CN108645805A - 一种免标快速检测半胱氨酸的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免标快速检测半胱氨酸(Cys)的新方法，主要是基于3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺(TMB)在钴掺杂的碳纳米材料(Co‑CNMs)存在情况下加入半胱氨酸引起其紫外吸收值的变化进行检测。TMB通常需要在双氧水存在的情况下发生颜色变化，我们合成的Co‑CNMs具有优异的催化性，可直接催化TMB变蓝，用硫酸终止后颜色变成黄色，而半胱氨酸的加入可抑制Co‑CNMs的催化活性，从而引起TMB紫外吸收值的降低，其紫外值的降低与加入半胱氨酸的浓度呈线性相关。双氧水易分解，性质不稳定，该方法避免了双氧水的使用，可极大提高检测结果的准确性。本发明提供的方法非常简单、特异性强、稳定性好、检测速度快，能够满足现场快速、准确的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种免标快速检测半胱氨酸(Cys)的新方法，本发明属于检测技术领域。
技术背景
半胱氨酸是人体内一种重要的含巯基氨基酸。由于其所含的巯基具有很高的亲核性，半胱氨酸是生物体内进行生命过程的一个重要的活性物种，它能够调节生物体内蛋白质的活性并在细胞内抗氧化性防御体系中起到了至关重要的作用。生命体内半胱氨酸含量的高低可以为一些疾病的诊断提供科学的依据。例如，体内半胱氨酸含量的减小将会导致婴儿生长缓慢，肺功能障碍等；而较高的半胱氨酸含量则与一些癌症以及心血管疾病的产生密切相关。因此，半胱氨酸的检测一直以来就是人们研究的热点，亟需发展一种快速、简便、灵敏度高、选择性高的半胱氨酸的快速检测方法。传统检测手段通常采用大型的仪器设备，如高效液相色谱，这些仪器虽然检测精度高，但由于其操作复杂、测试繁琐、耗时等缺点阻碍了其更加广泛的使用，并且无法满足现场检测的需求。比色检测方法因其具有便捷、可视化等优势而受到广泛关注。然而，我们注意到目前对于半胱氨酸的比色检测方法的文献报道虽然较多(Talanta 2016，82，71-74.；Anal.Methods 2014,6,5647-5651.；Sensorsand Actuators B:Chemical 2015，212，526-535.；Analyst 2015,140,5251-5256.；Chem.Commun.2015,51,4635-4638.)，但是多是基于在双氧水存在的条件下进行。众所周知，双氧水易失效不易保存，通常需要现用现配，双氧水的使用不仅增加检测成本，对检测结果准确度也有一定的影响。基于此，我们致力于发展一种在不存在双氧水情况下实现无酶免标快速检测半胱胺酸的新方法。
发明内容
对目标物实现高灵敏、高精准、简单的快速检测方法是分析化学的一个重要发展方向。针对以上存在的问题，我们开发了一种无双氧水、免标、成本低的快速检测半胱氨酸的新方法。其操作过程简单，成本低，检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：
本发明提供了一种低成本无双氧水免标快速检测半胱氨酸(Cys)的新方法。本方法将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，钴掺杂的碳纳米材料(Co-CNMs)与Cys三者共同混合，在室温孵育2h，TMB的氧化被抑制，致使其紫外吸收值降低，降低程度与Cys浓度呈线性相关，通过肉眼观察和检测TMB紫外吸收响应即可实现对Cys的快速检测。
本发明具体包括以下步骤：
(1)在1.17μM TMB和17μg/mL钴掺杂的碳纳米材料的混合溶液中，分别加入0-50μM不同浓度的Cys溶液，反应2h后，加入2M硫酸终止反应，用紫外分光光度仪器检测TMB的紫外吸收光谱，该紫外-可见吸收光谱最大吸收峰位于450nm波长处；
(2)以TMB紫外响应为纵坐标，以Cys浓度为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程：y＝1.52521x-0.06043，相关系数r＝0.993，检测限为1.0μM。
优选的：所述钴掺杂的碳纳米材料制备方法为：将2-甲基咪唑溶于与六水合硝酸钴以4:1的摩尔比混合溶于200mL甲醇，室温保存24小时，用离心法收集紫色沉淀物，用乙醇清洗数次，真空干燥24小时得到ZIF-67颗粒，将ZIF-67颗粒分散在陶瓷杯中，加热至350度并保持1-2小时，然后把温度升高到700度保持3-4小时，高温分解的环境为氮气与氢气的混合气体，之后自然冷却至室温。
优选的：所述氮气和氢气的体积比为9:1。
发明所述的方法是一种快速检测半胱氨酸的新方法。相对于现有技术，本发明创造所述的Cys的检测方法具有以下优势：本发明利用Cys，TMB和Co-CNMs的共同作用，具有操作简单、无双氧水、免标记、方法简单和特异性强且成本低的优势，检测限为1.0μM。
附图说明
构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的检测Cys原理验证相关实验数据。
图2为本发明创造实施例所述的检测Cys传感体系pH优化数据。
图3为本发明创造实施例所述的优化TMB所用浓度的紫外吸收响应数据。
图4为本发明创造实施例所述的检测Cys的反应时间优化数据。
图5为本发明创造实施例所述的TMB紫外吸收响应随Cys浓度变化的紫外吸收曲线。
图6为本发明创造实施例所述的TMB在450nm处紫外吸收响应随Cys浓度变化的线性拟合曲线及方程。
图7为本发明创造实施例所述的检测半胱氨酸特异性干扰实验数据。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
以下3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，钴掺杂的碳纳米材料(Co-CNMs)与Cys三者反应的体系是300μL(包括TMB，钴掺杂的碳纳米材料和不同浓度的Cys)，下面给出的三者的浓度都是在300μL体系下的浓度。
实施例1
1.17μM TMB(a)；1.17μM TMB与30μM Cys混合后(b)；1.17μM TMB与17μg/mL Co-CNMs混合后(c)；1.17μM TMB,17μg/mL Co-CNMs与30μM Cys混合后(d)，利用紫外分光光度仪测TMB紫外吸收响应(如图1所示)。图1说明我们合成的Co-CNMs具有优异的催化性，可直接催化TMB变蓝，用硫酸终止后颜色变成黄色，而半胱氨酸的加入可抑制Co-CNMs的催化活性，从而引起TMB紫外吸收值的降低。
实施例2
1.17μM TMB与17.0μg/mL的Co-CNMs混合孵育，使用不同pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)的MES缓冲液，测定TMB的紫外吸收响应。以位于450nm波长处最大吸收峰为纵坐标，pH值为横坐标做点线图。在pH4.0时，传感体系吸收值最高，因此检测体系在pH4.0下进行。
实施例3
17μg/mL Co-CNMs与不同浓度的TMB(0.5，0.67，0.83，1.0，1.17，1.3mM)混合反应，测定TMB的紫外吸收响应。以位于450nm波长处最大吸收峰为纵坐标，不同浓度的TMB为横坐标做柱状图。当TMB浓度达到1.2mM时，传感体系的吸收响应出现最高值，之后不再随着TMB浓度的增加而变化，因此选用1.2mM为TMB在传感体系中的浓度。
实施例4
1.17μM TMB与17.0μg/mL的Co-CNMs混合孵育不同的时间(30，60，90，120，150，180min)，测定TMB的紫外吸收响应。以位于450nm波长处最大吸收峰为纵坐标，孵育时间为横坐标做点线图。传感体系的吸收响应随孵育时间延长而增加，当孵育时间达到120min时，传感体系的吸收响应出现最高值，之后不再随着孵育时间的增加而变化，因此选用120min为孵育时间。
实施例5
在最佳实验条件下(pH＝4.0，[TMB]＝1.2MM，t＝120min)，1.17μM TMB，17.0μg/mLCo-CNMs与不同浓度Cys(0-50μM)混合反应2h，测定TMB的紫外吸收曲线。
实施例6
在最佳实验条件下，1.17μM TMB，17.0μg/mL Co-CNMs与0-50μg/mL的Cys混合反应2h，以TMB在450nm波长处的紫外吸收强度为纵坐标，以不同浓度Cys为横坐标做图并对其进行线性拟合，获得线性方程如下：
y＝1.52521x-0.06043(R2＝0.98657) 式(1)
检测限为实际实验检测的最低浓度，1.0μM
实施例7
特异性实验，样品中不含有氨基酸(a)，样品中含有：丙氨酸(b),精氨酸(c),天冬氨酸(d),谷氨酰胺(e),谷氨酸(f),甘氨酸(g),组氨酸(h),异亮氨酸(i),亮氨酸(j),赖氨酸(k),蛋氨酸(I),苯丙氨酸(m),脯氨酸(n),丝氨酸(o),苏氨酸(p),色氨酸(q),酪氨酸(r),缬氨酸(s),半胱氨酸(t)等作为本实验检测的干扰物质，并研究该方法的特异性。干扰物质浓度均为500μM,分别与1.17μM TMB和17.0μg/mL Co-CNMs混合反应2h后，利用紫外分光光度仪测定检测体系中TMB的紫外吸收响应。以TMB在450nm波长处的紫外吸收强度为纵坐标，以各检测氨基酸为横坐标做柱状图，如图7所示，只有Cys(50μM)可以明显降低TMB的紫外强度，而其他干扰氨基酸存在的情况下，TMB的紫外吸收强度没有明显变化，表明该方法对Cys检测具有优异的特异性。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种免标快速检测半胱氨酸的新方法，其特征在于：将钴掺杂的碳纳米材料，TMB和Cys同时混合，通过检测TMB紫外吸收强度的变化，快速检测Cys。
2.根据权利要求1所述一种免标快速检测半胱氨酸的新方法，其特征在于，具体操作方法如下：
(1)在1.17μM TMB和17μg/mL钴掺杂的碳纳米材料的混合溶液中，分别加入0-50μM不同浓度的Cys溶液，反应2h后，加入2M硫酸终止反应，用紫外分光光度仪器检测TMB的紫外吸收光谱，该紫外-可见吸收光谱最大吸收峰位于450nm波长处；
(2)以TMB紫外响应为纵坐标，以Cys浓度为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程：y＝1.52521x-0.06043，相关系数r＝0.993，检测限为1.0μM。
3.权利要求1-2任一权利要求所述的一种免标快速检测半胱氨酸的新方法，其特征在于：所述钴掺杂的碳纳米材料制备方法为：将2-甲基咪唑溶于与六水合硝酸钴以4:1的摩尔比混合溶于200mL甲醇，室温保存24小时，用离心法收集紫色沉淀物，用乙醇清洗数次，真空干燥24小时得到ZIF-67颗粒，将ZIF-67颗粒分散在陶瓷杯中，加热至350度并保持1-2小时，然后把温度升高到700度保持3-4小时，高温分解的环境为氮气与氢气的混合气体，之后自然冷却至室温。
4.根据权利要求3所述的一种免标快速检测半胱氨酸的新方法，其特征在于：所述氮气和氢气的体积比为9:1。
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