CN110257520A

CN110257520A - 一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术

Info

Publication number: CN110257520A
Application number: CN201910597122.6A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 蔡小玉
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: CN110257520B

Abstract

本发明是基于miRNA检测技术和分离的同时诊断方法，该方法是用HCR方法进行杂交链式反应，不需要酶参加，不同于其他检测方法，因此对温度以及其他环境条件没有严格要求；相较之前检测技术，该技术不涉及复杂的程序或复杂、昂贵的仪器，检测更加方便，简单，成本较低，用LIF进行检测，检测速度比较快速，2 min内即可完成检测；miRNA在与匹配的H1、H2发生杂交链式反应后，形成的产物时候长链双螺旋DNA结构，具有较强的稳定性；检测的灵敏度极高，少量样品即可完成miRNA‑21、miRNA‑31的检测和分离；该方法具有较好的特异性，对肺癌细胞A549的检测有良好的效果。

Description

一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术。

背景技术

小分子核糖核酸miRNA是非编码的单链RNA，广泛存在于植物和动物中。作为转录后的调控因子，miRNA通过转译抑制机制影响蛋白质水平和细胞内的稳态。越来越多的证据表明，动物中miRNA的失调会刺激癌症的发生，因此，检测生物中的miRNA具有重要意义，而在越来越多的特征性miRNA中，miRNA-21和miRNA-31在多种癌细胞系中有着过表达显示出显着的临床相关性。

灵敏的检测方法是检测miRNA的必要条件，因为它们在生物中的含量很低。最常见的miRNA检测方法是：Northern Blotting、微阵列芯片技术和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。Northern Blotting 法是一个耗时的过程，需要大量的样本。此外，标记试剂一般具有放射性，这可能导致有害的辐射。微阵列芯片是高灵敏度的检测miRNA的高通量方法。然而，基于微阵列芯片的分析也需要大量的样本。此外，制作微阵列芯片和特殊仪器的要求使试验成本高昂。反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）在扩增后可以提供超高灵敏度的miRNA检测。但这种方法成本高昂，而且复杂，因为它需要经过特殊设计的DNA序列和序列转录的过程。因此，开发一种快速、简单和灵敏的分析miRNA 的方法是必要的。

近些年来恶性肿瘤已成为中国居民死亡的首要原因，而肺癌是最常见的恶性肿瘤，占死亡率高达25.3%，患者生存率仅达到18.6%。尽管近几年在提高恶性肿瘤生存率上取得不断进步，肺癌生存率仍然很低且发病率以每年15%的速度增长，总患病率已经占据男性恶性肿瘤的首位。预计至2050年，每年我国将有90万人死于肺癌，将成为世界第一肺癌患病大国。因此提高肺癌患者生存率日益重要，做好肺癌的早期检测更显得尤为重要，而miRNA-21和miRNA-31在肺癌细胞中的表达升高，使得miRNA在肺癌发生和发展过程中发挥重要作用，miRNA-21和miRNA-31可以应用于肺癌细胞的检测与治疗。

目前应用先进的基因测序技术可以对不同组织病理类型的肺癌进行分子分型，针对分子水平上可以选择靶向药物，其针对性强，不良反应少，耐受性较好，但在肺癌晚期上治疗也是越显得困难。一些靶向药物如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼是临床上常用的EGFR－TKIs，均被国家食品药品监督管理局批准用于EGFR突变晚期NSCLC患者的一线治疗，但实际在临床工作中往往因各种原因不能获取NSCLC患者EGFR分子分型，目前对于EGFR突变阴性或突变未知NSCLC患者，含铂双药方案仍为一线治疗方案，但常常会发生化疗抵抗，而且随着抗癌过程延续，化疗不良反应、复发、并发症等原因使这些患者很难接受反复治疗。因此开发出一种简单、快速的早期肺癌检测技术是十分重要的，因为很多靶向药物，治疗方法在晚期效果都是比较差的，研究发现很多疾病的早期发作都可以根据其miRNA来检测，所以miRNA检测技术是具有重大意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

通过检测细胞中miRNA-21和miRNA-31的表达量，从而实现肺癌的诊断与治疗；具体方法为：根据碱基互补配对设计DNA单链H1、H2，当溶液中不存在miRNA时，H1和H2稳定存在于溶液中，不会发生反应；当加入引发剂miRNA后，由miRNA与H1的缺口末端碱基互补配对，打开了H1发卡结构，H1被打开的缺口末端由接着和H2的缺口末端杂交配对，从而H2的发卡结构又被打开，再次暴露出H2上的缺口末端。如此循环反复，形成杂交链式反应；最后测定获得miRNA对应的信号强度；

所述DNA单链序列如下：

H1-21:ATCAGACTGATGTTGACAAAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-FAM；

H2-21: FAM-ACTTTGTCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；

H1-31：FAM-GATGCTGGCATAGCTCAAAGTAGCTATGCCAGCATCTTGCCT；

H2-31：ACTTTGAGCTATGCCAGCATCAGGCAAGATGCTGGCATAGCT-FAM。

操作方法包括以下步骤：

（1）样品制备：将取得A549细胞用胰蛋白酶处理后，离心，取上清液，清洗，涡旋，离心后，加入75%v/v乙醇洗涤沉淀，干燥后的RNA用无RNA酶水进行溶解，配成浓度为5 × 10^-13M进行反应。

（2）miRNA检测：将完成HCR杂交链式反应的miRNA-21、miRNA-31用短毛细管高速电泳方法进行检测，用盐酸、超纯水、运行的缓冲液对自制的毛细管分离装置进行抽洗，进行光路对准，确保激光焦点刚好落到毛细管上。移动滑块，使毛细管锥形端探入样品池后，打开高压电源软件，在毛细管两端施加3000 V电压，进样3 s后，断开高压电源，立即移动滑块将毛细管探入缓冲液池，关上暗箱门。打开高压电源软件，在毛细管两端施加电压，分离样品，同时色谱采集单元开始记录谱图。

本发明的优点在于：

（1）本发明方法是用HCR方法进行杂交链式反应，不需要酶参加，不同于其他检测方法，因此对温度以及其他环境条件没有严格要求；

（2）相较之前检测技术，该技术不涉及复杂的程序或复杂、昂贵的仪器，检测更加方便，简单，成本较低，用LIF进行检测，检测速度比较快速，2 min内即可完成检测；

（3）miRNA在与匹配的H1、H2发生杂交链式反应后，形成的产物时候长链双螺旋DNA结构，具有较强的稳定性；

（4）检测的灵敏度极高，少量样品即可完成miRNA-21、miRNA-31的检测和分离；

（5）该方法具有较好的特异性，对肺癌细胞A549的检测有良好的效果。

附图说明

图1为基于HCR高灵敏度检测miRNA 的原理示意图。

图2为miRNA-21的检测限图。

图3为miRNA-31的检测限图。

具体实施方式

实施例1

1、样品准备

将取得A549细胞用胰蛋白酶处理后，离心，取上清液，清洗，涡旋，离心后，加入75%乙醇洗涤沉淀，干燥后的RNA用无RNA酶水溶解，进行反应。

2、DNA荧光探针

分别设计两段分别能与miRNA-21、miRNA-31碱基互补配对的DNA单链H1、H2,在H1、H2上面连接上FAM基团使之具有荧光信号，称这两段DNA单链H1、H2为miRNA-21、miRNA-31的DNA荧光探针，涉及的核酸链碱基序列如下（序列由5' to 3'）：

miRNA-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；

H1-21:ATCAGACTGATGTTGACAAAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-FAM；

H2-21: FAM-ACTTTGTCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；

miRNA-31 AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU；

H1-31：FAM-GATGCTGGCATAGCTCAAAGTAGCTATGCCAGCATCTTGCCT；

H2-31：ACTTTGAGCTATGCCAGCATCAGGCAAGATGCTGGCATAGCT-FAM；

当溶液中不存在miRNA时，H1和H2可以稳定存在于溶液中，不会发生反应。当加入引发剂miRNA后，由于碱基的互补配对原则，miRNA与H1的缺口末端碱基互补配对，打开了H1发卡结构，H1被打开的缺口末端由接着和H2的缺口末端杂交配对，从而H2的发卡结构又被打开，再次暴露出H2上的缺口末端。如此循环反复，形成杂交链式反应。杂交链式反应完成以后，由于未反应H1和H2单体与HCR产物同时存在于同一溶液中，这时就用超滤管离心掉未反应的H1和H2单体。因为H1和H2单体与HCR产物的分子量不同，通过优化HSCE条件，让所有的信号峰合并，测定总信号峰的强度，再扣除本底空白的强度就是miRNA所对应的信号强度。

miRNA检测：将完成HCR杂交链式反应的miRNA-21、miRNA-31用短毛细管高速电泳方法进行检测，用盐酸、超纯水、运行的缓冲液对自制的毛细管分离装置进行抽洗，进行光路对准，确保激光焦点刚好落到毛细管上；移动滑块，使毛细管锥形端探入样品池后，打开高压电源软件，在毛细管两端施加3000 V电压，进样3 s后，断开高压电源，立即移动滑块将毛细管探入缓冲液池，关上暗箱门；打开高压电源软件，在毛细管两端施加电压，分离样品，同时色谱采集单元开始记录谱图。

在动态凝胶电泳模式下，对一系列不同浓度的标准样品引发等温杂交链式反应进行分析测定，根据根据其与空白值的差值来确定miRNA的检测限。可得出miRNA-21和miRNA-31的检测限分别为：1.6 × 10^-14M、1.1 × 10^-14M，如图2、3所示。检测信号强度高，临床检测肺癌提出了新方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcagactga tgttgacaaa gttcaacatc agtctgataa gcta 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actttgtcaa catcagtctg attagcttat cagactgatg ttga 44

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggcaagaug cuggcauagc u 21

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgctggca tagctcaaag tagctatgcc agcatcttgc ct 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actttgagct atgccagcat caggcaagat gctggcatag ct 42

Claims

1.一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术，其特征在于，通过检测细胞中miRNA-21和miRNA-31的表达量，从而实现肺癌的诊断与治疗；具体方法为：根据碱基互补配对设计DNA单链H1、H2，当溶液中不存在miRNA时，H1和H2稳定存在于溶液中，不会发生反应；当加入引发剂miRNA后，由miRNA与H1的缺口末端碱基互补配对，打开了H1发卡结构，H1被打开的缺口末端由接着和H2的缺口末端杂交配对，从而H2的发卡结构又被打开，再次暴露出H2上的缺口末端；如此循环反复，形成杂交链式反应；最后测定获得miRNA对应的信号强度；

所述DNA单链序列如下：

H1-21:ATCAGACTGATGTTGACAAAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-FAM；

H2-21: FAM-ACTTTGTCAACATCAGTCTGATTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；

H1-31：FAM-GATGCTGGCATAGCTCAAAGTAGCTATGCCAGCATCTTGCCT；

H2-31：ACTTTGAGCTATGCCAGCATCAGGCAAGATGCTGGCATAGCT-FAM。

2.根据权利要求1所述一种利用短毛细管高速电泳检测肺癌细胞中miRNA的技术，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品制备：将取得A549细胞用胰蛋白酶处理后，离心，取上清液，清洗，涡旋，离心后，加入75%v/v乙醇洗涤沉淀，干燥后的RNA用无RNA酶水进行溶解，配成浓度为5 × 10^-13M进行反应；

（2）miRNA检测：将完成HCR杂交链式反应的miRNA-21、miRNA-31用短毛细管高速电泳方法进行检测，用盐酸、超纯水、运行的缓冲液对自制的毛细管分离装置进行抽洗，进行光路对准，确保激光焦点刚好落到毛细管上；移动滑块，使毛细管锥形端探入样品池后，打开高压电源软件，在毛细管两端施加3000 V电压，进样3 s后，断开高压电源，立即移动滑块将毛细管探入缓冲液池，关上暗箱门；打开高压电源软件，在毛细管两端施加电压，分离样品，同时色谱采集单元开始记录谱图。