CN109355429A - 基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法 - Google Patents

基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分子检测技术领域，公开了一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法，基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，包括有：捕获探针功能化微球的微流控检测芯片；四条LAMP引物及LAMP扩增试剂；LAMP基础结构环化试剂及环化辅助探针；滚环扩增试剂；信号探针修饰的石墨烯量子点。本发明的方法操作简单、灵敏度极高，可通过血液中EB病毒的检测实现鼻咽癌的早期诊断。本发明首次将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增(包含环介导等温扩增和滚环放大)及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，可以检测到10amol/L的EB病毒DNA。

Description

基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，尤其涉及一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
循环肿瘤核酸(ctDNA)在血液中浓度低且存在高水平的正常循环DNA的干扰，因此建立快速、高灵敏ctDNA检测方法是一个很有挑战性的工作。在过去的十年中，许多极具发展潜力的分析技术被提出用于ctDNA的检测，特别是从2012年到现在，一些新的概念和测试方法被引入这一领域。例如：基于定量PCR的技术体系(如Amplification RefractoryMutation System(ARMS),SNPase-ARMS qPCR,mutant-enriched PCR等)，基于数字PCR的技术体系(如Droplet digital PCR,Chip digital PCR等)，基于靶向杂交的技术体系(如表面增强拉曼光谱、局域表面等离子体共振等)。虽然这些技术都有着独特的不可替代的优势及特点，而且在相关领域也得到了较好的应用，但部分局限性(如成本较高、灵敏度低，不适合发展高通量技术等)制约了这些技术在肿瘤临床诊断领域获得更加广泛及深入的应用,另外，这些技术难以解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，是一种疱疹病毒，于1964年由爱泼斯坦和巴尔发现并命名,别名人类疱疹病毒4型(HHV-4)。自EB病毒的发现以来，因为感染EB病毒导致的病例的报道日益增多。目前认为，EB病毒与伯基特氏淋巴癌(Burkitt's lymphoma)、NK/T细胞淋巴瘤(Natural killeri T-cell lymphoma)、唇癌(Cheilocarcinoma)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)、何杰金氏淋巴癌(HD)、子宫颈癌(Cervicalcarcinoma)等有关。目前对鼻咽癌的发生致病机制的研究最为成熟，通过检测血液中的循环EB病毒，可以早期鼻咽癌诊断。目前对EB病毒的检测的方法主要有三种：病毒测定培养法、免疫学检测技术以及分子生物学检测技术，但是这些检测方法都相对存在一定的缺陷，如：需要昂贵的仪器设备、假阳性高、检测成本高、分析周期长、实验过程繁琐等，只适合在高危地区(如中国香港、广东等地区)的人群中开展筛选，对于低危地区的普通人根本难以承担检测所带来的一系列的高额费用。另外，由于EB病毒的在人体内具有较长潜伏期，鼻咽癌早期病人血液中的EB病毒DNA的含量极低，现有常规技术由于灵敏度低、需要样品量大等缺点难以发展成为临床检测技术，因此发展一种性价比高、操作简单、准确率高、高灵敏、检测快速的微量临床检测新技术显得尤为重要。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中这些检测方法都相对存在一定的缺陷，如：需要昂贵的仪器设备、假阳性高、检测成本高、分析周期长、实验过程繁琐等，只适合在高危地区(如中国香港、广东等地区)的人群中开展筛选，对于低危地区的普通人根本难以承担检测所带来的一系列的高额费用；
(2)现有常规技术由于灵敏度低、需要样品量大等缺点难以发展成为临床检测技术，尤其是难于检测血液样本中浓度极低的目标DNA
(3)难以解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。
解决上述技术问题的难度和意义：
该技术整合了环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、基于微流控的物质传递增强效应以及石墨烯量子点的高荧光量子产率特性，在微流控芯片中实现了血液中极低浓度EB病毒DNA的检测，灵敏度达到10amol/L，该技术需要融入的技术种类多、结果影响因素多，涉及多个学科技术交叉，如：核酸技术、材料化学、微流控芯片等，因此完成难度极大。
本发明较好解决了微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题，为极低浓度循环肿瘤核酸分析领域提供一个有效的技术途径，为我国在恶性肿瘤早期诊断、术前评估及预后等方面提供可靠保障，同时具有广阔的应用价值和市场前景。同时为发展未来自动化、高性能、微量疾病临床诊断平台技术提供了新的方向。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法，
本发明是这样实现的，一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，包括：
包被有捕获探针功能化微球的微流控检测芯片；捕获探针序列SEQ ID NO：1；
设计的四条LAMP引物及LAMP扩增试剂，以EB病毒DNA为模版通过环介导等温扩增获得LAMP基础结构序列；四条LAMP引物序列分别为：F3SEQ ID NO：4；B3SEQ ID NO：5、FIPSEQ ID NO：6、BIP SEQ ID NO：7；
LAMP基础结构序列为SEQ ID NO：8；
AGGGGCGGGTGGATTATCTGTTTGGGGGTGCAAGTTTTGGCTGGCCTGGGGGCCGTGGGGTCAACAGATAATCCACCCGCCCCTGGCGTGGAAGTTAATGTCCAGAGATCACCTCTGATTCTGGCCCCCAACGCCTCTGGCATGTTTGAGTCCCGCTGGCTGAACATTAGCATCCCGGCGGGGGCCAGAATCAGAGGTGAT；
LAMP基础结构环化试剂及环化辅助探针利用T4多聚核苷酸激酶对LAMP基础结构的5’端磷酸化，在环化辅助探针帮助下利用高温连接酶将LAMP基础结构序列环化；环化辅助探针序列为：SEQ ID NO：2；
滚环扩增试剂，微球表面捕获探针捕获环化的LAMP基础结构，以环形基础结构为模版通过滚环扩增形成长链的扩增序列；
扩增序列为SEQ ID NO：9；
(ATCACCTCTGATTCTGGCCCCCGCCGGGATGCTAATGTTCAGCCAGCGGGACTCAAACATGCCAGAGGCGTTGGGGGCCAGAATCAGAGGTGATCTCTGGACATTAACTTCCACGCCAGGGGCGGGTGGATTATCTGTTGACCCCACGGCCCCCAGGCCAGCCAAAACTTGCACCCCCAAACAGATAATCCACCCGCCCCT)n由以上序列不断重复构成。
信号探针修饰的石墨烯量子点，能与滚环扩增产物特异性杂交，产生荧光信号；信号探针序列为：SEQ ID NO：3。
本发明的另一目的在于提供一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：利用Blast软件比对并找到EB病毒的保守序列，根据保守序列设计4条等温扩增引物，分别命名为是F3、B3、FIP、BIP；
步骤二：以EB病毒DNA为模版进行环介导等温扩增(LAMP)，扩增过程可产生大量哑铃状的LAMP基础结构DNA序列；
步骤三：使用T4多聚核苷酸激酶对基础结构DNA序列的5’进行磷酸化，加入环化辅助探针，在高温连接酶(Ampligase)作用下将基础结构环化；
步骤四：生物素修饰的捕获探针固定于亲和素修饰微球的表面形成功能化微球，将微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠检测芯片；将环形DNA流入芯片，微球上固定的捕获探针能够与环形DNA互补杂交，将环形DNA捕获至微球表面；
步骤五：在聚合酶作用下以捕获探针为引物、以环形DNA为模版进行滚环扩增，形成包含成百上千个重复的环形DNA互补片段的单链DNA；
步骤六：加入信号探针修饰的石墨烯量子点，利用荧光显微镜CCD拍摄检测区微球表面荧光并进行定量。
进一步，所述步骤三中，环化辅助探针，该探针能与基础结构DNA序列的5’端和3’端序列完全互补并将两端相互拉近，再在高温连接酶作用下将基础结构DNA序列环化形成环形DNA，再在核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的作用下进行纯化。
进一步，所述步骤六中，加入信号探针修饰的石墨烯量子点，由于信号探针能与滚环扩增产物单链DNA上重复的环形DNA互补片段特异性结合，在微球表面结合大量的石墨烯量子点发荧光。
本发明的另一目的在于提供一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法包括：将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，用于循环核酸的检测，实现amol水平的核酸分析。
进一步，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法具体包括：
1)利用设计的四条LAMP引物在LAMP扩增试剂作用下对EB病毒DNA进行环介导等温扩增，产生LAMP基础结构；
2)利用T4多聚核苷酸激酶对LAMP基础结构的5’端磷酸化，在环化辅助探针帮助下利用高温连接酶将LAMP基础结构序列环化产生环形DNA；
3)将环化产物流入包被有捕获探针功能化微球的微流控检测芯片中，洗脱，得到捕获有环形DNA的微流控检测芯片；
4)流入滚环扩增试剂，以捕获探针为引物，以环形DNA为模版通过滚环扩增形成长链的扩增序列；
5)流入信号探针修饰的石墨烯量子点，与滚环扩增产物特异性杂交，洗脱；
6)微流控检测芯片进行荧光检测。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的方法操作简单、灵敏度极高，可通过血液中EB病毒的检测实现鼻咽癌的早期诊断。
本发明首次将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增(包含环介导等温扩增和滚环放大)及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，可以检测到10amol/L的EB病毒DNA。
本发明可实现疾病相关循环生物大分子的高灵敏检测、微创样品检测、不依赖复杂设备、成本低等特点，具有极大潜力发展为临床诊断技术。
本发明以循环核酸为分析对象，以微流控动态微阵列技术为依托，以环介导等温扩增技术、滚环扩增技术、基于微流控的物质传递增强效应以及石墨烯量子点的高荧光量子产率特性为信号放大手段，发展以微观条件下功能化微球为传感元件的高灵敏循环核酸分析新技术。该试剂盒的建立能够较好的解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。该技术只需要2μL病毒DNA样本，可实现10amol/L的EB病毒DNA的检测，即单次实验可以检测10个EB病毒DNA。该技术可实现疾病相关循环生物大分子的高灵敏检测、微创样品检测、不依赖复杂设备、成本低等特点，具有极大潜力发展为临床诊断技术。本发明提供的试剂盒，在信噪比(SNR)大于3的情况下，采用构建的微流控微珠阵列芯片最低可以检测到10amol/L的EB病毒DNA，而采用非芯片检测方法最低只能检测到10fmol/L的EB病毒DNA。芯片EB病毒DNA检测较非芯片检测方法灵敏度提高了1000倍，这充分证明了该方法用于高灵敏核酸分析具有较强的应用优势。
循环核酸常规检测方法与本发明的比较结果
本发明基于微流控微珠阵列芯片、高灵敏目标物多重扩增技术、功能化石墨烯量子点荧光的循环核酸检测新技术，首次将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增(包含环介导等温扩增和滚环放大)及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，可以实现循环核酸的超灵敏检测，灵敏度极高，可实现amol水平的核酸分析，其通用性高，应用潜力大，可用于血液中核酸目标的高灵敏检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法流程图。
图2是本发明实施例提供的微流控微珠阵列芯片的结构示意图及微结构显微照片示意图。
图3是本发明实施例提供的基于环介导等温扩增和滚环放大的循环EB病毒DNA检测原理图。
图4是本发明实施例提供的微流控微珠阵列芯片检测EB病毒DNA的灵敏度结果比较曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明首次利用微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重扩增(包含环介导等温扩增和滚环放大)及功能化石墨烯量子点高荧光量子产率的信号放大技术，发展循环肿瘤核酸诊断及监控(针对血液样品)技术，这符合检测平台微型化、集成化和便携化的发展趋势，同时也能为部分重要领域提供突破性的检测手段。
下面结合附图对本发明的应用原理进行进一步详细说明；
本发明实施例提供的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，包括有：捕获探针功能化微球的微流控检测芯片；四条LAMP引物及LAMP扩增试剂；LAMP基础结构环化试剂及环化辅助探针；滚环扩增试剂；信号探针修饰的石墨烯量子点。
本发明实施例提供的进一步，设计的四条LAMP引物及LAMP扩增试剂，以EB病毒DNA为模版通过环介导等温扩增获得LAMP基础结构序列，利用T4多聚核苷酸激酶对LAMP基础结构的5’端磷酸化，在环化辅助探针帮助下利用高温连接酶将LAMP基础结构序列环化。
本发明实施例提供的滚环扩增试剂，微球表面捕获探针能够捕获环化的LAMP基础结构，以环形基础结构为模版通过滚环扩增形成长链的扩增序列。
本发明实施例提供的信号探针修饰的石墨烯量子点，能与滚环扩增产物特异性杂交，产生荧光信号。
如图1所述，本发明实施例提供的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法，具体包括以下步骤：
S101：利用Blast软件比对并找到EB病毒的保守序列，根据保守序列设计4条等温扩增引物，分别命名为是F3、B3、FIP、BIP；
S102：以EB病毒DNA为模版进行环介导等温扩增(LAMP)，扩增过程可产生大量哑铃状的LAMP基础结构DNA序列(第一次信号放大)；
S103：使用T4多聚核苷酸激酶对基础结构DNA序列的5’进行磷酸化，加入环化辅助探针，在高温连接酶(Ampligase)作用下将基础结构环化；
S104：生物素修饰的捕获探针固定于亲和素修饰微球的表面形成功能化微球，将微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠检测芯片；将环形DNA流入芯片，微球上固定的捕获探针能够与环形DNA互补杂交，将环形DNA捕获至微球表面；
S105：在聚合酶(phi29DNA polymerase)作用下以捕获探针为引物、以环形DNA为模版进行滚环扩增，形成包含成百上千个重复的环形DNA互补片段的单链DNA(第二次信号放大)；
S106：加入信号探针修饰的石墨烯量子点，利用荧光显微镜CCD拍摄检测区微球表面荧光并进行定量。
步骤S103中，环化辅助探针，该探针能与基础结构DNA序列的5’端和3’端序列完全互补并将两端相互拉近，再在高温连接酶(Ampligase)作用下将基础结构DNA序列环化形成环形DNA，再在核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的作用下进行纯化。
步骤S106中，本发明实施例提供的加入信号探针修饰的石墨烯量子点，由于信号探针能与滚环扩增产物单链DNA上重复的环形DNA互补片段特异性结合，可在微球表面结合大量的石墨烯量子点发荧光。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理进行进一步详细说明；
实施例1；
按照所述方法制备检测用试剂盒，功能化微球上修饰的探针如表1中捕获探针所示，辅助基础结构DNA环化的DNA探针如表1中环化辅助探针所示，与氨基化石墨烯量子点交联的探针如表1中信号探针所示，环介导等温扩增引物如表1中F3、B3、FIP、BIP所示，制备得到EB病毒DNA检测用试剂盒。
表1DNA序列
BIP ATCACCTCTGATTCTGGCCCCCGCCGGGATGCTAATGTTCA环介导等温扩增引物包含B1C和B2SEQ ID NO：7。
LAMP基础结构序列为SEQ ID NO：8；
AGGGGCGGGTGGATTATCTGTTTGGGGGTGCAAGTTTTGGCTGGCCTGGGGGCCGTGGGGTCAACAGATAATCCACCCGCCCCTGGCGTGGAAGTTAATGTCCAGAGATCACCTCTGATTCTGGCCCCCAACGCCTCTGGCATGTTTGAGTCCCGCTGGCTGAACATTAGCATCCCGGCGGGGGCCAGAATCAGAGGTGAT；
扩增序列为SEQ ID NO：9；
(ATCACCTCTGATTCTGGCCCCCGCCGGGATGCTAATGTTCAGCCAGCGGGACTCAAACATGCCAGAGGCGTTGGGGGCCAGAATCAGAGGTGATCTCTGGACATTAACTTCCACGCCAGGGGCGGGTGGATTATCTGTTGACCCCACGGCCCCCAGGCCAGCCAAAACTTGCACCCCCAAACAGATAATCCACCCGCCCCT)n由以上序列不断重复构成。
实施例2；
(1)微流控芯片的设计、制备及检测芯片的构建
首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW 9.0)绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；准确称取12g聚二甲基硅氧烷前聚体及1.2g固化剂，搅拌5分钟使其充分混匀后于真空中除去气泡，然后平铺在制备的芯片阳模板上(厚约1mm)，气泡除尽后放入烘箱65℃下聚合3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基从阳模板上剥离下来。
如图2所示，本发明实施例提供的微流控微珠阵列芯片的结构示意图及微结构显微照片示意图。
芯片的结构示意图如图2A所示，功能化微球通过微珠装载片基(图2B)(微球装载片基也是PDMS的，带有不连通的微球装载通道，该片基中的通道壁使用BSA封闭，微球不会贴附在通道壁上，直接流入微型小室中)，固定(不连通的微球装载通道与微型小室相对贴合，在微球装载通道两侧形成2个缝隙，微球从宽的缝隙流入小室，但不能从小的缝隙流出，将微球留在小室中)在以微型小室(图2C)为单位构成的阵列中，微球从宽缝流入后不能从另一端的窄缝流出(图2D)，聚集在小室中；功能化微珠固定后，剥离微珠装载片基并将微球固定阵列片基和试剂传送片基贴合构建检测芯片(图2E)。设计的微流控芯片中，微珠固定微结构阵列由多个单独的小室构成，单个小室的尺寸为100μm宽、100μm长、30μm深；另一PDMS片基包含的微结构阵列覆盖通道的尺寸为120μm宽、120μm长、10μm深。每一个小室采用独立覆盖通道、实行独立流动控制，因此在该芯片中可以同时进行多个样品的分析。
取50μL微球(1％，直径为15.4μm，4.9×106个微球/mL)于1.5mL的EP管中，3500rpm离心5min，去上清液。用150μL Binding/Wash Buffer(20mM Tris pH 7.5,1M NaCl,1mMEDTA,0.0005％Triton X-100)洗涤三次，离心，去上清。将微球重新悬浮于30μL Binding/Wash Buffer中，加入4.5μL 10μM的生物素化的捕获探针，再加入15.5μL Binding/WashBuffer将溶液，最终体积为50μL。室温孵育30min，轻轻搅拌使其反应均匀，使用150μLBinding/Wash Buffer洗涤三次，去上清，通过离心洗涤方法去除未结合的分子。捕获探针通过修饰的生物素与微球表面的亲和素特异性结合并固定在微球表面，从而形成了具有目标分子检测能力的功能化聚苯乙烯微球。每个微球表面修饰3×107个生物素化的分子。功能化微球使用100μL 10％BSA TB Buffer(20mM Tris,140mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl2,1mM CaCl2,10％BSA,pH 7.4)于37℃下封闭微球1h，洗涤后将功能化微球悬浮于100μLBinding/Wash Buffer，4℃下保存。
(2)石墨烯量子点与信号探针交联
吸取2μL 100μΜ羧基化信号探针于10ml的0.01M PBS(137mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,2mmol/L KH2PO4,pH 7.4)缓冲液中，用HCL调节pH至4.0。再准确称取22mg EDC和20mg Sulfo-NHS(同时加入)，在室温条件下反应40min，再将pH调至7.4。加入0.5mg氨基化的石墨烯量子点于上述溶液中，在室温搅拌反应2h。最后将得到的溶液用30KD的Milipore超滤离心管在12000rpm下离心20min。用0.01M PBS洗涤两次，除去多余的DNA。纯化后的功能化石墨烯量子点重新溶解在2mL的0.1M的PBS(1.37mol/L NaCl,27mmol/L KCl,100mmol/L Na2HPO4,20mmol/L KH2PO4,pH 7.4)缓冲液中，于4℃避光保存。
(3)环介导等温扩增(LAMP)产生大量基础结构DNA序列
向反应管中加入2μL 10μM FIP、2μL 10μM BIP、0.5μL 10μM F3、0.5μL 10μM B3、2μL 10mM dNTPs、2μL的EB病毒DNA(1amol/L-100pmol/L)、0.5μL 8U/uL Bst DNA聚合酶和2.5μL Bst 10×Reaction Buffer(200mM Tris-HCl(pH8.8),100mM KCl,100mM(NH4)2SO4,20mM MgSO4,1％Triton X-100)、13μL已灭菌的去离子水，总反应体系共25μL。然后将反应管置于65℃恒温条件下反应1h。再将反应管置于80℃恒温条件下处理10min，以灭活BstDNA聚合酶。(-20℃冷冻备用)
(4)基础结构DNA序列磷酸化处理
取上述1μL LAMP反应扩增产物，加入2μL 10U/μL T4多聚核苷酸激酶(polynucleotide kinase)，加入17μL磷酸化通用反应液(50mM Tris-HCl pH 8.0,20mMMgCl2,5mM DTT,1mM ATP)，反应体系共20μL，充分混匀后，在37℃水浴反应2h，再加入1μL0.5M EDTA(pH 8.0)，加热到75℃保温10min，使酶失活。(4℃下保存待用)
(5)LAMP基础结构DNA环化
取已灭菌干净的离心管，加入19μL已灭菌的去离子水，再依次加入3μL的10×reaction buffer(200mM Tris-HCl pH8.3,250mM KCl,100mM MgCl2,5mM NAD+,0.1％Triton X-100)，5μL磷酸化处理的产物，2.5μL 10μM环化辅助探针，0.5μL Ampligase(100U/μL)，总反应体积为30μL。在PCR仪中设置，94℃的温度下30s，再在37℃下反应8min，进行25个循环，使LAMP基础结构DNA序列充分环化。然后95℃下处理5min，将酶灭活，随后迅速冷却至室温。移取5μL上述反应产物，加入0.25μL Exonuclease I(20U/μL)、0.25μLExonuclease III(200U/μL)、1μL 10×reaction buffer(500mM Tris-HCl(pH 8.0),50mMMgCl2、10mM DTT)以及3.5μL灭菌去离子水，于37℃反应1h，再加热至85℃，保温20min，灭活核酸外切酶。
(6)芯片中的滚环扩增
取2μL环化产物，加入1.6μL 25mM dNTPs、0.5μL 100U/μL phi29DNA polymerase、1μL 10×Reaction Buffer(330mM Tris-acetate(pH 7.9),100mM Mg-acetate,660mM K-acetate,1％(V/V)Tween20,10mM DTT)，补充去离子水至10μL,反应液在重力驱动下流入微通道中，30℃反应1h，随后洗涤通道终止反应。
如图3所示，本发明实施例提供的基于环介导等温扩增和滚环放大的循环EB病毒DNA检测原理图。
首先利用Blast软件比对并找到EB病毒的保守序列，根据保守序列设计4条等温扩增引物，分别命名为是F3、B3、FIP、BIP。以EB病毒DNA为模版进行环介导等温扩增(LAMP)，扩增过程可产生大量哑铃状的LAMP基础结构DNA序列(第一次信号放大)。使用T4多聚核苷酸激酶对基础结构DNA序列的5’进行磷酸化，加入环化辅助探针，该探针能与基础结构DNA序列的5’端和3’端序列完全互补并将两端相互拉近，再在高温连接酶(Ampligase)作用下将基础结构DNA序列环化形成环形DNA，再在核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的作用下进行纯化。生物素修饰的捕获探针固定于亲和素修饰微球的表面形成功能化微球，将微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠检测芯片；将环形DNA流入芯片，微球上固定的捕获探针能够与环形DNA互补杂交，将环形DNA捕获至微球表面。在聚合酶(phi29DNApolymerase)作用下以捕获探针为引物、以环形DNA为模版进行滚环扩增，形成包含成百上千个重复的环形DNA互补片段的单链DNA(第二次信号放大)。加入信号探针修饰的石墨烯量子点，由于信号探针能与滚环扩增产物单链DNA上重复的环形DNA互补片段特异性结合，可在微球表面结合大量的石墨烯量子点发荧光。最后利用荧光显微镜CCD拍摄检测区微球表面荧光并进行定量。
如图4所示，本发明实施例提供的微流控微珠阵列芯片检测EB病毒DNA的灵敏度结果比较曲线图。
(7)芯片内EB病毒DNA检测
流入5μL已稀释100倍功能石墨烯量子点，于37℃反应60min。再用高严谨洗脱缓冲溶液(10mM potassium phosphate buffer pH 7.6，150mM NaCl，0.1％Tween 20，60％formamide)洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对检测小室中的微球进行荧光观察和拍摄，并用荧光图像分析软件对微球表面荧光强度进行测算，通过对不同浓度的EB病毒DNA的芯片检测可获得如图4所示的检测曲线1。
(8)芯片外EB病毒DNA检测
在2μL环化产物中加入1.6μL 25mM dNTPs、0.5μL 100U/μL phi29DNApolymerase、1μL 10×Reaction Buffer(330mM Tris-acetate(pH 7.9),100mM Mg-acetate,660mM K-acetate,1％(V/V)Tween20,10mM DTT)、1μL功能化微球，补充去离子水至10μL,30℃反应1h，65℃水浴10min，使酶灭活，离心洗涤去上清。加入5μL已稀释100倍功能石墨烯量子点，于37℃，反应60min。再用高严谨洗脱缓冲溶液(10mM potassiumphosphate buffer pH 7.6，150mM NaCl，0.1％Tween 20，60％formamide)离心洗涤3次。将反应后的微球置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对微球进行荧光观察和拍摄，并用荧光图像分析软件对微球表面荧光强度进行测算，通过对不同浓度的EB病毒DNA的芯片检测可获得如图4所示的检测曲线2。
结果显示：在信噪比(SNR)大于3的情况下，采用构建的微流控微珠阵列芯片最低可以检测到10amol/L的EB病毒DNA，而采用芯片外检测方法最低只能检测到10fmol/L的EB病毒DNA。芯片EB病毒DNA检测较非芯片检测方法灵敏度提高了1000倍，由此可见微流体的物质传递增强性能导致了芯片内核酸分析的灵敏度高于芯片外检测的灵敏度，这充分证明了该方法用于高灵敏核酸分析具有较强的应用优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南工程学院
<120> 基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt aaaaaaaaaa cagccagcgg gactcaaaca t 41
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaaaacttg cacccccaaa cagataatcc acccgcccct atcacctctg attctggccc 60
ccgccgggat gctaatgtt 79
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttttttttt aaaaaaaaaa gccgtggggt caacagataa t 41
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggggcgggt ggattatctg tttgggggtg caagttttgg 40
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggggcgggt ggattatctg tttgggggtg caagttttgg ctggcctggg ggccgtgggg 60
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ggggccagaa tcagaggtga t 201
<210> 9
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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ggcgggtgga ttatctgttg accccacggc ccccaggcca gccaaaactt gcacccccaa 180
acagataatc cacccgcccc t 201

Claims (6)

1.一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，其特征在于，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，包括：
包被有捕获探针功能化微球的微流控检测芯片；捕获探针序列SEQ ID NO：1；
设计的四条LAMP引物及LAMP扩增试剂，以EB病毒DNA为模版通过环介导等温扩增获得LAMP基础结构序列；四条LAMP引物序列分别为：F3 SEQ ID NO：4；B3 SEQ ID NO：5、FIP SEQID NO：6、BIP SEQ ID NO：7；
LAMP基础结构序列为SEQ ID NO：8；
LAMP基础结构环化试剂及环化辅助探针利用T4多聚核苷酸激酶对LAMP基础结构的5’端磷酸化，在环化辅助探针帮助下利用高温连接酶将LAMP基础结构序列环化；环化辅助探针序列为：SEQ ID NO：2；
滚环扩增试剂，微球表面捕获探针捕获环化的LAMP基础结构，以环形基础结构为模版通过滚环扩增形成长链的扩增序列；
扩增序列为SEQ ID NO：9；
信号探针修饰的石墨烯量子点，能与滚环扩增产物特异性杂交，产生荧光信号；信号探针序列为：SEQ ID NO：3。
2.一种如权利要求1所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：利用Blast软件比对并找到EB病毒的保守序列，根据保守序列设计4条等温扩增引物，分别命名为是F3、B3、FIP、BIP；
步骤二：以EB病毒DNA为模版进行环介导等温扩增，扩增过程产生大量哑铃状的LAMP基础结构DNA序列；
步骤三：使用T4多聚核苷酸激酶对基础结构DNA序列的5’进行磷酸化，加入环化辅助探针，在高温连接酶作用下将基础结构环化形成环形DNA；
步骤四：生物素修饰的捕获探针固定于亲和素修饰微球的表面形成功能化微球，将微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠检测芯片；将环形DNA流入芯片，微球上固定的捕获探针能够与环形DNA互补杂交，将环形DNA捕获至微球表面；
步骤五：在聚合酶作用下以捕获探针为引物、以环形DNA为模版进行滚环扩增，形成包含成百上千个重复的环形DNA互补片段的单链DNA；
步骤六：加入信号探针修饰的石墨烯量子点，利用荧光显微镜CCD拍摄检测区微球表面荧光并进行定量。
3.如权利要求2所述的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，环化辅助探针，该探针能与基础结构DNA序列的5’端和3’端序列完全互补并将两端相互拉近，再在高温连接酶作用下将基础结构DNA序列环化形成环形DNA，再在核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的作用下进行纯化。
4.如权利要求2所述的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤六中，加入信号探针修饰的石墨烯量子点，由于信号探针能与滚环扩增产物单链DNA上重复的环形DNA互补片段特异性结合，在微球表面结合大量的石墨烯量子点发荧光。
5.一种如权利要求1所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法，其特征在于，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法包括：将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，用于循环核酸的检测，实现amol水平的核酸分析。
6.如权利要求5所述的基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法，其特征在于，所述基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒的应用方法具体包括：
1)利用设计的四条LAMP引物在LAMP扩增试剂作用下对EB病毒DNA进行环介导等温扩增，产生LAMP基础结构；
2)利用T4多聚核苷酸激酶对LAMP基础结构的5’端磷酸化，在环化辅助探针帮助下利用高温连接酶将LAMP基础结构序列环化产生环形DNA；
3)将环化产物流入包被有捕获探针功能化微球的微流控检测芯片中，洗脱，得到捕获有环形DNA的微流控检测芯片；
4)流入滚环扩增试剂，以捕获探针为引物，以环形DNA为模版通过滚环扩增形成长链的扩增序列；
5)流入信号探针修饰的石墨烯量子点，与滚环扩增产物特异性杂交，洗脱；
6)微流控检测芯片进行荧光检测。
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