CN112595764A - 一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于：对4条适配体的序列进行设计再构造，使其可以根据碱基互补配对组装成金字塔形的三维纳米结构，降低与有机磷农药结合的空间位阻；同时可以控制适配体之间的距离，避免互相缠绕，提高与有机磷农药结合效能；引入纳米金粒子（AuNPs）与适配体之间形成金硫键（Au‑S）结合，作为三维纳米结构的基点，同时由于AuNPs的高导电性和良好的催化性能，进一步增强检测的灵敏度和稳定性。提出的适配体传感器对辛硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、对硫磷和甲基对硫磷具有高度的敏感性，重复性和特异性；此外，通过取代适当的适配体，可用于检测其他农药，为快速，灵敏地检测多种农药提供了平台。

Description

一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，属于电化学生物传感器领域。
背景技术
有机磷农药具有靶标范围广、药效强、生物降解快、价格低廉等特点，是我国目前使用范围最广、用量最大的农药，且由于生产者常使用复配有机磷农药，造成在一种蔬菜样品中往往同时检出多种有机磷农药，因此有机磷农药多残留超标问题已成为我国农产品安全重大隐患之一，研究农药多残留的同步检测方法已成为农药检测分析的必然趋势。
适配体（Apt）是人工合成的核酸序列，其识别特性与抗体相似，又称“化学抗体”，与目前应用更为广泛的抗体、酶等生物传感元件相比，适配体制备难度更低、生物稳定性更优、生物依赖性更小，在快速分析检测领域的应用前景非常广阔，使其成为开发检测农药残留的生物传感器的理想选择。
发明内容
本发明的目的在于开发一种简单灵敏的适配体传感器，并用于辛硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、对硫磷和甲基对硫磷的检测。
本发明的技术方案为：由于适配体的筛选环境与适配体传感器的测试环境（pH值、温度等）有较大差异，会对适配体的结构造成影响，难以区别适配体与靶标物结合产生变形还是适配体本身由于测试环境的变化导致构象变化，单纯利用适配体结合靶标物前后空间结构变化引起信号改变的检测方法，不能满足检测的灵敏度要求，因此，为了提高适配体传感器的灵敏度和稳定性等性能，还利用了纳米材料修饰和纳米结构等技术，进一步增强检测有机磷农药的灵敏度和稳定性。
通过在玻碳电极固定纳米金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN）复合材料，再滴加BSA，实现传感器的构建，然后用于有机磷农药的检测；包括如下步骤：1）玻碳电极的预处理；2）15 nm纳米金粒子（AuNPs）的制备；3）纳米金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN）的组装；4）适配体传感器的组装；5）有机磷农药的测定。
优选地，1）中所述电极为玻碳电极，先将玻碳（GCE）电极用超纯水冲洗，用0.3 mm和0.05 mm的氧化铝粉末进行仔细打磨抛光，将铝粉冲掉；然后在50%的乙醇溶液（乙醇/水=1:1）和超纯水中分别超声60 s，并在氮气下吹干；然后放入铁氰化钾（[Fe(CN)6]3-/4-）溶液（含有5 mM K3[Fe(CN)6]，5 mM K4[Fe(CN)6]和0.1 M KCl）中采用循环伏安法进行扫描，扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.2～0.6 V，所测得的两峰值电位差小于100 mV，得到性能稳定电极。
优选地，2）中所述15 nm纳米金粒子（AuNPs）的制备过程：首先，在15 nm纳米金的制备过程中所有玻璃器皿都在新制备的王水中浸泡12 h，然后使用超纯水冲洗干净备用，将0.5 mL 1%的HAuCl4与50 mL的沸腾超纯水混合并进行持续搅拌，然后将1.25 mL1%的柠檬酸三钠溶液添加到上述溶液中，刚开始加入时溶液显示浅灰色，直至溶液颜色出现明显紫红色，然后加热使其保持沸腾状态10 min后停止，持续搅拌至冷却得到纳米金颗粒，将其储存于4℃环境下冷藏。
优选地，3）纳米金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN）的组装过程：（1）经计算所制备的纳米金浓度为25 nM，将20 μg/mL的二水合双（对-磺酰苯基）苯基膦化二钾盐加入制备好的纳米金溶液，室温下反应12 h，10000 r/min离心除去粒径不一致的上清液颗粒，加入0.5×TBE缓冲液恢复到原体积，取4份相同体积的纳米金溶液在体系浓度为50 mM的氯化钠环境中分别加入巯基修饰的S1-S4单链DNA（ssDNA），以1：8的摩尔比通过Au-S在单链DNA（ssDNA）表面修饰金纳米颗粒。
优选地，（2）将具有部分互补碱基序列的纳米金粒子与DNA的复合物两两混合，并且在90℃下水浴加热5 min，之后停止加热在水蒸气中缓慢冷却至室温，经过退火使2条单链DNA碱基互补的部分聚合成双链结构，连接稳定，得到金二聚体，其次，各取200 uL金二聚体混合后加入5 uL 5M NaCl溶液，在室温下搅拌反应24 h，得到金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN），将制备的AuNPs-DTN于4℃冰箱中保存。
优选地，4）适配体传感器的组装过程：首先，滴加6 μL的AuNPs-DTN溶液到预处理过的GCE电极的表面，室温下静置自然干燥；然后，将AuNPs-DTN/GCE在0.5%牛血清白蛋白（BSA）中孵育30 min以阻断非特异性结合位点，然后用超纯水冲洗，并用氮气吹干；最后得到BSA/AuNPs-DTN/GCE，储存在4℃的冰箱中备用。
优选地，所述非特异性结合位点封闭条件为：在电极表面滴6 μLBSA，室温下孵育30 min，轻轻冲洗电极表面，氮气吹干，至此适配体传感器制备完成。
优选地，5）有机磷农药的测定过程：电化学测试条件均为在pH 6.5的铁氰化钾（[Fe(CN)6]3-/4-）溶液（含有5 mM K3[Fe(CN)6]，5 mM K4[Fe(CN)6]和0.1 M KCl）中采用循环伏安法进行扫描，扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.2～0.6 V，记录上述制备好的适配体传感器被目标物溶液孵育前后的还原峰值电流变化，根据所得电流差值的大小反映农药浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：首先，使用AuNPs修饰单链适配体来组装新型DNA四面体纳米结构，纳米金因其良好的生物相容性和高导电性，不仅有助于保持适配体活性，还大大增强了传感器的电化学信号；其次构建新型DNA四面体纳米结构，由于适配体核酸序列可以在每个底部顶点和顶部顶点上延伸，使适配体在电极表面上具有良好的分布和更多的结合空间，增加了与有机磷农药结合效能；同时构成具有刚性的四面体结构，以降低与有机磷农药结合的空间位阻，也有助于适配体结构的稳定存在；该传感器可用于实际样品中有机磷农药的检测，在农药残留监测方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为设计的适配体序列。
图2为适配体传感器的组装过程。
图3为适配体传感器的CV表征和EIS表征。
图4为传感器的适配体浓度优化结果。
图5为传感器的孵育时间优化结果。
图6为传感器的pH优化结果。
图7为传感器的标准曲线： (A)辛硫磷；(B)杀螟硫磷；(C)倍硫磷；(D)对硫磷；(E)甲基对硫磷。
图8为传感器的性能评估：(A)特异性；(B)重复性；(C)稳定性。
图9为加标样品中辛硫磷的测定和回收结果。
具体实施方式
实施例：如图3所示，对适配体传感器制造过程的每个组装步骤进行了CV表征和EIS表征，图3A显示了玻碳电极（GCE）在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行电极修饰过程每一步的CV表征，裸GCE两峰值电位差小于80 mV（图3A-曲线a），满足检测的需要，使用AuNPs-DTN修饰裸GCE后，峰值电流信号强度减小了约5 μA（图3A-曲线b）， 这是由于AuNPs-DTN上带负电荷的适配体增加了电子转移阻力，也表明AuNPs-DTN被成功修饰在电极表面；随后，当加入BSA封闭非特异性结合位点之后，由于BSA的非导电性，峰值电流进一步降低（图3A-曲线c）；最后，加入有机磷农药时，AuNPs-DTN中的Apt能特异性结合农药，形成的适配体-农药复合物可进一步增加电极界面阻抗，峰值电流信号强度显著降低（图3A-曲线d）；此外，为了进一步验证适配体传感器电化学表征，对传感器进行了交流阻抗（EIS）的方法测试，EIS情况如图3B所示，在适配体传感器组装过程中阻碍了电子向电极表面的转移，从而使阻抗值不断增加，电流峰值依次下降，其结果与循环伏安的表征结果一致，表明传感器制备成功且检测方法可行。
实施例：适配体传感器条件优化，为了在各个细节方面改善适配体传感器的性能，首先对AuNPs-DTN的浓度进行了优化，图4显示了该传感器修饰不同浓度AuNPs-DTN时对辛硫磷峰值电流变化（ΔI）的大小，在0.001～0.01 μM范围内，随着AuNPs-DTN浓度的升高，峰值电流变化的差值不断增大，然而，当AuNPs-DTN浓度超过0.01 μM时，差值明显降低，这可能是因为高浓度的适配体阻碍了电子传递，因此，选择0.01μM作为最合适的AuNPs-DTN浓度。
实施例：研究了孵育时间对适配体传感器检测效果的影响，通过图5中AuNPs-DTN与辛硫磷在10~50 min范围内的作用结果可知：当与辛硫磷的反应时间在30 min内时，检测效果逐渐加强，且在30 min后保持相对稳定状态，这表明AuNPs-DTN与辛硫磷的结合程度基本饱和，因此，选择30 min作为最佳的孵育时间。
实施例：测试环境溶液的酸碱度是影响适配体传感器检测性能至关重要的因素，因此研究了不同pH的工作溶液（含有0.1 M KCl和5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的铁氰化钾溶液）对检测结果的影响，如图6所示，在pH值在5.5～8.5的范围内，峰值电流变化的差值在pH 6.5下出现最大值，结果表明反应溶液的最佳pH值为6.5。
实施例：建立适配体传感器的标准曲线（图7），如图7A-E所示，分别给出了5种有机磷农药浓度的对数值与ΔI之间的线性关系，根据信噪比为3（S/N=3）计算，辛硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、对硫磷和甲基对硫磷的最低检出限分别为0.07 pg/mL、0.8 pg/mL、0.7 pg/mL、0.7 pg/mL和0.08 pg/mL。
实施例：为了考察该适配体传感器的特异性，我们将克百威、呋虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、毒死蜱、喹硫磷以及水胺硫磷分别用作干扰物质与辛硫磷混合，检测混合溶液的电流信号，如图8A所示，在有干扰物质存在的情况下，电流的变化率最大为4.4%，小于5%，相对标准偏差为2.8%，所以说明该传感器的特异性符合要求。
实施例：为了研究制造的适配体传感器的重现性（图8B），制备了一批新的6个适配体传感器，并用于检测辛硫磷，其相对标准偏差（RSD）为1.86％（n=6），表明设计的适配体传感器具有较好的重现性。
实施例：稳定性是评价传感器性能的另一重要指标，通过检测适配体传感器储存在4℃冰箱下4天、8天和16天的ΔI，如图8C，检测效果维持在初始ΔI的98.5%、94.8%和92.2%，结果表明所研制的适配体传感器具有良好的稳定性。
实施例：从当地超市购买的菠菜、油菜籽和卷心菜样品用于实际样品实验中，它们用液相色谱技术检测后发现没有任何农药残留，采用标准加入法在样品中加入不同浓度（5ng/mL、10 ng/mL）的辛硫磷标准溶液，孵育24 h后取10 g样品加入榨汁机中匀浆，6000 rpm离心15 min后，通过0 .22 mm滤膜对上清液过滤，得到的提取液用本发明制备的适配体传感器检测，实验结果如图9所示，回收率在91.6%-106.6%之间，表明该方法制备的适配体传感器可用于实际样品的检测分析。

Claims (5)

1.一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）玻碳电极的预处理；
（2）15 nm纳米金粒子（AuNPs）的制备；
（3）纳米金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN）的组装；
（4）适配体传感器的组装；
（5）有机磷农药的测定。
2.根据权利要求1所述的一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述15 nm纳米金粒子（AuNPs）的制备方法为
首先，在15 nm纳米金的制备过程中所有玻璃器皿都在新制备的王水中浸泡12 h，然后使用超纯水冲洗干净备用，将0.5 mL 1%的HAuCl4与50 mL的沸腾超纯水混合并进行持续搅拌，然后将1.25 mL1%的柠檬酸三钠溶液添加到上述溶液中，刚开始加入时溶液显示浅灰色，直至溶液颜色出现明显紫红色，然后加热使其保持沸腾状态10 min后停止，持续搅拌至冷却得到纳米金颗粒，将其储存于4℃环境下冷藏。
3.根据权利要求1所述的一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述纳米金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN）的组装方法为
（1）经计算所制备的纳米金浓度为25 nM，将20 μg/mL的二水合双（对-磺酰苯基）苯基膦化二钾盐加入制备好的纳米金溶液，室温下反应12 h，10000 r/min离心除去粒径不一致的上清液颗粒，加入0.5×TBE缓冲液恢复到原体积，取4份相同体积的纳米金溶液在体系浓度为50 mM的氯化钠环境中分别加入巯基修饰的S1-S4单链DNA（ssDNA），以1：8的摩尔比通过Au-S在单链DNA（ssDNA）表面修饰金纳米颗粒
（2）将具有部分互补碱基序列的纳米金粒子与DNA的复合物两两混合，并且在90℃下水浴加热5 min，之后停止加热在水蒸气中缓慢冷却至室温，经过退火使2条单链DNA碱基互补的部分聚合成双链结构，连接稳定，得到金二聚体，其次，各取200 uL金二聚体混合后加入5uL 5M NaCl溶液，在室温下搅拌反应24 h，得到金-三维纳米适配体（AuNPs-DTN），将制备的AuNPs-DTN于4℃冰箱中保存。
4.根据权利要求1所述的一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述适配体传感器的组装方法为
首先，滴加6 μL的AuNPs-DTN溶液到预处理过的GCE电极的表面，室温下静置自然干燥，然后，将AuNPs-DTN/GCE在0.5%牛血清白蛋白（BSA）中孵育30 min以阻断非特异性结合位点，然后用超纯水冲洗，并用氮气吹干，最后得到BSA/AuNPs-DTN/GCE，储存在4℃的冰箱中备用。
5.根据权利要求1所述的一种基于金字塔形纳米结构的适配体传感器及其检测方法，其特征在于，步骤（5）中所述有机磷农药的测定方法为
电化学测试条件均为在pH 6.5的铁氰化钾（[Fe(CN)6]3-/4-）溶液（含有5 mM K3[Fe(CN)6]，5 mM K4[Fe(CN)6]和0.1 M KCl）中采用循环伏安法进行扫描，扫描速度为50 mV/s，扫描电位为-0.2～0.6 V，记录上述制备好的适配体传感器被目标物溶液孵育前后的还原峰值电流变化，根据所得电流差值的大小反映农药浓度。
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Wang et al. A silver–palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine, clenbuterol and salbutamol
Tang et al. Electrochemical immuno-bioanalysis for carcinoma antigen 125 based on thionine and gold nanoparticles-modified carbon paste interface
Jia et al. Triple signal amplification using gold nanoparticles, bienzyme and platinum nanoparticles functionalized graphene as enhancers for simultaneous multiple electrochemical immunoassay
Yang et al. Ultrasensitive electrochemical aptasensor for ochratoxin A based on two-level cascaded signal amplification strategy
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Zhang et al. Carbon-based nanocomposites with aptamer-templated silver nanoclusters for the highly sensitive and selective detection of platelet-derived growth factor
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Farshchi et al. Immunosensing of prostate cancer in human plasma samples using immobilization of antibody on the surface of mesoporous silica-modified silver nanoparticles and its immunocomplex with prostate-specific antigen
Zhang et al. Efficient strand displacement amplification via stepwise movement of a bipedal DNA walker on an electrode surface for ultrasensitive detection of antibiotics
Raoof et al. Development of a DNA biosensor based on MCM41 modified screen-printed graphite electrode for the study of the short sequence of the p53 tumor suppressor gene in hybridization and its interaction with the flutamide drug using hemin as the electrochemical label
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