CN110346436B - 检测尿嘧啶-dna糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器。所述传感器中用到的非酶纳米材料(OAPS‑Por)不仅可以大量吸附电活性物质硫堇分子，而且还可以在H2O2不参与的情况下，催化硫堇在电极上的还原，大大增强了信号强度。在该材料的基础上，制备信号探针(OAPS‑Por/Thi@AuNPs‑ssDNA),在UDG的存在下，电极上发卡DNA中的尿嘧啶碱基被去除，发卡结构展开，通过DNA碱基互补配对，将信号探针连接在电极表面，从而产生放大了的硫堇的还原峰。构建的生物传感器表现出较宽的线性范围(0.005‑1U/mL)低的检测限(0.000697U/mL)。此外，该生物传感器还可用于检测UDG活性抑制剂和HeLa细胞裂解液中UDG的活性，在临床诊断和生物医学研究中显示出巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器及其应用，尤其是涉及基于非酶纳米材料信号放大构建的新型无底物电化学生物传感器，用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶，属于电化学检测领域。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
对于所有生物体来说维持细胞基因组完整必不可少。然而，DNA容易受到X射线，活性氧(ROS)和紫外线辐射等的破坏。如果DNA损伤未及时修复，将会诱发各种疾病甚至癌症。碱基切除修复途径(BER)是众多NDA修复机制之一，其中DNA糖基化酶如尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)在维持基因组完整发挥着关键作用。UDG可识别并从DNA中去除受损的尿嘧啶碱基，并在完整的DNA链中产生脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点。调查显示，许多疾病如人类免疫缺陷症和淋巴瘤等均与UDG活性异常直接相关。因此快速而灵敏地检测UDG活性对于临床诊断和生物医学研究具有重要意义。
目前为止，已经开发了一些应用于UDG检测的方法，如凝胶电泳法，电化学发光法，比色法，荧光法和电化学生物传感器等。其中，电化学生物传感器由于其成本低，灵敏度高和简单操作等优点引起了广泛关注。目前这些电化学生物传感器虽然可以用于检测UDG活性，但灵敏度却不令人满意。因此，将信号进一步放大，提高灵敏度是我们新的电化学生物传感器要解决的关键问题。
用于检测UDG活性的电化学生物传感器往往会利用DNA循环扩增和基于生物酶催化等技术实现信号放大。然而循环过程中复杂的多步操作和生物酶的不稳定性限制了它们的实际应用。与天然酶相比，纳米酶由于其稳定性，温和的反应条件被应用于电化学生物传感器。除此之外，传统的过氧化物酶催化放大策略通常需要在H2O2存在的条件下，但是H2O2的不稳定性会增加操作的不确定性进而影响灵敏度。
发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种新型基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器及其制备方法，该方法在没有H2O2的情况下可实现电化学信号的增强，从而实现对UDG的快速、灵敏检测。满足了开发稳定的无底物的基于非酶纳米材料的电化学生物传感器的需求。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，包括：电极、信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA；
其中，所述信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA的制备方法为：
将OAPS-Por加入到硫堇溶液中，反应一段时间，过滤、干燥；
将上述干燥后的材料加入到AuNPs溶液，反应一段时间、离心、洗涤，分散在Tris-HCl溶液中，形成OAPS-Por/Thi@AuNPs溶液；
将单链DNA加入到OAPS-Por/Thi@AuNPs溶液，反应一段时间、离心，洗涤、分散在Tris-HCl溶液中，即得；
所述OAPS-Por的制备方法为Fe(III)四羧基苯卟啉与八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷(OAPS)OAPS在溶剂中反应一段时间、过滤、干燥，即得。
传感器的关键部分是基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的制备，该材料可以通过简单的吸附将电活性物质硫堇分子固载在材料表面，并且还对硫堇分子表现出良好的电催化还原的性质。在此基础上，本发明设计了两个DNA，分别为单链DNA和发卡DNA，这两个DNA均在5’末端修饰了巯基基团，发卡DNA通过Au-S固定在AuNPs/GCE表面，单链DNA固定在OAPS-Por/Thi@AuNPs上，形成信号探针。电极上的发卡DNA中包含四个尿嘧啶碱基，当在尿嘧啶-DNA糖基化酶的作用下，尿嘧啶被去除，发卡DNA结构被破坏，形成单链，随后，信号探针可以通过DNA的碱基互补配对连接到电极上，从而使电极产生一对硫堇的氧化还原峰，根据峰值大小可以灵敏地定量检测UDG的浓度。
本申请中单链DNA固定在OAPS-Por/Thi@AuNPs上，形成信号探针，因此，在一些实施例中，所述单链DNA由5’到3’的序列为：
SH-GCT GTC TGT GA。上述单链DNA可通过DNA的碱基互补配对将OAPS-Por/Thi@AuNPs负载在电极上，产生电化学信号。
为了通过峰值大小可以灵敏地定量检测UDG的浓度，在一些实施例中，电化学生物传感器的制备方法为：
在玻碳电极表面沉积纳米Au，形成AuNPs/GCE；
将退火后的发卡DNA滴在上述AuNPs/GCE上，孵化，冲洗，形成hDNA/AuNPs/GCE；
将6-巯基1-己醇(MCH)滴在上述hDNA/AuNPs/GCE上，孵化，冲洗，形成MCH/hDNA/AuNPs/GCE；将不同浓度的UDG滴加在MCH/hDNA/AuNPs/GCE上，孵育，冲洗，使电极上的发卡DNA打开成单链；
将信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA滴加在用UDG孵育后的MCH/hDNA/AuNPs/GCE上，孵育，冲洗，即得。上述设计可以使电活性物质硫堇分子被修饰在信号探针上，通过DNA杂交连到电极表面，可大大降低背景信号，增强灵敏度。
本申请中发卡DNA通过Au-S固定在AuNPs/GCE表面，在一些实施例中，所述发卡DNA由5’到3’的序列为：
SH-TTT TTG CUG UCU GUG AAG GAG GTA GAT CAC AGA CAG C。其5’末端修饰了巯基基团，链中还修饰了四个尿嘧啶碱基，当在尿嘧啶-DNA糖基化酶的作用下，尿嘧啶被去除，发卡DNA结构被破坏，形成单链，随后，信号探针可以通过DNA的碱基互补配对连接到电极上，从而使电极产生一对硫堇的氧化还原峰，根据峰值大小可以灵敏地定量检测UDG的浓度。
在一些实施例中，所述Fe(III)四羧基苯卟啉与八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷OAPS的质量比为30～60：25～45。
在一些实施例中，所述Fe(III)四羧基苯卟啉分散在EDC/NHS混合溶液中。
其中，NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺、EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
为了获得更强的电化学信号，在一些实施例中，所述OAPS-Por的具体制备步骤为：将Fe(III)四羧基苯卟啉加入到EDC/NHS混合溶液中，在室温下搅拌12小时，然后将八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷(OAPS)加入上述溶液，搅拌24小时，反应结束后，通过过滤得到灰黑色粉末，最后在80℃下真空干燥24小时，即得OAPS-Por。合成的基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)具有较大的比表面积,使更多的硫堇分子与AuNPs负载在上面，产生了更强的电化学信号。
在一些实施例中，所述信号探针(OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA)的具体制备步骤为：将OAPS-Por加到硫堇溶液中搅拌24小时后过滤，80℃下真空干燥24小时；取上述干燥好的材料加入到AuNPs溶液中，室温下搅拌12小时，然后离心，用超纯水洗涤3遍，分散在Tris-HCl中；将单链DNA加到上述分散液中，在4℃下搅拌12小时，离心，用Tris-HCl洗涤五次，然后分散在Tris-HCl中，放在4℃下备用。
本发明还提供了一种用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器测量系统，包括：任一上述的电化学生物传感器。
本发明还提供了一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，将滴加有不同浓度的UDG的任一上述的电化学生物传感器进行电化学响应表征，根据所得到的峰电流值与UDG浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
向任一上述的电化学生物传感器上滴加UDG溶液，孵育、冲洗后，在电化学生物传感器表面滴加信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA溶液，孵育电化学生物传感器，冲洗后，进行电化学表征测试，根据峰电流值和工作曲线确定UDG浓度。
本发明的有益效果在于：
(1)合成的基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)具有较大的比表面积,使更多的硫堇分子与AuNPs负载在上面，以产生更强的电化学信号；
(2)均匀分散在OAPS-Por上的AuNPs提高了电子在电极表面的传输能力，增强了灵敏度；
(3)OAPS-Por在没有H2O2的情况下，具有对硫堇分子良好的电催化还原的能力，进一步增强的信号；
(4)电活性物质硫堇分子被修饰在信号探针上，通过DNA杂交连到电极表面，可大大降低背景信号，增强灵敏度。
(5)本发明设计的电化学生物传感器只是通过简单的纳米材料催化放大，具有良好的稳定性，避免了复杂的繁琐的DNA设计与操作，降低了检测成本。
(6)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明实施例5的电化学生物传感器检测UDG的原理图，A为基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)及信号探针的制备，B为电化学生物传感器的构建过程；
图2为实施例2的基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的表征图。A为红外图，B为XPS图，C为铁的精细XPS图，D为电镜图，E是OAPS-Por/Thi@AuNPs电镜图，F为Zeta电位图；
图3为本发明实施例2的基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)对硫堇催化的电化学响应；其中，GCE(a)，OAPS/GCE(b)，FeTCPP/GCE(c)和OAPS-Por/GCE(d)以及GCE和OAPS-Por/GCE在含有5μMThi0.1M HAc-NaAc缓冲溶液(pH 5)的CV(A)和DPV(B)。
图4为本发明实施例4的电化学生物传感器可行性分析；MCH/hDNA/AuNPs/GCE(a)，MCH/hDNA/AuNPs/GCE在不存在(b)和存在(c)0.25U mL-1UDG的情况下与OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA孵育后在NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5.0)的DPV响应。
图5为本发明实施例5的电化学生物传感器对不同浓度UDG的电化学响应和峰电流与UDG浓度的线性拟合曲线；(A)传感器对不同浓度的UDG(从上到下：0,0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5和1U mL-1)在0.1M HAc-NaAc(pH5.0)中的DPV响应。(B)峰值电流与UDG浓度的对数值之间的拟合直线。误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图6为本发明实施例6的电化学生物传感器对UDG检测的选择性实验图：牛血清蛋白(BSA,1mg mL-1),甲酰嘧啶-DNA-糖基化酶(Fpg，1U mL-1)，人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG,1U mL-1)和UDG(1U mL-1)。误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
图7为本发明实施例7的电化学生物传感器对UDG抑制剂的电化学响应图。在不同UGI浓度(0.0125,0.025,0.05,0.125,0.25和0.5U mL-1)存在下生物传感器的DPV响应。UDG浓度为1U mL-1。
图8为本发明实施例5的电化学生物传感器的峰值电流与细胞数的对数之间的线性关系图。误差棒代表三次独立实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对传统的检测UDG活性的电化学生物传感器存在的操作步骤复杂、稳定性和灵敏度差的问题，本申请提供了一种新型基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的制备和信号探针(OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA)的制备；
(2)建立电化学生物传感器，检测尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)。
本发明所述基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)和信号探针的制备过程，包括以下步骤：
(1)基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的制备：
首先将52.75mg Fe(III)四羧基苯卟啉加入到100mL EDC/NHS(EDC:34Mm；NHS:34mM)混合溶液中，在室温下搅拌12小时，然后将36mg八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷(OAPS)加入上述溶液，搅拌24小时，反应结束后，通过顾虑得到灰黑色粉末，最后在80℃下真空干燥24小时，便得到了OAPS-Por。
(2)信号探针(OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA)的制备：
首先将40mg OAPS-Por加到40mL硫堇溶液(100mg/L)中搅拌24小时后过滤，80℃下真空干燥24小时；取2mg上述干燥好的材料加入到6mL AuNPs溶液中，室温下搅拌12小时，然后离心，用超纯水洗涤3遍，分散在1mL Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)中；将400微升单链DNA(ssDNA,2μM)加到上述分散液中，在4℃下搅拌12小时，离心，用10mMTris-HCl(pH＝7.4)洗涤五次，然后分散在1mL Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)中，放在4℃下备用。
根据上述的制备方法，所述单链DNA由5’到3’的序列为：
SH-GCT GTC TGT GA。
根据上述的制备方法，离心机的转速为6000rpm。
根据上述的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
分别用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3粉末抛光玻碳电极(d＝3mm)，然后依次在水-乙醇-水中超声5分钟，最后用氮气吹干备用；
将洗净的玻碳电极放入0.8％的HAuCl4溶液中，在-0.2V电压下沉积30s；
将10μL退火后的发卡DNA(hDNA，0.5μM)滴在电极上，在4℃下孵化过夜，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次；
在电极表面滴加10μL,1mM 6-巯基1-己醇(MCH),在室温下孵育30min，用10mMTris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次；
将10μL不同浓度(0-1U/mL)的UDG滴加在电极上，在37℃下孵育30-90min，用10mMTris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次；
将10μL权利要求2所述的信号探针溶液滴在电极上，在37℃下孵育30-90min用10mMTris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次，最后进行电化学响应表征。
根据所得到的峰电流值与UDG浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
根据上述的方法，所述发卡DNA由5’到3’的序列为：
SH-TTT TTG CUG UCU GUG AAG GAG GTA GAT CAC AGA CAG C。
根据上述的方法，所用的电化学检测方法为示差脉冲法，电压扫描范围为0.2to-0.5V。
上述的电化学生物传感器应用于检测UDG。
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中所使用冲洗电极的清洗液为10mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)
本发明的电化学生物传感器构建原理图见图1。传感器的关键部分是基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的制备，该材料可以通过简单的吸附将电活性物质硫堇分子固载在材料表面，并且还对硫堇分子表现出良好的电催化还原的性质。在此基础上，本发明设计了两个DNA，分别为单链DNA和发卡DNA，这两个DNA均在5’末端修饰了巯基基团，发卡DNA通过Au-S固定在AuNPs/GCE表面，单链DNA固定在OAPS-Por/Thi@AuNPs上，形成信号探针。电极上的发卡DNA中包含四个尿嘧啶碱基，当在尿嘧啶-DNA糖基化酶的作用下，尿嘧啶被去除，DNA的发卡结构被破坏，形成单链，随后，信号探针可以通过DNA的碱基互补配对连接到电极上，从而使电极产生一对硫堇的氧化还原峰，根据峰值大小可以灵敏地定量检测UDG的浓度。
以下结合实施例对本申请的方案进行说明。
以下实施例中，AuNPs溶液的合成方法为：将100mL 0.01％的HAuCl4溶液在剧烈搅拌情况下加热至沸腾，然后快速加入2.5mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续搅拌，当溶液变成酒红色时，说明AuNPs形成，停止加热，在缓慢搅拌中降至室温，然后放置在4℃中保存备用。
实施例1电极的制备
(1)分别用1.0，0.3和0.05μm的Al2O3粉末抛光玻碳电极(d＝3mm)，然后依次在水-乙醇-水中超声5分钟，最后用氮气吹干备用，记为GCE；
(2)将处理好的电极浸到8mL0.8％的HAuCl4溶液中，在恒电位(-0.2V)下，沉积30s，将电极用超纯水冲洗3次，记为AuNPs/GCE；
(3)将10μL退火后的发卡DNA(hDNA，0.5μM)滴在电极上，在4℃，保证100％湿度下孵化过夜，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次，记为hDNA/AuNPs/GCE；
(4)在步骤3处理过的电极表面滴加10μL,1mM 6-巯基1-己醇(MCH),在室温下孵育30min，用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次，记为MCH/hDNA/AuNPs/GCE；
实施例2基于卟啉的纳米材料(OAPS-Por)的制备：
首先将52.75mg Fe(III)四羧基苯卟啉加入到100mL EDC/NHS(EDC:34Mm；NHS:34mM)混合溶液中，在室温下搅拌12小时，然后将36mg八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷(OAPS)加入上述溶液，搅拌24小时，反应结束后，通过过滤得到灰黑色粉末，最后在80℃下真空干燥24小时，便得到了OAPS-Por，并对其进行了一系列的表征，如图2。
不同修饰电极在含有35μM硫堇的0.1M HAc-NaAc(pH5.0)溶液中测CV和DPV来评价OAPS-Por对Thi的电催化活性(图3)。将10μLOAPS-Por(1mg mL-1)和10μL与OAPS-Por中等效浓度的OAPS和FeTCPP滴加到GCE上，并在红外光下干燥后测量。如图3A所示，对于裸GCE(曲线a)，在-0.158V和-0.187V处观察到一对很明显的氧化还原峰，对应于Thi的可逆还原和氧化，并且OAPS/GCE没有显着变化，(曲线b)，表明OAPS不妨碍电子的传输，具有良好的导电性。然而，当FeTCPP固定在GCE上时(曲线c)，氧化峰电流减小，还原峰电流显着增加，并且还原峰电位转变为更负值。与FeTCPP/GCE相比，OAPS-Por/GCE显示出更强的还原电流，峰值电位没有任何进一步的变化(曲线d)，表明OAPS-Por对硫堇具有明显的电催化过程，类似于常见的辣根过氧化物酶(HRP)-H2O2体系。OAPS-Por具有比FeTCPP更强的催化能力，因为将FeTCPP加载到OAPS-Por网络中避免了卟啉环的氧化降解及其形成的二聚体。OAPS-Por对Thi还原的电催化活性在DPV中表现的更清楚(图3B)。与GCE相比，当OAPS-Por固定在GCE上时，阴极峰向左移动，从-0.188V到-0.24V，阴极电流值增加5.55μA。
实施例3信号探针(OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA)的制备：
(1)将40mg OAPS-Por加到40mL硫堇溶液(100mg/L)中搅拌24小时后过滤，80℃下真空干燥24小时
(2)取2mg步骤一中的材料加入到6mL AuNPs溶液中，室温下搅拌12小时，然后离心，用超纯水洗涤3遍，分散在1mL Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)中
(3)将400微升单链DNA(ssDNA,2μM)加到上述分散液中，在4℃下搅拌12小时，离心，用10Mm Tris-HCl(pH＝7.4)洗涤五次，然后分散在1mL Tris-HCl(10mM,pH＝7.4)中，放在4℃下备用。
实施例4检测UDG可行性实验
按实施例1中的步骤修饰好电极后，取10微升0.25U/mL的UDG溶液滴在电极表面，在37℃下孵育电极60分钟，用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次后，再在电极表面滴加10微升信号探针溶液，在37℃下孵育电极60分钟，用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次后，进行电化学表征测试，见图4，当没有UDG存在时，传感器电化学响应很小，但当有UDG时，传感器电化学响应明显，证明该传感器可以用于检测UDG。
实施例5尿嘧啶-DNA糖基化酶的检测
按实施例1中的步骤制备电极，然后按实施例4中的步骤进行UDG检测。改变UDG的浓度依次为0,0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.25,0.5and 1U/mL。结果如图5所示，随着UDG浓度的增加，传感器的信号响应越来越强，还原峰电流与UDG浓度的对数呈良好的线性关系。检测线性范围为0.05-1U/mL，线性方程为I＝-1.5279lg c-4.648(R2＝0.9964)，检测限为0.00069U/mL。
实施例6电化学生物传感器对UDG的特异性检测
为了探究传感器的特异性，在相同条件下，选择Fpg(1U mL-1)，hAAG(1U mL-1)和BSA(1mg mL-1)为对照物质。如图6所示，当传感器分别与BSA，Fpg和hAAG孵育时，峰值电流与空白溶液中的峰值电流相似，但是当传感器在UDG的孵育下，峰值电流显著增强。结果表明，该电化学生物传感器对UDG表现出良好的特异性。
实施例7电化学生物传感器对UDG抑制剂(UGI)的检测
按实施例1中步骤制备电极，在电极表面滴5微升不同浓度的UGI溶液，在37℃下孵育30min，然后滴加1U/mL的UDG溶液，继续孵育60分钟，用10mM Tris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次后，再在电极表面滴加10微升信号探针溶液，在37℃下孵育电极60分钟，用10mMTris-HCl(pH＝7.4)冲洗电极数次后，进行电化学表征测试。如图7所示，随着UGI浓度的增加，峰值电流明显降低。当UGI浓度升至0.5U mL-1时，UDG活性几乎完全被抑制，结果表明，该生物传感器可用于检测UDG抑制剂。
实施例8电化学生物传感器对细胞中UDG测定
为了证明所提出的方法用于实际样品分析的可行性，我们测量了HeLa细胞裂解液中的UDG活性。如图8所示，随着HeLa细胞数量的增加，UDG含量高也随之增加，DPV峰值电流显著增强。在对数标度上，峰值电流与HeLa细胞数在5到10000个细胞范围内呈线性相关，相关方程为I＝-1.6105lg N+0.3592，相关系数为0.9886，其中I为峰值电流和N是HeLa细胞的数量。在S/N＝3时，检测限为2个细胞。这些结果表明，所提出的方法可以不受细胞成分地干扰，这在临床诊断和生物医学研究中具有很大的实际应用潜力。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (8)
1.一种用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，包括：电极、信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA；
其中，所述信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA的制备方法为：
将OAPS-Por加入到硫堇溶液中，反应一段时间，过滤、干燥；
将上述干燥后的材料加入到AuNPs溶液，反应一段时间、离心、洗涤，分散在Tris-HCl溶液中，形成OAPS-Por/Thi@AuNPs溶液；
将单链DNA加入到OAPS-Por/Thi@AuNPs溶液，反应一段时间、离心，洗涤、分散在Tris-HCl溶液中，即得；
所述OAPS-Por的制备方法为Fe(III)四羧基苯卟啉与八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷OAPS在溶剂中反应一段时间、过滤、干燥，即得；
电化学生物传感器的制备方法为：
在玻碳电极表面沉积纳米Au，形成AuNPs/GCE；
将退火后的发卡DNA滴在所述AuNPs/GCE上，孵化，冲洗，形成hDNA/AuNPs/GCE；
将6-巯基1-己醇MCH滴在所述hDNA/AuNPs/GCE上，孵化，冲洗，形成MCH/hDNA/AuNPs/GCE；
将不同浓度的UDG滴加在MCH/hDNA/AuNPs/GCE上，孵育，冲洗，使电极上的发卡DNA打开成单链；
将信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA滴加在用UDG孵育后的MCH/hDNA/AuNPs/GCE上，孵育，冲洗，即得；
所述发卡DNA由5’到3’的序列为：
SH-TTT TTG CUG UCU GUG AAG GAG GTA GAT CAC AGA CAG C。
2.如权利要求1所述的用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，所述单链DNA由5’到3’的序列为：
SH-GCT GTC TGT GA。
3.如权利要求1所述的用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，所述Fe(III)四羧基苯卟啉与八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷OAPS的质量比为30～60：25～45。
4.如权利要求1所述的用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，所述Fe(III)四羧基苯卟啉分散在EDC/NHS混合溶液中。
5.如权利要求1所述的用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，所述OAPS-Por的具体制备步骤为：将Fe(III)四羧基苯卟啉加入到EDC/NHS混合溶液中，在室温下搅拌12小时，然后将八氨基苯基齐聚倍半硅氧烷OAPS加入所述溶液，搅拌24小时，反应结束后，通过过滤得到灰黑色粉末，最后在80℃下真空干燥24小时，即得OAPS-Por。
6.如权利要求1所述的用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器，其特征在于，所述信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA的具体制备步骤为：
将OAPS-Por加到硫堇溶液中搅拌24小时后过滤，80℃下真空干燥24小时；取所述干燥好的材料加入到AuNPs溶液中，室温下搅拌12小时，然后离心，用超纯水洗涤3遍，分散在Tris-HCl中；将单链DNA加到所述分散液中，在4℃下搅拌12小时，离心，用Tris-HCl洗涤五次，然后分散在Tris-HCl中，放在4℃下备用。
7.一种用于检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的、基于非酶纳米材料信号放大的无底物电化学生物传感器测量系统，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的电化学生物传感器。
8.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，其特征在于，将滴加有不同浓度的UDG的权利要求1-6任一项所述的电化学生物传感器进行电化学响应表征，根据所得到的峰电流值与UDG浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
向权利要求1-6任一项所述的电化学生物传感器上滴加UDG溶液，孵育、冲洗后，在电化学生物传感器表面滴加信号探针OAPS-Por/Thi@AuNPs-ssDNA溶液，孵育，冲洗后，进行电化学表征测试，根据峰电流值和工作曲线确定UDG浓度。
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| CN110346436A (zh) | 2019-10-18 |
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