CN104194771B - 一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 - Google Patents
一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104194771B CN104194771B CN201410389582.7A CN201410389582A CN104194771B CN 104194771 B CN104194771 B CN 104194771B CN 201410389582 A CN201410389582 A CN 201410389582A CN 104194771 B CN104194771 B CN 104194771B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tppna
- fluorometric reagent
- albuminous
- small volume
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
本发明公开了一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，属于荧光生物传感器领域。所述荧光试剂由DP-TPPNa和良溶剂组成。将3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于良溶剂中，加入苯硼酸、催化剂和碱性盐，反应得到DP-TPP；将DP-TPP溶于溶剂中，加入碱，反应得到DP-TPPNa。将所述DP-TPPNa溶解于良溶剂中得到荧光试剂；所述荧光试剂可定量检测血清中血清白蛋白，制备方法简单，操作方便，响应迅速，兼具高灵敏性和高选择性，且具有良好可视化的检出信号，根据实际需要可以完全脱离对于高精仪器的依赖性，将会在很大程度上满足当今人们对于血清中血清白蛋白的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用，具体涉及一种用于溶液荧光检测血清中微量血清白蛋白的实时“点亮”型荧光试剂及制备方法，属于荧光生物传感器领域。
背景技术
血清白蛋白是人体内循环系统中最多的蛋白质，它具有结合和运输内源性与外源性物质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能，在生命过程中有着重要的意义。血清白蛋白由肝脏产生，因此，血清中血清白蛋白含量低可能预示着患有慢性肝炎，肝硬化，甚至肝衰竭及糖尿病等疾病。其中，糖尿病可以引起蛋白质代谢紊乱，炎症细胞因子可以促进肝脏的急性期反应造成白蛋白合成的减少和分解的增加，所以血清中血清白蛋白的急剧减少是糖尿病并发症的表现之一。综上，对血清中血清白蛋白含量的特异性定量检测具有重要的临床应用。
以往对于血清白蛋白的检测主要有以下几个方法：电泳法、免疫法和染料结合法。电泳法操作相对繁琐；免疫法特异性好、灵敏度高且白蛋白易纯化，但成本较高，检测时间长；溴甲酚绿(BCG)法是最常用的染料结合法，反应较为快捷，测试在10～30s后可进行，但血清中的α和β球蛋白与BCG也能起慢反应，选择性较差，且需要专业仪器自动化生化分析仪，成本较高，操作复杂。
近年来，干化学法逐步应用于临床检验中，由于其具有操作简便快速、样本用量少的优点，适合于急诊检验，但其主要用于检测总蛋白含量，对血清白蛋白检测特异性一般，且主要用于尿液检查，需要使用干化学尿液分析仪。
2001年，唐本忠院士课题组报道了“聚集诱导发光(AIE)”现象，由于其独特的“点亮”效果，AIE分子被应用于检测一些生物分子，如DNA，RNA与蛋白质等，其中包括血清白蛋白。目前，已经报道的检测血清白蛋白的体系包括含有磺酸基钠的四苯基乙烯以及含有磺酸基钠的二苯乙烯基蒽体系，这两种体系的AIE分子检测血清白蛋白具有灵敏度高，检测速度快，样本用量少等优点，优于之前提到的方法。但已报道的体系除对血清白蛋白有响应外，还对其他蛋白存在一定程度的响应，虽然通过对其进行修饰等方法可以提高分子对血清白蛋白的响应程度，但也只能降低而不能排除其他蛋白对其检测的影响。除此以外，这两种体系在检测血清白蛋白的同时，并不能很好地排除血清中其他成分对检测的影响。因此，定量检测血清白蛋白需要进行预先分离才能达到其检测准确性。
(Peters,T.,Jr.Adv.ProteinChem.1985,37,161.Carter,D.C.；Ho,J.X.Adv.ProteinChem.1994,45,153.Sjoholm,I.；Ekman,B.；Kober,A.Mol.Pharmacol.1979,16,767.Hu,Y.J.；Liu,Y.；Xiao,X.H.Biomacromolecules2009,10,517.Murch,S.H.；Winyard,P.J.D.；Walker-Smith,J.A.Lancet1996,347,1299.deBrito-AshurstI.；VaraguM.；RafteryM.J.J.Am.Soc.Nephrol,2009,20(9),2075-2084.Hoogenberg,K.；Sluiter,W.J.；Dullaart,R.P.F.ActaEndrocrinol.1993,129,151.Lowry,O.H.；Rosebrough,N.J.；Farr,A.L.；Randall,R.J.J.Biol.Chem.1951,193,265.Martinez,A.W.；Phillips,S.T.；Butte,M.J.；Whitesides,G.M.Angew.Chem.,Int.Ed.2007,46,1318.Hong,Y.N.,Lam,J.W.Y.,Tang,B.Z.ChemSocRev,2011,40:5361–5388.Li,Z.,Dong,Y.Q.,Tang,B.Z.,Adv.Funct.Mater.,2009,19,905–917.Xu,X.J.,Huang,J.,LiZ.Chem.Commun.,2011,47,12385–12387.WangZ.L.,MaK.,TianW.J.Sci.China.Chem.,2013,9,1234–1238.HongY.N.,FengC.,TangB.Z.Anal.Chem.2010,82,7035–7043.)
发明内容
针对现有荧光试剂对血清中白蛋白的检测选择性不高，在定量检测血清白蛋白时需要进行预先分离才能达到其检测准确性的问题，本发明的目的之一在于提供一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂对血清白蛋白具有特异性的荧光响应，对血清中白蛋白的检测灵敏度高且非常快捷，并具有高度选择性；目的之二在于提供一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，所述制备方法简单，操作方便。
本发明的目的由以下技术方案实现：
一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂由4,4',4″-(3,4-二苯基-1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯酸钠(简称DP-TPPNa)和良溶剂1组成。
其中，DP-TPPNa的结构式如下：
所述良溶剂1优选去离子水、磷酸盐缓冲液、盐溶液和血清中的一种；DP-TPPNa的浓度优选10-3～10-7mol/L；
所述盐溶液中的盐优选钠盐、钾盐、氯盐、铁盐和铜盐中的一种以上；
一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)将3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于良溶剂2中，得到浓度为3.33～10g/L的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶液；向所述溶液中加入苯硼酸、催化剂和碱性盐，于70℃下反应18～30h，得到3,4-二苯基-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯(DP-TPP)；
(2)将DP-TPP溶解于溶剂中，得到浓度为1.67～4g/L的DP-TPP溶液；向所述溶液中加入氢氧化钠，于70℃下反应18～30h，透析，干燥，得到DP-TPPNa；
(3)将DP-TPPNa溶解于良溶剂1中，混合均匀，得到本发明所述荧光试剂；
其中，步骤(1)所述3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯、苯硼酸、催化剂与碱性盐的质量比优选1:1.92～2.22:0.18～0.55:2.25～3.64；
步骤(1)所述良溶剂2优选乙二醇二甲醚；催化剂优选四(三苯基膦)钯；碱性盐优选碳酸铯；
步骤(2)所述DP-TPP与碱的质量比优选1:0.57～0.96；
步骤(2)所述溶剂优选水与四氢呋喃组成的混合溶剂，其中，水与四氢呋喃的质量比优选1:0.5～2；
步骤(2)所述干燥优选冷冻真空干燥；
一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂应用于溶液荧光检测血清中微量血清白蛋白。
有益效果
(1)所述荧光试剂对于血清白蛋白有特异性的荧光响应，DP-TPPNa在良溶剂1中处于分散状态，荧光信号较弱。加入血清白蛋白后，DP-TPPNa被血清白蛋白包裹缠绕，使其分子内旋转受限，非辐射能量转移受到抑制，荧光试剂的荧光信号显著增强；
(2)所述荧光试剂对血清白蛋白检测具有较高的灵敏度，当血清白蛋白浓度为0.1μmol/L时，荧光试剂就有明显的信号增强；
(3)所述荧光试剂对血清白蛋白的检测具有高度选择性、特异性，对于γ-球蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、转铁蛋白及蛋白质水解产物多种氨基酸均无明显的荧光响应，且检测中不受蛋白质水解成分影响；
(4)所述荧光试剂对于血清白蛋白的检测非常快捷，荧光试剂的荧光强度几乎在加入血清白蛋白的同时就显著增强，具有实时“点亮”效果；
(5)本发明所述荧光试剂的制备方法简单；在检测时操作方便，血清中的其他主要成分都不影响荧光试剂的检出效果，可以直接检测血清中的血清白蛋白，而不需要预先分离。
附图说明
图1为以下实施例中的荧光检测机理示意图；
图2为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同蛋白质后的荧光谱图，从左到右依次是血清白蛋白、γ-球蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、转铁蛋白；
图3为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同的氨基酸与血清白蛋白的荧光谱图，从左到右依次是血清白蛋白、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸；
图4为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同浓度血清白蛋白的荧光强度随时间变化曲线；
图5为实施例1中DP-TPPNa荧光试剂1在不同血清白蛋白浓度下的荧光谱；
图6为实施例1中DP-TPPNa荧光试剂1的荧光强度血清白蛋白含量变化的曲线及其拟合直线；
图7为实施例1中分别向DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2中加入不同血清白蛋白浓度下的荧光谱；
图8为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2中加入不同血清中主要成分的荧光谱图，从左到右依次是血清白蛋白、γ-球蛋白、胆固醇、尿素、葡萄糖；
图9为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2中加入不同血清、尿液中主要成分的混合成分荧光谱图，从左到右依次是A血清白蛋白，B血清白蛋白、葡萄糖，C血清白蛋白、胆固醇，D血清白蛋白、γ-球蛋白，E血清白蛋白、γ-球蛋白、胆固醇、F血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖，G血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖、尿素，H血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖、尿素、γ-球蛋白；
图10为实施1例中向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同质量的血清白蛋白和牛血清的荧光变化图；
图11为实施例1中向DP-TPPNa荧光试剂3、DP-TPPNa荧光试剂4、DP-TPPNa荧光试剂1、DP-TPPNa荧光试剂5和DP-TPPNa荧光试剂6中加入血清白蛋白的荧光谱图，从左到右荧光试剂浓度依次为：10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L；
其中，I为加入生物分子后的荧光强度，I0为空白荧光试剂的荧光强度，I-I0/I0表示荧光强度增大倍数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。
以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。
表1
表2
以下实施例中的荧光检测机理示意图如图1所示，所述荧光试剂中的DP-TPPNa具有聚集诱导发光增强的特性，在良溶剂中荧光试剂发光较弱，而加入血清白蛋白后，DP-TPPNa被血清白蛋白分子链的螺旋结构包裹缠绕，使内旋转受到限制，抑制其非辐射能量转移，发光增强。
实施例1
(1)DP-TPP的制备
将100mg的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于10mL乙二醇二甲醚中，加入苯硼酸(192mg)、四(三苯基膦)钯(18mg)和碳酸铯(225mg)，在70℃下反应18小时，得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.91-7.71(d,6H),7.22-7.04(d,6H),6.99-6.84(d,10H),3.94-3.84(s,9H).MS(MALDI-TOF):calcd.forC40H31NO6,621.2；found,621.3；
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPP。
(2)DP-TPPNa的制备
将100mg的DP-TPP溶于水(5mL)与四氢呋喃(20mL)混合溶剂中，加入氢氧化钠(58mg)，升温至70℃反应18小时，透析后冷冻抽真空干燥得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪表征得到固体粉末的核磁氢谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):7.75-7.66(d,2H),7.60-7.51(d,4H),7.41-7.22(d,6H),7.21-6.89(s,10H)。
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPPNa。
(3)DP-TPPNa荧光试剂1的制备
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂1，浓度为10-5mol/L。
(4)特异性识别试验1
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，分别加入300μg的血清白蛋、γ-球蛋白、卵清蛋白、血红蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和转铁蛋白，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和加入蛋白质后荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图2可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对其他蛋白质均无明显变化。
(5)特异性识别试验2
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，分别加入300μg的血清白蛋白、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和丝氨酸，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和加入血清白蛋白和氨基酸后荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图3可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即血清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响DP-TPPNa荧光试剂1的检出效果。
(6)检出时间试验
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，首先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂的荧光强度(激发波长为310nm)，然后向其中加入30μg血清白蛋白，立刻测其荧光强度，随后在1分钟内每隔6秒用荧光分光光度计测量一次荧光试剂的荧光强度(激发波长为310nm)；重复以上操作，每次增加30μg，至加入血清白蛋白的总质量为150μg。由图4可知，DP-TPPNa荧光试剂1对于血清白蛋白的检测非常快捷，在第一次测量后各发光强度都几乎不再变化，即检出效果为即时响应。
(7)定量检测试验
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，每次加入血清白蛋白为0.3nmol，加入至血清白蛋白的总量为3.0nmol，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1及每次加入血清白蛋白后的荧光信号(激发波长为310nm)；由图5可知，随着血清白蛋白浓度的增加，DP-TPPNa荧光试剂1的发光强度逐渐增加；取各血清白蛋白含量对应的荧光强度最高的点，与血清白蛋白含量对应作图，得到图6；由图6可知，荧光强度增大倍数与血清白蛋白浓度在0.1～0.8μmol/L范围内呈现线性关系：Y(荧光强度增大倍数)＝0.1926+13.05174X(血清白蛋白浓度)，R2＝0.99832，其中，R代表线性相关度。
实施例2
(1)DP-TPP的制备
将100mg的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于30mL乙二醇二甲醚中，加入苯硼酸(222mg)、四(三苯基膦)钯(55mg)和碳酸铯(364mg)，在70℃下反应30小时，得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.91-7.71(d,6H),7.22-7.04(d,6H),6.99-6.84(d,10H),3.94-3.84(s,9H).MS(MALDI-TOF):calcd.forC40H31NO6,621.2；found,621.3；
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPP。
(2)DP-TPPNa的制备
将100mg的DP-TPP溶于水(40mL)与四氢呋喃(20mL)混合溶剂中，加入氢氧化钠(96mg)，升温至70℃反应30小时，透析后冷冻抽真空干燥得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):7.75-7.66(d,2H),7.60-7.51(d,4H),7.41-7.22(d,6H),7.21-6.89(s,10H)。
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPPNa。
(3)DP-TPPNa荧光试剂1的制备
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂1，浓度为10-5mol/L。
(4)特异性识别试验1
按照实施例1中步骤(4)的操作进行了特异性识别实验1，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同蛋白质后的荧光谱图可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对其他蛋白质均无明显变化。
(5)特异性识别试验2
按照实施例1中步骤(5)的操作进行了特异性识别实验2，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同的氨基酸与血清白蛋白的荧光谱图可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即血清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响DP-TPPNa荧光试剂1的检出效果。
(6)检出时间试验
按照实施例1中步骤(6)的操作进行了检出时间试验，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同浓度血清白蛋白的荧光强度随时间变化曲线可知，DP-TPPNa荧光试剂1对于血清白蛋白的检测非常快捷，在第一次测量后各发光强度都几乎不再变化，即检出效果为即时响应。
(7)定量检测试验
按照实施例1中步骤(7)的操作进行定量检测试验，由DP-TPPNa荧光试剂1在不同血清白蛋白浓度下的荧光谱可知，随着血清白蛋白浓度的增加，DP-TPPNa荧光试剂1的发光强度逐渐增加；取各血清白蛋白含量对应的荧光强度最高的点，与血清白蛋白含量对应作图；由图可知，荧光强度增大倍数与血清白蛋白浓度在0.1～0.8μmol/L范围内呈现线性关系：Y(荧光强度增大倍数)＝0.1926+13.05174X(血清白蛋白浓度)，R2＝0.99832，其中，R代表线性相关度。
实施例3
(1)DP-TPP的制备
将100mg的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于20mL乙二醇二甲醚中，加入苯硼酸(200mg)、四(三苯基膦)钯(40mg)和碳酸铯(280mg)，在70℃下反应24小时，得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.91-7.71(d,6H),7.22-7.04(d,6H),6.99-6.84(d,10H),3.94-3.84(s,9H).MS(MALDI-TOF):calcd.forC40H31NO6,621.2；found,621.3；
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPP。
(2)DP-TPPNa的制备
将100mg的DP-TPP溶于水(15mL)与四氢呋喃(15mL)混合溶剂中，加入氢氧化钠(70mg)，升温至70℃反应24小时，透析后冷冻抽真空干燥得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):7.75-7.66(d,2H),7.60-7.51(d,4H),7.41-7.22(d,6H),7.21-6.89(s,10H).
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPPNa。
(3)DP-TPPNa荧光试剂1的制备
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂1，浓度为10-5mol/L。
(4)特异性识别试验1
按照实施例1中步骤(4)的操作进行了特异性识别实验1，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同蛋白质后的荧光谱图可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对其他蛋白质均无明显变化。
(5)特异性识别试验2
按照实施例1中步骤(5)的操作进行了特异性识别实验2，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同的氨基酸与血清白蛋白的荧光谱图可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即血清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响DP-TPPNa荧光试剂1的检出效果。
(6)检出时间试验
按照实施例1中步骤(6)的操作进行了检出时间试验，由向DP-TPPNa荧光试剂1中加入不同浓度血清白蛋白的荧光强度随时间变化曲线可知，DP-TPPNa荧光试剂1对于血清白蛋白的检测非常快捷，在第一次测量后各发光强度都几乎不再变化，即检出效果为即时响应。
(7)定量检测试验
按照实施例1中步骤(7)的操作进行定量检测试验，由DP-TPPNa荧光试剂1在不同血清白蛋白浓度下的荧光谱可知，随着血清白蛋白浓度的增加，DP-TPPNa荧光试剂1的发光强度逐渐增加；取各血清白蛋白含量对应的荧光强度最高的点，与血清白蛋白含量对应作图；由图可知，荧光强度增大倍数与血清白蛋白浓度在0.1～0.8μmol/L范围内呈现线性关系：Y(荧光强度增大倍数)＝0.1926+13.05174X(血清白蛋白浓度)，R2＝0.99832，其中，R代表线性相关度。
实施例4
(1)DP-TPP的制备
将100mg的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于10mL乙二醇二甲醚中，加入苯硼酸(192mg)、四(三苯基膦)钯(18mg)和碳酸铯(225mg)，在70℃下反应18小时，得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到白色固体粉末的核磁氢谱和质谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.91-7.71(d,6H),7.22-7.04(d,6H),6.99-6.84(d,10H),3.94-3.84(s,9H).MS(MALDI-TOF):calcd.forC40H31NO6,621.2；found,621.3；
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPP。
(2)DP-TPPNa的制备
将100mg的DP-TPP溶于水(5mL)与四氢呋喃(15mL)混合溶剂中，加入氢氧化钠(58mg)，升温至70℃反应18小时，透析后冷冻抽真空干燥得到白色固体粉末；通过核磁共振波谱仪表征得到固体粉末的核磁氢谱数据如下：
1H-NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):7.75-7.66(d,2H),7.60-7.51(d,4H),7.41-7.22(d,6H),7.21-6.89(s,10H)。
说明白色固体粉末是本发明所述的DP-TPPNa。
(3)DP-TPPNa荧光试剂1的制备
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到母液2，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液2加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂1，浓度为10-5mol/L。
(4)DP-TPPNa荧光试剂2的制备
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，制成浓度为1×10-3mol/L的母液1。取2mL母液1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL磷酸盐缓冲液，振荡均匀，得到母液3，浓度为10-4mol/L；取2mL的10-4mol/L母液3加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL磷酸盐缓冲液，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂2，浓度为10-5mol/L。
(5)不同良溶剂制得荧光试剂的检出效果试验
分别取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1和3mL的DP-TPPNa荧光试剂2，每次各加入0.3nmol血清白蛋白，至加入血清白蛋白的总量为3.0nmol，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2及每次加入血清白蛋白后荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图7可知，随着血清白蛋白浓度的增加，各溶解体系中DP-TPPNa荧光试剂的发光强度都逐渐增加，即在不同溶解体系中，DP-TPPNa荧光试剂都能实现其检出功能。
实施例5
(1)血清中成分的检出试验
根据实施例4中方法得到DP-TPPNa荧光试剂1与DP-TPPNa荧光试剂2；
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1和3mL的DP-TPPNa荧光试剂2，各分别加入300μg血清白蛋、γ-球蛋白、胆固醇、尿素和葡萄糖，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2及添加血清中各主要成分后的荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图8可知，荧光试剂对血清白蛋白具有特异性点亮响应，而对血清中以及尿液中其他主要成分均无明显变化，即DP-TPPNa荧光试剂可以实现血清中以及尿液中对血清白蛋白的特异性检出效果。
(2)血清混合成分的检出试验
根据实施例4中方法得到DP-TPPNa荧光试剂1与DP-TPPNa荧光试剂2；
将血清白蛋白、γ-球蛋白、胆固醇、葡萄糖和尿素按照不同的组分混合，得到体系A～H，其成分分别为：A为血清白蛋白；B为血清白蛋白与葡萄糖的混合液，其中，血清白蛋白与葡萄糖的质量比为400:1；C为血清白蛋白与胆固醇的混合液，其中，血清白蛋白与胆固醇的质量比为400:3；D为血清白蛋白与γ-球蛋白的混合液，其中，血清白蛋白与γ-球蛋白的质量比为4:3；E为血清白蛋白、γ-球蛋白和胆固醇的混合液，其中，血清白蛋白、γ-球蛋白与胆固醇的质量比为400:300:3；F为血清白蛋白、胆固醇和葡萄糖的混合液，其中，血清白蛋白、胆固醇与葡萄糖的质量比为400:3:1；G为血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖和尿素的混合液，其中，血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖与尿素的质量比为400:3:1:1；H为血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖、尿素和γ-球蛋白混合液，其中，血清白蛋白、胆固醇、葡萄糖、尿素与γ-球蛋白的质量比为400:3:1:1:300；以上各成分质量比均在人体血清正常范围内；取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1和3mL的DP-TPPNa荧光试剂2，各分别加入体系A～H，使其中血清白蛋白质量均为300μg，用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和DP-TPPNa荧光试剂2及分别加入体系A～H后荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图9可知，各混合成分对荧光强度变化影响不大，即血清中其他成分的存在不影响DP-TPPNa荧光试剂对血清白蛋白的定量检出效果。
实施例6
实际血清中血清白蛋白检出试验，其中，荧光试剂1根据实施例1得到。
取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，每次加入3μg的血清白蛋白，加入血清白蛋白的总量为30μg；取3mL的DP-TPPNa荧光试剂1，每次加入牛血清质量为1.534mg，加入血清白蛋白的总量为23.016mg；用荧光分光光度计测量DP-TPPNa荧光试剂1和每次加入血清白蛋白后荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图10可知，荧光试剂对真实血清中的血清白蛋白同样具有点亮响应，可根据图中已知量的实验曲线得知实际血清中血清白蛋白的含量，即DP-TPPNa荧光试剂1可以根据已知曲线定量检测实际血清中血清白蛋白含量。
实施例7
(1)不同浓度DP-TPPNa荧光试剂的制备
根据实施例1中方法得到DP-TPPNa；
将3.22mgDP-TPPNa溶于5mL去离子水中，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂3，浓度为10-3mol/L；取2mL荧光试剂3加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到荧光试剂4，浓度为10-4mol/L；取2mL的荧光试剂4加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂1，浓度为10-5mol/L；取2mL的荧光试剂1加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂5，浓度为10-6mol/L；取2mL的荧光试剂5加入样品瓶中，再向样品瓶中加入18mL去离子水，振荡均匀，得到DP-TPPNa荧光试剂6，浓度为10-7mol/L。
(2)不同浓度的DP-TPPNa荧光试剂的检出效果
分别取3mL的DP-TPPNa荧光试剂3、DP-TPPNa荧光试剂4、DP-TPPNa荧光试剂1、DP-TPPNa荧光试剂5和DP-TPPNa荧光试剂6，加入300μg血清白蛋白，用荧光分光光度计测量不同浓度的DP-TPPNa荧光试剂和加入血清白蛋白后的荧光试剂的荧光信号(激发波长为310nm)；由图11可知，不同浓度的荧光试剂对血清白蛋白都具有较好的点亮响应。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂，其特征在于：所述荧光试剂由DP-TPPNa和良溶剂1组成，其中，DP-TPPNa是4,4',4”-(3,4-二苯基-1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯酸钠的简称，其结构式如下：
良溶剂1为去离子水或磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂，其特征在于：DP-TPPNa的浓度为10-3～10-7mol/L。
3.一种如权利要求1所述的检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)将3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶解于良溶剂2中，得到浓度为3.33～10g/L的3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯溶液；向所述溶液中加入苯硼酸、催化剂和碱性盐，于70℃下反应18～30h，得到3,4-二苯基-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯，简称DP-TPP；良溶剂2为乙二醇二甲醚；
(2)将DP-TPP溶解于溶剂中，得到浓度为1.67～4g/L的DP-TPP溶液；向所述溶液中加入氢氧化钠，于70℃下反应18～30h，透析，干燥，得到DP-TPPNa；
(3)将DP-TPPNa溶解于良溶剂1中，混合均匀，得到所述荧光试剂。
4.根据权利要求3所述的一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述3,4-二溴-1,2,5-三(甲氧羰基苯基)吡咯、苯硼酸、催化剂与碱性盐的质量比为1:1.92～2.22:0.18～0.55:2.25～3.64。
5.根据权利要求3所述的一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述催化剂为四(三苯基膦)钯；碱性盐为碳酸铯。
6.根据权利要求3所述的一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述DP-TPP与碱的质量比为1:0.57～0.96；所述溶剂为水与四氢呋喃组成的混合溶剂，其中，水与四氢呋喃的质量比为1:0.5～2。
7.根据权利要求3所述的一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述干燥为冷冻真空干燥。
8.一种如权利要求1所述的检测微量血清白蛋白的荧光试剂应用于血清中微量血清白蛋白的检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410389582.7A CN104194771B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410389582.7A CN104194771B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104194771A CN104194771A (zh) | 2014-12-10 |
| CN104194771B true CN104194771B (zh) | 2016-05-25 |
Family
ID=52080144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410389582.7A Expired - Fee Related CN104194771B (zh) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | 一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104194771B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105785039B (zh) * | 2016-04-01 | 2017-08-04 | 北京理工大学 | 阶梯式定量检测血浆中血清白蛋白及纤维蛋白原的方法 |
| CN105778894B (zh) * | 2016-04-01 | 2018-07-24 | 北京理工大学 | 一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 |
| CN106841128B (zh) * | 2016-12-07 | 2019-12-27 | 苏州尚稷电子科技有限公司 | 一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用 |
| CN111610168B (zh) * | 2019-02-26 | 2023-05-05 | 香港科技大学 | 一种用于检测潜在血迹的aie分子及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102219723A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-19 | 董宇平 | 具有聚集诱导发光性质的1，2，5-三苯基取代吡咯衍生物及其制备方法和用途 |
| CN102313726A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 一种基于聚集诱导发光原理用于铝离子特异性检测的荧光试剂 |
-
2014
- 2014-08-08 CN CN201410389582.7A patent/CN104194771B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102219723A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-19 | 董宇平 | 具有聚集诱导发光性质的1，2，5-三苯基取代吡咯衍生物及其制备方法和用途 |
| CN102313726A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 一种基于聚集诱导发光原理用于铝离子特异性检测的荧光试剂 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A fluorescence-switchable luminogen in the solid state：a sensitive and selective sensor for the fast "turn-on" detection of primary amine gas;Tianyu Han et al.;《Chem. Commun.》;20130403;4848-4850 * |
| A highly sensitive，single selective，real-time and "turn-on" fluorescent sensor for Al3+ detection in aqueous media;Xiaoyan Shi et al.;《J. Mater. Chem.》;20120814;19296-19302 * |
| A novel "turn-on" fluorescent chemosensor for the selective detection of Al3+ based on aggregation-induced emission;Tianyu Han et al.;《Chem. Commun.》;20111111;416-418 * |
| Aggregation-Induced Emission Enhancement of Aryl-Substituted Pyrrole Derivatives;Xiao Feng et al.;《J. Phys. Chem. B》;20101124;16731-16736 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104194771A (zh) | 2014-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104194771B (zh) | 一种检测微量血清白蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 | |
| Domenicali et al. | Posttranscriptional changes of serum albumin: clinical and prognostic significance in hospitalized patients with cirrhosis | |
| Cui et al. | Selective determination of cysteine using BSA-stabilized gold nanoclusters with red emission | |
| CN106883849A (zh) | 一种含氮硫参杂的石墨烯量子点及其制备方法与在制备赖氨酸荧光检测试剂上的应用 | |
| CN103217406B (zh) | 基于Au/Ag核/壳量子点的半胱氨酸和Cu2+荧光探针的制法 | |
| CN1432814A (zh) | 对照组合物及其用于凝结实验的方法 | |
| CN102183495A (zh) | 一种半胱氨酸的荧光检测方法 | |
| CN102721778A (zh) | 一种快速高效测定葡萄酒中酚酸的方法 | |
| Chen et al. | A novel histidine assay using tetraphenylporphyrin manganese (III) chloride as a molecular recognition probe by resonance light scattering technique | |
| Wuethrich et al. | Derivatisation for separation and detection in capillary electrophoresis (2012–2015) | |
| Kim et al. | An imidazole-appended p-phenylene-Cu (II) ensemble as a chemoprobe for histidine in biological samples | |
| Bonnel et al. | Ionic matrices pre-spotted matrix-assisted laser desorption/ionization plates for patient maker following in course of treatment, drug titration, and MALDI mass spectrometry imaging | |
| Aćimović et al. | Method for monitoring of the protein amino group changes during carbonylation | |
| CN104483295B (zh) | 基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法 | |
| WO2019014674A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR COLORIMETRIC QUANTIFICATION AND PROTEIN FLUORESCENCE | |
| CN102928392A (zh) | 一种检测半胱氨酸的方法 | |
| CN105778894A (zh) | 一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用 | |
| CN107941773B (zh) | 一种基于荧光分子的内毒素的检测方法 | |
| Fu et al. | Highly sensitive and naked eye dual-readout method for L-cysteine detection based on the NSET of fluorophore functionalized gold nanoparticles | |
| Zhang et al. | Glycoproteins and glycosylation: apolipoprotein c3 glycoforms by top-down maldi-tof mass spectrometry | |
| Li et al. | A coupled reagent of o-phthalaldehyde and sulfanilic acid for protein detection based on the measurements of light scattering signals with a common spectrofluorometer | |
| Chen et al. | Baseline separation of amino acid biomarkers of hepatocellular carcinoma by polyvinylpyrrolidone-filled capillary electrophoresis with light-emitting diode-induced fluorescence in the presence of mixed micelles | |
| Zeng et al. | A near infrared fluorescent probe for sensitive determination of human serum albumin | |
| CN104459008A (zh) | 一种蛋白质的快速检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN108002368B (zh) | 一种氨基蒽醌改性石墨烯gdaq及其制备方法与制备肼黄荧光检测试剂上的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160525 Termination date: 20210808 |