CN113533274A - 一种维生素c的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种维生素C的检测方法，属于维生素C检测技术领域。一种维生素C的检测方法，包括以下步骤：S1、向待测液中加入汞离子溶液进行反应，之后加入DNA序列P1和P2、N‑甲基卟啉二丙酸及KCl的缓冲液继续反应得到待测体系；其中P1和P2序列为能够与Hg2+形成错配的双螺旋DNA结构的序列，P1序列为能够形成G‑四链体结构的序列；S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在615nm处的荧光发射峰；S3、根据所述荧光发射峰结合维生素C的浓度与荧光发射峰的线性方程获取维生素C的浓度。本发明提出的检测方法灵敏度高且准确率高。
Description
技术领域
本发明涉及维生素C检测技术领域，具体涉及一种维生素C的检测方法。
背景技术
维生素C(Vitamin C)是一种多羟基化合物，该物质可从第2及第3位的烯醇式羟基上解离出氢离子，具有酸的性质，故又称抗坏血酸，其中L-构型的维生素C可促进食物蛋白质中的胱氨酸还原为半胱氨酸，进而合成抗体；还可以将人体难以吸收的三价铁还原为易于吸收的二价铁，促进铁元素的吸收，从而用于贫血症的治疗，因此对于维持人体健康具有重要作用。人体自身无法合成维生素C，只能通过体外摄取。婴幼儿所需的维生素C主要从婴幼儿奶粉中补充，奶粉中维生素C含量的不足会引起幼年期的坏血症，并引发一系列其他病症，从而影响身体的正常发育。因此研究婴幼儿奶粉中的维生素C含量，对保证奶粉的营养质量十分重要。
维生素C的检测一般有液相色谱法、电化学法、碘量法、紫外分光光度法等。色谱法的优势在于分析结果可靠，准确度较高，是目前维生素C含量商业化测定的常用方法，已作为2013版《英国药典》中规定的标准测定法。电化学、碘量法分别通过电信号的变化和碘的强氧化性，来实现不同量级的测定。但现有的检测方法存在灵敏度低且检测的准确率不高的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种维生素C的检测方法，解决现有技术中灵敏度低且检测的准确率不高的技术问题。
汞离子具有氧化性，可与维生素C发生氧化还原反应，汞离子自身被还原为零价汞单质。利用该性质，我们设计了一种高灵敏度的维生素C浓度测定方法。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种维生素C的检测方法。
一种维生素C的检测方法，包括以下步骤：
S1、向待测液中加入汞离子溶液进行反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸及KCl的缓冲液继续反应得到待测体系；其中P1和P2序列为能够与Hg2+形成错配的双螺旋DNA结构的序列，P1序列为能够形成G-四链体结构的序列；
S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在615nm处的荧光发射峰；
S3、根据所述荧光发射峰结合维生素C的浓度与荧光发射峰的线性方程获取维生素C的浓度。
进一步地，在步骤S3中，所述线性方程为Y＝74.06+80.38X，其中，X表示维生素C的浓度，Y表示荧光发射峰，所述线性方程由以下步骤得到：
将不同已知浓度的维生素C溶液和汞离子溶液反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸、KCl的缓冲液继续反应得到混合物，检测所述混合物的荧光发射光谱并记录615nm处的荧光发射峰，根据维生素C的浓度与对应的荧光发射峰的关系建立所述线性方程。
进一步地，在步骤S1中，DNA序列P1为5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’，DNA序列P2为5’-TCCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’。
进一步地，在步骤S1中，所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上。
进一步地，在步骤S1中，所述待测液由以下步骤制得：向奶粉中加入三氯乙酸进行反应使得蛋白质发生变性，之后取上清液即为所述待测液。
进一步地，在步骤S1中，所述加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸、KCl的缓冲液继续反应得到待测体系具体包括：
加入P1、P2以及汞离子溶液混匀并孵育2-2.5小时，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液，继续孵育30-45分钟得到所述待测体系。
进一步地，所述不同已知浓度的维生素C溶液的浓度为0.2-3.5μM。
进一步地，所述不同已知浓度的维生素C溶液的浓度分别为0.2μM，0.8μM，1.5μM，2.5μM，3μM，3.5μM。
进一步地，在步骤S1中，所述KCl的缓冲液为KCl的PBS缓冲液。
进一步地，所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上由以下步骤得到：
向不同浓度的汞离子溶液中加入P1和P2充分混匀并孵育，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液继续孵育得到多个实验组体系，检测多个实验组体系的荧光发射光谱，并记录615nm处的发射峰，随着汞离子浓度的递增，615nm处的发射峰的强度逐渐降低，汞离子浓度为6μM时发射峰的强度达到最低值，进而得到所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：向待测液中加入汞离子溶液进行反应，我们序列P1，用于形成G-四链体结构；待测液在不存在维生素C的情况下，P1、P2可以与汞离子通过T-Hg(Ⅱ)-T错配结构，形成双螺旋DNA结构。此时P1被覆盖，无法形成G-四链体，加入N-甲基卟啉二丙酸(NMM)荧光无变化；待测液存在维生素C的情况下，维生素C可与汞离子发生氧化还原反应，导致汞离子被还原为零价汞单质，汞单质无法参与形成T-Hg(Ⅱ)-T结构，则P1和P2不能形成双链结构，游离的P1链可自发形成G-四链体，并结合NMM产生强烈的荧光发射，615nm处的荧光发射强度与维生素C的浓度在一定范围内成正比根据线性方程，检测出待测液在615nm处的荧光发射强度可检测出维生素C的浓度，该检测方法灵敏度高且准确率高。
附图说明
图1是本发明维生素C的检测方法的机理示意图；
图2是本发明实施例1汞离子浓度的优化曲线图；
图3是本发明实施例1不同浓度维生素C-汞离子溶液存在下的DNA体系荧光恢复效果；图3a表示G-四链体/NMM荧光发射光谱随DNA体系中维生素C浓度增加的变化；图3b为峰值变化随维生素C浓度的滴定曲线。
图4是本发明实施例1DNA体系荧光变化随维生素C-汞离子溶液变化的线性关系曲线。
图5是本发明实施例1G-四链体/NMM体系荧光变化值对不同物质的响应结果。
具体实施方式
结合图1，本发明的方法原理为：首先，我们设计了一条含有多聚鸟嘌呤(Poly-G)的单链寡核苷酸序列P1(5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’)，用于形成G-四链体结构；和一条多聚胸腺嘧啶(Poly-T)核酸单链P2(5’-TCCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’)。在不存在维生素C的情况下，P1、P2可以通过T-Hg(Ⅱ)-T错配结构，形成双螺旋DNA结构。此时P1被覆盖，无法形成G-四链体，加入NMM体系荧光无变化；维生素C存在的情况下，维生素C可与汞离子发生氧化还原反应，导致汞离子被还原为零价汞单质，汞单质无法参与形成T-Hg(Ⅱ)-T结构，则P1和P2不能形成双链结构，游离的P1链可自发形成G-四链体，并结合NMM产生强烈的荧光发射。荧光发射强度与维生素C的浓度在一定范围内成正比。
基于上述原理，本具体实施方式提供了一种维生素C的检测方法，包括以下步骤：
S1、向待测液中加入汞离子溶液进行反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸及KCl的PBS缓冲液继续反应得到待测体系；其中P1和P2序列为能够与Hg2+形成错配的双螺旋DNA结构的序列，P1序列为能够形成G-四链体结构的序列；DNA序列P1为5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’，DNA序列P2为5’-TCCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’；所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上；所述待测液由以下步骤制得：向奶粉中加入三氯乙酸进行反应使得蛋白质发生变性，之后取上清液即为所述待测液；
在某些实施例中，加入P1、P2以及汞离子溶液混匀并孵育2-2.5小时，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液，继续孵育30-45分钟得到所述待测体系；
进一步地，所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上由以下步骤得到：
向不同浓度的汞离子溶液中加入P1和P2充分混匀并孵育，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液继续孵育得到多个实验组体系，检测多个实验组体系的荧光发射光谱，并记录615nm处的发射峰，随着汞离子浓度的递增，615nm处的发射峰的强度逐渐降低，汞离子浓度为6μM时发射峰的强度达到最低值，进而得到所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上；
S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在615nm处的荧光发射峰；
S3、根据所述荧光发射峰结合维生素C的浓度与荧光发射峰的线性方程获取维生素C的浓度；所述线性方程为Y＝74.06+80.38X，其中，X表示维生素C的浓度，Y表示荧光发射峰，所述线性方程由以下步骤得到：
将不同已知浓度的维生素C溶液和汞离子溶液反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸、KCl的缓冲液继续反应得到混合物，检测所述混合物的荧光发射光谱并记录615nm处的荧光发射峰，根据维生素C的浓度与对应的荧光发射峰的关系建立所述线性方程；所述不同已知浓度的维生素C溶液的浓度为0.2-3.5μM，进一步为0.2μM，0.8μM，1.5μM，2.5μM，3μM，3.5μM。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例包含以下内容：汞离子浓度优化；方法的灵敏度和线性检测范围；方法的选择性；对维生素C加标的奶粉样品中的维生素C含量进行回收率分析。
(1)汞离子浓度优化
汞离子的浓度与G-四链体/NMM荧光的猝灭效果有关，因此合适的汞离子浓度可有效降低本方法的背景噪声，提高灵敏度。我们设置了8组不同汞离子浓度的实验组，在每组缓冲体系中分别加入500nM P1 DNA、500nM P2 DNA以及不同浓度的汞离子，充分混匀于室温下孵育2小时后加入3μM NMM、15mM KCl的20mM PBS缓冲液，继续于室温避光环境下孵育30分钟，取200μL混合均匀的反应液于光径4mm的微量比色皿中，用F-7000荧光分光光度计测量体系在550-700nm的荧光发射光谱，并记录615nm处的发射峰。
结果如图2所示，随着体系中加入的汞离子浓度由0μM增加到7μM时，G-四链体/NMM的荧光发射强度从500降低到约200，并在汞离子浓度为6μM时达到最低值，此后荧光不再变化。该结果表明体系所需汞离子浓度优选为6μM以上，后续试验中采用6μM。
(2)方法的灵敏度和线性检测范围
首先，先让不同浓度的维生素C(维生素C浓度梯度为0μM，0.01μM，0.05μM，0.1μM，0.2μM，0.3μM，0.4μM，0.5μM，0.6μM，0.7μM，0.8μM，0.9μM，1μM，1.5μM，2μM，2.5μM，3μM，3.5μM，4μM，4.5μM，5μM)和6μM的Hg2+反应，然后再向该反应体系中加入含500nM DNA(P1和P2)、3μMNMM、15mM KCl的20mM PBS缓冲液(pH 7.0)，并于室温条件下避光反应30分钟后测量体系荧光光谱并记录615nm处的荧光发射峰。
荧光变化如图3所示，图3a表示G-四链体/NMM荧光发射光谱随DNA体系中维生素C浓度增加的变化，可看到615nm处的发射峰逐步升高；(b)图为峰值变化(F-F0)随维生素C浓度的滴定曲线(F和F0分别表示存在和不存在维生素C时的荧光发射强度)。随着维生素C浓度的增加，荧光变化相应升高并在维生素C浓度约为4.5μM时达到最大值，此后不再有明显变化。图4显示了在维生素C浓度为0.2-3.5μM范围内，该荧光变化具有明显的线性关系，因此，不同已知浓度的维生素C溶液的浓度优选为0.2-3.5μM范围内的浓度。通过拟合得到该范围内的线性方程为Y＝74.06+80.38X(R2＝0.98)，其中Y和X分别表示信号变化(F-F0)和维生素C的浓度。基于公式3α/斜率计算维生素C的检测限为33.9nM，其中α为11组维生素C浓度为0时空白样品的荧光强度标准偏差值。
(3)方法的选择性；
我们以奶粉中存在的主要营养成分以及部分金属元素为目标干扰物质，对体系进行荧光测量。具体干扰物为乳糖、葡萄糖、蔗糖、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+。具体结果如图5所示，维生素C的浓度为3μM，其他干扰物质的浓度为15μM，但经过相同的孵育过程后，维生素C的荧光变化远高于其他对照组，对照组的荧光变化值仅相当于大约维生素C的1/4，该结果表明其他物质未与汞离子发生化学或络合反应。其中四种金属离子与三种糖类分子均有少量的荧光恢复，我们猜测金属离子Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+对照组荧光恢复的原因是这些金属离子参与了G-四链体的稳定，使少量G-四链体得以与NMM结合导致荧光升高；葡萄糖和乳糖荧光恢复的原因可能是二者都属于还原糖，本身具有一定的还原性，能促进少量汞离子的还原，蔗糖导致荧光恢复的原因可能是蔗糖本身对汞离子的少量吸附。但上述干扰物质对体系荧光的恢复作用极其有限，对该方法的选择性未产生较大影响。
(4)维生素C加标的奶粉样品中维生素C含量的回收率分析；
我们建立了该方法的加标回收率实验：准确称量不同质量的维生素C粉末并配置成溶液，在市售不含维生素C的奶粉样品中加入上述维生素C溶液，经过处理后测量体系荧光变化，并通过标准方程计算回收率。具体处理方法为：首先，在50mL不同离心管中分别加入1g奶粉、7mL超纯水和不同量的维生素C，配置成含低、中、高浓度(0.5μM、1.8μM、3.0μM)维生素C的奶粉溶液。然后，加入1mL三氯乙酸(2M)，超声震荡10分钟，使蛋白质变性，再10000rpm离心15分钟，除去蛋白质，取上清液。再用0.22μm过滤器过滤后低温避光保存备用。最后，用我们的方法来检测维生素C浓度。
根据表1结果可知，该方法在奶粉的维生素C加标实验中具有较好的回收率，三种浓度的加标样品综合回收率在96％-111％之间，且与实际添加值相差不大，说明检测准确率高。考虑到维生素C自身在光、热环境中的不稳定性，基于此实验的回收率结果存在一定程度但可接受的误差，同时表明该方法具有奶粉中维生素C含量检测的实际应用潜力。
表1维生素C的回收率分析
另外将本申请提出的维生素C的检测方法与现有技术中的几种检测方法进行比较，见表2，可以看出本申请提出的维生素C的检测方法的线性范围和检测限都明显优于其他几种方法。
表2检测维生素C的不同方法的比较
| 方法 | 线性范围 | 检出限 | 参考文献 |
| 基于Ce-BDC氧化物酶 | 1.0-30μM | 320nM | 1 |
| 基于无花果蛋白酶 | 1.0-80μM | 430nM | 2 |
| 基于Au@Pt纳米粒子 | 10-100μM | 8770nM | 3 |
| 高效液相色谱法 | 113.5-567.7μM | 11300nM | 4 |
| 本申请 | 0.2-3.5μM | 33.9nM |
相关参考文献如下：
1、基于Ce-BDC的氧化物酶活性检测果汁中抗坏血酸的比色方法研究，分析测试学报，40(5)，678-683。
2、基于无花果蛋白酶快速检测维生素C含量的方法研究，食品科学技术学报，网络首发(还没有出，卷、期、页码)。https://kns.cnki.net/kcms/detail/10.1151.TS.20200930.0910.004.html
3、基于Au@Pt纳米粒子-双亲性气凝胶的模拟酶可视化检测抗坏血酸，分析化学，49(6)，982-991。
4、高效液相色谱法测定沾化冬枣中维生素C含量方法的优化，齐鲁工业大学学报，34(5)，37-42。
其他有益效果：
本方法成功开发了一种简单、高效和准确的新型检测方法，用于奶粉中维生素C含量的快速测定，并表现出良好的实际应用潜力，同时为维生素C检测的新方法开发提供了思路。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种维生素C的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向待测液中加入汞离子溶液进行反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸及KCl的缓冲液继续反应得到待测体系；其中P1和P2序列为能够与Hg2+形成错配的双螺旋DNA结构的序列，P1序列为能够形成G-四链体结构的序列；
S2、检测所述待测体系的荧光发射光谱并获取在615nm处的荧光发射峰；
S3、根据所述荧光发射峰结合维生素C的浓度与荧光发射峰的线性方程获取维生素C的浓度。
2.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，所述线性方程为Y＝74.06+80.38X，其中，X表示维生素C的浓度，Y表示荧光发射峰，所述线性方程由以下步骤得到：
将不同已知浓度的维生素C溶液和汞离子溶液反应，之后加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸、KCl的缓冲液继续反应得到混合物，检测所述混合物的荧光发射光谱并记录615nm处的荧光发射峰，根据维生素C的浓度与对应的荧光发射峰的关系建立所述线性方程。
3.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，DNA序列P1为5’-AGGGTTTTGGGTTTTGGGTTTTGGGA-3’，DNA序列P2为5’-TCCCTTTTCCCTTTTCCCTTTTCCCT-3’。
4.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上。
5.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述待测液由以下步骤制得：向奶粉中加入三氯乙酸进行反应使得蛋白质发生变性，之后取上清液即为所述待测液。
6.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述加入DNA序列P1和P2、N-甲基卟啉二丙酸、KCl的缓冲液继续反应得到待测体系具体包括：
加入P1、P2以及汞离子溶液混匀并孵育2-2.5小时，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液，继续孵育30-45分钟得到所述待测体系。
7.根据权利要求2所述的维生素C的检测方法，其特征在于，所述不同已知浓度的维生素C溶液的浓度为0.2-3.5μM。
8.根据权利要求7所述的维生素C的检测方法，其特征在于，所述不同已知浓度的维生素C溶液的浓度分别为0.2μM，0.8μM，1.5μM，2.5μM，3μM，3.5μM。
9.根据权利要求1所述的维生素C的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述KCl的缓冲液为KCl的PBS缓冲液。
10.根据权利要求4所述的维生素C的检测方法，所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上由以下步骤得到：
向不同浓度的汞离子溶液中加入P1和P2充分混匀并孵育，之后加入N-甲基卟啉二丙酸和KCl的缓冲液继续孵育得到多个实验组体系，检测多个实验组体系的荧光发射光谱，并记录615nm处的发射峰，随着汞离子浓度的递增，615nm处的发射峰的强度逐渐降低，汞离子浓度为6μM时发射峰的强度达到最低值，进而得到所述汞离子溶液中汞离子的浓度为6μM以上。
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