CN107091834B

CN107091834B - 一种基于发卡错配循环放大技术检测dna的方法

Info

Publication number: CN107091834B
Application number: CN201710371636.0A
Authority: CN
Inventors: 混旭; 王佳平; 梅振华; 孟妍
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Guangxi Dian Medical Laboratory Co., Ltd.
Priority date: 2017-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2037-05-24
Also published as: CN107091834A

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以探针DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；然后以磁珠为载体固定发卡结构的捕获DNA，在目标物DNA存在时，捕获DNA的发卡结构被打开，并在化学发光探针上的探针DNA的杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标DNA的测定。方法具有简单、灵敏度高的优势。

Description

一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法。

背景技术

虽然催化发卡自组装技术有很多优点，但是发卡结构在正常情况下会自己打开发卡结构，即使没有引发链存在时也会形成发卡自组装，即非特定性自组装，这样就会造成背景信号过高，所以本申请在发卡结构上引入错配碱基，以降低实验的背景信号，提高信噪比。本申请以磁珠为载体固定捕获DNA，通过错配催化发卡自组装技术并通过羟胺-O-磺酸作为氧化剂催化LumAuNPs产生化学发光的方法，对DNA进行了检测。方法具有灵敏度高、选择性好的特点。

发明内容

本发明旨在发明一种方法简单、灵敏度高的测定DNA的方法。

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法。

实现本发明目的技术方案是：

一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以探针DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；然后以磁珠为载体固定发卡结构的捕获DNA，在目标物DNA存在时，捕获DNA的发卡结构被打开，并在化学发光探针上的探针DNA的杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺-O-磺酸，以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标DNA的测定。LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，提高了检测信号强度；在探针DNA引入两个错配碱基降低了背景信号，提高了测定灵敏度。

本发明是通过以下措施来实现的：一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备；

(2)捕获DNA修饰磁珠的制备；

(3)探针DNA修饰LumAuNPs的制备；

(4)目标DNA的检测。

优选的，所述的鲁米诺胶体金纳米粒子的制备包括以下步骤：

实验开始前，将所用的玻璃仪器用HNO₃/HCl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。

优选的，所述的捕获DNA修饰磁珠的制备包括以下步骤：

取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10^-8M捕获DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存。

优选的，所述的探针DNA修饰LumAuNPs的制备包括以下步骤：

将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10^-6M的探针DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针。最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用。

优选的，所述的目标DNA的检测包括以下步骤：

取10μL～200μL捕获DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后取10μL～100μL含目标DNA的溶液加入到离心管中，37℃震荡反应40min，然后再加入10μL～100μL探针DNA修饰LumAuNPs溶液，37℃条件下震荡反应40min，通过目标DNA与捕获DNA的作用以及探针DNA与目标DNA和捕获DNA的作用，化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，将磁性分离物分散在50μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光，根据化学发光强度定量，实现目标DNA的测定。

所述的DNA序列为：

捕获DNA：5’-NH₂-CCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGT CTA CCG GGT TTA ATC CAC TCATCT TTG AAT AA-3’；

目标DNA：5’-ACTCATCTTTGAATAACTACCGGG-3’；

探针DNA：5’-AGA TGA GTG GAT TAA ACC CGG TAG ACT CAT CTT TGA ATA TGTACC GGG TTT AAT CCCACGAGATACTGTTCC-SH-3’。

本发明研究了不同浓度目标DNA与化学发光强度之间的关系，得到了检测目标DNA的标准曲线，线性范围及线性方程。

发明的优点与效果

当目标DNA的浓度在2.5fM到1pM之间时，随着目标DNA浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测目标DNA的非线性方程为y＝6244.26656+420.50459*x(y：化学发光强度；x：目标DNA浓度的对数，单位为M)，线性相关系数为0.9974，检出限为0.8fM(3σ)(图2)。该测定方法的精密度通过对浓度为100fM的目标DNA进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.4％，表明本测定方法有较好的重现性。

另外，利用LumAuNPs-H₂O₂为检测体系，在其他步骤相同时，按本发明的方法对目标DNA进行检测，测定的检出限为100fM。表明本发明提出的一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法具有高的灵敏度。

无目标物时，探针DNA和捕获DNA杂交效率低，空白信号，即背景信号低，从而有利于低浓度目标物测定，故灵敏度得到了提高。这无目标物时种杂交效率低归因于错配碱基的存在；当探针DNA中碱基和捕获DNA碱基无错配时，无目标物时，探针DNA和捕获DNA也会杂交，并且杂交效率较高，空白信号，即背景信号高，不利于低浓度目标物测定，故灵敏度低。

附图说明

图1检测目标DNA的原理示意图。探针DNA粗线为错配碱基。

图2目标DNA的浓度与化学发光强度关系图。

具体实施方式

下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。

实例1：一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法

1.实验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器设备

DHG鼓风干燥箱(善志仪器设备有限公司，上海)；AR224CN型奥豪斯分析天平(青岛中和恒信电子有限公司，青岛)；THZ型恒温振荡箱(佳源兴业科技有限公司，北京)；RFL-1型超微弱化学发光检测仪(瑞迈分析仪器有限公司，西安)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(安亭科学仪器厂，上海)。

1.1.2试剂

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl₄)从Sigma公司购买；粒径为0.5μm，浓度为10mg/mL的羧基磁珠从天津倍思乐色谱技术开发中心购买；鲁米诺(Luminol)、羟胺-O-磺酸(HOSA)和TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)购买于Aladdin公司；0.01M的鲁米诺用0.1M NaOH溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100mL水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸馏水稀释。

PBS缓冲溶液是0.10M，pH 7.4，其配制方法是称取0.1g KH₂PO₄、4.0g NaCl、1.45gNa₂HPO₄·12H₂O及0.1g KCl溶解于1L水中，即得。

所用到的单链DNA和发卡DNA(由上海生工生物工程有限公司合成)的序列如下：

目标DNA：5’-ACTCATCTTTGAATAACTACCGGG-3’；

发卡结构的DNA进行孵育处理后再使用。

1.2 LumAuNPs的合成

实验开始前，所用的玻璃仪器均用HNO₃/HCl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取100μL1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成50mL 0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在三口烧瓶中加磁子，并将其放入磁力搅拌器中，磁力搅拌下加热回流煮沸。待溶液沸腾后，快速加入1mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸40min，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热并在继续搅拌下冷却至室温。将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。

1.3捕获DNA修饰磁珠的制备

取50μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用100μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到1mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后在离心管中加入100μL浓度为5.0×10^-8M捕获DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获DNA修饰的磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mLPBS缓冲溶液中，4℃保存。

1.4探针DNA修饰LumAuNPs的制备

将5μL的TCEP加到100μL浓度为1.0×10^-6M的探针DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取600μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入50μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针。最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用。

1.5目标DNA的检测

取50μL捕获DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后再取50μL含目标DNA的溶液加入到离心管中，37℃震荡反应40min，然后再加入50μL探针DNA修饰LumAuNPs溶液，37℃条件下震荡反应40min，通过目标DNA与捕获DNA的作用以及探针DNA与目标DNA和捕获DNA的作用，化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，将磁性分离物分散在50μL pH 7.4的0.1MPBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光。根据标准溶液浓度和化学发光强度关系作图得标准曲线。

实例2：样品分析

将含目标DNA的样品溶液按步骤实例1中步骤1.5方法进行实验，根据化学发光强度和所得标准曲线可以获取目标DNA含量。

根据发明的方法对目标DNA含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为97.3–101.0％，测定结果见表1，本发明的方法在目标DNA检测中具有精密度高的特点。

表1.样品分析测定结果

编号	含量<sup>a,b</sup>	标准加入量	测得量	回收率
					1	12.52	10.0	22.48	99.6％
2	9.80	10.00	19.53	97.3％
					3	5.12	5.00	10.17	101.0％

^a7次测量结果

^b单位：fM。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛科技大学

<120> 一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

CCCGGTAGTT ATTCAAAGAT GAGTCTACCG GGTTTAATCC ACTCATCTTT GAATAA 56

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 2

ACTCATCTTT GAATAACTAC CGGG 24

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工系列

<400> 3

AGATGAGTGG ATTAAACCCG GTAGACTCAT CTTTGAATAT GTACCGGGTT TAATCCCACGAGATACTGTT CC 72

Claims

1.一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法，其特征在于以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以探针DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；然后以磁珠为载体固定发卡结构的捕获DNA，在目标物DNA存在时，捕获DNA的发卡结构被打开，并在化学发光探针上的探针DNA的杂交作用下，通过催化发卡自组装技术将化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，再加入羟胺-O-磺酸，以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标DNA的测定；LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，提高了检测信号强度；在探针DNA引入两个错配碱基降低了背景信号，提高了测定灵敏度，测定步骤如下：

(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备：实验开始前，将所用的玻璃仪器用王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干；取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用；

(2)捕获DNA修饰磁珠的制备：取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10^-8M捕获DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到捕获DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存；

(3)探针DNA修饰LumAuNPs的制备：将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10^-6M的探针DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mMTris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得探针DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针；最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用；

(4)目标DNA的检测：取10μL～200μL捕获DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后取10μL～100μL含目标DNA的溶液加入到离心管中，37℃震荡反应40min，然后再加入10μL～100μL探针DNA修饰LumAuNPs溶液，37℃条件下震荡反应40min，通过目标DNA与捕获DNA的作用以及探针DNA与目标DNA和捕获DNA的作用，化学发光探针连接在磁珠表面；经过磁分离后，将磁性分离物分散在50μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光，利用化学发光仪测定化学发光强度，根据化学发光强度定量，实现目标DNA的测定。

2.根据权利要求1所述的一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法，其特征在于所述的DNA的部分序列为：

捕获DNA：5’-NH₂-CCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGT CTA CCG GGT TTA ATC CAC TCA TCTTTG AAT AA-3’；

目标DNA：5’-ACTCATCTTTGAATAACTACCGGG-3’；

探针DNA：5’-AGA TGA GTG GAT TAA ACC CGG TAG ACT CAT CTT TGA ATA TGT ACCGGG TTT AAT CCCACGAGATACTGTTCC-SH-3’。

3.根据权利要求1所述的一种基于发卡错配循环放大技术检测DNA的方法，其特征在于所述的化学发光仪选用RFL-1型超微弱化学发光检测仪。