CN104865241A - 一种合金纳米粒子修饰的电致发光细胞传感纸芯片的制备 - Google Patents
一种合金纳米粒子修饰的电致发光细胞传感纸芯片的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于合金纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法。该传感纸芯片的制作方法包括以下步骤：制备AuPd修饰的纸芯片工作电极；制备多孔PtNi合金纳米材料；制备高性能量子点碳点（CDs）与PtNiCDs发光标记复合物；利用电极修饰技术，将适配体和细胞以及发光标记复合物修饰到传感纸芯片的AuPd工作电极表面。一种基于多金属纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的检测方法包括如下步骤：将修饰好的传感纸芯片连接到电化学工作站，配合化学发光仪，对待测液进行检测。本发明的电极特异性强；灵敏度高；完成一个检测过程时间短；成本低。电极检测肿瘤细胞的方法，操作简单快速，反应及结果均由仪器自动完成和记录。
Description
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，更具体地说是一种基于合金纳米粒子电致发光检测肿瘤细胞的折叠式纸芯片的制备。
背景技术
在恶性肿瘤也称癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体在受各种内在或外在致癌因素的作用下，局部组织的细胞的在基因水平失去了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。肿瘤发病率和死亡率上升趋势严重威胁着人类的健康，它的早期诊断和治疗是肿瘤预防治疗的重要研究领域之一。
由于人们对癌症预防的日益重视，肿瘤细胞检测方法也越来越多。目前而言，细胞检测的方法大都是基于荧光成像的方法，但是这个方法需要的操作时间长，设备昂贵，同时需要操作人员具有较熟练的经验。为了克服这些缺点，也催生了一些其他的肿瘤细胞的检测方法，例如：
1. 石英微天平传感器。主要通过检测物质在石英晶片表面上吸附前后石英晶片共振频率的变化以得到吸附物质的量以及一些物理性能。该方法的主要优点是灵敏度较高，响应快，缺点是重复率低并且不利于现场快速检测；
2. 表面增强拉曼光谱法检测（SERS）。目前普遍认为SERS主要有两种机理，一种是物理增强机理，通过局域场和偶极发射起作用；另一种是化学增强机理，通过分子的极化率起作用。该方法的优点是检测灵敏度高，缺点是一起昂贵，且需要熟练操作，不利于现场检测；
3. 电化学阻抗谱图法。其原理是给电化学系统施加一个频率不同的小振幅的交流电势波，测量交流电势与电流信号的比值（此比值即为系统的阻抗）随正弦波频率ω的变化，或者是阻抗的相位角Φ随ω的变化。该方法检测细胞时的缺点是应用范围有一定的限制。
以上几种方法对于肿瘤细胞的检测和分析都存在一些问题和缺点而限制其在实际样品检测中的应用。
发明内容
在本发明要解决的技术问题是提供了一种具有样品处理简单、检测速度快、成本低、灵敏度高、特异性强等特点的检测细胞电致发光传感折叠式纸芯片的制备及检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种基于合金纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法，其特征包括以下步骤：
（1） 制备折叠式纸芯片：先用蜡打印机在A4纸上打印如附图1的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟, 使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极和Ag/AgCl参比电极（如附图2）；
（2）制备用于修饰电极的AuPd纳米粒子，利用原位生长的方法，将其修饰到电极表面；
（3）选择能够特异性识别被检测细胞SK-BR-3 的适配体，通过自组装技术将其修饰到已经处理过的电极表面上；
（4）将已经过处理的被测细胞样品，利用自组装技术与（3）中的适配体进行特异性结合；
（5）制备具有高发光性能的量子点；
（6） 制备能够增强电子传递，起到信号放大作用的多孔纳米材料PtNi合金；
（7）利用自组装表面修饰等技术，将（5）与（6）制备的材料符合，合成具有信号放大作用的ECL探针。
本发明所述的基于合金纳米粒子修饰的细胞传感器将细胞修饰到电极表面包括以下步骤：
（1）将制备的纸芯片上的印刷电极用玛瑙锤子仔细地打磨2分钟；
（2）制备AuPd纳米粒子修饰纸电极
首先将15.0微升Au纳米种子滴加到纸电极的工作区域，然后在室温下反应1小时，清洗除去未结合的Au纳米后，将该电极放入到含有10 mM HAuCl4和20 mM H2PdCl4的混合溶液中，然后再振荡的条件下迅速加入柠檬酸，最后得到的AuPd修饰纸电极清洗后置于室温下30 min后即可得；
（3）制备PtNi合金纳米材料
通过在电弧炉里精炼高纯度的Pt、Ni、 Al金属，然后再氮气保护的环境下利用旋铸技术制备得到 PtNiAl 合金。然后通过去合金化处理将制得的PtNiAl 合金溶解在1M NaOH溶液里48h即可得到PtNi合金纳米材料；
（4）将制备的PtNi合金纳米材料冰水浴超声处理10-30 min, 得到分散性较好的合金材料溶液；
（5）将制备的碳点溶液离心处理5-10min，除去不发光的沉淀物质，得到分散性较好的碳点溶液；
（6）将（4）制备的PtNi合金材料溶液与（5）制备的碳点溶液混合超声，处理20-30min， 然后离心分离去除沉淀，得到分散性较好的PtNiCDs 复合材料溶液；
（7）将（6）制备好的PtNiCDs 复合材料溶液与伴刀豆球蛋白A（Con A）进行振荡处理20-30min, 然后离心除去未反应的部分，得到Con A-PtNiCDs复合物；
（8）将（2）制备好的已修饰好电极，通过层层修饰与自组装的技术逐层修饰上选定的适配体与一定浓度的肿瘤细胞, 经过逐步清洗除去未反应的适配体与细胞；
（9）将（6）制备的溶液修饰到（8）已修饰的电极表面，反应20-30min后经过清洗除去未反应的标记复合物，在室温下干燥5-10 min。
本发明还包括以下步骤：
本发明所述的发光量子点为碳点。
本发明所述的化学发光分析仪为西安瑞迈IFFM-E型流动注射化学发光分析仪。
一种基于合金纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法，其特征包括，选定任意一种肿瘤细胞，筛选与之匹配的适配体，利用该芯片即可方便快速检测。
本发明的有益效果
1. 基于3D纸芯片制备的ECL传感器，体积小，携带方便，便于处理，相对于传统电机，极大的降低了成本；
2. 将表面修饰技术应用到修饰电极的制备当中，使得纳米增效的电致发光传感芯片具有可控性，提高了电极的灵敏度和准确性；
3. 本发明所得到的一种基于合金纳米材料修饰的细胞片传感器，可以实现样本中被测细胞的高特异性、高灵敏度、低成本、快速检测；
4. 本发明的检测肿瘤细胞电致发光纸芯片传感器特异性、灵敏度高；检测速度快，完成一个基本检测过程仅需3-5min的时间，可以在短时间内实现大量样品的高通量筛选；试剂用量少，检测一个样品只需要几十微升试剂；成本低，检测一个样品仅需几分钱；
5. 一种基于多金属纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法，操作速度简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并有很好的重复性，便于现场检测。
附图说明
下面结合附图和具体实施例子对本发明做进一步的详细描述。
附图1 为A4纸上蜡打印疏水图案。
附图2 为纸上印刷电极a: 工作电极，b: 参比电极，c: 对电极。
具体实施方式
实施案例1（SK-BR-3肿瘤细胞的检测）
一种基于多金属纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备折叠式纸芯片：先用蜡打印机在A4纸上打印如附图的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟, 使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极和Ag/AgCl参比电极（如附图2）；
（2）制备AuPd纳米粒子修饰纸电极
首先将15.0微升Au纳米种子滴加到纸电极的工作区域，然后在室温下反应1小时，清洗除去未结合的Au纳米后，将该电极放入到含有HAuCl4（10 mM） 和H2PdCl4 (20 mM) 的混合溶液中，然后再振荡的条件下迅速加入柠檬酸，最后得到的AuPd修饰纸电极清洗后置于室温下30 min后即可得；
（3）制备PtNi合金纳米材料
通过在电弧炉里精炼高纯度的Pt、Ni、Al金属，然后再氮气保护的环境下利用旋铸技术制备得到 PtNiAl 合金。然后通过去合金化处理将制得的PtNiAl 合金溶解在NaOH (1M)溶液里48h即可得到PtNi合金纳米材料；
（4）将制备的PtNi合金纳米材料冰水浴超声处理10-30 min, 得到分散性较好的合金材料溶液；
（5）将制备的碳点溶液离心处理5-10min，除去不发光的沉淀物质，得到分散性较好的碳点溶液；
（6）将（4）制备的PtNi合金材料溶液与（5）制备的碳点溶液混合超声，处理20-30min， 然后离心分离去除沉淀，得到分散性较好的PtNiCDs 复合材料溶液；
（7）将（6）制备好的PtNiCDs 复合材料溶液与伴刀豆球蛋白A（Con A）进行振荡处理20-30min, 然后离心除去未反应的部分，得到Con A-PtNiCDs复合物；
（8）将（2）制备好的已修饰好电极，通过层层修饰与自组装的技术逐层修饰上选定的适配体与一定浓度的SK-BR-3肿瘤细胞, 经过逐步清洗除去未反应的适配体与SK-BR-3细胞；
（9）将（6）制备的溶液修饰到（8）已修饰的电极表面，反应20-30min后经过清洗除去未反应的标记复合物，在室温下干燥5-10 min。检测SK-BR-3细胞电致发光传感器制作完毕；
将制得的检测SK-BR-3细胞的电致发光传感器配合与化学发光分析仪，对SK-BR-3细胞进行高灵敏度、快速的检测，SK-BR-3细胞的检测范围为500-2.0×107 cells mL-1。
实施案例2 （对MCF-7细胞的检测）
一种基于多金属纳米粒子修饰的电化学发光细胞传感纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备折叠式纸芯片：先用蜡打印机在A4纸上打印如附图的蜡图案，并将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟, 使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；采用丝网印刷电极的方法，在处理好的A4纸的未打印蜡的亲水区域印刷碳工作电极和Ag/AgCl参比电极（如附图2）；
（2）制备AuPd纳米粒子修饰纸电极
首先将15.0微升Au纳米种子滴加到纸电极的工作区域，然后在室温下反应1小时，清洗除去未结合的Au纳米后，将该电极放入到含有HAuCl4（10 mM） 和H2PdCl4 (20 mM) 的混合溶液中，然后再振荡的条件下迅速加入柠檬酸，最后得到的AuPd修饰纸电极清洗后置于室温下30 min后即可得；
（3）制备PtNi合金纳米材料
通过在电弧炉里精炼高纯度的Pt、Ni、Al金属，然后再氮气保护的环境下利用旋铸技术制备得到 PtNiAl 合金。然后通过去合金化处理将制得的PtNiAl 合金溶解在NaOH (1M)溶液里48h即可得到PtNi合金纳米材料；
（4）将制备的PtNi合金纳米材料冰水浴超声处理10-30 min, 得到分散性较好的合金材料溶液；
（5）将制备的碳点溶液离心处理5-10min，除去不发光的沉淀物质，得到分散性较好的碳点溶液；
（6）将（4）制备的PtNi合金材料溶液与（5）制备的碳点溶液混合超声，处理20-30min， 然后离心分离去除沉淀，得到分散性较好的PtNiCDs 复合材料溶液；
（7）将（6）制备好的PtNiCDs 复合材料溶液与伴刀豆球蛋白A（Con A）进行振荡处理20-30min, 然后离心除去未反应的部分，得到Con A-PtNiCDs复合物；
（8）将（2）制备好的已修饰好电极，通过层层修饰与自组装的技术逐层修饰上选定的适配体与一定浓度的MCF-7肿瘤细胞, 经过逐步清洗除去未反应的适配体与MCF-7细胞；
（9）将（6）制备的溶液修饰到（8）已修饰的电极表面，反应20-30min后经过清洗除去未反应的标记复合物，在室温下干燥5-10 min。检测MCF-7细胞电致发光传感器制作完毕；
将制得的检测MCF-7细胞的电致发光传感器配合与化学发光分析仪，对MCF-7细胞进行高灵敏度、快速的检测，MCF-7细胞的检测范围为480-2.1×107 cells mL-1。
Claims (7)
1.一种合金纳米粒子修饰的细胞传感纸芯片的制备，其特征包括以下步骤：
（1.1）制备用于修饰电极的AuPd纳米粒子，利用原位生长的方法，将其修饰到电极表面；
（1.2）选择能够特异性识别被检测细胞肿瘤细胞的适配体，通过自组装技术将其修饰到已经处理过的电极表面上；
（1.3）将已经过处理的被测细胞样品，利用自组装技术与（1.2）中的适配体进行特异性结合；
（1.4）制备具有高发光性能的量子点；
（1.5）制备能够增强电子传递，起到信号放大作用的多孔纳米材料PtNi合金；
（1.6）利用自组装表面修饰等技术，将（1.5）与（1.4）制备的材料符合，合成具有信号放大作用的ECL探针。
2.根据权利要求1所述的制备基于3D纸芯片ECL细胞传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
（2.1）在计算机上设计微流控纸芯片的疏水区域的打印图案，将纸裁剪成打印机适合的尺寸，然后置于喷墨打印机中，打印已经设计好的疏水区图案；
（2.2）将带有蜡图案的的A4纸放到平板加热器或烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟, 使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域；然后进行丝网印刷，分别将参比电极、工作电极和对电极分别印刷到相对应的区域；
（2.3）将制备AuPd纳米材料修饰工作电极；
（2.4）将制备的PtNi合金纳米材料冰水浴超声处理10-30 min, 得到分散性较好的合金材料溶液；
（2.5）将制备的碳点溶液离心处理5-10min，除去不发光的沉淀物质，得到分散性较好的碳点溶液；
（2.6）将（2.4）制备的PtNi合金材料溶液与（2.5）制备的碳点溶液混合超声，处理20-30min， 然后离心分离去除沉淀，得到分散性较好的PtNiCDs 复合材料溶液；
（2.7）将（2.6）制备好的PtNiCDs 复合材料溶液与伴刀豆球蛋白A（Con A）进行振荡处理20-30min, 然后离心除去未反应的部分，得到Con A-PtNiCDs复合物；
（2.8）将（2.3）制备好的已修洗逐步除去未反应的适配体与细胞；
（2.9）将（2.6）制备的溶液修饰好电极，通过层层修饰与自组装的技术逐层修饰上适配体与一定浓度的肿瘤细胞, 经过清饰到（2.8）已修饰的电极表面，反应20-30min后经过清洗除去未反应的标记复合物，配合电化学工作站和化学发光分析仪对肿瘤细胞进行检测。
3.根据权利要求1-2所述的一种基于合金纳米粒子修饰的细胞传感纸芯片，其特征是：所述的AuPd修饰纸电极的制作步骤为：首先将15.0微升Au纳米种子滴加到纸电极的工作区域，然后在室温下反应1小时，清洗除去未结合的Au纳米后，将该电极放入到含有HAuCl4（10 mM） 和H2PdCl4 (20 mM) 的混合溶液中，然后再振荡的条件下迅速加入柠檬酸，最后得到的AuPd修饰纸电极清洗后置于室温下30 min后即可得。
4.根据权利要求1-3所述的的一种基于合金纳米粒子修饰的细胞传感纸芯片，其特征是：所述的PtNi合金纳米材料的制作步骤为：通过在电弧炉里精炼高纯度的Pt、 Ni、Al金属，然后再氮气保护的环境下利用旋铸技术制备得到 PtNiAl 合金。
5.然后通过去合金化处理将制得的PtNiAl 合金溶解在1M NaOH溶液里48h即可得到PtNi合金纳米材料。
6.根据权利要求1-5中任一种基于合金纳米粒子修饰的细胞传感纸芯片，其特征是：所述的发光量子点为碳点。
7.根据权利要求1-6中任一种基于合金纳米粒子修饰的细胞传感纸芯片，其特征是：所述的化学发光分析仪为西安瑞迈IFFM-E型流动注射化学发光分析仪。
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