CN103472047B - 一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法，利用主客体荧光探针在水溶液介质条件下，通过荧光发射光谱法及可视法，能够高灵敏、高选择性地检测识别不同pH值条件下的赖氨酸或色氨酸或赖氨酸和色氨酸的混合物。
Description
技术领域
本发明一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法属分析化学及生命科学领域。
背景技术
氨基酸是构成生命体的基本物质，是细胞代谢的基础物质。氨基酸的快速识别对细胞代谢分析具有重要意义，因此氨基酸的选择性识别与检测引起了人们极大的兴趣。目前，对氨基酸进行识别的常用方法是高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和毛细管、电泳(CE)等各种色谱法。这些方法具有精确度高和检出限低的优点，但样品前处理时间长、成本高，很难适应快速检测，限制了它们的应用。近年来，由于荧光分析的高灵敏和高选择性，实时原位检测，设备简单，多种用于氨基酸鉴别的荧光分子传感器相继被报道，然而多数荧光分子传感器只能选择性的识别一些含巯基等特殊功能基团的氨基酸分子，而对其它氨基酸分子的高选择性识别检测则相对较少。尤其是不同pH值条件下关于氨基酸分子的检测尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于发明一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法。本发明的目的通过下列技术措施完成:
本发明一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法是在水溶液中，以七元瓜环简称Q[7]与吖啶盐酸盐形成的1:1超分子自组装结构的荧光探针P，在水溶液中荧光探针P与色氨酸或赖氨酸分子反应后利用色氨酸或赖氨酸分子与七元瓜环Q[7]更容易形成超分子自组装结构，从而释放吖啶分子作为荧光信号分子对色氨酸或赖氨酸分子进行定性定量检测，Q[7]与吖啶盐酸盐1:1形成的超分子自组装结构简称荧光探针P的化学结构式如下:
荧光探针P与色氨酸或赖氨酸分子作用后的激发波长245nm,在pH＜4.0情况下的最大发射波长470nm,在4.0＜pH＜5.5情况下的最大发射波长450nm,在6.0＜pH≤7.2情况下的最大发射波长430nm。检测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的最低浓度至10-7mol·L-1，其它共存氨基酸分子都不干扰色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的测定。
上述定性检测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的方法是在一定浓度范围内的纯荧光探针水溶液中，当激发波长为245nm时，荧光探针的最大发射波长是480nm,当荧光探针水溶液中存在色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物时，在pH＜4.0情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至470nm表现为浅绿色荧光，在4.0＜pH＜5.5情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至450nm表现为蓝绿色荧光,在6.0＜pH≤7.2情况下的最大发射波长从480nm蓝移至430nm表现为蓝色荧光，色氨酸或赖氨酸分子的检测限最低至10-7mol·L-1。
上述定量分析方法为(1)荧光探针P溶液的配制方法，分别称取14毫克七元瓜环及吖啶盐酸盐2.5毫克用水溶解，配制成10.0mL，浓度为1.0×10-3mol·L-1，根据需要用蒸馏水逐级稀释到1.00×10-4mol·L-1的浓度;(2)色氨酸或赖氨酸及其它共存氨基酸分子的标准溶液：称取优级纯氨基酸配制成100mL溶液，氨基酸浓度为1.00×10-3mol·L-1，根据需要用蒸馏水逐级稀释到适宜的浓度;(3)取5个10.0mL容量瓶中分别加入荧光探针1.00×10-4mol·L-1标准液1.0mL，分别加入1.00×10-4mol·L-1,0,0.2,0.5,1,2毫升的色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物溶液，调节pH并稀释至刻度摇匀，室温放置5分钟;(4)引入荧光光谱进行测定，激发波长245nm;(5)以色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到工作曲线;(6)样品测定，取10.0mL容量瓶，加入探针浓度为1.00×10-4mol·L-11.0mL，加入被测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物溶液，稀释至刻度，室温放置5分钟，引入3.0cm的石英比色皿进行荧光测定，根据荧光强度在工作曲线上查出样品浓度。
本发明定量检测不同pH值下色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的方法，还可用标准加入法测定。
本发明的应用是以Q[7]与吖啶盐酸盐形成的1:1的主客体化合物为荧光探针,在不同pH值环境中色氨酸或赖氨酸分子或色氨酸和赖氨酸分子混合物测定中的应用。比如众所周知的癌细胞的pH值明显小于正常细胞的pH值。所以，构建具有不同pH值下氨基酸的荧光检测方法，实现正常细胞pH值环境下或癌细胞偏酸性环境下氨基酸含量的测定并通过不同的荧光信号显示显得尤为重要。
发明效果：利用七元瓜环与吖啶盐酸盐相互作用形成1:1主客体包结作为荧光探针体系，在水溶液介质条件下，利用目标氨基酸分子与七元瓜环更容易形成主客体包结从而释放吖啶分子作为荧光信号分子的超分子竞争作用原理，实现不同pH值条件下色氨酸或赖氨酸分子的荧光分光光度检测。该发明具有操作方法简便，灵敏度高、选择性能优越，浓度线性范围较宽，检测限低等特点。尤其是不同pH值条件下色氨酸或赖氨酸分子检测识别信号的不同荧光变化:pH＜4.0，荧光探针与氨酸或赖氨酸分子作用后荧光检测信号为最大发射波长470nm，4.0＜pH＜5.5，荧光探针与氨酸或赖氨酸分子作用后荧光检测信号为最大发射波长450nm，6.0＜pH≤7.2荧光探针与氨酸或赖氨酸分子作用后荧光检测信号为最大发射波长430nm。本发明一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法的检测限最低至10-7mol·L-1，校正线性范围1×10-5~2.5×10-4mol/L，pH值范围1.0-7.2。在分析化学及生命临床医学等方面有着广泛的应用前景和使用价值。
附图说明
图1a)主体分子七元瓜环的化学结构式；b)吖啶盐酸盐分子的化学结构式；c)七元瓜环与吖啶盐酸盐形成的荧光探针P的组装结构式；d)荧光探针识别赖氨酸或色氨酸的分子机理。
图2浓度为1.00×10-5mol·L-1荧光探针P的水溶液，加入2.00×10-5mol·L-1色氨酸分子以后在不同pH情况下的荧光光谱变化。激发波长为245nm。
图3365nm紫外灯照射下浓度为1.00×10-5mol·L-1荧光探针P中加入2.00×10-5mol·L-1色氨酸分子后溶液的颜色变化。
图4浓度为1.00×10-5mol·L-1荧光探针P的磷酸盐缓冲液中(pH=7.2)加入1.00×10-5mol·L-1不同氨基酸分子后的荧光光谱变化图。
具体实施方式
实施例一：荧光探针P的合成方法:
分别称取七元瓜环28mg（0.02mmol），吖啶盐酸盐4.4mg（0.02mmol），加入到50ml蒸馏水中，在80～95℃搅拌反应2h。冷却至室温后旋转蒸发除去水溶剂。丙酮沉淀、抽滤、干燥。制备得到白色固体30mg，产率94%。
缓冲溶液的配制:醋酸－醋酸钠缓冲液(pH4.6)取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6，再加水稀释至100ml，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.2)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200ml，摇匀，即得。pH2.0直接用0.1mol/L的稀盐酸加蒸馏水直接稀释配制。
实施例二：荧光探针P对氨基酸分子的识别检测
（1）荧光探针P溶液的配制方法：称取16.2mg的荧光探针固体，用不同pH缓冲液溶解，配制成10mL溶液，浓度为1.00×10-3mol·L-1，根据需要用不同pH缓冲液逐级稀释到适宜的浓度。
（2）氨基酸分子的标准溶液：称取优级纯氨基酸分子配制成100mL溶液，氨基酸分子浓度为1.00×10-3mol·L-1，根据需要用用不同pH缓冲液逐级稀释到适宜的浓度；
在10.0mL容量瓶中加入荧光探针P不同pH缓冲液(1.00×10-4mol·L-1，1.0mL)，色氨酸或赖氨酸分子(2.00×10-4mol·L-1，1.0mL)。用不同pH缓冲液稀释至刻度，摇匀，在室温放置5分钟，移入3cm的石英比色皿进行相应pH值下荧光光谱测定。荧光光谱测定的激发波长为245nm。
所用试剂为分析纯试剂，试验用水为二次蒸馏水。
所用荧光分光光度计型号为CaryEclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司制造。
在水介质溶液中，荧光探针P具有较强的荧光发射，激发波长为245nm，发射波长为480nm，在365nm紫外灯下观察到绿色荧光。加入色氨酸或赖氨酸溶液后。以色氨酸为例，在pH＜4.0情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至470nm表现为浅绿色荧光，在4.0＜pH＜5.5情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至450nm表现为蓝绿色荧光,在6.0＜pH≤7.2情况下的最大发射波长从480nm蓝移至430nm表现为蓝色荧光（如图2和图3）。表明荧光探针P对色氨酸和赖氨酸具有不同pH值下的荧光识别检测性能。
实施例三：
分别称取14毫克七元瓜环及吖啶盐酸盐2.5毫克用pH=7.2的缓冲溶液溶解，配制成10.0mL，浓度为1.0×10-3mol·L-1，根据需要用缓冲液逐级稀释到1.00×10-4mol·L-1的浓度;(2)色氨酸或赖氨酸及其它共存氨基酸分子的标准溶液：称取优级纯氨基酸分子配制成100mLpH=7.2的缓冲溶液，氨基酸分子浓度为1.00×10-3mol·L-1，根据需要用缓冲溶液逐级稀释到适宜的浓;(3)取5个10.0mL容量瓶中分别加入荧光探针1.00×10-4mol·L-1标准液1.0mL，分别加入1.00×10-4mol·L-1,0,0.2,0.5,1,2毫升的色氨酸或赖氨酸溶液稀释至刻度摇匀，室温放置5分钟;(4)引入荧光光谱进行测定，激发波长245nm;(5)以色氨酸或赖氨酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到工作曲线;(6)样品测定，取10.0mL容量瓶，加入探针浓度为1.00×10-4mol·L-11.0mL，加入被测色氨酸或赖氨酸溶液，稀释至刻度，室温放置5分钟，引入3cm的石英比色皿进行荧光测定，根据荧光强度在工作曲线上查出样品浓度。
在水溶液中，测定色氨酸或赖氨酸浓度变化与荧光探针的荧光发射的校准曲线。通过校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到线性范围和检出限列于表1。
Claims (5)
1.一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法,其特征是在水溶液中，以七元瓜环cucurbit[7]uril简称Q[7]与吖啶盐酸盐形成的1:1超分子自组装结构的荧光探针P，在水溶液中荧光探针P与色氨酸或赖氨酸分子反应后利用色氨酸或赖氨酸分子与七元瓜环Q[7]更容易形成超分子自组装结构，从而释放吖啶分子作为荧光信号分子对色氨酸或赖氨酸分子进行定性定量检测，Q[7]与吖啶盐酸盐1:1形成的超分子自组装结构简称荧光探针P的化学结构式如下:
荧光探针P与色氨酸或赖氨酸分子作用后的激发波长245nm,在pH＜4.0情况下的最大发射波长470nm,在4.0＜pH＜5.5情况下的最大发射波长450nm,在6.0＜pH≤7.2情况下的最大发射波长430nm，
检测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的最低浓度至10-7mol·L-1，共存氨基酸分子异亮氨酸，酪氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，丝氨酸，缬氨酸，甘氨酸，亮氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，组氨酸，谷氨酸都不干扰色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的测定。
2.根据权利要求1所述一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法，其特征是定性检测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物的方法是在一定浓度范围内的纯荧光探针水溶液中，当激发波长为245nm时，荧光探针的最大发射波长是480nm,当荧光探针水溶液中存在色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物时，在pH＜4.0情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至470nm表现为浅绿色荧光，在4.0＜pH＜5.5情况下,荧光探针的最大发射波长从480nm蓝移至450nm表现为蓝绿色荧光,在6.0＜pH≤7.2情况下的最大发射波长从480nm蓝移至430nm表现为蓝色荧光，色氨酸或赖氨酸分子的检测限最低至10-7mol·L-1。
3.根据权利要求1所述一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法，其特征是定量分析方法为(1)荧光探针P溶液的配制方法，分别称取14毫克七元瓜环及吖啶盐酸盐2.5毫克用水溶解，配制成10.0mL，浓度为1.0×10-3mol·L-1，根据需要用蒸馏水逐级稀释到1.00×10-4mol·L-1的浓度;(2)色氨酸或赖氨酸及共存氨基酸分子异亮氨酸，酪氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，丝氨酸，缬氨酸，甘氨酸，亮氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，组氨酸，谷氨酸的标准溶液：称取优级纯氨基酸配制成100mL溶液，氨基酸浓度为1.00×10-3mol·L-1，根据需要用蒸馏水逐级稀释到适宜的浓度;(3)取5个10.0mL容量瓶中分别加入荧光探针1.00×10-4mol·L-1标准液1.0mL，分别加入1.00×10-4mol·L-1,0,0.2,0.5,1,2毫升的色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物溶液，调节pH并稀释至刻度摇匀，室温放置5分钟;(4)引入荧光光谱进行测定，激发波长245nm;(5)以色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到工作曲线;(6)样品测定，取10.0mL容量瓶，加入探针浓度为1.00×10-4mol·L-11.0mL，加入被测色氨酸或赖氨酸或色氨酸和赖氨酸分子混合物溶液，稀释至刻度，室温放置5分钟，引入3.0cm的石英比色皿进行荧光测定，根据荧光强度在工作曲线上查出样品浓度。
4.根据权利要求3所述一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法，其特征是定量检测不同pH值下色氨酸或赖氨酸分子或色氨酸和赖氨酸分子混合物的方法，还可用标准加入法测定。
5.根据权利要求1所述一种不同pH值下氨基酸的荧光检测方法的应用，其特征是以Q[7]与吖啶盐酸盐形成的1:1的主客体化合物为荧光探针,在不同pH值环境中色氨酸或赖氨酸分子或色氨酸和赖氨酸分子混合物测定中的应用。
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