CN111812166A - 一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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程文婷
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Abstract

本发明公开了一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法。首先，固定在电极上的发夹DNA HP1可被靶标miRNA‑21打开，然后HP2被HP1新暴露的粘性末端打开，并置换miRNA‑21，同时，被释放的靶标miRNA‑21将与其它HP1杂交，导致更多的靶标循环，由于HP2被生物素修饰，可以和链霉亲和素修饰的银纳米颗粒结合，所以较多的银纳米颗粒会通过链霉亲和素‑生物素相互作用沉积在金电极表面，在不需要酶参与的情况下极大地放大了电化学信号。在本发明中，电化学信号只有在靶miRNA存在的情况下被激活和增强。因此本发明的生物传感器可作为一个新的传感平台对miRNA进行超灵敏和高选择性的检测。

Description

一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器领域，特别是涉及一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
外泌体是一种膜性囊泡，大小在30-100纳米之间，几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体。它可以作为信使参与细胞间通讯，将其携带的信息传递给靶细胞。目前，外泌体已受到人们越来越多的关注，由于它们能够携带多种亲代来源的包括蛋白质、microRNA、mRNA甚至DNA在内的多种“货物”使得外泌体能够维持生理功能并参与多种疾病的发病机制。而外泌体中的microRNA(miRNA)在发育调控、增殖、分化、心脏发育、表观遗传等方面发挥重要作用。此外，有大量证据表明，miRNA的异常表达与癌症、心脏病和神经系统疾病等多种疾病相关。由于外泌体含有外脂膜，其中的miRNA能够被保护不被核糖核酸酶降解，使其在外周血中能够稳定存在。因此，检测外泌体miRNA将为疾病的诊断提供更多有用的细节。
miRNA被认为是临床诊断和预后分子标志物研究领域的一个新的分支，多种检测miRNA的技术被开发。其中，Northern blotting、实时定量PCR和微阵列分析是最常用的检测方法。然而，这些方法都有样品制备过程繁琐和/或需要热循环等弊端。还有许多其他检测不同类型信号的microRNA传感平台被建立,如表面增强拉曼散射(SER),电化学,化学发光和荧光信号等,其中,电化学生物传感器展示了高度敏感和选择性,低成本、快速、操作简单等优势。
在此，本发明公开了一种基于靶循环辅助的信号放大和链霉亲和素-生物素相互作用诱导银纳米颗粒沉积的高灵敏检测microRNA的电化学生物传感器。首先，固定在电极上的发夹DNA HP1可被靶标miRNA-21打开，然后HP2被HP1新暴露的粘性末端打开，并置换miRNA-21，同时被释放的靶标miRNA-21将与其它HP1杂交，导致更多的靶标循环，由于HP2被生物素修饰，可以和链霉亲和素修饰的银纳米颗粒结合。因此较多的银纳米颗粒会通过链霉亲和素-生物素相互作用沉积在金电极表面，在不需要酶参与的情况下极大地放大了电化学信号。在本发明中，电化学信号只有在靶miRNA存在的情况下被激活和增强。因此该生物传感器可作为一个新的传感平台对miRNA进行超灵敏和高选择性的检测。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器，首先，固定在电极上的发夹DNA HP1可被靶标miRNA-21打开，然后HP2被HP1新暴露的粘性末端打开，并置换miRNA-21，同时被释放的靶标miRNA-21将与其它HP1杂交，使得更多的靶标循环，由于HP2被生物素修饰，可以和链霉亲和素修饰的银纳米颗粒结合，因此较多的银纳米颗粒会通过链霉亲和素-生物素相互作用沉积在金电极表面，在不需要酶参与的情况下极大地放大了电化学信号，从而该生物传感器可作为一个新的传感平台对miRNA进行超灵敏和高选择性的检测。
本发明的第二个目的在于提供一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)外泌体分离
按照外泌体分离试剂盒的说明提取血样中的外泌体，再用TRIzol试剂提取外泌体中的总RNA；
(2)实时定量PCR检测miR-21
1)根据操作说明使用TRIzol试剂提取外泌体的总RNA，并在TU-1901紫外-可见光谱仪上定量；
2)使用商品化一步法qRT-PCR试剂盒作为对照
具体地，在冰上制备40-60μL反应溶液，然后将上述反应溶液在45-55℃下加热25-35分钟，最后，按照厂家说明书进行PCR反应；
(3)链霉亲和素修饰的银纳米颗粒及生物素化银纳米颗粒的制备；
(4)电化学法检测miRNA-21
1)将HP1溶于DNA固定缓冲液，滴在金电极上过夜；
2)用DNA固定缓冲液冲洗步骤(4)-1)制备得到的电极，并用Tris-HCl处理后，将电极与MCH反应10-20分钟，避免非特异性吸附；
3)将含不同浓度miRNA-21的PBS溶液浇铸在金电极上反应50-70分钟；
4)再将步骤(4)-3)制得的金电极置于含1-4.0μM HP2的DNA杂交溶液中，35-40℃反应1-3小时；
5)用10mM Tris-HCl缓冲液和去离子水彻底冲洗步骤(4)-4)制得的电极，将得到的清洁电极在35-40℃条件下，浸入链霉亲和素修饰的银纳米溶液中反应20-40分钟；
6)最后在步骤(4)-5)制得的金电极中滴入的生物素化银纳米颗粒溶液于35-40℃反应半小时，该修饰电极准备用于测量；
(5)电化学测量
在CHI 660E电化学工作站进行方波伏安图(SWV)和电化学阻抗谱(EIS)测试，工作电极为直径1-5mm的金电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝；
将KCl溶ris-HNO3缓冲液(pH7.4)中进行方波伏安图测量；
在含0.1-0.8M KCl的2-8mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测试；
其中，SWV和EIS的参数如下：(a)SWV：扫描范围-0.2～0.3V；频率：15赫兹；扫描速度：0.25V/s；阶跃电位：5mV；振幅：25mV；(b)EIS：振幅：5mV；频率范围：0.01Hz-100KHz；偏置电位：0.22V；
优选地，步骤(2)-1)中RNA的量为4×1011颗粒/mL；
优选地，在冰上制备50μL反应溶液，然后将上述反应溶液在50℃下加热30分钟；
优选地，步骤(4)-1)将2.0μM HP1溶于10μLDNA固定缓冲液，滴在金电极上过夜；
优选地，步骤(4)-1)中，HP1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：TTTTTTATATGCGAGTTAGTCAACATCAGTCTGATAAGC TAACTCGCATAT；
优选地，步骤(4)-2)用DNA固定缓冲液将上述电极冲洗3次，并用10μL的Tris-HCl(10mM)处理后，将电极与1mM MCH反应15分钟；
优选地，步骤(4)-3)在37℃条件下，将10μL含不同浓度miRNA-21的PBS溶液(10mM,pH 7.4)浇铸在金电极上反应60分钟；
优选地，步骤(4)-4)再将步骤3)制得的金电极置于含2.0μM HP2的DNA杂交溶液中，37℃反应2小时；
优选地，步骤(4)-4)中，HP2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：TCAACATCAGTCTGATAAATATGCGAGTTAGCTTATCAGA CTGATGTTGA
优选地，步骤(4)-5)用10mM Tris-HCl缓冲液和去离子水彻底冲洗步骤4)制得的电极，将得到的清洁电极在37℃条件下，浸入50μL链霉亲和素修饰的银纳米溶液中反应30分钟；
优选地，步骤(4)-6)中，在步骤5)制得的金电极中滴入10μL的生物素化银纳米颗粒溶液于37℃反应半小时；
优选地，步骤(5)中工作电极为直径3mm的金电极；
优选地，步骤(5)中，100mM KCl溶于5毫升10mM Tris-HNO3缓冲液(pH7.4)中进行方波伏安图测量；
优选地，步骤(5)中，在含0.5M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测试；
优选地，步骤(5)中，SWV和EIS的参数如下：(a)SWV：扫描范围-0.2～0.3V；频率：15赫兹；扫描速度：0.25V/s；阶跃电位：5mV；振幅：25mV；(b)EIS：振幅：5mV；频率范围：0.01Hz-100KHz；偏置电位：0.22V；
本发明的第三个目的在于提供用上述电化学生物传感器检测外泌体microRNA的检测方法。
本发明的最后一个目的在于，将上述电化学传感器和检测方法用于检测外泌体microRNA。
本发明的有益效果
(1)由于双信号放大策略，本发明人类生物样本中的miRNA-21的检测下限可以达到0.4fM(如表2所示)。
(2)本发明中发夹样DNA探针和链霉亲和素-生物素相互作用的联用提高了本发明检测方法的特异性。
(3)基于银纳米颗粒沉积的信号放大策略，不仅使miRNA检测具有高灵敏度，而且是无酶情况下的简单操作。
(4)本发明公开的方法与qRT-PCR结果的高度一致性证实了它是一种可以测定生物样本中的外泌体miRNA有用手段。
附图说明
图1为外泌体检测microRNA原理图。
图2为实施例3中的电极扫描的CV图。
图3A为实验例1中生物素化的银纳米颗粒TEM图。
图3B为实验例1中链霉亲和素修饰的银纳米颗粒的紫外可见光光谱图。
图4为实验例2中电极修饰的EIS图。
图5为实验例3中生物传感器的特征图。
图6为实验例4中HP1和miRNA-21杂交时间的优化图。
图7为实验例4中HP1和HP2时间的优化。
图8为实验例4中streptavidin-AgNPs和biotinylated AgNPs孵育时间的优化图。
图9为实验例5中.miRNA21检测结果图。
图10为实施例6中该方法的特异性研究结果图。
图11为实施例7中(A)为PCa患者血液标本外泌体的TEM图；(B)为外泌体密度的大小分布图。
图12为生物样本中外泌体miRNA-21的检测对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中NaBH4、生物素、AgNO3、链霉亲和素、6-巯基己醇(MCH)、柠檬酸三钠和三(羧基乙基)膦盐酸(TCEP)均购自Sigma-Aldrich贸易有限公司(中国上海)；单链DNA或RNA寡核苷酸购自生工生物技术有限公司(中国上海)，其中HP1(a)碱基序列如SEQ ID NO.1所示，HP2(b)碱基序列如SEQ ID NO.2所示；DNA溶液由10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)配制，miRNA溶液由DEPC处理过的水配制；血液样本来自南京市第二医院，并得到了当地伦理委员会的批准；商品化一步法qRT-PCR试剂盒购自天根生物技术有限公司；外泌体分离试剂盒购自AIVD生物公司。
本发明按照外泌体分离试剂盒(AIVD生物公司，深圳，中国)的说明提取血样中的外泌体，然后用TRIzol试剂提取外泌体中的总RNA。
本发明原理如下：
如图1所示，将发夹探针HP1通过金硫键修饰在金电极表面，在有靶microRNA存在的情况下，HP1通过与靶microRNA结合，茎环结构被打开，然后HP1新暴露的粘性末端将HP2茎环结构打开，当HP2被滴在金电极表面时，靶microRNA被置换，同时被释放的microRNA再次与另一个HP1结合，并发生一系列循环反应，由于HP2被生物素修饰，因此可以与链霉亲和素修饰的银纳米颗粒结合。因此，较多的生物素化银纳米颗粒通过链霉亲和素-生物素相互作用沉积在金电极上，使得与靶miRNA浓度相关的电化学信号增强。
实施例1实时定量PCR检测miR-21
首先，按照外泌体分离试剂盒(AIVD生物公司，深圳，中国)的说明提取血样中的外泌体。然后用TRIzol试剂提取外泌体中的总RNA，再根据操作说明使用TRIzol试剂提取外泌体的总RNA(4×1011颗粒/mL)，并在TU-1901紫外-可见光谱仪上定量，并使用商品化一步法qRT-PCR试剂盒作为对照(天根生物技术有限公司，北京，中国)，在冰上制备50μL反应溶液(200nM TaqMan探针，250nM前向引物，200nM反转录引物，250nM反向引物，5U HotMasterTaq DNA聚合酶,25μL 2×Master Mix，0.7μL RTase逆转录酶,5μL总RNA)。然后，将上述反应溶液在50℃下加热30分钟，最后，按照厂家说明书进行PCR反应。
实施例2链霉亲和素修饰的银纳米颗粒及生物素化银纳米颗粒的制备
根据文献制备生物素化银纳米颗粒和链霉亲和素银纳米颗粒。
所述文献具体为1.H.Li,Z.Sun,W.Zhong,N.Hao,D.Xu,H.-Y.Chen,Ultrasensitive Electrochemical Detection For DNA Arrays Based on SilverNanoparticle Aggregates,Analytical Chemistry 82(13)(2010)5477-5483.；2.J.Li,T.Gao,S.Gu,J.Zhi,J.Yang,G.Li,An electrochemical biosensor for the assay ofalpha-fetoprotein-L3 with practical applications。
实施例3电化学法检测miRNA-21
将2.0μM HP1溶于10μLDNA固定缓冲液，滴在金电极上过夜，HP1在金电极上的表面密度约为3.80×10-12mol·cm-2。然后，用DNA固定缓冲液将上述电极冲洗三次，并用10μL的Tris-HCl(10mM)处理后，将电极与1mM MCH反应15分钟，避免非特异性吸附。接下来，在37℃条件下，将10μL含不同浓度miRNA-21的PBS溶液(10mM,pH 7.4)浇铸在金电极上反应60分钟。再将上述金电极置于含2.0μM HP2的DNA杂交溶液中，37℃反应2小时。随后，用10mMTris-HCl缓冲液和去离子水彻底冲洗电极。将得到的清洁电极在37℃条件下，浸入50μL链霉亲和素修饰的银纳米溶液中反应30分钟。此时，金电极表面约有1.21×10-11mol链霉亲和素。最后，滴入10μL的生物素化银纳米颗粒溶液于37℃反应半小时，此时，在金电极表面大约留有5.57×10-11mol的银纳米颗粒，该修饰电极准备用于测量(如图2所示)。
实施例4电化学测量
在CHI 660E电化学工作站进行方波伏安图(SWV)和电化学阻抗谱(EIS)测试。工作电极为直径3mm的金电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝。100mM KCl溶于5毫升10mM Tris-HNO3缓冲液(pH7.4)中进行方波伏安图测量。在含0.5M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测试。SWV和EIS的参数如下：(a)SWV：扫描范围-0.2～0.3V；频率：15赫兹；扫描速度：0.25V/s；阶跃电位：5mV；振幅：25mV；(b)EIS：振幅：5mV；频率范围：0.01Hz-100KHz；偏置电位：0.22V。这些数据至少通过3次独立重复实验获得。
实验例1生物素化银纳米颗粒和链霉亲和素修饰的银纳米颗粒的表征
首先，选择透射电子显微镜(TEM)来表征生物素化的银纳米颗粒，如图3A所示，生物素化的银纳米颗粒呈球形，直径约为6nm，与之前的文献报道一致。此外，用紫外可见分光光度法验证链霉亲和素对银纳米颗粒的修饰，如图3B所示，与裸的银纳米颗粒相比，链霉亲和素修饰的银纳米颗粒紫外可见光光谱在280nm处有一个强的吸收峰，表明链霉亲和素-银纳米颗粒复合物成功合成。
实验例2金电极修饰的表征
如图4所示，EIS用于验证电极的修饰，裸电极的EIS接近一条直线(曲线a，43Ω)，修饰后的HP1和MCH在金电极表面时，会出现一个明显的半圆(曲线b,1640Ω)，表明由于带负电荷的DNA对[Fe(CN)6]3-/4-的排斥造成了较大的界面电阻。当miRNA-21与HP1杂交后，半圆的直径显著增加(曲线c,2253Ω)。加入生物素化的HP2后，半圆的直径随着HP1替代microRNA和生物素化的HP2杂交而增加(曲线d,3883Ω)。当链霉亲和素修饰的银纳米颗粒通过链霉亲和素和生物素反应而固定在电极上时，由于造成电子转移障碍，半圆的直径进一步增加(曲线e，4988Ω)，最后,当制备好的生物传感器结合了生物素化的银纳米颗粒，由于电极界面的高电阻，出现一个更大的直径半圆(曲线f，6012Ω)，表明该生物传感器成功制备。
实验例3生物传感器的表征
链霉亲和素和生物素反应的信号放大效应通过SWV验证，如图5所示，链霉亲和素和生物素反应辅助信号放大后，电化学信号明显增强，同时，还可以观察到，信号放大后的峰值电流响应比没有信号放大时增加了约三倍。
实验例4检测条件的优化
为了获得最高的miRNA检测敏感性，本实施例对涉及该检测的三个重要方面进行了研究，首先，HP1与miRNA-21杂交时间的优化，从图6可以看出，随着催化发夹组装时间的延长，伏安响应逐渐增加，并达到稳定，60分钟被证明可以实现完全杂交，同时我们还优化了HP1和HP2的杂交时间，如图7所示，2小时为最佳孵育时间，除此之外，对链霉亲和素与生物素的相互作用时间也进行了优化，如图8所示，随着孵育时间增加，伏安响应增加，30分钟后信号趋于稳定，因此选择30分钟的孵育时间进行信号放大。
实验例5miRNA-21的电化学检测
用本发明所述电化学方法分析人工合成的miRNA-21水平，如图9所示，在最优条件下，随着miRNA-21浓度在1fM-200pM范围内增加，银纳米颗粒的峰值电流也逐渐增大，且检测限低至0.4fM(S/N＝3)，线性回归方程为：y＝-10.3-0.65x(n＝3,R2＝0.99)。能获得如此低检测限的原因是由于采用了以下两种信号放大策略。一是释放的靶miRNA可以触发一轮接一轮的催化组装循环，导致较多的生物素化的HP2被固定在金电极表面，为银纳米颗粒提供了更多的结合位点。二是由于链霉亲和素与生物素的相互作用，更多的银纳米粒子可以聚集在电极上。
实验例6生物传感器的选择性
本实施例比较了该电化学生物传感器在不同miRNA(如miRNA-605、miRNA-200c和miRNA-433)存在的情况下的性能，来探讨该生物传感器的选择性。如图10所示，只有包含靶标miRNA-21的样品才能获得高信号，而其余miRNA的电化学信号接近背景水平。这是完全合理的，因为其他miRNA无法打开金电极表面的发夹DNA，启动后续的纳米颗粒沉积，表明该电化学生物传感器具有高度的特异性，可以区分靶miRNA和其他miRNA。
实验例7生物样本中外泌体miRNA-21的检测
为进一步验证本发明设计的电化学生物传感器在实际血液样本中的应用潜力，本实施例还将该方法与qRT-PCR方法进行了比较，用两种方法分析了6名前列腺癌患者和6名健康志愿者血清样本中的外泌体miRNA-21的水平。首先，如图11所示，通过透射电子显微镜和动态光散射对外泌体的形态和尺寸进行表征。透射电镜成像结果显示，外泌体为球状结构，粒径范围约为30-100nm。此外，动态光散射结果显示的外泌体直径范围略大于透射电子显微镜。透射电子显微镜和动态光散射的结果均与文献描述的外泌体特征一致。从图12可以看出，前列腺癌患者样本中外泌体miRNA-21浓度水平明显高于健康志愿者，说明肿瘤样本中外泌体miRNA-21过表达，这与之前文献报道一致。此外，通过对这两种方法的比较，可以清楚地看到它们具有良好的一致性，说明了本发明的电化学方法具有较高的准确性和实际应用能力。
综上所述，本发明公开了一种高灵敏的用于检测生物样本中的外泌体miRNA的电化学方法，该方法采用靶标循环和链霉亲和素-生物素相互作用辅助的银纳米颗粒沉积进行信号放大，探针序列如表1所示，本发明和现有技术的比较如表2所示。
表1探针序列
Figure BDA0002571250170000091
表2.该方法与之前方法的对比
Figure BDA0002571250170000101
Figure BDA0002571250170000111
序列表
<110> 南京市第二医院
南京市高淳人民医院
<120> 一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法
<141> 2020-06-25
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
ttttttatat gcgagttagt caacatcagt ctgataagct aactcgcata t 51
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
tcaacatcag tctgataaat atgcgagtta gcttatcaga ctgatgttga 50

Claims (5)

1.一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器，其特征在于，首先固定在电极上的发夹DNA HP1可被靶标miRNA-21打开，然后HP2被HP1新暴露的粘性末端打开，并置换miRNA-21，同时被释放的靶标miRNA-21将与其它HP1杂交，使得更多的靶标循环，由于HP2被生物素修饰，可以和链霉亲和素修饰的银纳米颗粒结合，因此较多的银纳米颗粒会通过链霉亲和素-生物素相互作用沉积在金电极表面，在不需要酶参与的情况下极大地放大了电化学信号。
2.一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
(1)外泌体分离
按照外泌体分离试剂盒的说明提取血样中的外泌体，再用TRIzol试剂提取外泌体中的总RNA；
(2)实时定量PCR检测miR-21
1)根据操作说明使用TRIzol试剂提取外泌体的总RNA，并在TU-1901紫外-可见光谱仪上定量；
2)使用商品化一步法qRT-PCR试剂盒作为对照；
具体地，在冰上制备40-60μL反应溶液，然后将上述反应溶液在45-55℃下加热25-35分钟，最后，按照厂家说明书进行PCR反应；
(3)链霉亲和素修饰的银纳米颗粒及生物素化银纳米颗粒的制备；
(4)电化学法检测miRNA-21
1)将HP1溶于DNA固定缓冲液，滴在金电极上过夜；
2)用DNA固定缓冲液冲洗步骤(4)-1)制备得到的电极，并用Tris-HCl处理后，将电极与MCH反应10-20分钟，避免非特异性吸附；
3)将含不同浓度miRNA-21的PBS溶液浇铸在金电极上反应50-70分钟；
4)再将步骤(4)-3)制得的金电极置于含1-4.0μM HP2的DNA杂交溶液中，35-40℃反应1-3小时；
5)用10mM Tris-HCl缓冲液和去离子水彻底冲洗步骤(4)-4)制得的电极，将得到的清洁电极在35-40℃条件下，浸入链霉亲和素修饰的银纳米溶液中反应20-40分钟；
6)最后在步骤(4)-5)制得的金电极中滴入的生物素化银纳米颗粒溶液于35-40℃反应半小时，该修饰电极准备用于测量；
(5)电化学测量
在CHI 660E电化学工作站进行方波伏安图(SWV)和电化学阻抗谱(EIS)测试，工作电极为直径1-5mm的金电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝；
将KCl溶ris-HNO3缓冲液(pH7.4)中进行方波伏安图测量；
在含0.1-0.8M KCl的2-8mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测试。
3.如权利要求2所述的电化学生物传感器的制备方法，其中，SWV和EIS的参数如下：(a)SWV：扫描范围-0.2～0.3V；频率：15赫兹；扫描速度：0.25V/s；阶跃电位：5mV；振幅：25mV；(b)EIS：振幅：5mV；频率范围：0.01Hz-100KHz；偏置电位：0.22V。
4.如权利要求2所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，
其中，步骤(2)-1)中RNA的量为4×1011颗粒/mL；
其中，在冰上制备50μL反应溶液，然后将反应溶液在50℃下加热30分钟；
其中，步骤(4)-1)将2.0μM HP1溶于10μLDNA固定缓冲液，滴在金电极上过夜；
其中，步骤(4)-1)中，HP1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：TTTTTTATATGCGAGTTAGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAACTCGCATAT；
其中，步骤(4)-2)用DNA固定缓冲液将上述电极冲洗3次，并用10μL的Tris-HCl(10mM)处理后，将电极与1mM MCH反应15分钟；
其中，步骤(4)-3)在37℃条件下，将10μL含不同浓度miRNA-21的PBS溶液(10mM,pH7.4)浇铸在金电极上反应60分钟；
其中，步骤(4)-4)再将步骤3)制得的金电极置于含2.0μM HP2的DNA杂交溶液中，37℃反应2小时；
其中，步骤(4)-4)中，HP2的碱基序列如SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.2：TCAACATCAGTCTGATAAATATGCGAGTTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
其中，步骤(4)-5)用10mM Tris-HCl缓冲液和去离子水彻底冲洗步骤4)制得的电极，将得到的清洁电极在37℃条件下，浸入50μL链霉亲和素修饰的银纳米溶液中反应30分钟；
其中，步骤(4)-6)中，在步骤(4)-5)制得的金电极中滴入10μL的生物素化银纳米颗粒溶液于37℃反应半小时；
其中，步骤(5)中工作电极为直径3mm的金电极；
其中，步骤(5)中，100mM KCl溶于5毫升10mM Tris-HNO3缓冲液(pH7.4)中进行方波伏安图测量；
其中，步骤(5)中，在含0.5M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测试。
5.一种用如权利要求1所述的电化学生物传感器检测外泌体microRNA的检测方法。
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