CN102183495A - 一种半胱氨酸的荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种半胱氨酸的荧光检测方法。汞离子特异性DNA(存在7个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配)在没有汞离子存在时呈无规卷曲状态，加入汞离子后由于形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配合物使汞离子特异性DNA呈发夹结构，加入荧光染料Sybr Green I，由于Sybr Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料，荧光强度很高。加入待测氨基酸，当检测到半胱氨酸时，半胱氨酸能与汞离子形成更加稳定的配合物，从而提取出T-Hg2+-T配合物中的汞离子，发夹结构解螺旋，荧光强度下降，而其它氨基酸不会引起荧光强度的改变。本发明不仅具有高度的灵敏度，很好的特异性，而且简单，快速，整个过程能在5分钟内完成。

Description

一种半胱氨酸的荧光检测方法
技术领域
本发明涉及半胱氨酸的检测领域，特别涉及一种半胱氨酸的荧光检测方法。
背景技术
半胱氨酸属于蛋白质氨基酸，是生物体内非常重要的巯基类物质，它在生物体内参与细胞的还原过程，具有调节肝脏内磷脂的代谢和保护肝脏细胞免受毒物损害等生理功能。生物体内半胱氨酸含量的变化或代谢失调均会导致一些疾病的发生，通过测定生物体内半胱氨酸含量，可实现某些代谢疾病的诊断，因此实现半胱氨酸快速、灵敏的检测具有十分重要的意义。已报道的半胱氨酸测定方法较多，主要有分光光度法(O.Rusin，N.N.S.Luce，；R.A.Agbaria，J.O.Escobedo，S.Jiang，I.M.Warner，F.B.Dawan，K.Lian and R.M.Strongin，J.Am.Chem.Soc.，2004，126，438.W.Wang，O.Rusin，X.Xu，K.K.Kim，J.O.Escobedo，S.O.Fakayode，K.A.Fletcher，M.Lowry，C.M.Schowalter，C.M.Lawrence，F.R.Fronczek，I.M.Warner and R.M.Strongin，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，15949.)、电化学法(J.M.Zen，A.S.Kumar and J.C.Chen，Anal.Chem.2001，73，1169.M.Zhou，J.Ding，L.Guo and Q.K.Shang，Anal.Chem.，2007，79，5328.J.C.Ndamanisha，J.Bai，B.Qi and L.P.Guo，Anal.Biochem.，2009，386，79.)、分离技术比如高压液相色谱和毛细管电泳(C.Lu，Y.Zu and V.W.W.Yam，J.Chromatogr.A，2007，1163，328.Y.V.Tcherkas and A.D.Denisenko，J.Chromator.A，2001，913，309.M.J.Nozal，J.L.Bernal，L.Toribio，P.Marinero，O.Moral，L.Manzanas and E.Rodriguez，J.Chromatogr.A，1997，778，347.)和比色法(F.X.Zhang，L.Han，L.B.Israel，J.G.Daras，M.M.Maye，N.K.Ly and C.J.Zhong，Analyst，2002，127，462.L.Li and B.Li，Analyst，2009，134，1361.P.K.Sudeep，S.T.S.Joseph and K.G.Thomas，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，6516.)。但这些方法大多灵敏度或选择性不好，或者需要复杂的实验步骤。因而难以满足实际检测的需要。
目前基于靶向响应DNA结构转换的高灵敏度高选择性低成本生物传感器越来越受到研究者的关注。当检测到目标分子，DNA的结构会发生改变。核酸适配体(aptamer)是一类通过指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技术体外筛选出来的对靶分子具有高度亲和力的一类DNA或RNA分子。理论上，对于特定的目标分子，总能找到一种或多种与之特异性结合的aptamer，因此大大拓宽了应用领域，被认为是生物传感器最理想的识别元件之一。汞离子特异性DNA(MSD，存在7个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配)在没有汞离子存在时呈无规卷曲状态，加入汞离子后由于形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配合物使汞离子特异性DNA呈发夹结构，荧光染料Sybr Green I能够识别这种结构变化因为它与MSD和MSD/Hg2+复合物的相互作用不同。
众所周知半胱氨酸能与汞离子形成非常稳定的络合物(G.Berthon，Pure&App.Chem.，1995，67，1117.)。用这个特征，Mirkin等(J.S.Lee，P.A.Ulmann，M.S.Han and C.A.Mirkin，Nano Lett.，2008，8，529.)发展了一种比色检测半胱氨酸的高灵敏度高选择性方法，但这种方法需要升温，操作繁琐。我们最近(H.Xu，M.Hepel，Anal.Chem.，2011，inpress。)发展了一 种荧光“开”的分子灯标探针检测半胱氨酸，这种方法也是基于Hg2+被半胱氨酸和T-T错配的竞争配位，灵敏度和选择性都很高，但它不仅需要对分子灯标进行双重荧光标记而且也需要对溶液进行加热，所以这种方法不仅成本高而且也较复杂。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术的缺陷，提供一种高灵敏度和特异性，操作简单的半胱氨酸荧光检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
(1)在缓冲溶液中将汞离子特异性DNA与汞离子反应，
(2)加入荧光染料，测定荧光强度，
(3)加入待测氨基酸，测定荧光强度。
其中，上述荧光染料可为任何现有能通过荧光方法指示单双链结构变化的物质。本发明优选Sybr Green I。Sybr Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。
本发明所用的缓冲溶液较佳的是10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.0-7.50，使用其可以控制适当的pH，且不与汞离子产生沉淀。
本发明中所说的汞离子特异性DNA存在7个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配，序列为5’-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’。当体系中存在汞离子时，能够形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶配合物使DNA呈发夹结构。其浓度可为10-100nM，优选为10nM，50nM或100nM。
本发明所说的汞离子浓度为汞离子特异性DNA浓度的7倍.以便使所有的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配形成胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶配合物。
本发明中所说的汞离子特异性DNA和汞离子混合反应时间为2分钟，加入荧光染料反应2分钟后进行荧光测试。加入待测氨基酸混合均匀后立即进行荧光测试。
所述的荧光染料Sybr Green I的浓度要使得汞离子特异性DNA-Hg2+-Sybr Green I体系的荧光强度与汞离子特异性DNA-Sybr Green I体系的荧光强度之差最大。
所述的待测氨基酸，包括从蛋白质水解产物中分离出来的常见20种氨基酸，色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明只需三步即可完成，大大简化了操作步骤。一般工作者只需通过简单训练即可完成，无需专业工作人员进行操作。
2、本发明5分钟之内即可完成检测。大大节约了检测时间。
3、本发明无需对DNA进行标记，节约了检测成本。
4、本发明具有高度的灵敏度和特异性，检测限可达到3.34nM；除半胱氨酸外，其余19种 氨基酸都不会对检测造成干扰。
附图说明
图1为本发明的半胱氨酸荧光检测方法示意图。
图2为根据本发明的方法测定的有无半胱氨酸时的荧光光谱。其中[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，[Sybr Green I]＝1.225×10-7M，[半胱氨酸]＝140nM。
图3为本发明中最佳Sybr Green I浓度选择图。图3a为汞离子特异性DNA-Sybr GreenI体系的荧光光谱。图3b为汞离子特异性DNA-Hg2+-Sybr Green I体系的荧光光谱。图3c为汞离子特异性DNA-Hg2+-Sybr Green I荧光强度与汞离子特异性DNA-Sybr Green I荧光强度比值与SG浓度的关系曲线。
图4为根据本发明的方法测定的不同半胱氨酸浓度的荧光光谱(图4a)和荧光强度的变化(图4b)。其中[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，[Sybr Green I]＝1.225×10-7M。图4a中半胱氨酸浓度从上到下依次为：0，7，21，28，35，42，49，56，70，84，98，112，126，140，160，200nM。图4b插图为半胱氨酸的线性动力学范围，其中误差线为三次测定的标准偏差。
图5为根据本发明的方法测定的不同氨基酸的荧光强度。其中[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，[Sybr Green I]＝1.225×10-7M，[氨基酸]＝140nM，Bnk：空白样品，Cys：半胱氨酸，Ile：异亮氨酸，Ser：丝氨酸，Lys：赖氨酸，Thr：苏氨酸，Trp：色氨酸，His：组氨酸，Glu：谷氨酸，Gly：甘氨酸，Pro：脯氨酸，Tyr：酪氨酸，Leu：亮氨酸，Ala：丙氨酸，Val：缬氨酸，Met：蛋氨酸，Gln：谷氨酰胺，Asp：天冬氨酸，Asn：天冬酰胺，Phe：苯丙氨酸，Arg：精氨酸。图6为根据本发明的方法在不同DNA浓度和汞离子浓度下测定不同浓度半胱氨酸时的荧光强度和线性动力学范围(图6a和6b插图)。
具体实施方式
下面根据附图，给出本发明优选的实施例，并予以详细的描述，使能更好地理解本发明的功能、特点。
实验仪器
所用仪器为荧光分光光度计(LS-55，美国Perkins Elmer仪器有限公司)。仪器条件为：脉冲式氙灯激发，激发波长为495nm，荧光光谱的扫描范围500-650nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，用宽度10mm石英比色皿进行测量，样品体积2mL；室温。
本发明各实施例中所用原料中的荧光染料Sybr Green I的结构式如下，购于Invitrogen公司，母液浓度为10,000×。
Figure BSA00000431196800031
作为本发明实施例中试验用材料汞离子特异性DNA序列如下，由Takara公司合成并经HPLC纯化。
5’-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’
各种氨基酸购自Sigma公司。分析纯的硝酸汞购自国药化学试剂有限公司。
实施例1
向比色皿中加入2mL buffer(10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.50)，加入2μL Hg2+(70μM)和汞离子特异性DNA10μL(2μM)，混合均匀反应2分钟，加入5μL Sybr Green I(25×)，混合均匀，2分钟后进行荧光测试。在此基础上加入半胱氨酸4μL(70μM)，混合均匀，立即进行荧光测试。此时各物质最终浓度为：[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，[Sybr Green I]＝1.225×10-7M，[半胱氨酸]＝140nM。
半胱氨酸加入前后的荧光光谱图如图2所示，其中，a为半胱氨酸加入前的荧光光谱，最大发射波长处的荧光强度为116.7，b为半胱氨酸加入后的荧光光谱，最大发射波长处的荧光强度为15。因此本发明能够定量检测半胱氨酸。
Sybr Green I的浓度的选择：
向比色皿1中加入2mL buffer(10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.50)，加入汞离子特异性DNA10μL(2μM)，混合均匀反应2分钟，然后向其中逐渐加入Sybr Green I，每次加入SG混匀后反应两分钟，进行荧光测试。荧光谱图如图3a。此时各物质最终浓度为：[MSD]＝10nM，Sybr Green I由下往上依次为：2.45×10-8M，1.225×10-7M，2.45×10-7M，3.675×10-7M，6.125×10-7M。
向比色皿2中加入2mL buffer(10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.50)，加入2μL Hg2+(70μM)和汞离子特异性DNA10μL(2μM)，混合均匀反应2分钟，然后向其中逐渐加入Sybr Green I，每次加入SG混匀后反应两分钟，进行荧光测试。荧光谱图如图3b。此时各物质最终浓度为：[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，Sybr Green I由下往上依次为：2.45×10-8M，1.225×10-7M，2.45×10-7M，3.675×10-7M，6.125×10-7M。
分别以荧光发射波长最大处的荧光强度对Sybr Green I浓度作图得到图3c中正方形所标识的线(MSD-Sybr Green I)和三角形所标识的线(MSD-Hg2+-Sybr Green I)，圆形所标识的线为MSD-Hg2+-Sybr Green I荧光强度与MSD-Sybr Green I荧光强度比值与SG浓度的关系曲线，最高比值出现在Sybr Green I浓度为1.225×10-7M时，比值为21.8。因此当[MSD]＝10nM，[Hg2+]＝70nM，选择Sybr Green I浓度为1.225×10-7M，此时汞离子特异性DNA-Hg2+-SybrGreen I体系的荧光强度与汞离子特异性DNA-Sybr Green I体系的荧光强度之差最大。
实施例2
向比色皿中加入2mL buffer(10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.50)，加入2μL Hg2+(70μM)和汞离子特异性DNA10μL(2μM)，混合均匀反应2分钟，加入5μL Sybr Green I(25×)，混合均匀，2分钟后进行荧光测试。在此基础上加入不同浓度的半胱氨酸，混合均匀，立即进行荧光测试。结果如图4所示，说明本发明能够定量检测不同浓度的半胱氨酸，半胱氨酸浓度在7-84nM与荧光强度成正比。
实施例3
将半胱氨酸换成其它氨基酸重复实施例1步骤，结果如图5所示。说明本发明不受其它氨基酸的干扰，具有很好的选择性。
实施例4
将汞离子特异性DNA浓度换成50nM，汞离子浓度为350nM，Sybr Green I浓度为6.125×10-7M重复实施例2步骤，结果如图6a所示，半胱氨酸的浓度在50-250nM范围内与荧光强度成正比。
实施例5
将汞离子特异性DNA浓度换成100nM，汞离子浓度为700nM，Sybr Green I浓度为1.225×10-6M重复实施例2步骤，结果如图6b所示，半胱氨酸的浓度在50-1000nM范围内与荧光强度成正比。
以上所述的，是根据本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所做的简单、等效变化，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的技术内容为本领域技术人员的公知常识。
Figure IWB00000007350200011

Claims (12)

1.一种半胱氨酸的荧光检测方法，其包括下列步骤：
(1)在缓冲溶液中将汞离子特异性DNA与汞离子反应，
(2)加入荧光染料，测定荧光强度，
(3)加入待测氨基酸，测定荧光强度。
2.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于荧光染料为能通过荧光方法指示单双链结构变化的物质。
3.如权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于所述荧光染料优选为Sybr Green I。
4.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于反应体系为10mM MOPS，含0.1M NaNO3，pH 7.0-7.50。
5.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于汞离子特异性DNA存在7个胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配，序列为5’-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’。
6.如权利要求1或5所述的荧光检测方法，其特征在于汞离子特异性DNA浓度为10nM-100nM。
7.如权利要求1或6所述的荧光检测方法，其特征在于汞离子特异性DNA浓度优选为10nM，50nM或100nM。
8.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于汞离子浓度为汞离子特异性DNA浓度的7倍。
9.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在所述汞离子特异性DNA和汞离子混合反应时间为2分钟，加入荧光染料反应2分钟后进行荧光测试。
10.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于加入待测氨基酸混合均匀后立即进行荧光测试。
11.如权利要求1或3所述的荧光检测方法，其特征在于所述的荧光染料Sybr Green I的浓度要使得汞离子特异性DNA-Hg2+-Sybr Green I体系的荧光强度与汞离子特异性DNA-Sybr Green I体系的荧光强度之差最大。
12.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于待测氨基酸包括色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。
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