CN108663419A - 纸芯片及其制备方法以及生物分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纸芯片及采用纸芯片的生物分子检测方法以及制备纸芯片的方法，所述纸芯片依次包括：电极层，设置有对电极、参比电极和多个工作电极，其中多个工作电极表面固定有检测材料；叠加在电极层上的分流层，设置有穿过分流层的参比电极导流孔和多个工作电极导流孔，参比电极导流孔和多个工作电极导流孔通过第一导流通路连接；以及叠加在分流层上的进样过滤层，设置有位于进样过滤层上表面的中心分流区和穿过进样过滤层的多个分流导流孔，中心分流区和多个分流导流孔通过第二导流通路连接，待检测液通过进样通路流入中心分流区；其中，待检测液经由分流导流孔和工作电极导流孔导流至工作电极，并经由参比电极导流孔导流至对电极和所述参比电极。

Description

纸芯片及其制备方法以及生物分子检测方法

技术领域

本发明的实施例涉及生物检测领域，特别涉及一种纸芯片及采用纸芯片的生物分子检测方法。

背景技术

生物分子例如疾病标志物的检测是了解人体器官功能并进一步评估人体健康的重要手段，例如，临床上主要通过参考基础卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、基础雌二醇(E2)等临床指标来评估卵巢储备功能。但是，FSH、LH和E2等性激素在人体血液中含量极低，需要较高的检测灵敏度。

对于FSH、LH和E2的检测，目前主要有免疫胶体金试条、免疫生化检测仪、微流控纸芯片等方法。其中，免疫胶体金试条方法操作方便、结构简单，但是其为定性或半定量检测，灵敏度不高；免疫生化检测仪可实现多参数同时检测、检测灵敏度高，但是检测周期长、需样量大、价格昂贵。微流控纸芯片以滤纸为基底材料，可以在一个纸芯片上完成加样、过滤、检测等功能，且结构简单、成本低廉、用样量少，可以实现生物分子的微量、多参数联合检测。

目前采用直接电化学检测方法的纸芯片多为滴加样品、用样量大，并且在纸芯片研制过程中面临不同参数检测相互干扰、低含量性激素易受电极制备修饰条件和环境因素干扰、微沟道和微反应区有待优化的问题。

发明内容

本发明的实施例旨在提出一种多参数检测、灵敏度高的纸芯片，并提供一种采用纸芯片的生物分子检测方法。

根据本发明的一个方面，提出一种纸芯片，依次包括：电极层，所述电极层上设置有对电极、参比电极和多个工作电极，其中所述多个工作电极表面固定有用于检测生物分子的检测材料；叠加在电极层上的分流层，所述分流层上设置有穿过分流层的参比电极导流孔和多个工作电极导流孔，并且所述参比电极导流孔和多个工作电极导流孔通过位于分流层上表面的第一导流通路连接；以及叠加在分流层上的进样过滤层，所述进样过滤层上设置有位于进样过滤层上表面的中心分流区和穿过进样过滤层的多个分流导流孔，所述中心分流区和多个分流导流孔通过位于进样过滤层上表面的第二导流通路连接，待检测液通过位于进样过滤层上表面的进样通路流入中心分流区；其中，所述待检测液经由所述分流导流孔和所述工作电极导流孔导流至所述工作电极，并经由所述参比电极导流孔导流至所述对电极和所述参比电极。

根据一些实施方式，所述分流层包括吸水区，所述吸水区通过位于分流层下表面的排液通路与所述参比电极导流孔连接。

根据一些实施方式，所述分流层包括通过分割线分离的可移除部分和固定部分，所述可移除部分包括参比电极导流孔、多个工作电极导流孔和第一导流通路，所述固定部分包括吸水区；所述分割线将所述排液通路分成位于可移除部分中的第一排液通路部分和位于固定部分中的第二排液通路部分。

根据一些实施方式，所述分割线由穿过所述分流层的打孔线构成。

根据一些实施方式，所述电极层上设置有多个输出电极，所述多个输出电极通过连接线分别与对电极、参比电极和多个工作电极电连接。

根据一些实施方式，所述分流层下表面设置有导线，所述导线的两端分别与电极层的两条连接线电连接；并且所述分割线将所述导线分成位于固定部分中的第二导线部分和位于可移除部分中的第一导线部分，所述第一导线部分与所述电极层的所述两条连接线电连接。

根据一些实施方式，所述可移除部分连接至所述电极层，使得所述可移除部分能够和所述电极层一起从纸芯片移除以构成独立的电极检测单元用于进行检测；以及所述固定部分连接至所述进样过滤层。

根据一些实施方式，所述纸芯片包括位于进样过滤层上方的覆盖层。

根据一些实施方式，所述检测材料包括基础卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、基础雌二醇(E2)的抗体。

根据本发明的另一方面，提出一种采用所述的纸芯片的生物分子检测方法，包括：通过进样过滤层的进样通路通入待检测液，使待检测液流至电极层；使待检测液与电极层的检测材料发生化学反应；以及反应完成后，将分流层的可移除部分和电极层构成的电极检测单元从纸芯片移除，插入检测仪进行分析。

根据本发明的另一方面，提出一种制备所述的纸芯片的方法，包括：分别制备电极层、分流层和进样过滤层；和叠加并连接电极层、分流层和进样过滤层；其中，分别采用滤纸制备所述分流层和所述进样过滤层，其中，采用喷蜡打印机进行双面打印，以在所述分流层和所述进样过滤层的滤纸的上表面和下表面分别形成不同的图案；采用双面热压工艺进行熔蜡，控制蜡在滤纸上的浸润深度，以在所述分流层和所述进样过滤层的部分区域形成一面疏水一面亲水的双层结构。

根据一些实施方式，在采用喷蜡打印机双面打印分流层时，在所述参比电极导流孔、所述工作电极导流孔所在的区域在分流层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，而在所述第一导流通路所在的区域在分流层的上表面形成未喷蜡区，在分流层的下表面形成喷蜡区；在采用喷蜡打印机双面打印进样过滤层时，在所述分流导流孔所在的区域在进样过滤层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，在所述中心分流区、第二导流通路、进样通路所在的区域在进样过滤层的上表面形成未喷蜡区，在进样过滤层的下表面形成喷蜡区。

根据一些实施方式，还包括：在采用喷蜡打印机双面打印分流层时，在分流层中形成吸水区和排液通路，在所述吸水区所在的区域在分流层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，以及在排液通路所在的区域在分流层的上表面形成喷蜡区，在分流层的下表面形成未喷蜡区。

根据一些实施方式，在所述进样过滤层的除分流导流孔、中心分流区、第二导流通路、进样通路以外的区域在进样过滤层的上表面和下表面上均形成喷蜡区；并且，在所述分流层的除参比电极导流孔、工作电极导流孔、第一导流通路、吸水区和排液通路以外的区域在分流层的上表面和下表面上均形成喷蜡区。

根据一些实施方式，在采用双面热压工艺进行熔蜡时，控制蜡在滤纸上的浸润深度，使得在双面喷蜡的区域蜡融化后浸润整个滤纸的厚度，而在单面喷蜡的区域，蜡融化后仅浸润滤纸的一部分厚度。

在根据本发明的实施例的纸芯片中，通过设置表面固定有检测材料的多个工作电极，可同步检测多种生物分子，从而实现多参数联合检测。并且通过设置进样过滤层和分流层上的多种孔、通道结构，可实现精准的流量控制，保证待检测液能均匀流向各工作电极，检测不受相互干扰。

附图说明

通过下文中参照附图对本发明所作的描述，本发明的其它目的和优点将显而易见，并可帮助对本发明有全面的理解。

图1示出了根据本发明的一个示例性实施例的纸芯片的总体结构示意图；

图2示出了图1的纸芯片的进样过滤层的结构示意图；

图3示出了图1的纸芯片的分流层的结构示意图；

图4示出了制备图1的纸芯片的分流层的流程图；

图5示出了图1的纸芯片的电极层的结构示意图；

图6示出了图1的纸芯片的电极检测单元的结构示意图；

图7示出了图1的纸芯片的导线的作用示意图；以及

图8示出了根据本发明的另一示例性实施例的包括覆盖层的纸芯片的总体结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向。因此，使用的方向用语是用来说明并非用来限制本发明的保护范围。

图1示出了根据本发明的一个示例性实施例的纸芯片100的总体结构示意图，其中左侧为各层的上表面，右侧为各层的下表面。如图1所示，纸芯片100依次包括：电极层1，电极层1上设置有对电极11、参比电极12和多个工作电极13，其中多个工作电极13表面固定有用于检测生物分子的检测材料；叠加在电极层1上的分流层2，分流层2上设置有穿过分流层2的参比电极导流孔21和多个工作电极导流孔23，并且参比电极导流孔21和多个工作电极导流孔23通过位于分流层2上表面的第一导流通路24连接；以及叠加在分流层2上的进样过滤层3，进样过滤层3上设置有位于进样过滤层3上表面的中心分流区31和穿过进样过滤层3的多个分流导流孔33，中心分流区31和多个分流导流孔33通过位于进样过滤层3上表面的第二导流通路34连接，待检测液通过位于进样过滤层3上表面的进样通路35流入中心分流区31。待检测液经由分流导流孔33和工作电极导流孔23导流至工作电极13，并经由参比电极导流孔21导流至对电极11和参比电极12。

在根据本发明的实施例的纸芯片100中，通过设置表面固定有检测材料的多个工作电极13，可同步检测多种生物分子，从而实现多参数联合检测。并且通过设置进样过滤层2和分流层3上的多种孔、通道结构，可实现精准的流量控制，保证待检测液能均匀流向各工作电极，检测不受相互干扰。此外，采用多层组合设计，可在单个纸芯片上实现加样、分离、免疫检测等功能，操作简单、检测快速，同时采用直接电化学免疫检测方法，无须加入二抗，所需试剂少，可减少人为操作误差。

图2示出了根据图1的纸芯片100的进样过滤层3的结构示意图，其中左右两侧分别为进样过滤层3的上下表面。如图2所示，进样过滤层3上下表面可以具有不同的结构，上表面可包括：中心分流区31、多个分流导流孔33、第二导流通路34；下表面可包括多个分流导流孔33。即，中心分流区31与第二导流通路34仅形成于进样过滤层3的上表面，而多个分流导流孔33为穿过进样过滤层3的通孔。中心分流区31和多个分流导流孔33通过多个第二导流通路34连接，形成从一个中心分流区31到多个分流导流孔33的发射状。分流导流孔33的数量可根据实际需要检测的指标数确定，例如设置为2-5个。待检测液可从中心分流区31通过多个第二导流通路34流到多个分流导流孔33。在本发明的实施例中，进样过滤层3还包括形成于上表面的进样通路35，用于将待测液体从进样过滤层3的侧边开口导入中心分流区31。

进样过滤层3采用过滤材料，例如可包括过滤膜，用于将待检测液中的细胞分离截留。在本发明的实施例中，进样过滤层3采用Whatman公司的血浆分离(plasma separation)膜作为基材。进一步地，在基材上喷蜡进行疏水化处理。参照图2，其中上下表面所示的空白部分均为喷蜡区30，而上下表面所示的黑色图案，即中心分流区31、多个分流导流孔33、第二导流通路34以及进样通路35则为原始纤维结构，待检测液可在其中流通，并且，由于基材的过滤功能，待检测液中的细胞可分离截留在过滤膜上，其余物质则透过过滤膜进入下一层。进样通路35可以为细长形状的微沟道，待检测液在毛细作用下可实现自动进样。

进样过滤层3可如下制备：

1)采用喷蜡打印机进行双面打印，以在进样过滤层3的上表面和下表面分别形成不同的图案，其中，上表面打印图2左图所示图案，下表面打印图2右图所示图案。具体地，在分流导流孔33所在的区域在进样过滤层3的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，在中心分流区31、第二导流通路34、进样通路35所在的区域在进样过滤层3的上表面形成未喷蜡区，在进样过滤层3的下表面形成喷蜡区。此外，在进样过滤层3的除分流导流孔33、中心分流区31、第二导流通路34、进样通路35以外的空白区域中在进样过滤层3的上表面和下表面上均形成喷蜡区30。

2)采用双面热压技术进行熔蜡，精确控制热压温度和热压速度，以控制蜡在滤纸上的浸润深度，从而在进样过滤层3的部分区域形成一面疏水一面亲水的双层结构。具体地，在双面喷蜡的区域蜡融化后浸润整个滤纸的厚度，而在单面喷蜡的区域，蜡融化后仅浸润滤纸的一部分厚度。浸润部分为疏水结构，未浸润部分为亲水结构。例如，在中心分流区31、第二导流通路34、进样通路35所在的区域在蜡溶化后，从滤纸的下表面浸入滤纸一半的厚度，从而在滤纸的下半部分形成疏水结构，在滤纸的上半部分形成亲水结构。喷蜡区30全部为疏水结构，分流导流孔33全部为亲水结构。

采用双面热压进行熔蜡技术，可以通过调节温度、压力和时间，精确控制蜡在滤纸上的浸润深度，可以在一张滤纸上形成一面疏水一面亲水的结构，提高了单层滤纸的使用效率，降低了纸芯片的结构复杂度，提高了检测效率，降低了成本。

图3示出了图1的纸芯片100的分流层2的结构示意图，其中左右两侧分别为分流层2的上下表面。如图3所示，分流层2上下表面可具有不同的结构，上表面可包括：参比电极导流孔21、多个工作电极导流孔23、第一导流通路24；下表面可包括：参比电极导流孔21、多个工作电极导流孔23。即，第一导流通路24仅形成于分流层2上表面，而参比电极导流孔21和多个工作电极导流孔23为穿过分流层2的通孔。如上所述，待检测液在进样过滤层3中最终流到多个分流导流孔33，在本发明的实施例中，多个分流导流孔33和多个工作电极导流孔23的位置一一对应，那么，待检测液将进一步流到多个工作电极导流孔23。由于多个工作电极导流孔23通过多个第一导流通路24与参比电极导流孔21连接，因此一部分待检测液可沿第一导流通路24流到参比电极导流孔21。

进一步地，参照图3，分流层2还包括吸水区25，吸水区25通过位于分流层2下表面的排液通路26与参比电极导流孔21连接，使得多余的待检测液可流到吸水区25。在本发明的实施例中，分流层2采用Whatman公司的滤纸作为基材。类似于进样过滤层3，分流层2的基材也通过喷蜡进行疏水化处理。图3中上下表面所示的空白部分均为喷蜡区20，而上下表面所示的黑色图案，即参比电极导流孔21、多个工作电极导流孔23、第一导流通路24、吸水区25以及排液通路26均为原始纤维结构，利于待检测液在其中流通。

进一步地，分流层2还包括位于下表面的导线27，导线27的两端分别与下面将讨论的电极层1的两条连接线14(图1示出)电连接。导线27可以为例如碳导通线。

继续参照图3，分流层2可包括通过分割线28分离的可移除部分2-1和固定部分2-2。可移除部分2-1可包括参比电极导流孔21、多个工作电极导流孔23和第一导流通路24；固定部分2-2可包括吸水区25。可移除部分2-1和固定部分2-2分离可导致流入吸水区25的液路断开，即，分割线28将排液通路26分成位于可移除部分2-1中的第一排液通路部分26-1和位于固定部分2-2中的第二排液通路部分26-2。并且，分割线28将导线27分成位于可移除部分2-1中的第一导线部分27-1和位于固定部分2-2中的第二导线部分27-2。分割线28可以由穿过分流层2的打孔线构成。可移除部分2-1可连接至电极层1，使得可移除部分2-1能够和电极层1一起从纸芯片移除以用于进行检测；以及固定部分2-2可连接至进样过滤层3。

图4示出了制备图1的纸芯片100的分流层2的流程图，参照图4，分流层2可如下制备：

1)采用喷蜡打印机进行双面打印，以在分流层2的上表面和下表面分别形成不同的图案，其中，上表面打印图4A所示图案，下表面打印图4B所示图案。具体地，在参比电极导流孔21、工作电极导流孔23所在的区域在分流层2的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，而在第一导流通路24所在的区域在分流层2的上表面形成未喷蜡区，在分流层的下表面形成喷蜡区。进一步地，在分流层2中形成吸水区25和排液通路26，在吸水区25所在的区域在分流层2的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，以及在排液通路26所在的区域在分流层2的上表面形成喷蜡区，在分流层2的下表面形成未喷蜡区。此外，在分流层2的除参比电极导流孔21、工作电极导流孔23、第一导流通路24、吸水区25和排液通路26以外的区域在分流层2的上表面和下表面上均形成喷蜡区。

2)采用双面热压技术进行熔蜡，精确控制热压温度和热压速度，以控制蜡在滤纸上的浸润深度，从而在分流层2的部分区域形成一面疏水一面亲水的双层结构。具体地，在双面喷蜡的区域蜡融化后浸润整个滤纸的厚度，而在单面喷蜡的区域，蜡融化后仅浸润滤纸的一部分厚度。浸润部分为疏水结构，未浸润部分为亲水结构。例如，在第一导流通路24所在的区域在蜡溶化后，从滤纸的下表面浸入滤纸一半的厚度，从而在滤纸的下半部分形成疏水结构，在滤纸的上半部分形成亲水结构。在排液通路26所在的区域在蜡溶化后，从滤纸的上表面浸入滤纸一半的厚度，从而在滤纸的上半部分形成疏水结构，在滤纸的下半部分形成亲水结构。喷蜡区20全部为疏水结构，参比电极导流孔21、工作电极导流孔23、吸水区25全部为亲水结构。

采用双面热压进行熔蜡技术，可以通过调节温度、压力和时间，精确控制蜡在滤纸上的浸润深度，可以在一张滤纸上形成一面疏水一面亲水的结构，提高了单层滤纸的使用效率，降低了纸芯片的结构复杂度，提高了检测效率，降低了成本。

3)在分流层2的下表面通过丝网印刷形成导线27，如图4D所示，此时上表面的图案和图4A相同，如图4C所示；

4)在滤纸上打孔形成分割线28，将分流层2分成可移除部分2-1和固定部分2-2，如图4E、4F所示；

5)在固定部分2-2的上表面，通过双面胶和进样过滤层3的下表面粘合，在可移除部分2-1的下表面通过双面胶和电极层1相连。

图5示出了根据图1的纸芯片100的电极层1的结构示意图。如图5所示，电极层1包括对电极11、参比电极12和多个工作电极13，多个工作电极13表面固定有用于检测生物分子的检测材料。多个工作电极13的位置与分流层2的多个工作电极导流孔23的位置一一对应，使得多个工作电极导流孔23的待检测液流入多个工作电极13与检测材料发生反应，改变电极表面的电化学性质。类似地，对电极11和参比电极12的位置与参比电极导流孔21的位置对应，使得待检测液可流到对电极11和参比电极12。由此，分流层2使得待检测液体均匀流到电极层1。进一步地，电极层1还包括多个输出电极15，输出电极15通过多条连接线14分别与对电极11、参比电极12和多个工作电极13相连，以便对电极11、参比电极12和多个工作电极13与外部检测仪器形成检测回路。

电极层1可采用带有保护掩膜的塑料基片作为基材，制备流程如下：

1)使用专业软件刻绘如图4所示电极图形；

2)将带有保护掩膜的塑料基片固定在刻图机上，设置合适的刀压、速率及其他参数，将图形输出到刻字机，刻出电极图形，并将需溅射部分的掩模去除，暴露出电极图形；

3)采用真空磁控溅射技术溅射金导电薄膜，获得致密、光滑的金导电层，并去除电极图形周围的掩膜，形成对电极11、参比电极12、多个工作电极13、连接线14、输出电极15；

4)采用丝网印刷技术在参比电极12金电极表面丝印一层Ag|AgCl层，获得Ag|AgCl参比电极；

5)进行工作电极制备，包括：

(a)采用氧等离子技术对工作电极进行表面清洗，以去除工作电极表面残余的有机微尘和增强表面的浸润性，其中，氧等离子设备功率设置在50W，表面清洗时间3min；

(b)取壳聚糖(CS)溶液、5mg碳纳米管(MWCNTs)和硫堇溶液(THI)(2mg/mL)进行混合搅拌，并加入H₂O₂(wt％＝3％)，然后进行超声分散30min，以获得良好的THI-CS-MWCNTs复合膜的混合液分散液；

(c)用移液器吸取经超声分散的THI-CS-MWCNTs混合溶液，将其滴涂于工作电极表面，可采用三电极体系，进行电化学修饰，其中，工作电位：-0.4V，沉积时间为5min；

(d)将胶体金溶液和抗体混合，充分搅拌5min后，形成金-抗体混合物，采用冷冻离心机进行离心，除去未结合的抗体；

(e)将金-抗体混合物溶于牛血清白蛋白(BSA)溶液，滴加于工作电极表面，抗体通过金纳米粒子和碳纳米管上的胺基反应固定在工作电极上。

图6示出了图1的纸芯片100的电极检测单元5的结构示意图，如图5所示，分流层2的可移除部分2-1和电极层1一同构成电极检测单元5。当待检测液与抗体的免疫反应结束后，可以将电极层1与可移除部分2-1从纸芯片上移除，然后将电极检测单元5插入检测仪进行分析。并且由于电极检测单元5与吸水区25和进样过滤层3的液体通路完全断开，吸水区25的多余液体和进样过滤层3的残留液体不会对检测造成干扰，可以提高检测确度。

图7示出了图1的纸芯片100的导线27的作用示意图。如图7左图所示，导线27与电极层1上表面的连接到两个输出电极15的两条连接线14充分电接触，导通形成短路状态；如图7右图所示，当可移除部分2-1从纸芯片100上移除后，导线27断开，只剩下可移除部分2-1中的第一导线部分27-1和电极层1的两条连接线14电连接，两个输出电极15之间形成断路状态。因此，可通过检测两个输出电极15之间的电路状态，判断是否将可移除部分2-1从纸芯片100上取下。因此，可在确保电极检测单元5与吸水区25和进样过滤层3的液体通路完全断开的情况下进行精确的检测。

图8示出了根据本发明的另一示例性实施例的包括覆盖层6的纸芯片200的总体结构示意图，如图8所示，纸芯片200包括位于进样过滤层3上方的覆盖层4，覆盖层4为疏水材料，可通过胶粘方式与进样过滤层3粘合在一起，其作用主要是覆盖进样过滤层3以防止污染、避免加样后样品散溢。该实施例的其它部分与图1相同，在此不再赘述。

下面简要说明本发明的实施例的纸芯片的组装流程：

1)将覆盖层4下表面和进样过滤层3的上表面粘合；

2)在分流层2上表面的固定部分2-2粘接双面胶，通过双面胶和进样过滤层3的下表面粘合；

3)在分流层2下表面的可移除部分2-1粘接双面胶，通过双面胶和电极层1粘合。

本发明还提出一种采用纸芯片的生物分子检测方法，采用如前述各实施例的纸芯片，包括：

通过进样过滤层的进样通路通入待检测液，使待检测液流至电极层；

使待检测液与电极层的检测材料发生化学反应；以及

反应完成后，将分流层的可移除部分和电极层构成的电极检测单元从纸芯片移除，插入检测仪进行分析。

本发明的实施例的纸芯片至少具有以下效果：

(1)采用双面热压进行熔蜡技术，可以通过调节温度、压力和时间，精确控制蜡在滤纸上的浸润深度，可以在一张滤纸上形成一面疏水一面亲水的结构，提高了单层滤纸的使用效率，降低了纸芯片的结构复杂度，提高了检测效率，降低了成本。

(2)通过移除孔将分流层分成两部分，可移除部分通过双面胶和电极层相连形成可移除电极检测单元。加入待测液体，充分反应后，将可移除电极检测单元从纸芯片上取下，则可移除电极检测单元与吸水区和进样过滤区的液体通路完全断开。吸水区的多余液体和进样过滤区的残留液体不会对检测造成干扰，可以提高检测准确度。

(3)通过粘合作用，电极层上表面的两条连接线与分流层下表面的导线充分接触，两个输出电极通过导线导通，处于短路状态；当可移除部分从纸芯片上移除后，导线断开，两个输出电极之间处于断路状态。可以通过检测两个输出电极之间的电路状态，判断是否将可移除部分从纸芯片上取下。

虽然结合附图对本发明进行了说明，但是附图中公开的实施例旨在对本发明的实施方式进行示例性说明，而不能理解为对本发明的一种限制。本领域普通技术人员将理解，在不背离本发明总体构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本发明的范围以权利要求和它们的等同物限定。

Claims (15)

1.一种纸芯片，依次包括：

电极层，所述电极层上设置有对电极、参比电极和多个工作电极，其中所述多个工作电极表面固定有用于检测生物分子的检测材料；

叠加在电极层上的分流层，所述分流层上设置有穿过分流层的参比电极导流孔和多个工作电极导流孔，并且所述参比电极导流孔和多个工作电极导流孔通过位于分流层上表面的第一导流通路连接；以及

叠加在分流层上的进样过滤层，所述进样过滤层上设置有位于进样过滤层上表面的中心分流区和穿过进样过滤层的多个分流导流孔，所述中心分流区和多个分流导流孔通过位于进样过滤层上表面的第二导流通路连接，待检测液通过位于进样过滤层上表面的进样通路流入中心分流区；

其中，所述待检测液经由所述分流导流孔和所述工作电极导流孔导流至所述工作电极，并经由所述参比电极导流孔导流至所述对电极和所述参比电极。

2.根据权利要求1所述的纸芯片，其特征在于，所述分流层包括吸水区，所述吸水区通过位于分流层下表面的排液通路与所述参比电极导流孔连接。

3.根据权利要求2所述的纸芯片，其特征在于，所述分流层包括通过分割线分离的可移除部分和固定部分，所述可移除部分包括参比电极导流孔、多个工作电极导流孔和第一导流通路，所述固定部分包括吸水区；

所述分割线将所述排液通路分成位于可移除部分中的第一排液通路部分和位于固定部分中的第二排液通路部分。

4.根据权利要求3所述的纸芯片，其特征在于，所述分割线由穿过所述分流层的打孔线构成。

5.根据权利要求3所述的纸芯片，其特征在于，所述电极层上设置有多个输出电极，所述多个输出电极通过连接线分别与对电极、参比电极和多个工作电极电连接。

6.根据权利要求5所述的纸芯片，其特征在于，所述分流层下表面设置有导线，所述导线的两端分别与电极层的两条连接线电连接；并且

所述分割线将所述导线分成位于可移除部分中的第一导线部分和位于固定部分中的第二导线部分，所述第一导线部分和电极层的所述两条连接线电连接。

7.根据权利要求6所述的纸芯片，其特征在于，所述可移除部分连接至所述电极层，使得所述可移除部分能够和所述电极层一起从纸芯片移除以构成独立的电极检测单元用于进行检测；以及

所述固定部分连接至所述进样过滤层。

8.根据权利要求1所述的纸芯片，其特征在于，所述纸芯片包括位于进样过滤层上方的覆盖层。

9.根据权利要求1所述的纸芯片，其特征在于，所述检测材料包括基础卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、基础雌二醇(E2)的抗体。

10.一种生物分子检测方法，其特征在于，采用权利要求3-7任一项所述的纸芯片，所述方法包括：

通过进样过滤层的进样通路通入待检测液，使待检测液流至电极层；

使待检测液与电极层的检测材料发生化学反应；以及

反应完成后，将分流层的可移除部分和电极层构成的电极检测单元从纸芯片移除，插入检测仪进行分析。

11.一种制备权利要求1-9任一项所述的纸芯片的方法，包括：

分别制备电极层、分流层和进样过滤层；和

叠加并连接电极层、分流层和进样过滤层；

其中，分别采用滤纸制备所述分流层和所述进样过滤层，其中，

采用喷蜡打印机进行双面打印，以在所述分流层和所述进样过滤层的滤纸的上表面和下表面分别形成不同的图案；

采用双面热压工艺进行熔蜡，控制蜡在滤纸上的浸润深度，以在所述分流层和所述进样过滤层的部分区域形成一面疏水一面亲水的双层结构。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，

在采用喷蜡打印机双面打印分流层时，在所述参比电极导流孔、所述工作电极导流孔所在的区域在分流层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，而在所述第一导流通路所在的区域在分流层的上表面形成未喷蜡区，在分流层的下表面形成喷蜡区；

在采用喷蜡打印机双面打印进样过滤层时，在所述分流导流孔所在的区域在进样过滤层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，在所述中心分流区、第二导流通路、进样通路所在的区域在进样过滤层的上表面形成未喷蜡区，在进样过滤层的下表面形成喷蜡区。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，还包括：

在采用喷蜡打印机双面打印分流层时，在分流层中形成吸水区和排液通路，在所述吸水区所在的区域在分流层的上表面和下表面上均形成未喷蜡区，以及在排液通路所在的区域在分流层的上表面形成喷蜡区，在分流层的下表面形成未喷蜡区。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，

在所述进样过滤层的除分流导流孔、中心分流区、第二导流通路、进样通路以外的区域在进样过滤层的上表面和下表面上均形成喷蜡区；并且，

在所述分流层的除参比电极导流孔、工作电极导流孔、第一导流通路、吸水区和排液通路以外的区域在分流层的上表面和下表面上均形成喷蜡区。

15.根据权利要求11-14任一项所述的方法，其特征在于，在采用双面热压工艺进行熔蜡时，控制蜡在滤纸上的浸润深度，使得在双面喷蜡的区域蜡融化后浸润整个滤纸的厚度，而在单面喷蜡的区域，蜡融化后仅浸润滤纸的一部分厚度。