CN104132936A - 一种稳定、新型的过氧化物酶测定用显色液 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学试剂领域。本发明的目的在于将比表面积大、稳定性好的新材料氧化石墨烯应用于传统显色液中，替代其中的过氧化氢，得到一种新型、稳定的过氧化物酶显色体系，并提供了其制备方法。该新型显色体系能解决传统显色液中过氧化氢不稳定，遇光照、金属离子易分解的问题。由于氧化石墨烯分散液本身性质稳定、比表面积大的优点，使得该新型显色液与传统显色体系相比具有稳定性好，对二抗需求少、成本低的优点。

Description

一种稳定、新型的过氧化物酶测定用显色液

技术领域：

本发明属于生物化学试剂领域，具体涉及一种过氧化物酶测定用显色液，及其制备方法。 

背景技术：

在多数检测中，过氧化物和显色的电子供体与样品中的分析物反应，此分析物可能是催化剂(如法医样品、血浆、尿液、血色素等)，或与催化剂相关的物质(酶标过氧化物酶)。如样品中含有此分析物，则发生氧化反应，并在几秒到几小时内发生可见的显色反应。过氧化活性检测也适用于规定在滤膜、细胞或组织切片、电泳凝胶、杂交斑点上分析物的定位分析。 

所谓过氧化物酶，通常来源于辣根，因此常被称辣根过氧化物酶，是临床和科研检验试剂中的常用酶。过氧化物酶作为多种试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的作用有重要影响。过氧化物酶显色液是免疫学、免疫组织化学、生物化学等检测以及研究领域常用的显色体系。目前在科研、乃至临床医学都有广泛的应用。 

过氧化物酶显色液的工作原理简单描述如下： 

过氧化物(常用的如过氧化氢)在过氧化物酶的作用下发生分解反应，并释放氧化态氧(O-)，O-与显色体系中的供氧体(一般为无色，常用的有TMB、DAB)发生氧化还原反应，生色物被氧化，氧化态的生色物产生特定的颜色。反应完成后，显色体系深浅可以直接指示反应体系中被检测物质的含量，从而实现定性或者定量的检测。然而，双氧水中的氧元素化合价是-1价，-1价的氧不是氧元素的稳定状态，即使无过氧化物酶的情况下，双氧水也会发生分解，从而降低过氧化活性检测的准确性。因此，寻求稳定性好的过氧化物意义重大。 

氧化石墨烯是近几年研究比较多的材料，一般由石墨经强酸氧化而得。经过氧化处理后，氧化石墨仍保持石墨的层状结构，但在每一层的石墨烯单片上引入了许多氧基功能团。这些氧基功能团的引入使得单一的石墨烯结构变得非常复杂。氧化石墨烯是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，因此，其结构跨越了一般化学和材料科学的典型尺度。氧化石墨烯可视为一种非传统型态的软性材料，具有聚合物、胶体、薄膜，以及两性分子的特性。氧化石墨烯长久以来被视为亲水性物质，因为其在水中具有优越的分散性，但是，相关实验结果显示，氧化石墨烯实际上具有两亲性，从石墨烯薄片边缘到中央呈现亲水至疏水的性质分布。因此，氧化石墨烯可如同界面活性剂一般存在界面，并降低界面间的能量。 

基于以上技术背景，发明人认为：氧化石墨烯具备巨大的比表面积、优异的水溶性，同时稳定性很好，可以作为一种新型的过氧化物，替代传统的过氧化氢。 

发明人为了实现上述问题进行了长时间的研究和验证，结果发现：是用氧化石墨烯的水溶液作为过氧化物，在很大的浓度范围内，都可以和显色的电子供体与样品中的分析物发生氧化反应，并在几秒到几小时内发生可见的显色反应。 

发明内容：

本发明的目的在于用比表面积大、稳定性好的氧化石墨烯替代传统显色液中的过氧化氢，以解决过氧化氢不稳定，遇光照、金属离子等易分解的问题，得到了一种稳定、新型的过氧化物酶显色液。 

本发明选用两种常见的显色液为研究对象，即DAB显色液(DAB-H₂O₂)和TMB显色液(TMB-H₂O₂)，以氧化石墨烯替代这两种显色液中的过氧化氢，得到新型DAB显色液(DAB-CO)和新型TMB显色液(TMB-CO)。 

所述DAB-CO显色液由DAB，Na₂HPO₄·12H₂O，柠檬酸和氧化石墨烯溶液组成，生色物质DAB，即3，3-四盐酸二氨基联苯胺，其浓度分别为0.2-0.6mg/ml，最好为0.4mg/ml，Na₂HPO₄·12H₂O浓度为15-20mg/ml，最好为18mg/ml，柠檬酸浓度为：4-5mg/ml，最好为4.5mg/ml。 

所述TMB-CO显色液由TMB，EDTA，甘油，柠檬酸和氧化石墨烯溶液组成，生色物质TMB即四甲基联苯胺，不易溶于水，使用时先将其溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，再用柠檬酸缓冲液配成储存液，TMB在显色液中的浓度为0.1-0.2mg/ml，最好为0.15mg/ml。EDTA为金属离子螯合剂，能作用缓冲液中的重金属离子，消除重金属离子对过氧化物催化作用的影响，EDTA在显色液中的浓度为0.1-0.3mg/ml，最好为0.2mg/ml。显色液中甘油的浓度最好为3-8％，最好为5％。柠檬酸作为显色液的缓冲物质，其浓度为0.7-1.2mg/ml，最好为0.9mg/ml。 

所述氧化石墨烯溶液由氧化石墨烯分散至蒸馏水中所得。首先使用氨基环氧加成反应制备超小尺寸氧化石墨烯(＜500nm)，试用该方法制备的石墨烯尺寸小，毒性小，便于修饰，再在蒸馏水中超声剥离石墨烯，得到氧化石墨烯分散液。氧化石墨烯的浓度为0.01-1.0mg/ml。本发明优势： 

本发明利用氧化石墨烯比表面积大，过氧化物酶负载量大，优异的水溶性和稳定好的优势，取代传统显色液中的过氧化氢，以克服过氧化氢不稳定，遇光照、金属离子易分解的问题，替代所得到的DAB-CO和TMB-CO显色液与过氧化物酶作用时间快，能持续发光几秒到几小时，且信号稳定。 

附图说明：

附图为显色体系中不同氧化石墨烯的浓度对显色性能的影响。 

具体实施方式：

下面通过具体实例，对本发明做进一步的说明。 

1、DAB-CO显色液：称取3.6g十二水磷酸氢二钠，0.92g柠檬酸，溶于100ml蒸馏水中，配成缓冲液，再称取80mg DAB溶解在缓冲液中，用柠檬酸或磷酸氢二钠调pH值至5.0，过滤后分装至离心管中，1ml/管，-20℃保存。使用前室温下溶解，以1∶1比例与氧化石墨烯分散液混合后使用。 

2、TMB-CO显色液：称取0.04g EDTA，0.19g柠檬酸，10ml甘油溶于70ml蒸馏水中，配成缓冲液，再取0.03g TMB溶于0.6ml DMSO中，待溶解后将其加至缓冲液中，定容至100ml，调pH值至5.0。过滤后分装至离心管中，1ml/管，-20℃保存。使用前室温下溶解，以1∶1比例与氧化石墨烯分散液混合后使用。 

3、氧化石墨烯制备：取40mg氧化石墨烯分散在100ml蒸馏水中，搅拌3h，然后在100W超声仪下超声3h，使氧化石墨片层剥落，获得棕色的分散液，4000r/min离心40min，移去沉淀，得到氧化石墨烯分散液。 

4、TBS-T缓冲溶液的制备：TRIS-HCl24.23g，NaCl80.06g，用蒸馏水定容至1000ml，加HCl调pH值至7.6，制成10×TBS-T储备液。取100ml储备液，边搅拌边加入1ml吐温-20，用蒸馏水稀释至1000ml即得TBS-T缓冲溶液。 

5、免疫组化检测：将含有过氧化氢溶液的DAB显色液(DAB-H₂O₂)和TMB显色液(TMB-H₂O₂)与含有氧化石墨烯的DAB显色液(DAB-CO)和TMB显色液(TMB-CO)进行比较。 

(1)比较不同氧化石墨烯浓度对显色性能的影响：配制不同浓度氧化石墨烯分散液，与上述DAB显色液、TMB显色液分别等比例混合后，加入到样品中，以双抗体夹心法ELISA为例，显色10min后，测OD₄₅₀见说明书附图。 

结果显示：随氧化石墨烯浓度的增加，两种显色液的显色性能均是呈先增加后减小趋势的，在0.2mg/ml左右达到最高值，氧化石墨烯浓度为0.075-1.0mg/ml范围内，OD₄₅₀均已达到0.4以上，信号强度好且稳定。而氧化石墨烯最佳浓度为0.2mg/ml左右。 

(2)以双抗体夹心法ELISA为例，使用TBS-T缓冲液按照1∶2000、1∶5000、1∶8000、1∶10000的比例稀释过氧化物酶标记的山羊抗小鼠(IgG)，显色10min后，测得OD₄₅₀值如下表所示： 

表1 

由表1可以看出：含有氧化石墨烯的显色液其显色效果要优于传统的含有过氧化氢的显色液，而且随二抗稀释比例的增加，其信号强度下降的也较慢(四种显色液的二抗稀释浓度1∶10000与1∶2000相比下降比例分别为80.36％、66.3％、51.6％和45.3％)，对于含有氧化石墨烯的显色液DAB-CO和TMB-CO来说，二抗稀释度达1∶10000时也能得到较好的信号强度，这与氧化石墨烯比表面积大，负载过氧化物酶能力强有关，因此用氧化石墨烯替代过氧化氢制得的新型显色液可以减少二抗的使用量，降低了成本。 

(3)试验结果表明：制备的新型显色液DAB-CO显色液和TMB-CO显色液在室温放置6个月以上没有出现浑浊、沉淀等现象，用上述方法测其显色性能几乎没有变化，说明该新型显色液稳定性好。 

Claims (5)

1.一种用于检测过氧化物酶的新型、稳定显色液，其特征为：是以传统DAB显色液和TMB显色液分别为研究对象而制备得到的新型显色体系DAB-CO显色液和TMB-CO显色液。 

2.根据权利要求1所述的DAB-CO显色液，其特征为：由DAB，Na₂HPO₄·12H₂O，柠檬酸和氧化石墨烯分散液组成，所述氧化石墨烯分散液，是使用氨基环氧加成反应制备的超小尺寸氧化石墨烯(＜500nm)，将其用超声的方法分散在蒸馏水中，在显色液中的浓度为0.01-1.0mg/ml；所述DAB，即3，3-四盐酸二氨基联苯胺，是该显色液的生色物质，在显色体系中的浓度为0.2-0.6mg/ml；所述Na2HPO₄·12H₂O，在显色体系中的浓度为15-20mg/ml；所述柠檬酸，在显色体系中的浓度为4-5mg/ml。 

3.根据权利要求1中所述TMB-CO显色液，其特征为：由TMB，EDTA，二甲基亚砜，甘油，柠檬酸和氧化石墨烯分散液组成，所述氧化石墨烯分散液同权利要求书2；所述二甲基亚砜为TMB的溶解剂，在显色体系中的含量0.4-0.8％；所述TMB，即四甲基联苯胺，为生色物质，在显色体系中的浓度为0.1-0.2mg/ml；所述EDTA，即乙二胺四乙酸二钠，为金属离子螯合剂，在显色体系中的浓度为0.1-0.3mg/ml；所述甘油，在显色体系中的浓度为3-8％；所述柠檬酸，在显色体系中的浓度为0.7-1.2mg/ml。 

4.根据权利要求2所述DAB-CO显色液制备方法如下：将氧化石墨烯溶解在蒸馏水中，超声3h(功率100W)，得到均一的氧化石墨烯分散液，作为A液；将柠檬酸和Na₂HPO₄·12H₂O溶于蒸馏水中制成缓冲液，再将DAB溶解在缓冲溶液中，作为B液，使用前将A、B液以1∶1比例混合。 

5.根据权利要求3所述TMB-CO显色液制备方法如下：将氧化石墨烯溶解在蒸馏水中，超声3h(功率100W)，得到均一的氧化石墨烯分散液，作为A液；将TMB溶解在DMSO中，再将其溶解在由EDTA，柠檬酸和甘油溶于蒸馏水中制成的缓冲液中，作为B液，使用前将A、B液以1∶1比例混合。