CN111944928B

CN111944928B - 基于三链dna结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测eb病毒的序列组合和方法

Info

Publication number: CN111944928B
Application number: CN202010902959.XA
Authority: CN
Inventors: 傅昕; 张何; 周菡
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2040-09-01
Also published as: CN111944928A

Abstract

本发明提供了基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合和方法，属于基因工程技术领域，包括微球修饰探针、核酶序列1、核酶序列2、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针和荧光探针。采用本发明提供的序列组合和方法实现了待测物中低浓度EB病毒DNA的检测。

Description

基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测 EB病毒的序列组合和方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合和方法。

背景技术

恶性肿瘤是目前全世界的主要致死病因之一，根据世界卫生组织(WHO)的报告，全球癌症病例将急剧增加，估计到2035年将达到二千四百万例。如何对恶性肿瘤进行早期诊断及实时监控肿瘤变化以达到高的生存机会已成为各国生命科学研究的重点。作为新一代的肿瘤标志物，肿瘤外周血循环核酸的研究已成为现阶段肿瘤学的研究热点之一。循环肿瘤DNA(ctDNA)，是循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性核酸，是由于肿瘤细胞增生活跃时的自动释放、肿瘤细胞凋亡、坏死等原因进入血液，并可用于肿瘤的无创诊断。近年来的研究表明，ctDNA与肿瘤负荷、瘤内异质性、治疗反应和耐药性密切相关，为肿瘤的诊断、疗效预测和预后提供了新的分子标志物。因此，由于循环肿瘤核酸具有检测方便且微创的优点可逐步代替受诸多因素限制的肿瘤组织学，发展或者结合新技术、新概念及新仪器用于建立高灵敏、微量循环肿瘤核酸高效检测新技术极具现实意义。

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，是一种疱疹病毒，于1964年由爱泼斯坦和巴尔发现并命名。目前认为，EB病毒与鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)、NK/T细胞淋巴瘤(Natural killeri T-cell lymphoma)等有关。现阶段对鼻咽癌的发生致病机制的研究最为成熟，通过检测血液中的循环EB病毒，可以早期鼻咽癌诊断，然而由于EB病毒的在人体内具有较长潜伏期，鼻咽癌早期病人血液中的EB病毒DNA的含量极低，常规检测方法(病毒测定培养法、免疫学检测技术以及分子生物学检测技术)存在假阳性高、灵敏度不高、检测成本高、分析周期长、实验过程繁琐、需要昂贵的仪器设备等缺陷，只适合在高危地区的人群中开展筛选，对于低危地区的普通人根本难以承担检测所带来的一系列的高额费用。因此发展一种性价比高、操作简单、准确率高、高灵敏、检测快速的微量临床检测新技术显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合和方法，采用本发明提供的序列组合实现了待测物中低浓度EB病毒DNA的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合，包括微球修饰探针、核酶序列1、核酶序列2、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针和荧光探针；

所述微球修饰探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述核酶序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述核酶序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述第三链杂交链式反应引发探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述荧光探针的3’端有石墨烯量子点；

所述第三链杂交探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种非诊断目的地利用上述技术方案所述的序列组合检测EB病毒的方法，包括以下步骤：

1)将所述微球修饰探针固定在微球上、封闭，得到功能化微球，将所述功能化微球固定在芯片上，得到含有修饰探针的芯片；

2)将所述核酶序列1和核酶序列2固定到步骤1)得到的含有修饰探针的芯片上，得到捕获EB病毒的芯片；

3)将所述步骤2)得到的捕获EB病毒的芯片与待检测物、所述杂交链式反应发夹探针1、所述杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第

在本发明中，杂交链式反应发夹探针1简称为H1，杂交链式反应发夹探针2简称H2，第三链杂交链式反应引发探针简称P1，第三链杂交探针简称L1，荧光探针简称L2。

本发明利用序列组合检测样品中RB病毒的技术原理：

一双链DNA纳米线的芯片；

4)将所述步骤3)得到的含有第一双链DNA纳米线的芯片与第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第二双链DNA纳米线的芯片；

5)将所述步骤4)得到的含有第二双链DNA纳米线的芯片与荧光探针进行反应，得到检测芯片，对所述检测芯片的微球表面荧光强度进行测算，将测算结果代入检测曲线F_荧光强度＝4.361+0.112C_EB病毒DNA中，得到待检测物中EB病毒含量。

优选的，所述步骤1)功能化微球的表面修饰3×10⁷个生物素化的分子。

优选的，所述步骤1)封闭的条件包括：所述封闭的温度为37℃，所述封闭的时间为1h。

优选的，所述步骤2)固定的条件包括：所述固定的温度为37℃，所述固定的时间为5min。

优选的，所述步骤3)反应的条件包括：所述反应的温度为37℃。所述反应的时间为60min。

优选的，所述步骤4)反应的条件包括：所述反应的温度为30℃，所述反应的时间为120min。

优选的，所述步骤5)反应的条件包括：所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为15min。

本发明包含2个步骤：第一步：捕获EB病毒DNA后激活10-23核酶并对目标序列进行切割；第二步为切割后暴露出杂交链式反应引发序列，在设计的探针体系共同作用下完成基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式反应，通过石墨烯量子点的荧光获得检测信号。如图1所示：第一步：微球修饰探针通过3端的生物素与微球表面的亲和素结合，并固定在微球表面。微球修饰探针包含10-23核酶切割位点(5’TrA 3’)其中A碱基为腺嘌呤(RNA)，微球修饰探针其他碱基都为脱氧核苷酸。微球修饰探针分别与核酶序列1和核酶序列2杂交，构建成EB病毒DNA捕获功能单位，此时10-23核酶空间结构未形成，不能对目标序列进行切割。当反应体系中存在EB病毒DNA时，捕获功能单位与EB病毒DNA杂交，10-23核酶空间结构得以完善，酶活性被激发，对微球修饰探针中的切割位点(5’TrA 3’)进行切割，并释放杂交链式反应引发序列(SEQ ID No.10：5’rAGAGAGAGAAGAGAGGAAGAGGAA 3’)。第二步：如图2所示，第一步释放的杂交链式反应引发序列与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行单向的自组装杂交链式反应，形成初始双链DNA纳米线；然后流入DNA探针L1和P1，L1部分序列(5’端)与双链DNA纳米线通过Hoogsteen氢键(T-A-T和C-G-C)结合形成三链DNA，L1的游离序列(3’端)与P1部分序列(5’端)杂交，将P1序列捕获到微球表面，捕获的P1序列中包含杂交链式反应引发序列(3’端，游离状态)，可以与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行新的单向自组装杂交链式反应，形成一条新的双链DNA纳米线，L1通过三链DNA与双链DNA纳米线结合并捕获P1探针，形成杂交链式反应引发基本单位，由于每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L1探针三链结合序列，因此可形成n个杂交链式反应引发基本单位，从而引发了多维立体网状杂交链式反应；同时每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L2探针三链结合序列，可以通过三链DNA方式结合L2(修饰有石墨烯量子点)，通过荧光获取检测信号。

附图说明

图1为裂分式10-23核酶激活及切割示意图；

图2为多维立体网状杂交链式反应原理示意图；

图3为EB病毒DNA芯片检测结果。

具体实施方式

本发明提供了基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合，包括微球修饰探针、核酶序列1、核酶序列2、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针和荧光探针。

在本发明中，所述微球修饰探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

5’GACTCACTATrAGAGAGAGAAGAGAGGAAGAGGAATTTTTTTTTT3’--Biotin，所述微球修饰探针用于形成10-23核酶并捕获EB病毒DNA。

在本发明中，所述核酶序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’GTTCTATTTCCAGGTCGAAATAGTGAGTC3’。

所述核酶序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

5’CTTCTCTCTTCCGAGCCCTGCCCCATT3’。

所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

5’TTCCTCTTCCTCTCTTCTCTCTCTTCCTCTAGAGAGAGAAGAGAGGAA3’。

所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：

5’AGAGAGAGAAGAGAGGAAGAGGAATTCCTCTCTTCTCTCTCTAGA GGA3’。

所述第三链杂交链式反应引发探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：

5’AGAGAGAGAAGAGAGGAAGAGGAACTCTTCTCTCTCTTAAATCACT3’。

所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述荧光探针的3’端有石墨烯量子点，具体如下：

5’TCTCTCCTTCTCCTTCCCCCCTTTTTTTTTT3’---石墨烯量子点。

所述第三链杂交探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下：

5’TCTCCTTCTCTCTCTAGTGATTTAAGA GAGAG3’。

一种非诊断目的地利用权利要求1所述的序列组合检测EB病毒的方法，包括以下步骤：

3)将所述步骤2)得到的捕获EB病毒的芯片与待检测物、所述杂交链式反应发夹探针1、所述杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第一双链DNA纳米线的芯片；

5)将所述步骤4)得到的含有第二双链DNA纳米线的芯片与荧光探针进行反应，得到检测芯片，对所述检测芯片的微球表面荧光强度进行测算，将测算结果代入检测曲线F_荧光强度＝4.361+0.112C_EB病毒DNA(C:fmol·L^-1)中，得到待检测物中EB病毒含量。

本申请将所述微球修饰探针固定在微球上、封闭，得到功能化微球，将所述功能化微球固定在芯片上，得到含有修饰探针的芯片。

本申请对修饰探针固定在微球上的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规将探针固定在微球上的方法即可。在本发明中，所述封闭的温度优选为37℃，所述封闭的时间优选为1h，本发明对封闭采用的其他条件没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述功能化微球的表面优选修饰3×10⁷个生物素化的分子。本发明对所述芯片的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法制备即可。

本发明将所述核酶序列1和核酶序列2固定到得到的含有修饰探针的芯片上，得到捕获EB病毒的芯片。在本发明中，所述固定的条件优选包括：所述固定的温度优选为37℃，所述固定的时间优选为5min。本发明对固定时使用到的缓冲液和洗涤液没有特殊限定，采用常规即可。

本发明将得到的捕获EB病毒的芯片与待检测物、所述杂交链式反应发夹探针1、所述杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第一双链DNA纳米线的芯片。在本发明中，所述反应的条件优选包括：所述反应的温度优选为37℃。所述反应的时间优选为60min。在本发明中，当待检测物中含有EB病毒时，捕获EB病毒的芯片与EB病毒DNA杂交，10-23核酶空间结构得以完善，酶活性被激发，对微球修饰探针中的切割位点(5’TrA3’)进行切割，并释放杂交链式反应引发序列，与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行单向的自组装杂交链式反应，形成初始双链DNA纳米线(即第一双链DNA纳米线)。

本发明将得到的含有第一双链DNA纳米线的芯片与第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第二双链DNA纳米线的芯片。在本发明中，反应的条件优选包括：所述反应的温度优选为30℃，所述反应的时间优选为120min。在本发明中，所述L1部分序列(5’端)与双链DNA纳米线通过Hoogsteen氢键(T-A-T和C-G-C)结合形成三链DNA，L1的游离序列(3’端)与P1部分序列(5’端)杂交，将P1序列捕获到微球表面，捕获的P1序列中包含杂交链式反应引发序列(3’端，游离状态)，可以与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行新的单向自组装杂交链式反应，形成一条新的双链DNA纳米线，L1通过三链DNA与双链DNA纳米线结合并捕获P1探针，形成杂交链式反应引发基本单位，由于每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L1探针三链结合序列，因此可形成n个杂交链式反应引发基本单位，从而引发了多维立体网状杂交链式反应，形成多维立体网状DNA结构。

本发明将得到的含有第二双链DNA纳米线的芯片与荧光探针进行反应，得到检测芯片，对所述检测芯片的微球表面荧光强度进行测算，将测算结果代入检测曲线F_荧光强度＝4.361+0.112C_EB病毒DNA中，得到待检测物中EB病毒含量。在本发明中，所述C_EB病毒DNA为EB病毒DNA浓度，单位为fmol·L^-1。在本发明中，所述反应的条件优选包括：所述反应的温度优选为25℃，所述反应的时间优选为15min。每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L2探针三链结合序列，可以通过三链DNA方式结合L2(修饰有石墨烯量子点)。将检测芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对检测小室中的微球进行荧光观察和拍摄，并用荧光图像分析软件对微球表

发展的基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大技术高灵敏检测EB病毒DNA

(1)微球功能化

面荧光强度进行测算。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例用到的序列如表1所示。

表1序列

实施例1

首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW 9.0)绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；准确称取12g聚二甲基硅氧烷前聚体及1.2g固化剂，搅拌5min使其充分混匀后于真空中除去气泡，然后平铺在制备的芯片阳模板上(厚约1mm)，气泡除尽后放入烘箱65℃下聚合3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基从阳模板上剥离下来。功能化微球通过流体力学的方法固定在微球固定阵列片基中的小室内，并与试剂传送片基贴合构建检测芯片，每一个小室采用独立覆盖通道、实行独立流动控制，因此在该芯片中可以同时进行多个样品的分析。

取50μL微球(1％，直径为15.4μm，4.9×10⁶个微球/mL)于1.5mL的EP管中，3500rpm离心5min，去上清液。用150μL Binding/Wash Buffer(20mM Tris pH 7.5,1M NaCl,1mMEDTA,0.0005％TritonX-100)洗涤三次，离心，去上清。将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash Buffer中，加入4.5μL 10μM的微球修饰探针，再加入15.5μL Binding/Wash Buffer将溶液，最终体积为50μL。室温孵育30min，轻轻搅拌使其反应均匀，使用150μL Binding/WashBuffer洗涤三次，去上清，通过离心洗涤方法去除未结合的分子。捕获探针通过修饰的生物素与微球表面的亲和素特异性结合并固定在微球表面，从而形成了具有目标分子检测能力的功能化聚苯乙烯微球。每个微球表面修饰3×10⁷个生物素化的分子。功能化微球使用100μL 10％BSA TB Buffer(20mM Tris,140mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl₂,1mM CaCl₂,10％BSA,pH 7.4)于37℃下封闭微球1h，洗涤后将功能化微球悬浮于100μL Binding/Wash Buffer，4℃下保存。

(2)微流控芯片的装配

(3)石墨烯量子点与信号探针交联

吸取2μL 100μΜ羧基化探针L2于10ml的0.01M PBS(137mmol/L NaCl,2.7mmol/LKCl,10mmol/L Na₂HPO₄,2mmol/L KH₂PO₄,pH 7.4)缓冲液中，用HCL调节pH至4.0。再准确称取22mg EDC和20mg Sulfo-NHS(同时加入)，在室温条件下反应40min，再将pH调至7.4。加入0.5mg氨基化的石墨烯量子点于上述溶液中，在室温搅拌反应2h。最后将得到的溶液用30KD的Milipore超滤离心管在12000rpm下离心20min。用0.01M PBS洗涤两次，除去多余的DNA。纯化后的功能化石墨烯量子点重新溶解在2mL的0.1M的PBS(1.37mol/L NaCl,27mmol/LKCl,100mmol/L Na₂HPO₄,20mmol/L KH₂PO₄,pH 7.4)缓冲液中，于4℃避光保存。

(4)发夹探针的制备

发夹探针H1、发夹探针H2以及P1探针使用2×SSC缓冲液(0.03M柠檬酸钠，0.3MNaCl)配置。为了减少非发夹二聚体的产生以及提高发夹结构的形成比例，采用逐步缓慢退火。将发夹探针H1(10nM)和发夹探针H2(10nM)分别于冰上溶解，随后分别90℃处理10min，65℃处理10min，47℃处理15min，30℃处理10min，15℃60min；将探针P1(10nM)于冰上溶解，随后90℃处理10min，70℃处理10min，50℃处理10min，33℃处理15min，25℃10min，15℃60min，退火后的探针4℃保存3-4天。

(5)EB病毒DNA捕获功能结构的形成及10-23核酶酶促切割

5μL核酶序列1(10nM)、5μL核酶序列2(10nM)用6X SSC buffer(0.09M柠檬酸钠，0.9M NaCl)稀释至100uL，混匀后采用液压驱动方式流入微流控芯片37℃反应5min，分别与微球表面修饰的微球修饰探针杂交结合，形成EB病毒DNA捕获功能单位，反应完成后流入2XSSC buffer洗涤5min；EB病毒DNA 5μL(10nM)、8μL H1(10nM)、8μL H2(10nM)，使用Tris-HCl缓冲液(40mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM MgCl₂，pH＝7.5)稀释至50μL，混匀后采用液压驱动方式流入微流控芯片37℃反应60min，捕获功能结构与EB病毒DNA杂交，10-23核酶空间结构得以完善，酶活性被激发，对微球修饰探针中的切割位点(5’TrA 3’)进行切割，并释放杂交链式反应引发序列，与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行单向的自组装杂交链式反应，形成初始双链DNA纳米线；反应完成后流入Tris-Ac buffer(20mM Tris-Ac,0.15uM AgNO₃,0.1mM KNO₃,0.25mM精胺,pH＝7.4)洗涤5min。

(6)多维立体网状杂交链式反应

5μL L1(10nM)、5μL P1(10nM)、8μL H1(10nM)、8μL H2(10nM)，使用Tris-Acbuffer至终体系100μL，混匀后采用液压驱动方式流入微流控芯片30℃反应120min，L1部分序列(5’端)与双链DNA纳米线通过Hoogsteen氢键(T-A-T和C-G-C)结合形成三链DNA，L1的游离序列(3’端)与P1部分序列(5’端)杂交，将P1序列捕获到微球表面，捕获的P1序列中包含杂交链式反应引发序列(3’端，游离状态)，可以与发夹探针1(H1)、发夹探针2(H2)进行新的单向自组装杂交链式反应，形成一条新的双链DNA纳米线，L1通过三链DNA与双链DNA纳米线结合并捕获P1探针，形成杂交链式反应引发基本单位，由于每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L1探针三链结合序列，因此可形成n个杂交链式反应引发基本单位，从而引发了多维立体网状杂交链式反应，形成多维立体网状DNA结构，反应完成后流入Tris-Ac buffer洗涤5min。

(7)EB病毒DNA芯片检测

流入5μL已稀释100倍的石墨烯量子点功能化L2探针，于25℃反应15min，每一条形成的双链DNA纳米线上存在n个L2探针三链结合序列，可以通过三链DNA方式结合L2(修饰有石墨烯量子点)，反应完成后流入Tris-Ac buffer洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对检测小室中的微球进行荧光观察和拍摄，并用荧光图像分析软件对微球表面荧光强度进行测算，通过对不同浓度的EB病毒DNA的芯片检测可获得如图3中的A所示的检测曲线。EB病毒DNA浓度在0.5fmol/L～50fmol/L之间呈现良好的线性关系(图3中的B)，回归方程为F_荧光强度＝4.361+0.112C_EB病毒DNA(C:fmol·L^-1)，线性相关系数r²为0.990。结果显示：在信噪比(SNR)大于3的情况下，采用构建的微流控芯片最低可以检测到0.5fmol/L的EB病毒DNA。

实施例2

血清中EB病毒DNA芯片检测，采用实施例1的方法。

为考察检测体系对于实际样品中EB病毒DNA检测的性能，选用实际样品为人血清(混合型)，在0.2mL的EP管中，加入浓度为1、10和50fmol/L的EB病毒DNA与血清样品1:1混合，配制实际样品，并流入芯片中进行加标回收实验。如表2所示，人血清中EB病毒DNA的回收率在92.0％～104.5％之间，RSD在1.9％～3.4％之间。表明检测体系的抗干扰能力较强，此方法用于血清中EB病毒DNA检测仍具有良好的稳定性和准确度。

表2血清样品中EB病毒DNA加标回收实验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合和方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactcactat ragagagaga agagaggaag aggaattttt ttttt 45

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttctatttc caggtcgaaa tagtgagtc 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttctctctt ccgagccctg ccccatt 27

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctcttcc tctcttctct ctcttcctct agagagagaa gagaggaa 48

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagagagaa gagaggaaga ggaattcctc tcttctctct ctagagga 48

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagagagaa gagaggaaga ggaactcttc tctctcttaa atcact 46

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctctccttc tccttccccc cttttttttt t 31

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctccttctc tctctagtga tttaagagag ag 32

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatggggcag tggaaataga ac 22

Claims

1.基于三链DNA结构的多维立体网状杂交链式信号放大的检测EB病毒的序列组合，其特征在于，包括微球修饰探针、核酶序列1、核酶序列2、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针和荧光探针；

所述微球修饰探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述核酶序列1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述核酶序列2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述第三链杂交探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

2.一种非诊断目的地利用权利要求1所述的序列组合检测EB病毒的方法，包括以下步骤：

1)将所述微球修饰探针固定在微球上、封闭，得到功能化微球，将所述功能化微球固定在芯片上，得到含有修饰探针的芯片；所述功能化微球的表面修饰3×10⁷个生物素化的分子；所述封闭的温度为37℃，所述封闭的时间为1h；

2)将所述核酶序列1和核酶序列2固定到步骤1)得到的含有修饰探针的芯片上，得到捕获EB病毒的芯片；所述固定的温度为37℃，所述固定的时间为5min；

3)将所述步骤2)得到的捕获EB病毒的芯片与待检测物、所述杂交链式反应发夹探针1、所述杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第一双链DNA纳米线的芯片；所述反应的温度为37℃，所述反应的时间为60min；

4)将所述步骤3)得到的含有第一双链DNA纳米线的芯片与第三链杂交链式反应引发探针、第三链杂交探针、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2进行反应，得到含有第二双链DNA纳米线的芯片；所述反应的温度为30℃，所述反应的时间为120min；

5)将所述步骤4)得到的含有第二双链DNA纳米线的芯片与荧光探针进行反应，得到检测芯片，对所述检测芯片的微球表面荧光强度进行测算，将测算结果代入检测曲线F_荧光强度＝4.361+0.112C_EB病毒DNA中，得到待检测物中EB病毒含量；所述反应的温度为25℃，所述反应的时间为15min。