CN105651746A - 基于硫黄素t染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法，向所制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针加入缓冲溶液，往反应液加入不同浓度的碘离子溶液进行反应，测量混合液的荧光值，建立方程可用于未知待测液中的碘离子溶度的检测。本发明改变了目前常用的检测碘离子的检测模式，首次采用无标记荧光探针技术检测碘离子，以克服现有检测方法中存在的灵敏度不高、复杂的操作步骤、昂贵的大型仪器、难以实现在线快速检测等缺陷，具有检测响应快、灵敏度高、选择性好等优点，是适宜有效实用的检测方法，可应用于实际样品中碘离子的测定。

Description

基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法
技术领域
本发明属于阴离子检测技术领域，具体涉及一种基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法和应用。
背景技术
阴离子的识别和检测在生物传感、化学分析和环境检测等领域都具有重要作用。在众多阴离子中，碘离子因其重要的生物医学意义受到广泛的关注。碘是人体必不可少的微量元素之一，它对人体正常生长、神经发育和甲状腺功能起着至关重要的作用。然而,异常的碘离子浓度水平通常是与疾病有关的，碘缺乏或碘过量都会导致诸如甲状腺肿大、甲状腺功能减退和甲状腺机能亢进等疾病，影响人的身体健康[Li,Y.J.,Tseng,Y.T.,Unnikrishnan,B.,Huang,C.C.,2013.ACSAppliedMaterialsInterfaces5,9161–9166]。因此，碘离子的定量检测具有非常重要的实际意义。
目前，常用的碘离子分析方法有毛细管电泳、色谱法、电化学方法和原子光谱法等，但是这些方法成本比较高、耗时长、样品制备过程复杂、需要比较昂贵的仪器，这些都限制了这些检测方法在实际中的应用。因此，开发低成本，简单快速，高灵敏性，高选择性的检测新方法一直是碘离子定量检测的重要研究内容。荧光检测方法由于其灵敏性和操作简便性而备受研究者青睐。传统的荧光分析方法中使用的荧光探针设计到荧光基团的标记及修饰，这个过程不仅增加了成本，还使用有机染料和有机溶剂，因此这些已报道的方法不全是绿色化学的分析方法。相比较而言，能够实现低成本环境友好的无标记荧光探针的设计及应用将具有更大的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法，以克服现有检测碘离子的方法中成本高、操作复杂及需要昂贵的大型仪器、难以实现在线快速检测，不利于大规模推广的缺陷。
本发明提出一种基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针用以检测碘离子的方法，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针与碘离子发生作用，破坏DNA序列的发夹结构，使荧光减弱，实现对碘离子的定量检测。本发明方法包括：合成基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针，加入碘离子标准溶液或样品溶液进行反应，采用荧光分析法实现对碘离子的定量检测。
本发明方法包括以下步骤：
(1)向所制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针加入缓冲溶液，稳定一段时间；
(2)在步骤(1)得到的反应液中加入不同浓度的碘离子溶液进行反应，稳定一段时间，测量混合液的荧光值，建立方程检测待测液中的碘离子溶度，所述反应温度为10～38℃，反应时间为1～10分钟。
其中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。所述缓冲溶液的pH值为6～8。
其中，步骤(1)中，“稳定一段时间”是指反应液混合孵育1～10分钟。
其中，步骤(2)中，“稳定一段时间”是指反应液混合孵育1～10分钟。
其中，步骤(2)中，“不同浓度的碘离子溶液”是指不同浓度的碘化钾溶液，浓度分别为0,0.5，1，2，4，6，8，10，12μM。
本发明方法中，优选地，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针是硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针。
其中，所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针是以硫黄素T染料、DNA序列、汞离子为反应物，通过如下制备方法得到的：首先取终浓度为0.1～10μM的硫黄素染料溶液、终浓度为0.2～20μM的合成的特定序列的DNA和终浓度为1.5～150μM的汞离子溶液，制备得到所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针，再加入5～20mM的缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液、醋酸钠-醋酸缓冲溶液、Tris缓冲溶液)，混合并稳定1～10分钟；优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲溶液浓度为5～20mM；所述缓冲溶液的pH值为6～8。。
其中，所述“DNA序列”、所述“特定序列的DNA”包括符合以下要求的任何DNA：序列中富含胸腺嘧啶(T碱基)；当体系不存在汞离子时，DNA序列不能折叠成发夹结构；当体系中存在汞离子，胸腺嘧啶与汞离子之间存在“T-Hg2+-T”强作用力，DNA序列能折叠成发夹结构。
在一具体实施方案中，所述DNA序列为：5’-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3’；见[Wang,Y.X.,Geng,F.H.,Cheng,Q.L.,Xu,H.Y.,Xu,M.T.,2011.Analyst136,4284–4288]。
本发明方法中，步骤(1)中，为向所制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液中加入待测溶液进行反应。其中，待测溶液浓度，即碘离子浓度为0～1.2×10-5M，反应温度为10～38℃，反应时间为1～10分钟，所用缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，反应浓度，即磷酸盐缓冲溶液浓度为5～20mM；所述缓冲溶液的pH值为6～8，优选地，当所用的缓冲液pH＝7时，能够提高检测的灵敏度及缩短检测时间。
其中，所述步骤(2)，利用荧光光谱仪扫描混合溶液的荧光发射光谱，以荧光强度变化值为纵坐标，碘离子的浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到一元一次方程；取待检液，加入等体积的检测液，混合溶液反应后，扫描混合溶液的荧光发射光谱获取荧光强度变化值，代入所述一元一次方程，得到碘离子的浓度。
本发明方法中，步骤(2)中，通过荧光分析法实现对碘离子的检测。所制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液在490nm处荧光强度高，当存在碘离子时，490nm处荧光强度降低。碘离子含量越多，490nm处荧光强度变化值越大。
本发明还提出了基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针，其与碘离子发生作用，破坏DNA序列的发夹结构，使荧光减弱。优选地，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针为硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针。
本发明还提出了基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针的制备方法，采用“一锅法-混合”制得，所述“一锅法-混合”包括以下步骤：以硫黄素T染料、所述DNA序列、汞离子为反应物，首先取一定浓度的硫黄素染料溶液、合成的特定序列的DNA、和汞离子溶液，制备得到所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针，再加入一定浓度的缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲溶液)，混合并稳定一段时间。
具体地，所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针的制备方法，采用“一锅法-混合”制得，所述“一锅法-混合”包括以下步骤：以硫黄素T染料、DNA序列、汞离子为反应物，采用“一锅法-混合”方法，加入终浓度为0.1～10μM的硫黄素染料溶液、终浓度为0.2～20μM的合成的DNA溶液和终浓度为1.5～150μM的汞离子溶液，振荡1～10分钟，然后稳定1～10分钟，得到所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液。
本发明还提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针，所述试剂盒用于检测碘离子。
本发明还提出了一种试剂盒，其包括试剂1：浓度为1～100μM的硫黄素染料溶液；试剂2：浓度为2～200μM的合成的DNA溶液；试剂3：浓度为15～1500μM的汞离子溶液；试剂4：浓度为5～20mM的磷酸盐缓冲溶液；试剂5：纯水；其中，所述试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂5的体积比为1:1:1:5:1。
即，假设试剂盒的终体积为100μl，所述试剂盒包括试剂1：10μl浓度为1～100μM的硫黄素染料溶液；试剂2：10μl浓度为2～200μM的合成的DNA溶液；试剂3：10μl浓度为15～1500μM的汞离子溶液；试剂4：50μl浓度为5～20mM的磷酸盐缓冲溶液；试剂5：10μl纯水，其中，所述试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂5的体积比为1:1:1:5:1。
本发明进一步提出了一种测定系统，所述系统包括如上所述的检测试剂盒、多功能酶标仪、透明微孔板、荧光光谱仪、比色皿，所述系统用于检测碘离子。
本发明进一步提出了如上所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针在检测碘离子中的应用。
本发明进一步提出了如上所述的检测试剂盒在检测碘离子中的应用。
本发明进一步提出了如上所述的测定系统在检测碘离子中的应用。
进一步地，本发明应用于所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法中使用的仪器包括：
多功能酶标仪SynergyMx(BioTek,USA)、384孔透明微孔板。
进一步地，所述检测仪器还可以使用其他的荧光仪器包括：荧光光谱仪(例如日立F-7000)、比色皿。
本发明还提出了基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针在检测碘离子中的应用。
本发明的整个反应体系可控制在微升级别，体积为20～100微升。优选地，实验方案为：取10微升待测溶液加到90微升所制备的无标记荧光探针溶液中，孵育1～10分钟。缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，反应浓度为5～20mM。通过荧光分析法进行检测。
本发明的基本原理为：使用一段DNA序列，该DNA序列在汞离子存在下会折叠形成发夹结构，硫黄素染料会嵌在发夹结构上造成荧光增强。当溶液加入碘离子，碘离子与汞离子之间存在着强作用力，造成发夹结构被破坏，荧光减弱，因此可以将其发展成为一种能够检测碘离子的无标记荧光探针，实现了碘离子的高灵敏度快速检测。本发明的检测原理图可参见图1。
与现有技术相比，本发明优点包括如下：本发明改变了目前常用的检测碘离子的检测模式，首次采用无标记荧光技术检测，简单快速，成本低，无需复杂的操作过程及昂贵的大型仪器。本发明的检测方法特异性高，选择性好，实用性强，能够有效避免实际样品中可能共存物质的干扰。本发明测定碘离子的浓度范围0～1.2×10-5M，线性范围0～6×10-6M(线性方程：Y＝-0.11572X+0.9798,R2＝0.9902)。检测灵敏度高，检出限可达到0.16μM。本发明的检测响应快速。直接采用硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液对碘离子进行检测，整个检测过程不超过10分钟。
附图说明
图1是本发明的检测原理示意图。
图2是本发明对检测缓冲液的最适pH条件优化的实验结果。
图3是本发明的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液加入不同浓度碘离子的荧光光谱图。
图4是本发明硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液在490nm处荧光强度随碘离子浓度变化的关系图及线性区间工作曲线。
图5是本发明检测碘离子的其他干扰离子的对比结果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。本发明中的室温是指进行实施操作的实验室温度25℃±5℃。
荧光分析法检测。实验使用的仪器是：多功能酶标仪SynergyMx(BioTek,USA)，扫描波长范围：460～700nm，使用384孔透明微孔板，取100μl反应液进行测定。除此之外，本方法也适用于其他的荧光光谱仪测试。
本发明中，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针溶液的制备，包括具体步骤如下：8μl的100μM的DNA溶液、40μl的150μM的汞离子溶液和40μl的10μM的硫黄素T溶液和312μl的超纯水，振荡1分钟，稳定1分钟，得到的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液，备用。可用于下一步的检测，每次取40μl。
本发明首先对碘离子检测的实验条件进行优化，其中确定检测所需的磷酸盐缓冲液体系最佳pH条件非常重要。选定磷酸盐缓冲液终浓度为10mM,选择不同pH值的缓冲溶液进行检测，结果见图2。如图2(A)所示，硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液的荧光强度在加入碘离子前后都随缓冲液pH值的改变而改变，而只有当硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液在加入碘离子前后其490nm处荧光强度变化值(F0/F)达到最大时，才能发挥最好的检测效果，得到的差值结果见图2(B)，从图2(B)可见可响应的缓冲溶液pH值范围为6～8，最佳值为7。
以前述优化好的最优检测条件对碘离子进行检测，完成本次发明。
检测步骤：室温下，取40μl已制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液与50μl的PBS缓冲溶液(pH＝7,20mM)混合，然后加入10μl待测溶液，同时以不加碘离子的溶液为一组，加入可能存在的干扰离子的若干组为对照，其中干扰例子的浓度是碘离子浓度的十倍，上述溶液振荡1分钟，稳定1分钟，然后通过荧光分析法进行检测。
待测溶液选取碘离子浓度为0～12μM间的溶液9组，进行实验。
其检测结果如下所示：
如图3所示:所制备的硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液响应不同浓度的碘离子作用后所对应的荧光发射光谱。荧光强度变化值随着碘离子浓度变化的工作曲线如图4(A)所示，线性区间如工作曲线图4(B)所示，其中，工作曲线采用在490nm处荧光强度变化值进行表征。
具体检测结果如下表所示(9组)：
依照上表的检测结果，比较碘离子浓度与490nm处荧光强度变化值的对应关系，在0～6μM的浓度区间内可以拟合得到一个线性方程：Y＝-0.11572X+0.9798,R2＝0.9902，基于空白样品三倍标准偏差，得到的碘离子的最低检测浓度为0.16μM。
图5所示为实施例检测碘离子的干扰离子的对比结果，通过使用十倍浓度于碘离子的其他阴离子作为干扰离子，图5(A)表明只有碘离子能淬灭硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液的荧光，其他干扰离子无显著影响，图5(B)表明当体系同时存在碘离子和其他干扰离子时，干扰离子并不影响碘离子对硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针的猝灭。所以，该体系对碘离子检测具有高度的特异性。
测定实际样中的碘离子含量。配制人工尿样[Brooks,T.,Keevil,C.W.,1997.LettersinAppliedMicrobiology24,203-206]，加入不同浓度的碘离子溶液，用硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针体系进行加标回收试验。通过将测定的荧光强度带入标准曲线，从而计算出测得的碘离子浓度。人工尿样的检测数据如表1所示：
表1人工尿样中碘离子的测定结果
a三次测定取平均值
综上结果，可见碘离子能够与硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液发生特异性结合，造成荧光淬灭。随着碘离子浓度的变化，可以借助荧光分析法实现对样品中碘离子的检测，检出限为0.16μM，线性范围0～6×10-6M，线性相关系数0.9902。本发明实用性强，可用于人工尿样中碘离子的检测，说明其能够有效避免实际样品中可能共存物质对碘离子检测的干扰。
综上所述仅为发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明保护范畴。

Claims (13)

1.基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针检测碘离子的方法，其特征在于，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针与碘离子发生作用，破坏DNA序列的发夹结构，使荧光减弱，实现对碘离子的定量检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)向所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针加入缓冲溶液；
(2)在步骤(1)得到的反应液中加入碘离子溶液进行反应，测量混合液的荧光值，建立方程检测待测液中的碘离子溶度，所述反应温度为10～38℃，反应时间为1～10分钟。
3.如权利要求1～2任一项所述的方法，其特征在于，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针是硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针。
4.如权利要求1～2任一项所述的方法，其特征在于，所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针是通过如下方法得到的：以硫黄素T染料、DNA序列、汞离子为反应物，采用“一锅法-混合”方法，加入终浓度为0.1～10μM的硫黄素染料溶液、终浓度为0.2～20μM的合成的DNA溶液和终浓度为1.5～150μM的汞离子溶液，振荡1～10分钟，然后稳定1～10分钟，得到所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲溶液浓度为5～20mM。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为6～8。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)，利用荧光光谱仪扫描混合溶液的荧光发射光谱，以荧光强度变化值为纵坐标，碘离子的浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到一元一次方程；取待检液，加入等体积的检测液，混合溶液反应后，扫描混合溶液的荧光发射光谱获取荧光强度变化值，代入所述一元一次方程，得到碘离子的浓度，其中，所述方法在490nm处测定。
8.一种基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针，其特征在于，所述基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针是硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针，用于检测碘离子。
9.如权利要求8所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针的制备方法，其特征在于，采用“一锅法-混合”制得，所述“一锅法-混合”包括以下步骤：以硫黄素T染料、DNA序列、汞离子为反应物，采用“一锅法-混合”方法，加入终浓度为0.1～10μM的硫黄素染料溶液、终浓度为0.2～20μM的合成的DNA溶液和终浓度为1.5～150μM的汞离子溶液，振荡1～10分钟，然后稳定1～10分钟，得到所述硫黄素T/DNA/Hg2+无标记荧光探针溶液。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求8所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针，所述试剂盒用于检测碘离子。
11.一种试剂盒，其特征在于，其包括试剂1：浓度为1～100μM的硫黄素染料溶液；试剂2：浓度为2～200μM的合成的DNA溶液；试剂3：浓度为15～1500μM的汞离子溶液；试剂4：浓度为5～20mM的磷酸盐缓冲溶液；试剂5：纯水；其中，所述试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂5的体积比为1:1:1:5:1。
12.一种测定系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求10所述的检测试剂盒、多功能酶标仪、透明微孔板、荧光光谱仪、比色皿，所述系统用于检测碘离子。
13.如权利要求8所述的基于硫黄素T染料设计的无标记荧光探针、如权利要求10-11之任一项所述的检测试剂盒，或如权利要求12所述的测定系统在检测碘离子中的应用。
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