CN113322305B - 一种基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器的制备及对前列腺抗原(PSA)和Let‑7a miRNA的检测应用。本发明的技术方案是利用电化学发光共振能量转移(ECL‑RET)技术,制备了电化学发光免疫传感器,通过“off‑on”检测模式,实现了对前列腺抗原和Let‑7a miRNA的灵敏分析。首先采用金纳米团簇(Met‑Au NCs)修饰电极,构建了Met‑AuNCs ECL供体与Au‑MnO2纳米花受体之间的高效ECL‑RET系统,制备了一种信号“off”的ECL免疫传感器检测PSA。然后,Let‑7a miRNA(目标二)触发滚环放大(RCA)反应产生长DNA纳米线,该纳米线可以连接大量生物素‑链霉亲和素结构,标记大量碱性磷酸酶(ALP),ALP催化L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠(AAP)原位产生大量抗坏血酸(AA)。AA将MnO2还原为Mn2+,抑制了MnO2对Met‑AuNCs ECL的猝灭,并获得明显的ECL信号“ON”状态,用于Let‑7a检测。
Description
技术领域:
本发明涉及一种基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器的制备方法及对前列腺抗原和Let-7a miRNA的分析检测应用。
背景技术:
前列腺抗原(PSA)和Let-7a miRNA的出现是癌症早期发病的特征,因此定量检测前列腺抗原和Let-7a miRNA具有重大的意义[Kannan P.,Chen J.,Su F.,etal.Anal.Chem.2019,91, 14792–14802]。免疫传感器的核心在于分析过程中保持免疫分子良好的生物活性[Lee D., Donkers R.L.,Wang G.,et al.Am.Chem.Soc.2004,126,6193–6199]。二氧化锰具有较大的比表面积、出色的电化学和催化性能、环境友好等优点[Suib,S.L.Acc.Chem.Res.2008,41, 479-487]。MnO2表面上高分散的金纳米粒子可有效地增加晶格氧迁移率、促进金属氧化物键的弱化,有利于增强MnO2的催化性能[Yang N.,HuangY.X.,Ding G.S.,Fan A.Anal.Chem. 2019,91,4906-4912]。DNA聚合酶驱动的滚环扩增可用于某些特异性基因和microRNA的高灵敏度检测,对于快速有效的癌症筛查,癌症的早期诊疗、以及转移和并发症具有重要意义 [Li X.J.,Sun X.,Fan D.W.,et al.Biosens.andBioelectron.2019,142,111551]。
电化学发光免疫分析法因其高灵敏度、特异性、不需要放射性物质和低背景信号而引起了临床界的关注[Liu H.,Li L.,Duan L.,et al.Anal.Chem.2013,85,7941-7947]。金纳米团簇作为一种具有吸引力的ECL发光体,因其优异的生物相容性[Deng S.,ChengL.,Lei J.,et al. Nanoscale 2013,5,5435–5441]、多功能类分子结构、直接的电子跃迁特性、独特的光学[Liu J., Duchesne P.N.,Yu M.,Jiang X.,NingX.Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,8894–8898]和电化学性质而引起广泛关注。
本工作中利用电化学发光共振能量转移(ECL-RET)技术,制备了电化学发光免疫传感器,通过“on-off”检测模式,实现同时对前列腺抗原和Let-7a miRNA的高灵敏分析检测。
发明内容:
本发明的目的是基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光共振能量转移系统,进一步利用抗坏血酸诱导MnO2-Au纳米花释放Mn2+,提供一种用于双目标检测的电化学发光免疫传感器的制备方法,及检测前列腺抗原和Let-7a miRNA的分析应用。
具体包括以下步骤:
步骤1.金纳米团簇(AuNCS)的制备:
将40mL蛋氨酸和6mL NaOH混合后添加到4mL HAuCl4溶液(20mg/mL)中,并以400rpm进行充分搅拌。上述反应在37℃下持续6小时,得到蛋氨酸-金纳米团簇(Met-AuNCs) 溶液。
步骤2.MnO2-Au纳米花(NFs)与二抗(Ab2)的结合:
将1.0g KMnO4和0.4g MnSO4与30mL去离子水充分搅拌溶解30分钟,然后在50mL 高压釜中,140℃下反应1小时,缓慢冷却至室温。取出后离心,并用乙醇和水分别连续洗涤三次,最后将洗涤纯化后的产物在60℃的真空烘箱中进行干燥。得到MnO2纳米花固体。取50mg产物与140mg PVP和1mL柠檬酸钠水溶液添加到50mL的去离子水搅拌加热至沸腾,随后,80μL 200mM AuCl4 -(aq)缓慢加入到上述沸腾的溶液中,并煮沸30分钟。离心,得到的MnO2-Au沉淀,使用乙醇、去离子水洗涤三次,然后在60℃下烘干。取0.2mgMnO2-Au 粉末加入到100μLPBS中混匀,随后加入50μLAb2(200μg/mL)溶液并在4℃下搅拌过夜,使用50μL 1%的牛血清蛋白在4℃下反应1小时来封闭非特异性位点,离心分离并洗涤以去除未结合的牛血清蛋白,最后Ab2-MnO2-Au NFs分散在100μLPBS(0.1M,pH 7.4)中。
步骤3.基于滚环放大反应(RCA)和碱性磷酸酶(ALP)催化L-抗坏血酸-2-磷酸三钠(AAP)原位产生AA:
2μL环模板、6μL不同浓度的靶标(let-7a)、120U T4DNA和3μL 10×T4 DNA buffer充分混合,并在37℃振荡反应1小时,随后加入5μL dNTPs(10mM)、3U phi29 DNA聚合酶和3μL酶反应缓冲液,在37℃恒温振荡器中反应3h以上,最后在75℃中孵育20分钟灭活。
上述滚环放大产物与6μL CdSe-DNA探针和6μL Biotin-DNA探针在37℃下杂交1小时,随后加入10μL 1:100的ALP-Streptavidin溶液在37℃下孵育一小时,然后将上述溶液离心并重新分散至30μL水溶液。为进行酶促反应:将30μL 4mmol AAP溶液与上述溶液混合,并在避光处于37℃反应30分钟得AA。
步骤4.ECL免疫传感器的制备:
将10μL纯化的AuNCs修饰在预处理的玻碳电极上,并在黑暗中干燥。然后,将10μL0.026mol/L的3,4-噻吩二羧酸、10μL Ab1溶液(200μg/mL),依次滴加到电极表面,并在4℃下孵育1.5小时。然后加入10μL不同浓度的前列腺抗原,4℃下孵育2小时,再与10μL Ab2-Au-MnO2NFs(ECL信号淬灭探针)形成免疫复合物,构建了ECL免疫传感器,检测 ECL“off”信号。再将固定抗原浓度(10ng mL-1)测定ECL的电极插入目标二(不同浓度Let-7a miRNA)引发扩增反应产生的AA溶液中,反应4分钟,MnO2被AA还原为Mn2+,由此成功构建ECL“on”的传感平台,用于Let-7a miRNA检测。
步骤5.ECL检测:
利用MPI-E电化学发光仪器,在200mM,pH 7.4(含有20mM TPA)的缓冲溶液中进行ECL检测,电位扫描范围是0.4V~1.0V,光电倍增管(PMT)是900V。
附图说明:
图1基于Met-AuNCs/Au-MnO2NFs ECL能量转移系统及滚环放大反应的传感器检测双靶 PSA和Let-7a示意图。
图2Met-AuNCs的(A)TEM图像,(B)粒径分布,(C)FL发射光谱,(D)UV-vis吸收光谱。(D) 的插图:在电泳成像仪的白光(左)和紫外光(右)的辐射下Met-AuNCs的成像图。
图3(A)MnO2 NFs的SEM图像,(B)AA腐蚀的MnO2NFs的SEM图像,(C)MnO2 NFs的 TEM图像,(D)Au-MnO2 NFs的紫外-可见吸收光谱图,(E)Au-MnO2 NFs的SEM图像,(F) Au-MnO2NFs的SEM-EDX元素映射图,(G)Au-MnO2 NFs的TEM图像,(H)Au-MnO2 NFs 的HRTEM图像。
图4滚环放大反应的琼脂糖凝胶电泳分析。
图5(A)生物传感器对不同浓度前列腺特异性抗原的ECL响应信号。(B)用于PSA测定的线性关系图(10fg mL-1-100ng mL-1,PMT=900V)
图6(A)ECL传感器对不同浓度Let-7a miRNA的ECL响应信号。(B)用于Let-7amiRNA测定的线性关系(10fM-10nM,PMT=900V)。
具体实施方式:
实施例1.ECL免疫传感器的制备及对目标的检测
Met-AuNCS的制备:将40mL Met和6mL NaOH混合后添加到4mL HAuCl4溶液,在 37℃下持续小时,得到Met-AuNCs溶液。
MnO2-Au NFs与Ab2的结合:将1.0g KMnO4和0.4g MnSO4与30mL去离子水充分搅拌溶解30分钟,然后于140℃下反应1小时,将产物洗涤、纯化、干燥,得到MnO2纳米花固体。取50mgMnO2产物、140mg PVP、1mL柠檬酸钠水溶液与50mL去离子水搅拌加热至沸腾,缓慢加入80μL 200mM AuCl4 -溶液,煮沸30分钟。再将MnO2-Au产物离心、洗涤、烘干。取0.2mgMnO2-Au粉末加入到100μLPBS中混匀,再加入50μLAb2(200μg/mL)溶液搅拌过夜,加入50μL 1%的牛血清蛋白反应1小时,离心、洗涤后将Ab2-MnO2-Au NFs分散在100μLPBS(0.1M,pH 7.4)中。
滚环扩增反应与AA溶液的制备:2μL环模板、6μL不同浓度的靶(let-7a)、120UT4DNA和3μL 10×T4DNA buffer充分混合并在37℃恒温振荡器中反应1h,随后加入5μLdNTPs(10mmol)、3U phi29 DNA聚合酶和3μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,37℃恒温振荡器中反应3h以上,最后在75℃中孵育20分钟灭活。上述滚环放大产物与6μL CdSe-DNA 探针和6μL Biotin-DNA探针在37℃下杂交1小时,随后加入10μL 1:100的ALP-Streptavidin 溶液在37℃下孵育1小时,将上述溶液离心并重新分散至30μL。此后进行酶促反应:将30 μL4mmol AAP溶液与上述溶液混合,并在避光处于37℃反应30分钟得AA。
ECL免疫传感器的制备及对目标检测:将10μL纯化的AuNCs修饰在玻碳电极上,检测ECL信号。然后,将10μL 0.026mol/L的3,4-噻吩二羧酸、10μL Ab1溶液(200μg/mL),依次滴加到电极表面,并在4℃孵育1.5小时。加入10μL不同浓度的前列腺抗原,4℃下孵育2小时。与10μL修饰的Ab2-Au-MnO2NFs形成免疫复合物,检测抗原对应ECL信号。再将此电极系统确定抗原浓度和ECL信号,插入不同浓度Let-7a miRNA经RCA扩增催化AAP 原位产生的AA溶液中反应6分钟,检测Let-7a对应ECL信号。
实施例2.ECL免疫传感器的制备及对目标的检测
将“2μL环模板、6μL不同浓度的靶(let-7a)、120U T4DNA和3μL 10×T4DNA buffer充分混合并在37℃恒温振荡器中反应1h,随后加入5μL dNTPs(10mmol)、3Uphi29 DNA 聚合酶和3μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,37℃恒温振荡器中反应3h以上,最后在75℃中孵育20分钟灭活。”改为“2μL环模板、6μL不同浓度的靶(let-7a)、120U T4DNA和3 μL 10×T4DNAbuffer充分混合并在37℃恒温振荡器中反应2h,随后加入5μL dNTPs (10mmol)、3U phi29DNA聚合酶和3μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,37℃恒温振荡器中反应3h以上,最后在75℃中孵育20分钟灭活”。制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的ECL免疫传感器。对前列腺抗原和Let-7a miRNA的检测结果同实施例1。
实施例3.ECL免疫传感器的制备及对目标的检测
将“上述滚环放大产物与6μL CdSe-DNA探针和6μL Biotin-DNA探针在37℃下杂交1 小时,随后加入10μL 1:100的ALP-Streptavidin溶液在37℃下孵育1小时,将上述溶液离心并重新分散至30μL。”改为将“上述滚环放大产物与6μL CdSe-DNA探针和6μL Biotin-DNA探针在37℃下杂交2小时,随后加入10μL 1:100的ALP-Streptavidin溶液在 37℃下孵育1小时,将上述溶液离心并重新分散至30μL。”。制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的ECL免疫传感器。对前列腺抗原和Let-7a miRNA的检测结果同实施例1。
实施例4.ECL免疫传感器的制备及对目标的检测
“再将此电极系统插入由Let-7a miRNA经RCA扩增并标记ALP催化AAP原位产生的AA溶液中反应6分钟,检测ECL信号”。改成“再将此电极系统插入由Let-7a miRNA经RCA 扩增并标记ALP催化AAP原位产生的AA溶液中反应8分钟,检测ECL信号”。制备的其他条件同实施例1,得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对前列腺抗原和Let-7a miRNA的检测的结果同实施例1。
Claims (1)
1.一种用于检测前列腺抗原PSA和Let-7a miRNA的基于金纳米团簇/MnO2纳米花的电化学发光传感器,由下列步骤组成:
步骤1. 蛋氨酸-金纳米团簇Met-Au NCs的制备:
将40 mL蛋氨酸和6 mL NaOH混合后添加到4 mL 20 mg/mL HAuCl4溶液中,并以400 rpm进行充分搅拌;上述反应在37 °C下持续6小时,得到Met-AuNCs溶液;
步骤2. MnO2纳米花的合成:
首先,将1.0 g KMnO4和0.4 g MnSO4与30 mL去离子水充分搅拌溶解30分钟,然后在50mL不锈钢高压釜中,140 ℃下反应1小时,缓慢冷却至室温;取出离心,并用乙醇和水分别连续洗涤三次,最后将洗涤纯化后的产物在60 ℃的真空烘箱中进行干燥,得到MnO2纳米花固体;
步骤3. Au-MnO2纳米花与二抗Ab2的结合:
将50 mg上述制备的MnO2纳米花固体加到含有50 mL去离子水的三口烧瓶中,然后将140mg 聚乙烯吡咯烷酮PVP和1 mL 1 wt%柠檬酸钠水溶液加入,并在剧烈搅拌下加热至沸腾;随后,80 μL 200 mM AuCl4 -缓慢加入到上述沸腾的溶液中并煮沸30分钟;离心,得到的MnO2-Au沉淀,使用乙醇、去离子水洗涤三次,然后在60 ℃下烘干,得到MnO2-Au纳米花粉末;取0.2 mg MnO2-Au 纳米花粉末加入到100 μL的PBS中混匀,随后加入50 μL的200 μg/mLAb2溶液并在4 ℃下搅拌过夜,使用50 μL 1%的牛血清蛋白在4 ℃下反应1小时来封闭非特异性的识别位点,离心分离并洗涤以去除未结合的牛血清蛋白,最后所得的Ab2-MnO2-Au纳米花分散在100 μL的0.1 M, pH 7.4的PBS中;
步骤4. 基于滚环放大反应RCA及碱性磷酸酶ALP催化L-抗坏血酸-2-磷酸三钠AAP原位产生抗坏血酸AA: 2 μL环模板,序列为: P-CTACTACCTCATTTCCCGGTACCCACCCAGTCCACCCCCACATTTTAACTATACAAC、6 μL不同浓度的靶let-7a,序列为: UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU、120U T4 DNA和3 μL 10×T4 DNA buffer充分混合并在37 ℃恒温振荡器中反应1 h,随后加入5 μL dNTPs 10 mmol、3 U phi29 DNA聚合酶和3 μL phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,37 ℃的恒温振荡器中反应3 h以上,最后在75 ℃中孵育20分钟灭活;上述滚环放大的产物与6 μL CdSe-DNA探针,DNA序列为:TACCCACCCAGTCCACCCCCACATGCCCCTTATCCAGCCT-NH2和6 μLBiotin-DNA探针,序列为: AACTATACAACCTACTACCTCAGGAACTCTCTAATCGCTAACCC-biotin 在37 ℃下杂交1小时,随后加入10 μL 1:100的ALP-Streptavidin链霉亲合素溶液在37 ℃下孵育1小时,再将上述溶液离心并重新分散至30 μL;为进行酶促反应:将30 μL 4 mmol AAP溶液与上述溶液混合,并在避光处于37 °C反应 30分钟获得AA;
步骤5. 电化学发光ECL免疫传感器的制备:将10 μL纯化的AuNCs修饰在预处理的玻碳电极上,并在黑暗中干燥;然后,将10 μL 0.026 mol/L的3,4-噻吩二羧酸、10 μL的200 µg/mL一抗Ab1溶液,依次滴加到电极表面,并在4 ℃孵育1.5小时;然后加入10 μL不同浓度的前列腺抗原PSA,4 ℃下孵育2小时,再与10 µL Ab2-Au-MnO2纳米花ECL信号淬灭探针形成免疫复合物,构建了ECL免疫传感器,检测ECL“off”信号;再固定PSA抗原浓度为10 ng mL-1,将检测ECL之后的电极插入不同浓度Let-7a miRNA引发扩增反应产生的AA溶液中,反应4分钟,MnO2被AA还原为Mn2+,成功构建 ECL“on”的传感平台,用于 Let-7a miRNA检测;
步骤 6 电化学发光检测:
利用 MPI-E 电化学发光仪器,在含有50 mM三乙胺 pH 7.4的0.1 M缓冲溶液中进行ECL检测,电位扫描范围是0.4 V~1.0 V,光电倍增管 PMT是900 V。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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