，市面上用于提取外泌体以及与之结合的生物聚合体的试剂盒存在许多缺陷，包括但不限于提取得到的样品纯度低、缺乏标准化、缺乏灵敏度并且需要像超速离心机这样较贵的设备。以上问题均能通过本发明解决。
在一实施例中，本发明涉及从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述方法采用低分子聚合物，将外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子沉淀，得到的提取物可协助检测、预防以及研究多种疾病，包括癌症、肝炎以及糖尿病。
在本发明的一实施例中，所述用于沉淀外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子的低分子聚合物包括平均分子量位于300-1,00,00,000Da之间的聚乙二醇溶液，具体地，是平均分子量位于300-5000Da之间，最优为位于1000-5000Da之间的聚乙二醇溶液。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法或试剂盒包含分子量位于1000-5000Da的PEG，所述PEG的质量浓度为10％-25％。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法使用了分子量为1000-5000Da的PEG，所述PEG的浓度为10％-25％，所述PEG溶液是将所述PEG溶解于蒸馏水中配置得到的。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中所述方法使用了分子量为1000-5000Da的PEG，所述PEG的浓度为10％-25％，所述PEG溶液是将所述PEG溶解于生理盐溶液中得到的，例如标准磷酸盐缓冲液。
在一最佳实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法使用了分子量为1000-5000Da的PEG，所述PEG的浓度为10％-25％，所述PEG溶液是将所述PEG溶解于生理盐溶液中得到的，例如pH为7.0-8.0的中-碱性标准磷酸盐缓冲液，更具体地，所述标准磷酸盐缓冲液pH范围为7.2-7.6。
在一最佳实施例中，本发明涉及从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述生物样本包括血液、血清、唾液、血浆、尿液、脑髓液、乳液、泪液以及细胞培养基等。其中所述分子量位于1000-5000Da，浓度为10％-25％的PEG以及所述浓度为20％-50％(w/v)的有机化合物盐以一特定比例混合。
在一实施例中，本发明方法的第三步包括利用台式离心机将第二步得到的混合体离心，预设离心时间为10-20分钟，得到离心沉淀以及上清液。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中所述离心力使混合物样本中较重的组分与较轻的组分在离心轴方向上彼此分离。作用于离心样品的离心力是由离心机转子的旋转速度以及旋转半径产生的，外泌体沉淀(离心沉淀)在离心力作用下聚集在离心管底部。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中所述离心步骤包括一步低速离心。
在一最佳实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述离心步骤可通过普通的台式离心机完成，转速可为1000-5000转/分钟，最优为在低温下，以3000转/分钟，离心不超过20分钟。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法的第四步包括弃去离心上清液，并用某一预设浓度的缓冲液清洗离心沉淀。所述用于清洗的缓冲液最优为浓度是1％(w/v)的磷酸盐缓冲液。
参考图1B，在另一实施例中，本发明涉及从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述生物样本包括生物血清或条件培养基。所述血清样本与一种体积排斥聚合物相混合。所述体积排斥聚合物含有分子量为1000-5000Da，特定浓度为10％-25％范围内的乙二醇的聚合产物——聚乙二醇。将所述体积排斥聚合物加入生理盐溶液中，例如pH为7.0-8.0的中-碱性标准磷酸盐缓冲液，更具体地，pH为7.2-7.6，即可得到体积排斥聚合物溶液。将所述混合物于台式离心机中低速离心，转速为1000-5000转/分钟，最优可在低温条件下，以3000转/分的速度离心不超过20分钟，然后收集上清液，即可得到无细胞衍生囊泡体血清，具有多种商业用途。本发明所述的提取细胞衍生囊泡体的方法可得到高纯度的上清液组分，其中的血清组分中剩余的细胞衍生囊泡体含量小于103每毫升血清。可以通过蛋白质印迹法来检测无外泌体上清液中的外泌体标记蛋白的浓度，以此检测血清的纯度。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物表白中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述方法的第五步，即最后一步，包括用预设浓度的缓冲溶液重悬离心沉淀，从沉淀组分中得到提取的细胞衍生囊泡体。所述缓冲溶液最优为浓度是1％(w/v)的磷酸盐缓冲液。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述方法提取出高纯度、高稳定性以及高含量的外泌体，所述外泌体包括多种与之相结合的生物大分子，例如核酸、蛋白质和脂质等。所述包含有高纯度外泌体的离心沉淀能够溶于液体，比如蒸馏水或盐溶液，例如磷酸盐缓冲液，用于后续使用。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。通过所述方法，从多种生物样本中提取出的外泌体可量化检测至少6种与外泌体相关的标记蛋白，包括但不限于CD9、CD63、HPS70、脂阀结构蛋白-1、脂阀结构蛋白-2以及Alix蛋白。这是本发明最重要的特征，因为量化检测一系列标记蛋白，才能达到治疗与诊断的目的，并以该标记蛋白为抗原进行靶向给药。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述方法得到与细胞衍生囊泡体相结合或分离的可计量的大分子，例如蛋白质、核酸和脂质等。以上列出的提取步骤保证提取的细胞衍生囊泡体样品中不含有能可靠计量的细胞裂解标记蛋白——钙联接蛋白。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。所述试剂盒包括一个含有大分子稳定剂的A溶液、一个含有体积排斥聚合物的B溶液、以及一个含有稀释液的C溶液，所述稀释液含有一种缓冲液。所述试剂盒可通过本申请以上所述的方法从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒，其中所述方法所需的生物样本浓度为至少50微升。因此，本发明从工业生产角度来说，具有很大的优势，能够从很小量的样本中提取出2.2x1012-4.5x1014的外泌体，该产量可达到市场上其他竞争产品的10000倍。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒，所述提取过程中，没有孵育步骤。本发明能够将从条件细胞培养基或其他生物样本中提取出的外泌体产量提高10000倍，达到2.2x1012-4.5x1014，而耗时仅需10-20分钟，也就是说，与需要过夜孵育的试剂盒相比，本发明节约了36-72倍的实验时间。所以，本发明具有多种竞争力以及发明优势，尤其有利于工业规模上的外泌体提取。
在另一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子的方法及其试剂盒。所述方法可得到2.2x1012-4.5x1014的外泌体，通过所述方法，从生物体液或条件培养基中得到的每毫升的外泌体纯度高，稳定性好，并能够用于癌症诊断试剂盒、肝炎诊断试剂盒、糖尿病诊断试剂盒以及用于药物开发的试剂盒以及给药方法。
以下实施例代表但不限制本发明。
实施例1：从生物体液中提取细胞衍生囊泡体(图2)
在一反应管中，装入任何小于4毫升的生物体液，更为合适的是小于3毫升的生物体液，最优为至少50微升的生物体液，或者装入至少100微升、至少200微升、500微升、至少1毫升或至少2毫升的生物体液。向所述生物样本中以40％(v/v)的比例加入质量分数为1％的磷酸盐缓冲液，并混合均匀。然后再向其中加入1.5％(w/w)、2％(w/w)、或者2.5％(w/w)的大分子稳定剂，其中大分子稳定剂最优为分子通式是C6H12O7的有机化合物钠盐，并用移液枪上下吸吹混匀。然后再向该混合物中加入含有低分子量聚乙二醇的体积排斥聚合物，并用移液枪上下吸吹混匀，得到一种混合体。其中，所述体积排斥聚合物最优为含有分子量不大于5000Da，且不小于3000Da的聚乙二醇，并且至少含有10％(w/v)、12％(w/v)、或15％(w/v)的分子量为4000Da的聚乙二醇。将所述混合体放入台式离心机最好在低温条件下以2000转/分钟、2500转/分钟、或3000转/分钟离心，其中低温条件最优为4摄氏度，离心小于20分钟，更好的是小于15分钟、小于12分钟、小于11分钟，最优的是至少离心10分钟。将离心所得上清液弃去，并以1％质量分数的磷酸盐缓冲液清洗离心沉淀，并将清洗后的离心沉淀重悬于适量的液体中，用于检测提取的外泌体的每毫升产量，或者检测外泌体蛋白的微克每升产量。结合图2，通过本实施例得到的外泌体纯度高，其中外泌体组分的产量为4.5x1014个外泌体微粒每毫升生物体液，即与竞争产品相比，外泌体提取量提高了106倍。
实施例2：从细胞培养基中提取细胞衍生囊泡体(图3)
在一反应管中，装入小于4毫升的条件细胞培养基，最优为至少50微升，或者至少100微升、至少200微升、至少500微升、至少1毫升、或者至少1毫升。向所述生物样本中加入1.5％(w/w)、2％(w/w)、或2.5％(w/w)的大分子稳定剂，其中大分子稳定剂最优为分子通式是C6H12O7的有机化合物钠盐，并用移液枪上下吸吹混匀。再向该混合物中加入含有低分子量聚乙二醇的体积排斥聚合物，并用移液枪上下吸吹混匀，得到一种混合体。其中，所述体积排斥聚合物最优为含有分子量不大于5000Da，且不小于3000Da的聚乙二醇，并且至少含有20％(w/v)、22％(w/v)、或25％(w/v)的分子量为4000Da的聚乙二醇。将所述混合体放入台式离心机在低温条件下以1500转/分钟、2000转/分钟、2500转/分钟、或3000转/分钟离心，其中低温条件最优为4摄氏度，离心少于25分钟，更好的是少于22分钟、少于21分钟，更好的是至少离心20分钟，最优为至少离心15分钟。将离心所得上清液弃去，并以1％质量分数的磷酸盐缓冲液清洗离心沉淀，并将清洗后的离心沉淀重悬于适量的液体中，用于检测提取的外泌体的每毫升产量，或者检测外泌体蛋白的微克每升产量。结合图2，通过本实施例得到的外泌体纯度高，其中外泌体组分的产量为2.2x1012个外泌体微粒每毫升细胞培养基，即与竞争产品相比，外泌体提取量提高了104倍。
实施例3：估量提取的细胞衍生囊泡体中外泌体蛋白的含量(图4)
参考图4，展示了在一些实施例中，提取得到的蛋白质产量。其中，这些实施例将相关领域现有技术的相关步骤按照以上所述方法进行改进，并遵从以上所述的实验步骤进行，得到的外泌体蛋白量为75微克-500微克每毫升生物样本，其中所述生物样本包括了一种细胞系或多种细胞系的细胞培养基。
实施例4：估量提取的细胞衍生囊泡体中核酸含量(图5)
图5A展示了在一些实施例中，提取得到的核酸产量。其中，这些实施例将相关领域现有技术的相关步骤按照以上所述方法进行改进，并遵从以上所述的实验步骤进行，得到的外泌体DNA量为100纳克-250纳克每毫升生物样本，其中所述生物样本含有细胞培养基。
图5B表示从细胞培养基中分离出的DNA在0.8％琼脂胶上的电泳图。该结果可通过如下操作得到：第一步制备0.8％琼脂胶，并加入SYBER SAFE染料用于DNA显色，然后将DNA加样至琼脂胶中，电泳1小时。在Chemi Doc XRS系统(Bio-Rad美国)中观察结果。
图5C表示从血清样本中分离出的DNA在添加与不添加DNA消化酶的条件下，在0.8％琼脂胶上用Chemi Doc XRS系统(Bio-Rad美国)观测到的电泳图。
进一步地，一些实施例还提取了外泌体中的RNA，并检测其产量。其中，这些实施例将相关领域现有技术的相关步骤按照以上所述方法进行改进，并遵从以上所述的实验步骤进行，得到的外泌体RNA量为250纳克-450纳克每毫升所述生物样本。
图5D为外泌体RNA在15％聚丙烯酰胺凝胶的分离电泳图(PAGE)。其中，RNA通过银染显色。该结果可通过如下操作得到：第一步加样RNA至凝胶中，跑PAGE电泳，然后将电泳胶于150ml含有50％甲醇以及5％乙酸的溶液中固定18分钟，然后转入150ml的50％甲醇中清洗10分钟，再用蒸馏水清洗，然后于150ml硫代硫酸钠溶液中浸泡1分钟，再用水漂洗1分钟，然后将电泳胶放入150ml含有0.1％硝酸银和0.8％福尔马林(37％)的溶液中浸泡18分钟，再用水漂洗1分钟之后，放入150ml含有2％碳酸钠和0.04％福尔马林(37％)的溶液中反应，直至条带显色至一定程度。最后一步，用150ml的15％乙酸溶液清洗电泳胶10分钟，再用水清洗5分钟，最后通过Chemi Doc XRS系统(Bio-Rad美国)观测电泳结果。
实施例5：提取的细胞衍生囊泡体的扫描电子显微镜图像(图6)
参考图6，其中图6A是从细胞条件培养基中提取的外泌体的电子扫描显微镜图片。图6B是从血清中提取的外泌体的电子扫描显微镜图片。所述图片可通过以下步骤获得：利用PEG，从2ml细胞条件培养基或50微升血清中提取外泌体，然后向外泌体沉淀中加入1×PBS，以3000转/分钟，离心3分钟的条件清洗该沉淀，然后将外泌体沉淀溶于约为500微升的蒸馏水中，然后将重悬的外泌体以滴样方式加入到网格板上，并用5nm的金对其镀金10分钟，最后在200nm分辨率下进行扫描电子显微镜的成像。
实施例6：通过乙酰胆碱酯酶比色法定量检测外泌体活性(图7)
参考图7，该图是乙酰胆碱酯酶比色法定量检测外泌体活性的结果。所述结果可通过以下步骤得到：从4ml细胞条件培养基中提取外泌体，然后将外泌体沉淀于50微升的磷酸盐缓冲液中重悬，并取10微升的重悬样品加入到96孔板中，再向96孔板中加入20微升的6-10mM 5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶液，然后再加入170微升的0.5-1mM乙酰胆碱碘，放入酶标仪中读取405nm处的吸光值。该比色反应能较好的体现离心沉淀中外泌体的存在及其活性。由于乙酰胆碱酯酶是一种结合于细胞膜上的标记物，所以该反应能够清晰的验证细胞衍生囊泡体的存在。
实施例7：外泌体标记蛋白的检测以及外泌体纯度检查(图8)
参考图8，该图是外泌体标记蛋白的检测结果以及外泌体纯度的检查结果。所述结果是通过蛋白质印迹法得到的。首先，将外泌体蛋白分解并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将电泳胶上的蛋白转模至FluoroTrans(美国颇尔公司)的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，再将该膜放入含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中于室温封闭1小时。然后进行免疫印迹反应，将所述PVDF膜与每一种标记蛋白的初级抗体孵育反应(所述初级抗体以1:2000稀释，于4℃过夜孵育)，再将所述PVDF膜与二级抗体孵育反应(所述二级抗体以1:5000稀释，在室温中孵育1小时)。进一步地，用含有1％吐温-20的PBS溶液漂洗所述PVDF膜，然后利用Optiblot ECL检测试剂盒(英国Abcam公司，货号：ab133406)检测所述PVDF膜的ECL发光信号。其中，所述初级抗体包括：脂阀结构蛋白1抗体(英国Abcam公司，货号：ab181988)、CD63抗体(美国Cloud Clone公司，货号：PAB247Hu01)、HSP70抗体(英国Abcam公司，货号：ab47455)、以及钙联接蛋白抗体(美国Cell Signalling Technologies，货号：2679)，二级抗体包括：HRP(辣根过氧化物酶)标记兔抗(美国Pierce公司)和HRP标记鼠抗(美国Pierce公司)。显然，从多种细胞系中提取得到外泌体组分不含有可靠计量的细胞裂解物标记蛋白——钙联接蛋白，而外泌体标记物脂阀结构蛋白出现在所有的外泌体提取样品中，证明了提取物的纯度。
实施例8：提取的外泌体的生物兼容性(图9)
参考图9，该图展示了提取得到的外泌体的生物兼容性。可根据以下步骤得到该结果。取大约4ml的HEK293T细胞条件培养基(所述细胞系最优培养条件为：含有最终浓度为10％无外泌体血清的DMEM(杜氏改良培养基)培养基)，与葡萄糖酸钠混合，其中葡萄糖酸钠的最终浓度为25％，然后再向其中加入PEG-4000，使其最终浓度达到25％，摇匀或用移液枪上下吸取混匀。将该混合物于4摄氏度条件下，以3000转/分钟的速度离心20分钟，得到外泌体沉淀，再用50微升的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗并重悬所述外泌体沉淀。再利用PKH绿色荧光细胞连接试剂盒(美国Sigma，货号：PKH67GL)按照说明书的指示，对外泌体进行标记。染色反应中，可以通过加入2ml的DMEM完全培养基(从无外泌体血清培养基中制得)中和未结合的染剂，将50毫克的PKH绿色荧光标记的外泌体加入到单层培养的HeLa细胞和SiHa细胞中进行孵育。4小时后，细胞已固定，然后清洗细胞，并用激光共聚焦显微镜在63×放大下拍摄图片。显然，提取的外泌体能够被细胞吸收，因此，所述提取的外泌体对许多医学应用至关重要，例如药物设计、疾病治疗以及诊断。
在一实施例中，本发明涉及从一种生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法及其试剂盒。其中，所述方法能够从至少为50微升的小体积生物样本中提取得到高纯度并且生物兼容性好的实验室级别的外泌体，其产量可达2.2x1012to 4.5x1014，从多种生物样本中，包括条件细胞培养基或其他生物样本，提取外泌体所需时间均小于20分钟。乙酰胆碱比色法(图7)以及蛋白质印迹法均验证了提取的外泌体的纯度，其中通过蛋白质印记法，可清晰看到从外泌体沉淀中分离出的脂阀结构蛋白-2以及从细胞裂解物中分离出的钙联接蛋白(图8)。提取得到的外泌体具有生物兼容性，并且由PKH绿色荧光细胞连接试剂盒检测可知，所述提取的外泌体能够轻松地被细胞吸收(图9)，所以，提取得到的外泌体与疾病诊断、治疗、给药以及科研都密切相关。
以上描述应被视为展示性的描述，不应对发明内容起到限制意义。相关领域技术人员应理解，在本发明的范围内，可对本发明内容做一定的修改。

Claims (26)

1.一种从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法，其中，所述方法包括：
第一步，向所述生物样本中加入大分子稳定剂，得到一种混合物，并混合所述混合物；或者在第一步中，向所述生物样本中加入一种稀释液，得到另一种混合物，并混合所述另一种混合物，然后向所述另一种混合物中加入大分子稳定剂，并将含有所述生物样本、所述稀释液、以及所述大分子稳定剂的混合物混合均匀，其中所述大分子稳定剂的分子通式为C6H12O7、C6H12O6和C6H22O11中的一种；
第二步，向第一步得到的混合物中加入体积排斥聚合物，得到一种混合体；
第三步，将第二步所得的混合体放入一部台式离心机中进行离心，离心的预设时间为10-20分钟，得到一种离心沉淀和一种离心上清液；
第四步，弃去所述离心上清液，然后用一预设浓度的缓冲溶液清洗所述离心沉淀；以及
第五步，利用另一预设浓度的缓冲溶液重悬离心沉淀，得到提取出的存在于离心沉淀组分中的细胞衍生囊泡体，其特征在于，所述存在于沉淀组分中的细胞衍生囊泡体的产量范围为2.2xl012-4.5xl014，大小为30-120nm，
其中，所述从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法中不包括任何孵育步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本为生物体液，包括但不限于血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳液、关节滑液、脑髓液、汗液、泪液、阴道液或羊水。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本包括但不限于用于培养以下任意一种细胞系的细胞培养基：HEK293T细胞系、LN229细胞系、MCF7A细胞系、SiHa细胞系、HeLa细胞系、C33a细胞系、Caski细胞系、A549细胞系、A431细胞系、或Jurket细胞系。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，需要的所述生物样本体积最小为50微升。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述稀释液为质量分数为1％(w/w)的磷酸盐缓冲液，并且以反应混合物浓度为40％(v/v)的比例添加使用。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积排斥聚合物以10％-25％(w/v)的量添加使用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述体积排斥聚合物为以下任意一种：葡聚糖、硫酸葡聚糖、乙酸葡聚糖、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、或聚醋酸乙烯酯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述体积排斥聚合物是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6之间的聚乙二醇。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子通式为C6H12O7的大分子稳定剂是摩尔浓度为20％-50％的有机化合物钠盐，所述分子通式为C6H12O7的大分子稳定剂以0.2％-5％(w/v)的量加入到生物样本中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子通式为C6H12O6或C6H22O11其中一种的大分子稳定剂的摩尔浓度为20％-50％，并以0.2％-5％的量加入到生物样本中。
12.根据权利要求1所述的方法，所述离心速度为1000-5000转/分钟，离心温度不超过4摄氏度。
13.根据权利要求1所述的方法，其中第五步中，用于重悬所述离心沉淀的所述缓冲溶液为1％(w/w)磷酸盐缓冲液。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在第五步完成时，从一生物样本中，提取得到的所述细胞衍生囊泡体含有多种外泌体标记蛋白，包括但不限于抗原CD63(CD63)、抗原CD9(CD9)、抗原CD81(CD81)、HSP70、脂阀结构蛋白-1、脂阀结构蛋白-2、以及Alix蛋白。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取得到的细胞衍生囊泡体中不含有可靠计量的细胞裂解物标记蛋白钙联接蛋白。
16.根据权利要求1所述的方法，其中从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的蛋白质的量为75微克-500微克每毫升所述生物样本。
17.根据权利要求1所述的方法，其中外泌体的量化体现为估计的总外泌体蛋白质的微克每毫升数。
18.根据权利要求1所述的方法，其中通过估算外泌体膜结合蛋白的量，确定所述外泌体的纯度，所述外泌体膜结合蛋白为乙酰胆碱酯酶，其中所述外泌体的提取灵敏度为每毫升生物体液中含有0.1-1500毫单位的乙酰胆碱酯酶。
19.根据权利要求1所述的方法，其中从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的RNA的量为250纳克-450纳克每毫升所述生物样本，从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的DNA的量为100纳克-250纳克每毫升所述生物样本。
20.一种制备无细胞衍生囊泡体的血清的方法，其中，所述血清至少去除了部分细胞衍生囊泡体，所述方法包括：
第一步，向一种生物样本中加入大分子稳定剂，得到一种混合物，并混合所述混合物；或者在第一步中，向所述生物样本中加入一种稀释液，得到另一种混合物，并混合所述另一种混合物，然后向所述另一种混合物中加入大分子稳定剂，并将含有所述生物样本、所述稀释液、以及所述大分子稳定剂的混合物混合均匀，其中所述大分子稳定剂的分子通式为C6H12O7、C6H12O6和C6H22O11中的一种，
第二步，向第一步得到的所述混合物中加入一种体积排斥聚合物，得到一种混合体；
第三步，将第二步得到的所述混合体放入一台式离心机中离心，预设离心时间为10-20分钟，得到一种离心沉淀和一种离心上清液；
第四步，即最后一步，将所述离心上清液转入适合的容器中，即为所述无细胞衍生囊泡体的血清，
其中，制备无细胞衍生囊泡体的血清的方法中不包括任何的孵育步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述血清包括但不限于以下血清中的一种或多种：牛血清、马血清、人血清、大鼠血清、小鼠血清、兔血清、绵羊血清、山羊血清、羔羊血清、鸡血清、以及猪血清。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述体积排斥聚合物是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6之间的聚乙二醇，并以10％-25％(w/v)的量加入到所述生物样本中。
23.一种用于从生物样本中提取分泌的细胞衍生囊泡体的试剂盒，其特征在于，所述细胞衍生囊泡体含有外泌体，其中提取得到的所述外泌体的量为2.2xl012 to 4.5xl014，所述试剂盒包括：
一种A溶液，其中含有一种大分子稳定剂，其中所述大分子稳定剂的分子通式为C6H12O7,C6H12O6,and C6H22O11中的一种；
一种B溶液，其中含有一种体积排斥聚合物；以及
一种C溶液，其中含有一种稀释液，所述稀释液含有一种缓冲液。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述体积排斥聚合物是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6的聚乙二醇，并以10％-25％(w/v)的量添加使用。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述大分子稳定剂是一种分子通式为C6H12O7，摩尔浓度为20％-50％的有机化合物钠盐，并以0.2％-5％(w/v)的量添加使用。
26.根据权利要求23所述的试剂盒，所述稀释液是质量分数为1％(w/w)的磷酸盐缓冲液，并以反应混合物浓度为40％(v/v)的比例使用，所述生物样本为血清或血浆。
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