CN114859039A - 体外诊断检测试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

体外诊断检测试剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及体外诊断检测试剂及其制备方法和应用，检测试剂包括中空金纳米颗粒和负载于中空金纳米颗粒表面的功能分子，中空金纳米颗粒为中空多孔结构，且中空金纳米颗粒的粒径为50‑120nm，吸收波长为500nm‑700nm，功能分子为抗体、抗原、核酸或标志蛋白。本发明的检测试剂能够提高疾病的体外诊断灵敏度和稳定性。

Description

体外诊断检测试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药学技术领域，特别涉及体外诊断检测试剂及其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析技术是一种将色谱层析技术与免疫技术相结合的免疫分析技术，目前市场上的免疫层析试纸条多使用胶体金或者胶体硒作为检测标志物，具有操作简便，成本低，快速，检测标本种类多等优点，在疾病诊断、兽药残留、食品安全检测等领域具有广泛的用途。胶体金免疫层析试纸条的基本原理是利用抗原抗体结合反应，在层析过程中，胶体金标记物随样品溶液通过毛细作用在构建好的试纸条上移动，当移动到反应垫上时与测试线T上埋好的相应受体结合被固定，聚集后显红棕色，T线的颜色深浅大致反映了样品中待测物的含量，同时设置质控线C，以验证检测结果是否有效。基本检测方法包括双抗体夹心法：用于较大分子抗原检测；间接法：用于抗体检测；竞争法：用于小分子抗原检测。
常见的产品例如早孕试纸条，由样品垫，金标垫，反应垫和吸水垫构成，反应垫上划有检测线T线和质控线C线，使用双抗体夹心法，当样本中待检测的人绒毛膜促性腺激素滴入在样品垫上，在吸水垫的毛细作用下进行移动，然后与金标垫上的金标抗体结合，继续移动到反应垫上与质控线和检测线上的单抗二结合后聚集显色，即代表阳性反应。但是目前胶体金免疫层析技术灵敏度不高，导致只能进行一些疾病的初筛，可信度不高，准确诊断还需要借助其他技术，不利于临床诊断。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高体外诊断灵敏度的检测试剂及其制备方法和应用。
一种检测试剂，所述检测试剂包括中空金纳米颗粒和负载于所述中空金纳米颗粒表面的功能分子，所述中空金纳米颗粒为中空多孔结构，且所述中空金纳米颗粒的粒径为50-120nm，吸收波长为500nm-700nm，所述功能分子为抗体、抗原、核酸或标志蛋白。
上述检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
获取所述中空金纳米颗粒的分散液；
将功能分子负载至所述中空金纳米颗粒的表面，制得所述检测试剂。
一种试纸条，包含有上述检测试剂。
一种试剂盒，包括上述检测试剂，或上述试纸条。
一种检测药物有效性的方法，包括采用上述试剂盒检测待测药物的步骤。
上述检测试剂，或上述试纸条在人兽疾病中间结果鉴定、食品安全检测和兽药残留检测中的应用。
本发明具有以下有益效果：
上述检测试剂通过中空金纳米颗粒负载功能分子，相比于传统的胶体金纳米颗粒，检测下限明显降低。同时本发明的中空金纳米颗粒，相比于常用的胶体金，粒径更大，不易团聚，且为多孔结构，比表面积更大，与功能分子的亲和力更大，故能显著提高功能分子荷载量，进而能够达到提高检测的灵敏性的目的。且中空金纳米颗粒具有优异的对酸碱盐的稳定性，可以提高检测试剂的稳定性，所使用的中空金纳米颗粒外观与胶体金的红棕色不同，呈墨绿色，聚集后可以用肉眼有效的分辨出是否显阳性反应，并且较易分辨出深浅，可以用在传统的免疫层析试纸条中来进行简单的定量。
此外，上述检测试剂还可以用于SPR芯片技术中作放大检测信号的增强试剂，相比于传统的胶体金作为增强试剂，具有更高的检测灵敏度，并且可以缩短检测时间，例如：本发明的检测试剂对样本中新冠中和抗体的检测灵敏度能够提高约16倍，并且OD650-OD590的值与浓度的相关系数更高，表明本发明的检测试剂联合SPR芯片可在一定的检测范围内进行定量检测或半定量检测，克服了传统方法难以实现定量或半定量的缺陷。还可以与PEI反应作为SPR芯片上的孵育试剂用作结合包被蛋白，与长金法生成孵育试剂相比，能显著提高SPR芯片的检测线性范围和检测灵敏度。
附图说明
图1为胶体金(左)和本发明的检测试剂联合SPR芯片(右)检测新冠中和抗体原理图；
图2为本发明一实施方式的试纸条的示意图；
图3为对比例1的胶体金检测血浆中新冠中和抗体扫谱图(500nm-700nm)；
图4为对比例1的胶体金吸光度和时间关系图(0-4.5min)；
图5为对比例1的胶体金检测新冠中和抗体的吸光度和浓度关系图；
图6为实施例1的中空金检测血浆中新冠中和抗体扫谱图(500nm-700nm)；
图7为实施例1的中空金吸光度和时间关系图(0-4.5min)；
图8为实施例1的中空金检测新冠中和抗体的吸光度和浓度关系图；
图9为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体原理图；
图10为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体样本检测图(检测的cut off值取-0.0046，可以很好的保证特异性的情况下具备良好的灵敏度)；
图11为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体阳性血清样本稀释检测图(阳性血清样本稀释倍数分别为100、1000、2000、4000、8000、16000，进行检测相应的OD值变化图)；
图12为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体标准曲线(阳性血清样本稀释对应标准曲线)；
图13为实施例8的中空金检测小鹅瘟病毒抗原的试纸条浓度梯度检测结果图(LOD＝5ng/mL)；
图14为实施例9的中空金检测NT-proBNP的试纸条浓度梯度检测结果图(LOD＝10ng/mL)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施方式提供了一种检测试剂，检测试剂包括中空金纳米颗粒(NHGNPs)和负载于中空金纳米颗粒表面的功能分子，中空金纳米颗粒为中空多孔结构，且中空金纳米颗粒的粒径为50-120nm，吸收波长为500nm-700nm，功能分子为抗体、抗原、核酸或标志蛋白。
本发明技术人员在研究中发现，传统的免疫层析技术常采用胶体金或者胶体硒作为检测标志物，其灵敏度不高，且为实心纳米金，粒径约为30-40nm，摩尔吸光系数较小亮度不足，比表面积小，静电吸附作用负载的抗体/抗原不足，导致检测灵敏度不高。且目前大多数免疫层析技术无法实现定量或半定量检测，例如心衰的诊断，心衰的典型蛋白标志物是可溶性裂解基质素sST2和pro-BNP蛋白，但是这两种蛋白在血浆中的含量与心衰病程具有明显正相关性，单纯靠胶体金试纸条检测出有和无的差别意义并不大。
此外，本发明技术人员在研究中还发现：表面等离子体共振传感(SPR)技术是近年来快速发展的一种体外诊断模式，具有灵敏度高、所需试样少、能够实时检测等优点。目前报道的一种新型纳米等离子光学传感器(Nanoplasmonic Sensor)芯片，纳米等离子光学检测系统结构简单，成本低，操作简便，可以采用普通的酶标仪或光学显微成像系统进行检测，使用胶体金作为信号增强试剂，用于进行新冠病毒抗原或血浆中新冠中和抗体的检测，但灵敏度较低，并且胶体金的胶体稳定性较差，易于死金，稳定性低。同时在芯片板上包被功能分子时采用长金法生成金纳米粒，但负载量小，检测范围窄，易于饱和，当用PEI法孵育中空金纳米粒用于包被功能分子，增大蛋白负载量，显著提高了SPR芯片的检测线性范围和检测灵敏度。
基于此，申请人创新性地采用具有较大粒径(50-120nm)的中空金纳米颗粒来负载功能分子，相比于传统的胶体金，中空金纳米颗粒具有更高的摩尔吸光系数，更高的稳定性和更大的比表面积，与功能分子具有更高的亲和力，能够有效地提高功能分子的负载量(如图1所示)，不易于团聚，稳定性较高，能够提高检测的灵敏度和稳定性。且本发明的检测试剂具有优异的对酸碱盐的稳定性，可以提高检测试剂的稳定性，所使用的中空金纳米颗粒外观与胶体金的红棕色不同，呈墨绿色，聚集后可以用肉眼有效的分辨出是否显阳性反应，并且较易分辨出深浅，可以用来进行简单的定量，降低检测的操作复杂性。
此外，本发明的检测试剂适用较广，不仅能够用于制备免疫层析试纸条，还可以与表面等离子体共振传感技术联用，充分利用SPR技术的各项优势，还可以克服传统SPR技术中灵敏度低，稳定性低的缺陷。故本发明的检测试剂为体外诊断提供了一种全新的研发思路。
在一些实施例中，功能分子为S-RBD蛋白。
通过采用负载S-RBD蛋白的检测试剂，可以用于检测新冠病毒中和抗体。中和抗体是患者在染病的数天或者一周后，机体产生的抗病毒抗体，其中中和抗体作为有抗病毒活性的抗体，仅占抗病毒抗体中的少部分，中和抗体可以识别病毒表面蛋白，阻断病毒与细胞表面的特异性受体结合，进而防止病毒继续侵入人体细胞。新冠病毒中和抗体可以特异性识别并且结合新冠病毒的RBD位点，在血液中和病毒结合，抢先阻断病毒与人ACE-2结合，从而防止病毒进入细胞繁殖产生症状。故进行中和抗体检测可以在疫苗研发上市过程中，评估新冠疫苗有效性，另外还可以从中和抗体中筛选出有效的抗体药物。
在一些实施例中，功能分子为NT-proBNP单克隆抗体和/或sST2单克隆抗体。
通过采用负载NT-proBNP单克隆抗体和sST2单克隆抗体的检测试剂，可以用于检测心力衰竭。心力衰竭(HF)是一种复杂的心血管疾病，其严重的危害的人体健康。目前对于心力衰竭的诊断与危险分层主要依靠于症状、体征、心脏超声等手段，但其灵敏度或特异性有限。血浆生物标记物近年来成为诊断心力衰竭的常用工具。N-端脑利肽(NT-proBNP)是公认的用于心衰诊断的金标准，然而其血浆水平易受到各种因素的影响；可溶性基质裂解素-2(sST-2)是一种心衰辅助诊断标志物，其具有高特异性，水平稳定；将N-端脑利肽(NT-proBNP)和可溶性基质裂解素-2(sST-2)联合应用用于心衰的诊断，可显著提高检测灵敏度，减少假阴性、漏检等问题的发生；同时以本发明的大粒径、低密度中空金纳米颗粒为载体，可增加其胶体稳定性、增大其摩尔吸光系数、提高视觉灵敏度，提高抗原抗体负载量和结合稳定性，有望开发成为一种灵敏度高且操作简便的体外快速诊断试剂盒，为心衰的早期诊断与鉴别、治疗以及预后判断提供了有力的保障。
在一些实施例中，功能分子为CRP蛋白单克隆抗体。
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP的检测被广泛用于监测不同的炎症状态，也可用于监测对炎症的治疗效果。随着高灵敏度的检测方法的不断发展，CRP还是心血管疾病强的预测因素，并且是动脉粥样硬化的重要介质。CRP在IL一6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及其他细胞因子的诱导下能在肝脏快速合成，通常炎症刺激后24～48h血清CRP水平出现峰值，血清CRP水平会从每毫升小于1pg增加到每毫升几百微克，而且随着疾病的消除，CRP能从血循环中快速清除。由于CRP不受年龄、性别、贫血、妊娠等机体状态和治疗药物等因素的影响，因此CRP是感染性炎症反应的敏感指标。通过将中空金纳米颗粒用PEI法孵育在SPR芯片板上用于包被CRP单克隆抗体，显著提高了检测线性范围和灵敏度。
在一些实施例中，功能分子为非洲猪瘟病毒单克隆抗体。
通过负载非洲猪瘟病毒单克隆抗体的检测试剂，可以用于检测非洲猪瘟病毒颗粒。非洲猪瘟病毒(ASFV)是引发非洲猪瘟的病原体，它是一种大型双链DNA病毒，有极强的生存力和抵抗力，在环境和生猪肉产品中高度稳定，不仅可以在猪肉、猪血、体液、相关组织、排泄物中存活，也可以存在于腌肉、泔水中，软蜱是该病毒的主要传播者，而病猪肉及制品、被污染的物品均可成为传染源。由于缺乏针对ASFV的疫苗和有效治疗手段，疾病控制主要依靠对感染猪进行扑杀。猪场一线需要快速检测技术尽早确诊，以便早处理、早隔离，做到精准拔牙式防控，而当下猪场检测必须依靠省畜牧兽医部门指定的委托实验室(市县级检测机构、第三方检测和科研单位)，养猪人员只能依靠症状进行诊断，容易误诊为猪瘟、猪丹毒、蓝耳病等，导致病毒传播，贻误处理时机。因此，一种快速、灵敏、可在现场部署，并且具备高通量检测、低成本的ASFV检测方式对防止非洲猪瘟的广泛传播和减少经济损失至关重要。通过本发明的中空金纳米颗粒用作功能分子的载体，预计能极大的提高非洲猪瘟检测试剂盒的灵敏度和特异性，降低检测下限两到三个数量级，以满足对非洲猪瘟早期感染、潜伏期和环境样本的检测需求。
在一些实施例中，功能分子为小鹅瘟病毒单克隆抗体。
小鹅瘟通常是雏鹅容易发生的一种急性烈性败血性病毒性传染病，是由于感染鹅细小病毒(GPV)而导致。患病雏鹅主要表现出精神沉郁，停止采食，严重下痢，体质消瘦，有时伴有神经症状，具有很高的死亡率，且能够通过呼吸道和消化道传播，还能够通过卵进行垂直传播，对养鹅业造成严重危害，应加以防治。
琼脂扩散试验是检测GPV的传统方法，此方法操作简单、方便、快速且经济，但是灵敏度较低，对抗原抗体的要求比较高。使用中空金免疫层析试纸条，可以在保证操作简便快速，经济的同时提高检测灵敏度，减少漏诊和误诊，有望开发成为一种灵敏度高且操作简便的小鹅瘟病毒现场检测试纸条。
在一些实施例中，中空金纳米颗粒的粒径为70-110nm；进一步地，中空金纳米颗粒的粒径为90-110nm；进一步地中空金纳米颗粒的粒径为55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm。
在一些实施例中，中空金纳米颗粒的吸收波长为550-650nm；进一步地，吸收波长为600-630nm；进一步地，中空金纳米颗粒的吸收波长为560mm、580nm、585nm、590nm、595nm、600nm、605nm、610nm、615nm、620nm、625nm、630nm、635nm、640nm、或645nm。
本发明一实施方式提供了上述检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
S100：获取中空金纳米颗粒的分散液。
在一些实施例中，步骤S100中，采用钴模板法或银模板法制备中空金纳米颗粒的分散液。
在一些实施例中，步骤S100包括以下步骤：
S110:将柠檬酸盐、钴源和溶剂混合，制得混合液，其中，钴源为能够提供二价钴离子的盐。
可理解的，本发明所采用的试剂可以为无水合物也可以为水合物，仅需不与本发明的发明目的相悖即可，应理解为均在本发明的保护范围内。
在一些实施例中，钴源为氯化钴、氟化钴和溴化钴中的一种或多种。
在一些实施例中，柠檬酸盐为柠檬酸钠和柠檬酸钾中的一种或多种。
在一些实施例中，溶剂为水。
在一些实施例中，混合液中包含有PVP K30，以提高稳定性。进一步地，混合液中PVP K30的体积百分含量为0.05％-0.2％；进一步地，体积百分含量为0.08％-0.12％。
在一些实施例中，每100mL溶剂加入1-3mL、0.04-0.06M的柠檬酸钠溶液，加入80-120μL、0.3-0.6M的氯化钴溶液。
在一些实施例中，每100mL溶剂加入8-12mL、0.04-0.06M的柠檬酸钠溶液，加入460-520μL、0.3-0.6M的氯化钴溶液。
S120：在真空环境下，向混合液中加入还原性硼氢化盐溶液，进行反应。
在一些实施例中，还原性硼氢化盐为硼氢化钠和硼氢化钾中的一种或多种。
在一些实施例中，每100mL混合液中，加入0.8-1.2mL、0.1-0.2mM的硼氢化钠溶液。
在一些实施例中，每100mL混合液中，加入4.8-5.4mL、0.1-0.2mM的硼氢化钠溶液。
在一些实施例中，步骤S120中，反应至溶液从无色逐渐变深至深灰色。
在一些实施例中，步骤S120中，反应时间为10-20min；进一步地，反应时间为10-14min。
在一些实施例中，步骤S120中，反应温度为15-35℃。
S130：通入空气，并加入氯金酸溶液，进行反应，获得反应液，反应液为中空金纳米颗粒的分散液。
在一些实施例中，步骤S120中，每100mL混合液中，加入0.8-1.2mL、0.1-0.2mM的硼氢化钠溶液，步骤S130中，加入0.4-0.6mL的20-30mM的氯金酸溶液。
在一些实施例中，步骤S120中，每100mL混合液中，加入4.8-5.4mL、0.1-0.2mM的硼氢化钠溶液，步骤S130中，加入1-4mL的20-30mM的氯金酸溶液。
在一些实施例中，步骤S130中，先在温度为0-4℃的条件下搅拌5-20min，然后通入空气，加入氯金酸溶液，进行反应，高浓度合成所制得的中空金溶液浓度为0.1mg/mL。
S140：向反应液中加入PVP K30，在温度为0-4℃的条件下进行离心，收集沉淀物；将沉淀物重分散，制得中空纳米颗粒分散液。
可理解的，当无需重新分散可省去步骤S140，应理解为均在本发明的保护范围内。
在一些实施例中，步骤S140中，PVP K30的体积为反应液的0.05％-0.2％。
在一些实施例中，离心转速为5000r-15000r；进一步地，离心转速为8000r-10000r。
在一些实施例中，步骤S100包括以下步骤：
将6mL0.05M柠檬酸钠、300μL0.4M氯化钴和300mL水混合，制得混合液；惰性气体氛围下，向所述混合液中加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，进行反应；待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，通入空气并加入1.5mL的25mM的氯金酸溶液，搅拌12-36h，制得所述中空纳米颗粒分散液；加入PVP K30溶液，在0-4℃的条件下离心，收集沉淀物；将所述沉淀物重分散，制得所述中空纳米颗粒分散液；或
在一些实施例中，步骤S100包括以下步骤：
将6mL0.05M柠檬酸钠、300μL0.4M氯化钴和60mL水混合，制得混合液；惰性气体氛围下，向所述混合液中加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，进行反应；待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，在0-4℃的条件下搅拌5-20min，通入空气并加入1.5mL的25mM的氯金酸溶液稀释至4.5mL，搅拌12-36h，加入PVP K30溶液，制得所述中空纳米颗粒分散液。
S200：将功能分子负载至中空金纳米颗粒的表面，制得检测试剂。
在一些实施例中，步骤S200包括以下步骤：将功能分子添加到中空金纳米颗粒分散液中，孵化，封闭，离心，重分散。
进一步地，功能分子为S-RBD蛋白，步骤S200包括以下步骤：将S-RBD蛋白添加到中空金属纳米颗粒的分散液中，然后孵化，再加入BSA溶液封闭，离心，0-4℃的条件下保存。
本发明一实施方式提供了一种中空金纳米颗粒分散液的制备方法，具体如步骤S100所述。
本发明一实施方式还提供了一种试纸条，包含有上述检测试剂。其中，检测试剂及其制备方法如上所述，在此不再进行赘述。
在一些实施例中，试纸条包括反应垫，反应垫上包被有上述检测试剂。
在一些实施例中，所述试纸条包含有：功能分子为抗NT-proBNP抗体的检测试剂和功能分子为抗sST2抗体的检测试剂。
目前市场上用于心衰检测的试剂盒都是单联检测，存在假阴性、漏检等不足之处，通过采用中空金纳米颗粒负载NT-proBNP抗体和sST-2抗体，以sST-2蛋白作为NT-proBNP蛋白的辅助检测物，联合检测sST-2和NT-proBNP两种蛋白，有利于提高检测灵敏度、特异性，降低假阴性、漏检问题的发生率。对于心衰的诊断、鉴别、危险分层及预后判断具有更大价值，且对于急性心衰的诊断及预后判定上潜力巨大。
在一些实施例中，试纸条包括硝酸纤维膜，硝酸纤维膜包括第一检测线和第二检测线，有一个检测线包被有抗NT-proBNPd单克隆抗体，有一个检测线包被有抗sST2单克隆抗体。
在一些实施例中，硝酸纤维膜还包括质控线，质控线由羊抗鼠IgG抗体制备而成。
在一些实施例中，试纸条还包括金标垫，金标垫上涂覆有混合检测试剂和鼠IgG抗体，所述混合检测试剂为功能分子为NT-proBNP抗体的检测试剂和功能分子为sST2抗体的检测试剂的组合。
在一些实施例中，试纸条包括底板；进一步地，底板为PVC底板；进一步地，PVC底板宽度为5mm。
进一步地，玻璃纤维，硝酸纤维素膜，吸水纸之间各自交叠区域的长度均为2mm。
在一些实施例中，如图2所示，试纸条10包括底板100和设置在底板100上的包被膜200(未图示)，沿层析方向(箭头所示)，包被膜200包括依次排列的样品垫210、金标垫220、反应垫230和吸水垫240，所述样品垫210的一端与金标垫220的一端接触，形成台阶状，金标垫220的另一端与反应垫230的一端接触，形成台阶状，反应垫230的另一端与吸水垫240的一端接触，形成台阶状。
进一步地，所述反应垫230由硝酸纤维素膜组成。
进一步地，所述反应垫230上设置有检测线231(如图2中2311和2312)和质控线232，所述质控线232靠近所述吸水垫240，所述检测线231靠近金标垫220，所述检测线231包括第一检测线2311和第二检测线2312，所述第一检测线2311靠近所述金标垫220，所述第二检测线2312靠近所述吸水垫240，所述质控线232内包被有羊抗鼠IgG抗体，所述第一检测线2311内包被有抗NT-proBNPd单克隆抗体，所述第二检测线2312内包被有抗sST2单克隆抗体，所述金标垫220内包被上述检测试剂，且所述检测试剂为第一检测试剂和第二检测试剂的组合，所述第一检测试剂的功能分子为NT-proBNP抗体，所述第二检测试剂的功能分子为sST2抗体。
本发明一实施方式还提供了上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
在PVC底板上搭建包被膜，金标垫上涂覆上述检测试剂(即中空金标记的单克隆抗体)，反应垫由硝酸纤维素膜组成，作为固相载体，上面涂覆中空金标记抗体相应的二抗和抗鼠抗体以构成检测线和质控线。
其中，试纸条的结构如上所述，在此不再进行赘述。
在一些实施例中，所述硝酸纤维素膜粘贴在PVP底板的中部。
在一些实施例中，吸水垫粘贴在所述硝酸纤维素膜一侧的底板上，所述吸水纸和所述硝酸纤维素膜之间有2mm的重叠。
在一些实施例中，所述样品垫粘贴在所述硝酸纤维素膜的另一侧底板上，所述硝酸纤维素膜和金标垫之间有2mm的重叠。
在一些实施例中，所述样品垫是由玻璃纤维浸泡在含有0.5％BSA、0.1％Triton、0.1％Tween-80、0.2％PEG4000、10％蔗糖、20mM的NaAc的溶液中，冻干后形成的。
本发明一实施方式还提供了一种试剂盒，包括上述检测试剂或上述试纸条。
在一些实施例中，试剂盒包括上述检测试剂和能够与检测试剂作用的SPR芯片。
通过采用上述检测试剂和SPR芯片联用来进行体外检测具有以下优势：1)上述检测试剂中采用中空金纳米颗粒代替传统的胶体金作为检测增强试剂，中空多孔金具有大粒径，低密度，中空多孔的特性，可增加胶体稳定性，提高检测灵敏度，与Nano SPR芯片技术连用，可以增强SPR信号强度，大大提高检测灵敏度；2)SPR芯片能够在对血清、血浆指尖血样本进行简单处理步骤的情况下，超快速、超高灵敏度直接检测样品中的待测物如新冠中和抗体，可以快速判断药物(如新冠疫苗)的有效性；3)检测操作简便快速、灵敏度高，NanoSPR检测技术不需要荧光或染色标记；4)检测成本低，检测试剂制备简单，纳米等离子光学检测系统结构简单，成本低，操作简便，可以采用普通的酶标仪或光学显微成像系统进行检测，完全摆脱了价格在百万元人民币以上的国外进口传统SPR检测仪器设备的限制，大大降低了检测设备成本，在提升检测效率和精准度的同时扩大了该项技术和产品在各种应用场景的可推广前景。
在一些实施例中，检测试剂的功能分子为S-RBD蛋白，SPR芯片为包含有anti-human IgG的芯片。
本发明的检测试剂通过以S-RBD蛋白为功能分子并联合SPR芯片，当进行检测时，如图1中右侧所示，样本中的SARS-CoV-2中和抗体与试剂中的检测试剂(即中空金标记S-RBD蛋白溶液)在传感器芯片集成微孔板中反应，形成免疫结合物粒子，产生的结合物粒子与纳米孔芯片会发生等离子共振效应，在特定波长590nm或650nm处引起吸光度的改变，两处波长处的吸光度的差值与样本中SARS-CoV-2中和抗体的含量成正比。故通过两处波长处吸光度的差值可以判断相关药物的有效性。
在一些实施例中，采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。
在一些实施例中，采用以下方法制备SPR芯片：
S310：制备纳米阵列结构的芯片；
在一些实施例中，步骤S310包括以下步骤：
S311：提供模具；
在一些实施例中，模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。
S312：将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上，固化(优选105mw/cm2的紫外光照射2-4min)，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。
S313：在纳米杯阵列上沉积钛(Ti)和70nm的金(Au)；
在一些实施例中，采用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。
S314：切片，粘在目标区域上(例如开底96孔板或芯片墨盒上)。
S320：冲洗芯片后，将芯片置于MUA乙醇溶液中室温孵育，清洗，然后在EDC和NHS的混合物中浸泡，使芯片在室温下激活，制得活化芯片。
在一些实施例中，步骤S320中，将芯片置于10mM MUA乙醇溶液中室温孵育20-40min；用60％-80％乙醇和去离子水清洗芯片两次，然后在例如400mM EDC和100mM NHS的混合物中浸泡20-40min，使芯片在室温下激活。
S330：冲洗后，将anti-human IgG固定在活化芯片上，室温下固化4h，用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用BSA封闭液和乙醇胺溶液孵育，孵育后，功能化芯片，冲洗，备用。
在一些实施例中，步骤S330中，采用11.0μg/mL-13.0μg/mL(优选12.0μg/mL)的anti-human IgG固定在活化芯片上，室温下固化3-5h(优选4h)，然后用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用50μg/mL-70μg/mL(优选60μg/mL)BSA封闭液和5％-15％(优选10％)乙醇胺溶液孵育，室温孵育20-40min。
在一些实施例中，上述试剂盒的检测下限为0.5ng/mL。
本发明还提供了一种检测药物有效性的方法，包括采用上述试剂盒检测待测药物的步骤。
在一些实施例中，待测药物为疫苗或抗体药物。与疫苗依赖于人体自身能够产生出足够的免疫应答以防治疾病不同，抗体药物起效更为迅速，可立即提供免疫反应。此外，抗体药物还具有可及性高和后续可以快速实现大规模生产的优势，可以作为防治病毒(例如新冠病毒)的有力武器。
在一些实施例中，检测药物有效性的方法包括以下步骤：
S410：将检测试剂、待测样品加入SPR芯片中；
其中，待测样品可以根据检测试剂进行选择，例如稀释的血清等。
S420：检测波长590nm和/或650nm处吸光度变化值，根据吸光度变化值，计算待测样品中SARS-CoV-2中和抗体的含量；
S430：根据SARS-CoV-2中和抗体的含量判断所述药物的有效性。
上述方法具有以下优点：1)能够在对血清或血浆样品进行简单处理的情况下，超快速、超高灵敏度直接检测样品中的新冠中和抗体。2)检测操作简便快速、灵敏度高、检测速度高和重现性高；3)成本低。
在一些实施例中，功能分子为非洲猪瘟单克隆抗体，检测方法与步骤S410-S430基本相同，不同之处在于，采用功能分子为非洲猪瘟单克隆抗体的检测试剂替代功能分子为S-RBD蛋白的检测试剂，用以检测非洲猪瘟病毒颗粒强度。
在一些实施例中，功能分子为N蛋白，检测方法与步骤S410-S430基本相同，不同之处在于，采用功能分子为N蛋白的检测试剂替代功能分子为S-RBD蛋白的检测试剂，用以检测新冠病毒颗粒强度。
在一些实施例中，功能分子为CRP单克隆抗体，检测方法与步骤S410-S430基本相同，不同之处在于，采用功能分子为CRP单克隆抗体的检测试剂替代功能分子为S-RBD蛋白的检测试剂，用以检测引起炎症的病原微生物的强度。
在一些实施例中，功能分子为小鹅瘟病毒单克隆抗体，检测方法与步骤S410-S430基本相同，不同之处在于，采用功能分子为小鹅瘟病毒单克隆抗体的检测试剂替代功能分子为S-RBD蛋白的检测试剂，用以检测小鹅瘟病毒颗粒强度。本发明一实施方式提供了一种检测方法，包括采用上述试剂盒进行检测的步骤。
在一些实施例中，检测方法为疾病检测方法；在一些实施例中，检测方法为食品安全性检测方法；在一些实施例中，检测方法为兽药残留检测方法。
下面列举具体实施例来对本发明进行说明。需要说明的是，下述实施例仅为示例，不应理解为对本发明的限制。
实施例1
中空金纳米颗粒的合成：在300mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，搅拌12分钟时间，然后通入空气并加入1.5mL的25mM的氯金酸溶液搅拌过夜，搅拌过夜后加入300μL的20％PVP K30溶液，在4℃、9000r离心例如10分钟后取沉淀用超纯水重新分散即得到中空金纳米颗粒分散液。该中空金纳米颗粒粒径分布在90nm-110nm之间，最大吸收波长在600-630nm之间，稀释后外观呈现墨绿色。
S-RBD蛋白的标记：将9μL S-RBD蛋白添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
SPR芯片的制备:采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。最初的模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上。经过105mw/cm2的紫外光照射3分钟后，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。然后，用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。之后，该薄片被切割成13厘米×8.5厘米，粘在由3D打印机制作的开底96孔板或芯片墨盒上。用去离子水冲洗芯片集成微孔板孔或卡两次后，芯片置于例如10mM MUA乙醇溶液中室温孵育0.5h。用70％乙醇和去离子水清洗芯片两次，然后在例如400mM EDC和100mM NHS的混合物中浸泡30分钟，使芯片在室温下激活。随后，芯片在去离子水中冲洗两次，并立即将12.0μg/mL的anti-human IgG固定在活化芯片上，室温下固化4h。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用60μg/mL BSA封闭液和10％乙醇胺溶液孵育，室温孵育30分钟。孵育后，功能化芯片用去离子水轻轻冲洗两次，然后存放在4℃的潮湿环境中。
用中空金联合SPR芯片检测新冠中和抗体的具体的检测过程是：首先将待测样本(配制不同浓度，具体参见图6-图8)加入到芯片中，在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为起点，然后将S-RBD标记好的中空多孔金纳米颗粒加入到SPR芯片中，在摇床中37℃恒温震摇15分钟后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为终点，用终点数据减去起点数据，然后将例如OD650-OD590的数值用来表征样本中新冠中和抗体的强度，并与阴性样本进行对照。
实施例2
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
S-RBD蛋白的标记：将9μL S-RBD蛋白添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用1mLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
SPR芯片的制备:采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。最初的模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上。经过105mw/cm2的紫外光照射3分钟后，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。然后，用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。之后，该薄片被切割成13厘米×8.5厘米，粘在由3D打印机制作的开底96孔板或芯片墨盒上。用去离子水冲洗芯片集成微孔板孔或卡两次后，芯片置于例如10mM MUA乙醇溶液中室温孵育0.5h。用70％乙醇和去离子水清洗芯片两次，然后在例如400mM EDC和100mM NHS的混合物中浸泡30分钟，使芯片在室温下激活。随后，芯片在去离子水中冲洗两次，并立即将12.0μg/mL的anti-human IgG固定在活化芯片上，室温下固化4h。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用60μg/mL BSA封闭液和10％乙醇胺溶液孵育，室温孵育30分钟。孵育后，功能化芯片用去离子水轻轻冲洗两次，然后存放在4℃的潮湿环境中。
用中空金联合SPR芯片检测新冠中和抗体的具体的检测过程是：首先将待测样本加入到芯片中，在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为起点，然后将S-RBD标记好的中空多孔金纳米颗粒加入到SPR芯片中，在摇床中37℃恒温震摇15分钟后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为终点，用终点数据减去起点数据，然后将例如OD650-OD590的数值用来表征样本中新冠中和抗体的强度，并与阴性样本进行对照。
实施例3
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
非洲猪瘟单克隆抗体的标记：将9μL非洲猪瘟病毒单克隆抗体添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
SPR芯片的制备:采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。最初的模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上。经过105mw/cm2的紫外光照射3分钟后，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。然后，用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。之后，该薄片被切割成13厘米×8.5厘米，粘在由3D打印机制作的开底96孔板或芯片墨盒上。用去离子水冲洗芯片集成微孔板孔或卡两次后，加入1mM的氯金酸和1mM的L-半胱氨酸在37℃下孵育30分钟，然后用去离子水冲洗两遍后将10μg/mL的非洲猪瘟多克隆抗体固定在活化芯片上，4℃下固化12h。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用1％BSA和10％乙醇胺封闭液封闭，37℃封闭30分钟。封闭后，功能化芯片用PBST轻轻冲洗两次，然后，用PBS和1％蔗糖溶液进行保护，37℃保护30分钟，保护后，存放在4℃的潮湿环境中。
具体的检测过程是：将处理好的检测样本加入到芯片板中，然后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描，数值记为起点，将非洲猪瘟单克隆抗体标记好的中空多孔金纳米颗粒加入到SPR芯片中，在摇床中37℃恒温震摇15分钟后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描，数值记为终点，用起点数据减去终点数据，将例如OD650-OD590的数值用来表征样本中非洲猪瘟颗粒的强度，并与阴性样本进行对照。测试结果如图10-图12，其中，图10为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体样本检测图；图11为实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体阳性血清样本稀释检测图(阳性血清样本稀释倍数分别为100、1000、2000、4000、8000、16000，进行检测相应的OD值变化图)；图12为实施例3的本发明的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体标准曲线(阳性血清样本稀释对应标准曲线)。
实施例4
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
N蛋白抗体的标记：将10μg/mL的N蛋白抗体添加到1.5毫升的0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
SPR芯片的制备:采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。最初的模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上。经过105mw/cm2的紫外光照射3分钟后，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。然后，用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。之后，该薄片被切割成13厘米×8.5厘米，粘在由3D打印机制作的开底96孔板或芯片墨盒上。用去离子水冲洗芯片集成微孔板孔或卡两次后，加入1mM的氯金酸和1mM的L-半胱氨酸在37℃下孵育30分钟，然后用去离子水冲洗两遍后将8μg/mL的N22抗体固定在活化芯片上，4℃下固化12h。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用1％BSA和10％乙醇胺封闭液封闭，37℃封闭30分钟。封闭后，功能化芯片用PBST轻轻冲洗两次，然后，用PBS和1％蔗糖溶液进行保护，37℃保护30分钟，保护后，存放在4℃的潮湿环境中。待检测样本用佰抗稀释液(1％NaCl、0.1％Triton、0.5％BSA、10％Hepes，0.1％EDTA)稀释100倍。
具体的检测过程是：将处理好的检测样本加入到芯片板中，然后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描，数值记为起点，将N蛋白标记好的中空多孔金纳米颗粒加入到SPR芯片中，在摇床中37℃恒温震摇15分钟后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描，数值记为终点，用起点数据减去终点数据，将例如OD650-OD590的数值用来表征样本中新冠病毒颗粒的强度，并与阴性样本进行对照。
实施例5
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
CRP单克隆抗体MC18的标记：将6μL的CRP单克隆抗体MC18添加到1.5毫升的0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μLR2(pH＝9.2PBST、2％蔗糖、2％甘露糖)重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
SPR芯片的制备:采用复制成型工艺制备了纳米等离子体传感器。最初的模具是一个锥形的纳米阵列(直径为220纳米，深度为500纳米，周期为440纳米)，位于由光刻和等离子体蚀刻制成的硅片上。将光学黏合剂均匀地涂在模具上，并放置在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄片上。经过105mw/cm2的紫外光照射3分钟后，带UV聚合物层的PET片材从模具上剥落。然后，用电子束蒸发器将10nm的钛(Ti)和70nm的金(Au)沉积到纳米杯阵列上。之后，该薄片被切割成13厘米×8.5厘米，粘在3D打印机制作的开底96孔板或芯片墨盒上。用去离子水冲洗芯片集成微孔板孔或卡两次后，加入0.5mg/mL的PEI600，在室温下反应2h，然后甩干用去离子水洗两遍烘干，加入0.05mg/mL的中空多孔金溶液，在室温下孵育1h，用去离子水冲洗两遍后加入8μg/mL的CRP单克隆抗体MC15固定在活化芯片上，4℃下固化12h。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后用(1％PBS+0.1％Tween20+1％BSA+3％蔗糖+0.1％P300)封闭液封闭，37℃封闭30分钟。封闭后，功能化芯片用PBST轻轻冲洗两次，然后，用PBS和1％蔗糖溶液进行保护，37℃保护30分钟，保护后，存放在4℃的潮湿环境中。
具体的检测过程是：首先将待测样本加入到芯片中，在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为起点，然后将CRP单克隆抗体MC18标记好的中空多孔金纳米颗粒加入到SPR芯片中，在摇床中37℃恒温震摇15分钟后在酶标仪中进行500nm-700nm光谱扫描检测，所得数据记为终点，用终点数据减去起点数据，然后将例如OD650-OD590的数值用来表征样本中引起炎症的病原微生物的强度，并与阴性样本进行对照。
实施例6
与实施例1基本相同，不同之处在于，中空金纳米颗粒合成步骤中，省去加入300μL的20％PVP K30溶液的步骤。
实施例7
与实施例2基本相同，不同之处在于，中空金纳米颗粒合成步骤中，省去“冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟”的步骤。
实施例8
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
小鹅瘟病毒单克隆抗体的标记：将9μL小鹅瘟病毒单克隆抗体添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μL PBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
试纸条的制备：试纸条由玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水垫、玻璃纤维样品垫、PVC底板等组成，试纸条检测原理采用双抗体夹心法，试纸条大小为10cm×5mm，将硝酸纤维素膜粘贴在底板中间，将吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，再依次将样品垫，金标垫和硝酸纤维素膜由上到下依次交叠，金标垫位于硝酸纤维素膜和吸水垫之间，相互交叠长度均为2mm。金标垫处理：将玻璃纤维素膜浸入金标垫处理液(0.5％BSA、0.1％Triton、0.1％Tween-80、0.2％PEG4000、10％蔗糖、20mM的NaAc)中4℃过夜，37℃烘干。用喷金划膜仪将抗小鹅瘟病毒单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别以1.0mg/mL、1.2mg/mL的浓度包被硝酸纤维素膜，作为检测线和质控线。将金标抗体涂覆于以处理好的金标垫上，用真空冻干机冻干后备用。
具体检测过程是取咽拭子样本，立即将拭子浸入1mL50％甘油-PBS保存液中，然后取50μL加入到样品垫中，当样本中的小鹅瘟病毒浓度高于极限值时，会与金标垫上中空金标记的小鹅瘟病毒单克隆抗体结合，当该复合物层析到反应垫上检测线和质控线时，会被二抗截留从而显色。而当样本中小鹅瘟病毒浓度低于极限值时，则不会显色，因此阳性结果为：检测线和质控线均显墨绿色。测试结果如图13所示。
实施例9
中空金纳米颗粒的合成：在60mL去离子水中加入6mL0.05M的柠檬酸钠溶液和300μL0.4M的氯化钴溶液，用磁力搅拌器进行搅拌并抽真空除去容器中和溶液中的空气，除去空气后加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，继续搅拌和抽真空，待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，冰水浴(0-4摄氏度)搅拌12分钟，然后通入空气并将1.5mL的25mM氯金酸溶液稀释至4.5mL加入后搅拌过夜后即得高浓度的中空金纳米颗粒分散液。
NT-proBNP单克隆抗体的标记：将15μLNT-proBNP单克隆抗体添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用1mLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
sST2单克隆抗体的标记：将10μLsST2单克隆抗体添加到0.2毫克/毫升的NHGNPs，然后孵化15分钟。再加入75μL的20％BSA溶液封闭15分钟，然后将蛋白标记的NHGNPs在7500r中离心15分钟。最后,将NHGNPs沉淀用530μLPBST重新分散，4℃保存，以备进一步实验。
双联试纸条的制备：试纸条由玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水垫、玻璃纤维样品垫、PVC底板等组成，试纸条检测原理采用双抗体夹心法，试纸条大小为10cm×5mm，将硝酸纤维素膜粘贴在底板中间，将吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，再依次将样品垫，金标垫和硝酸纤维素膜由上到下依次交叠，金标垫位于硝酸纤维素膜和吸水垫之间，相互交叠长度均为2mm。金标垫处理：将玻璃纤维素膜浸入金标垫处理液(0.5％BSA、0.1％Triton、0.1％Tween-80、0.2％PEG4000、10％蔗糖、20mM的NaAc)中4℃过夜，37℃烘干。用喷金划膜仪将抗NT-proBNP单克隆抗体、抗sST2单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别以1.6mg/mL、1.2mg/mL、1.0mg/mL的浓度包被硝酸纤维素膜，作为检测线和质控线。将金标抗体涂覆于以处理好的金标垫上，用真空冻干机冻干后备用。
具体检测过程是取0.5毫升稀释10倍的血清样本加入到样品垫中，当样本中的NT-proBNP、sST2蛋白高于极限值时，会与金标垫上中空金标记的NT-proBNP单克隆抗体和中空金标记的sST2单克隆抗体结合，当该复合物层析到反应垫上检测线和质控线时，会被二抗截留从而显色。而当样本中NT-proBNP、sST2低于极限值时，则不会显色，因此阳性结果为：检测线1、检测线2和质控线均显墨绿色。测试结果如图14所示。
对比例1
胶体金制备方法：将2.5mL的25mM氯金酸溶液加入到250mL去离子水中，接入冷凝管回流保持溶液体积恒定，然后在油浴中加热至沸腾并均匀搅拌10min后，加入3mL的1％的柠檬酸钠溶液。观察到溶液先迅速变黑后逐渐变为酒红色并保持稳定，即得胶体金溶液，并配制成不同浓度，具体如图3-图5。
从图3-图8可以看出，胶体金检测下限为8.3ng/ml，浓度与吸光度相关系数R2＝0.992，而本发明的中空金检测下限为0.5ng/ml，浓度与吸光度相关系数R2＝0.998，中空金对样本中新冠中和抗体的检测灵敏度提高了约16倍，并且OD650-OD590的值与浓度的相关系数更高，表明可在一定的检测范围内进行定量检测或半定量检测。
从图10-12可以看出，实施例3的检测试剂联合SPR芯片检测非洲猪瘟抗体具有较高的灵敏度。从图13-图14可以看出，中空金检测小鹅瘟病毒抗原的试纸条和中空金检测NT-proBNP的试纸条均具有较优的技术效果。
说明本发明的检测试剂能够达到提高检测的灵敏性的目的，且可以用在免疫层析试纸条中来进行简单的定量，并可与SPR芯片联用，能显著提高SPR芯片的检测线性范围和检测灵敏度，为体外诊断提供了一种全新的研发思路。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括中空金纳米颗粒和负载于所述中空金纳米颗粒表面的功能分子，所述中空金纳米颗粒为中空多孔结构，且所述中空金纳米颗粒的粒径为50-120nm，吸收波长为500nm-700nm，所述功能分子为抗体、抗原、核酸或标志蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述功能分子为S-RBD蛋白或N蛋白；或
所述功能分子为CRP单克隆抗体；或
所述功能分子为NT-proBNP单克隆抗体和/或sST2单克隆抗体；或
所述功能分子为非洲猪瘟病毒单克隆抗体或小鹅瘟病毒单克隆抗体。
3.权利要求1-2任一项所述的检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取所述中空金纳米颗粒的分散液；
将所述功能分子添加到中空金纳米颗粒的分散液中，孵化，封闭，离心，重分散，制得所述检测试剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用以下方法获取所述中空金纳米颗粒的分散液：
将柠檬酸盐、钴源(优选为氯化钴、氟化钴或溴化钴)和溶剂混合，制得混合液；其中，所述钴源为能够提供二价钴离子的盐；
在真空环境下，向所述混合液中加入还原性硼氢化盐溶液(优选为硼氢化钠或硼氢化钾)进行反应；
通入空气，并加入氯金酸溶液，进行反应，获得反应液，所述反应液为所述中空金纳米颗粒的分散液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，采用以下方法获取中空金纳米颗粒分散液：
将6mL0.05M柠檬酸钠、300μL0.4M氯化钴和300mL水混合，制得混合液；惰性气体氛围下，向所述混合液中加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，进行反应；待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，通入空气并加入1.5mL的25mM的氯金酸溶液，搅拌12-36h，制得所述中空纳米颗粒分散液；加入PVP K30溶液，在0-4℃的条件下离心，收集沉淀物；将所述沉淀物重分散，制得所述中空金纳米颗粒的分散液；或
采用以下方法获取中空金纳米颗粒分散液：
将6mL0.05M柠檬酸钠、300μL0.4M氯化钴和60mL水混合，制得混合液；惰性气体氛围下，向所述混合液中加入3mL0.13mM的硼氢化钠溶液，进行反应；待溶液从无色逐渐变深至深灰色后，在0-4℃的条件下搅拌5-20min，通入空气并加入1.5mL的25mM的氯金酸溶液稀释至4.5mL，搅拌12-36h，加入PVP K30溶液，制得所述中空金纳米颗粒的分散液。
6.一种试纸条，其特征在于，包括包含有权利要求1或2所述的检测试剂。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，包括底板和设置在底板上的包被膜，沿层析方向，所述包被膜包括依次排列的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫；
所述反应垫上设置有检测线和质控线，所述质控线靠近所述吸水垫，所述检测线靠近所述金标垫，所述检测线包括第一检测线和第二检测线，所述第一检测线靠近所述金标垫，所述第二检测线靠近所述吸水垫；
其中，所述质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体，所述第一检测线内包被有抗NT-proBNPd单克隆抗体，所述第二检测线内包被有抗sST2单克隆抗体，所述金标垫内包被有权利要求1或2所述的检测试剂，且所述检测试剂为第一检测试剂和第二检测试剂的组合，所述第一检测试剂的功能分子为NT-proBNP抗体，所述第二检测试剂的功能分子为sST2抗体。
8.一种检测药物有效性的方法，其特征在于，包括采用试剂盒检测待测药物的步骤；
其中，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测试剂，和能够与所述检测试剂作用的SPR芯片；或
所述试剂盒包括权利要求6或7所述的试纸条。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测试剂的功能分子为S-RBD蛋白、N蛋白、非洲猪瘟单克隆抗体、CRP单克隆抗体或小鹅瘟病毒单克隆抗体，所述SPR芯片为anti-human IgG的SPR芯片；
所述方法包括以下步骤：
将所述检测试剂、待测样品加入所述SPR芯片中；
检测波长为590nm和/或650nm处吸光度变化值，根据所述吸光度变化值，计算所述待测样品中待测指标的含量；
根据所述待测指标的含量判断所述药物的有效性；
其中，功能分子为S-RBD蛋白的检测试剂的待测指标为SARS-CoV-2中和抗体；功能分子为N蛋白的检测试剂的待测指标为新冠病毒颗粒强度；功能分子为非洲猪瘟单克隆抗体的检测试剂的待测指标为非洲猪瘟病毒颗粒强度；功能分子为CRP单克隆抗体的检测试剂的待测指标为引起炎症的病原微生物的强度；功能分子为小鹅瘟病毒单克隆抗体的检测试剂的待测指标为小鹅瘟病毒颗粒强度。
10.权利要求1或2所述的检测试剂，或权利要求6或7所述的试纸条在人兽疾病中间结果检测、食品安全检测和兽药残留检测中的应用。
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