CN112813070B - 结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于河豚毒素检测技术领域，具体为一种结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途。本发明从TTX分子的结构出发，选有可能与TTX结合的核酸适配体Anti‑IFNγ；然后使用碱基A替换Anti‑IFNγ中的非天然碱基获得其变体AI‑57，并预测其3D结构；利用分子对接软件及分子动力学模拟软件模拟AI‑57与TTX的结合模式与结合过程,计算预测的平衡解离常数为26.0 nM；最后用微量热泳动实验验证AI‑57与TTX的结合能力,实验测得的平衡解离常数为28.3 nM，与计算值几乎一致。本发明确定的适配体AI‑57用于检测河豚毒素，对于食品安全具有极其重要的意义，为开发基于核酸适配体的TTX生物传感器奠定了基础。

Description

结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途
技术领域
本发明属于河豚毒素检测技术领域，具体涉及结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其筛选方法和用途。
背景技术
河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) 是一种存在于河豚体内的海洋生物毒素，人类可能通过食用或接触受污染的海产品及生活用水而遭受TTX的侵害，该毒素会导致误食者腹泻性中毒以及麻痹性中毒；据报道，TTX的毒性约是氰化钠的100倍，摄入1~2 mg就足以杀死重50 kg的人体(1,6)。因此，检测海产品或生活用水中的TTX对于人类健康具有重要意义。目前，TTX的检测方法有小鼠生物检测法(MBA)(7)、酶联免疫分析法(ELISA)(8)、高效液相色谱法(HPLC)(9)以及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)(10)等。然而，这些方法存在检测灵敏度低、操作复杂、重复性差、设备昂贵、对技术人员要求高或动物伦理等问题；同时，也没有足够快速的检测技术对水样或中毒生物进行TTX的现场检测(11)。因此，相关领域仍然需要快速、灵敏和低成本的检测方法。近年来，基于核酸适配体的生物传感器制作技术的快速发展，为高效检测TTX等海洋毒素提供了新的解决方案。
核酸适配体是一种由指数富集的配体系统进化技术 (Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment, SELEX)筛选出的寡核苷酸片段；可折叠成特定的结构，与靶标分子或细胞特异性结合；通常由20-80个核苷酸组成，分子量为6-30 kDa(12)。海洋毒素本身的毒性导致生物体难以产生抗体，因此，使用抗体检测毒素的方法也难以实现；而靶标小分子的核酸适配体可特异性识别或区分小分子间微小的差异，因此，通常作为化学和生物传感器的识别元件，广泛应用于食品和环境监测等领域(13)。生物传感器是一种以细胞分子或其他生物材料作为敏感元件，结合二级传感器，通过级联放大信号对多种化学物质进行检测的新型检测技术；具有操作简单、速度快、灵敏度高、小型化、易于自动化等优点；广泛应用于药物筛选、物质安全检测、疾病诊断等不同领域(14,15)。将核酸适配体作为生物传感器的敏感元件，不仅可以降低检测成本、缩短检测时间，而且可以提高检测灵敏度(15)。
综上，核酸适配体在TTX检测以及抑制剂制备等领域具有广阔的应用前景。然而，缺乏高亲和性TTX适配体的研究现状极大限制了其实际的应用。一方面是受到核酸适配体筛选方法的限制，如SELEX筛选方法存在操作复杂、周期长、样品消耗量大等问题；另一方面，因为适配体与小分子相互作用机制的研究尚不成熟，所以新发展的SELEX技术对TTX这种小分子筛选效率仍然很低，从而导致目前高亲和性TTX适配体极少。
因此，本发明得到的高亲和性TTX适配体AI-57，为开发基于适配体的生物传感器检测技术与解毒剂药物奠定基础，促进TTX适配体在各领域的发展与应用。此TTX核酸适配体的产生可分为两个部分，第一部分采用计算技术模拟核酸适配体AI-57与TTX分子的结合，第二部分通过实验验证该适配体能高亲和性结合TTX分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途，为开发基于适配体的生物传感器检测技术与解毒剂药物奠定基础。
本发明提供的能够结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体，其序利为： 5’-CCCGCCCGGGTCCGCGAAGCGGTAGGTATGGGCTAGGCAGCTGGCGGGCGCGAAGCG-3’（ SEQ.ID.NO1所示），记为核酸适配体AI-57。
本发明提供的能够结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体的获得方法，基本步骤为：首先，从河豚毒素的结构出发，通过查阅文献获得可能与河豚毒素结合的核酸适配体Anti-IFNγ(2)；然后，使用碱基A替换Anti-IFNγ中的非天然碱基获得适配体变体，并预测其3D结构；然后，利用AutoDock4.2分子对接软件以及GROMACS分子动力学软件模拟适配体变体与河豚毒素分子的结合；最后，采用MST实验验证适配体变体与河豚毒素分子的结合能力，最终得到的结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体，记为核酸适配体AI-57。
本发明提供的结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体的获得方法，具体步骤为：
第一步：根据河豚毒素分子的结构，寻找可能与其结合的核酸适配体；
第一步的目的是获得可能与河豚毒素结合的核酸适配体。目前，经SELEX技术已经产生大量不同的核酸适配体，假设适配体在几何和结合作用模式上与TTX分子匹配，则这些原不是针对TTX的适配体很可能与TTX发生结合相互作用。河豚毒素在众多海洋毒素中分子量较小，结构富含羟基，并含有一个胍基(1)，在中性条件下，该胍基带正电。在寻找可能与其结合的核酸适配体时，首先要考虑该适配体需具有稳定的3D结构和大小适合的结合位点，以容纳TTX；另外，在空间构象中，结合位点应富含能与羟基、胍基形成氢键相互作用的N、O原子，以紧密结合TTX。通过对收集的适配体进行二级或三级结构的比较，初步获得可能与TTX结合的核酸适配体Anti-IFNγ(2)；将Anti-IFNγ中的两个非天然碱基替换为腺嘌呤脱氧核苷酸，获得适配体变体并命名为AI-57。在RNA Secondary Structure Prediction网站预测适配体AI-57的二级结构，并利用Rosetta程序中的RNA 3D Structure Modeling模块预测AI-57的3D结构。该适配体结构拥有三个茎环，其中两个茎环保留了原适配体的迷你发卡，这有利于AI-57结构的稳定。
第二步：进行分子动力学模拟，获取核酸适配体AI-57的稳定构象；
第二步的目的是获得3D结构更合理化的AI-57适配体，以提高第三步分子对接结果的可靠性。由第一步查阅资料、收集适配体以及结构预测，获得了结构稳定、在空间构象中具有TTX可能结合的位置，且结合位置周围富含N、O原子的核酸适配体AI-57。为了使适配体AI-57预测的结构更合理化，对其进行分子动力学模拟。采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包(3)、AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模。在模拟系统中，将AI-57置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；另外，插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先，利用最速下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后，采用v-rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于50 ns的分子动力学模拟，以获得适配体AI-57的稳定构象。
第三步：使用AutoDock4.2对接核酸适配体AI-57与毒素分子TTX；
第三步目的是通过分子对接初步判断核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合强度，以初步确认该适配体是否适合结合TTX分子。由上一步获得结构更合理化的核酸适配体AI-57后，使用AutoDock4.2进行AI-57与TTX的分子对接。AutoDock4.2是一款分子自动对接软件，所谓分子对接，是指利用配体分子与受体分子间的几何匹配和能量匹配而相互识别的过程(4)。该软件分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(Lamarckian GeneticAlgorithm, LGA)，可以在不知道结合位点的情况下预测结合构象以及结合强度；该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化。分子对接方法根据不同的简化程度可以分为刚性、半柔性以及柔性对接，其中刚性对接是指在对接过程中研究体系的构象不发生变化，柔性对接是指体系的构象基本上可以自由变化，而半柔性对接是指体系中仅配体构象能发生一定变化。本对接将AI-57适配体作为受体、TTX分子作为配体进行半柔性对接。半柔性对接与刚性对接相比准确性较高，与柔性对接相比计算时间较短，因此，较适合处理小分子与大分子之间的对接。
第四步：进行分子动力学模拟，获得AI-57与TTX复合物的稳定构象；
通过上一步分子对接获得初步结合构象及结合强度后，判断其计算结合结果较好。第四步的目的是通过分子动力学模拟进一步判断核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合情况，以进一步确认该适配体是否适合结合TTX分子。具体利用我们之前已报道的方法(1)，将适配体AI-57与TTX分子作为整体进行分子动力学模拟，以获得稳定的复合物构象。其中，毒素分子TTX的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；模拟体系采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包、AMBER99bsc1力场以及SPC水模型进行建模。在模拟系统中，将核酸适配体AI-57置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；为了与溶液环境保持一致，插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；并通过v-rescale和berendsen耦合维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于100 ns的分子动力学模拟。
第五步：采用MST实验测定核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合亲和力；
微量热泳动方法是利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，来分析分子间的相互作用(5)。对于每一组MST实验，利用梯度稀释法1:1稀释TTX溶液至16组，用于16根毛细管的上样；另外，每根毛细管中核酸适配体AI-57的浓度固定，并用荧光标记于AI-57的3’端。核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，从而导致热泳动之后荧光信号值发生变化；通过测量在不同结合程度下，样品溶液在MST过程中荧光信号的变化，可以拟合得到关于该结合反应的解离平衡常数，即K d值。
本发明结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体AI-57，可用于检测河豚毒素，为开发基于适配体的生物传感器与解毒剂药物奠定基础，促进TTX适配体在各领域的发展与应用。
本发明首先从TTX分子的结构出发，选有可能与TTX结合的核酸适配体Anti-IFNγ；然后，使用碱基A替换Anti-IFNγ中的非天然碱基获得其变体AI-57，并预测其3D结构；其次，利用分子对接软件及分子动力学模拟软件模拟AI-57与TTX的结合模式与结合过程,计算预测的平衡解离常数为26.0 nM；最后，用微量热泳动实验验证AI-57与TTX的结合能力,实验测得的平衡解离常数为28.3 nM，与计算值几乎一致。
本发明采用计算技术模拟核酸适配体AI-57与TTX分子的结合；通过实验验证该适配体能与TTX分子高亲和性结合，这为获得靶标分子的核酸适配体提供了一种新途径。
附图说明
图1为获得高亲和性TTX核酸适配体AI-57的流程图。
图2为TTX的化学结构式。
图3为核酸适配体AI-57的序列及其预测结构。
图4为随时间变化核酸适配体AI-57的RMSD及稳定构象示意图。
图5为核酸适配体AI-57与TTX分子对接结果示意图。
图6为随时间变化AI-57:TTX体系的RMSD及稳定构象示意图。
图7为核酸适配体AI-57与TTX分子的MST实验结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明。
下述实施例中所用的实验方法，如无特定说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特定说明，均从商业途径获得。
第一步：根据河豚毒素分子的结构，寻找可能与其结合的核酸适配体；
第一步旨在获得可能与TTX分子结合的核酸适配体。目前，经SELEX技术已经产生大量不同的核酸适配体，假设适配体在几何和结合作用模式上与TTX分子匹配，则这些原不是针对TTX的适配体很可能与TTX发生结合相互作用。河豚毒素在众多海洋毒素中分子量较小，结构富含多个羟基，并含有一个胍基(如图2所示)(1)，在中性条件下，该胍基带正电。在寻找可能与其结合的核酸适配体时，首先要考虑该适配体需具有稳定的3D结构和大小适合的结合位点，以容纳TTX；另外，在空间构象中，结合位点应富含能与羟基、胍基形成氢键相互作用的N、O原子，以紧密结合TTX。通过对收集的适配体进行二级或三级结构的比较，初步获得可能与TTX结合的核酸适配体Anti-IFNγ(2)；将Anti-IFNγ中的两个非天然碱基替换为腺嘌呤脱氧核苷酸，获得适配体变体并命名为AI-57。在RNA Secondary StructurePrediction网站预测适配体AI-57的二级结构，并利用Rosetta程序中的RNA 3D StructureModeling模块预测AI-57的3D结构。如图3所示，该适配体拥有三个茎环结构，其中两个茎环保留了原适配体的迷你发卡，这有利于AI-57结构的稳定。
第二步：进行分子动力学模拟，获取核酸适配体AI-57的稳定构象；
第二步旨在获得3D结构更合理化的AI-57适配体，以提高第三步分子对接结果的可靠性。由第一步查阅资料、收集适配体以及结构预测，获得了结构稳定、在空间构象中具有TTX可能结合的位置，且结合位置周围富含N、O原子的核酸适配体AI-57。为了使适配体AI-57预测的结构更合理化，对其进行分子动力学模拟。采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包(3)、AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模。在模拟系统中，将AI-57置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；另外，插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先，利用最速下降算法对模拟系统进行能量最小化；然后，采用v-rescale恒温器控制系统平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于50 ns的分子动力学模拟，以获得适配体AI-57的稳定构象，结果如图4所示。
第三步：使用AutoDock4.2对接核酸适配体AI-57与毒素分子TTX；
第三步旨在通过分子对接初步判断核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合强度，以初步确认该适配体是否适合结合TTX分子。由上一步获得结构更合理化的核酸适配体AI-57后，使用AutoDock4.2进行AI-57与TTX的分子对接。AutoDock4.2是一款分子自动对接软件，所谓分子对接，是指利用配体分子与受体分子间的几何匹配和能量匹配而相互识别的过程(4)。该软件分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(Lamarckian GeneticAlgorithm, LGA)，可以在不知道结合位点的情况下预测结合构象以及结合强度；该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化。分子对接方法根据不同的简化程度可以分为刚性、半柔性以及柔性对接，其中刚性对接是指在对接过程中研究体系的构象不发生变化，柔性对接是指体系的构象基本上可以自由变化，而半柔性对接是指体系中仅配体构象能发生一定变化。半柔性对接与刚性对接相比准确性较高，与柔性对接相比计算时间较短，因此，较适合处理小分子与大分子之间的对接。本对接将AI-57适配体作为受体、TTX分子作为配体进行半柔性对接，对接获得的平衡解离常数K d为26.0 nM，结果如图5所示。
第四步：进行分子动力学模拟，获得AI-57与TTX复合物的稳定构象；
由上一步分子对接获得初步结合构象及结合强度后，判断其计算结合结果较好。第四步旨在通过分子动力学模拟进一步判断核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合情况，以进一步确认该适配体是否适合结合TTX分子。将适配体AI-57与TTX分子作为整体进行分子动力学模拟，以获得稳定的复合物构象。其中，毒素分子TTX的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；模拟体系采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包、AMBER99bsc1力场以及SPC水模型进行建模。在模拟系统中，将核酸适配体AI-57置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；为了与溶液环境保持一致，插入金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度。模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；并通过v-rescale和berendsen耦合维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于100 ns的分子动力学模拟，AI-57:TTX体系的RMSD及稳定构象如图6所示。
第五步：采用MST实验测定核酸适配体AI-57与毒素分子TTX的结合亲和力；
本实验采用微量热泳动技术验证核酸适配体AI-57与TTX分子的结合能力。MST是利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，来分析分子间的相互作用(5)。目前该方法已广泛用于分析蛋白质与蛋白质、蛋白质和核酸、蛋白质与小分子、核酸与核酸、核酸与小分子之间的相互作用。实验中所用的河豚毒素购买于普华仕科技有限公司，所用的核酸适配体以及其余化学试剂均购自于上海生工生物工程有限公司；实验所用的设备为德国NanoTemper Technologies的Monolith NT.115分子间相互作用仪。
1、样品准备：本发明用于MST实验的结合缓冲液为50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2mM
MgCl2，维持体系的pH为7.5。缓冲液制备完成后，用0.2 μm的水相过滤膜过滤，以除去溶液中的颗粒物。本实验首先用缓冲液将核酸适配体AI-57稀释到100 nmol/L，然后取800 μL核酸样品置于加热器中，95℃加热10分钟，再冰浴5分钟，最后在室温下静置5分钟(用于四组平行实验)。因为模拟结果显示TTX结合位置远离AI-57的3’端，所以将荧光标记(6-FAM)连接在AI-57的3’端。MST实验用于测量K d值时，采用梯度稀释的方法，将TTX溶液依次稀释成16组。具体操作为：(1)准备16个小PCR管，编号为1到16，向第1和第2个管中加入10μL的1×buffer 4 μM TTX溶液。(2)第2到第16个管中分别加入10 μL含0.1%吐温20的1×buffer。(3)将第2个PCR管中的10 μL溶液转移到第3个管中，充分混匀 (放于微型离心机上离心)，然后取第3个管中的10 μL转移到第4个管中，充分混匀，依次稀释到第16个管。(4)最后将第16个管中的20 μL溶液弃掉10 μL，从而第1到第16个管中的溶液均为10 μL，且浓度依次减半。
2、适配体AI-57与TTX分子混合并孵育：向TTX分子的16个梯度溶液中依次加入10μL 100 nM已荧光标记的核酸适配体AI-57；此时，溶液体系中TTX的最高浓度为2 μM，核酸适配体AI-57的恒定浓度为50 nM，1×buffer，0.05%吐温20；避光室温孵育120 min。待孵育完后，可用于MST实验。
3、MST实验：在进行MST实验之前，需要设置测量荧光标记分子溶液的荧光强度，根据文献和MST使用手册可知，溶液荧光读数为200-1500是可取的，800左右是最为合适的，实验可以通过调节核酸分子浓度和LED灯光强度来调节荧光强度(5)。本次设定在LED power40%、MST power 40%、热泳时间30 s以及温度25℃的条件下，测定适配体AI-57与TTX的结合反应。在设置好实验条件后，将样品置于毛细管中，并依次将毛细管放入毛细管架的凹槽里，再将毛细管架装入MST仪器并关闭仪器舱门。然后，在操作界面上依次填写16个毛细管中TTX分子的终浓度，再点击操作界面的Start Cap Scan，查看扫面出来的16个毛细管的初始荧光值是否一致(保证荧光标记分子浓度一致)，如果不一致将会影响接下来数据的收集和拟合，一般荧光值的偏差控制在10%之内。通过扫描毛细管中的样品还可以判断分子是否粘附于毛细管表面，如果扫描结果为一个光滑的峰形图，则说明管壁未粘附样品分子。待扫描结果显示正常后，点击Start MST Measurement 按钮进行MST检测。
待MST实验完成后，将数据导入MO.Affinify Analysis软件进行数据分析。测量结果如图7所示，AI-57与TTX结合反应的K d值为28.3 nM，此证明了核酸适配体AI-57是一种能结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体。
参考文献
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序列表
<110> 复旦大学
<120> 结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> AI-57
<400> 1
cccgcccggg tccgcgaagc ggtaggtatg ggctaggcag ctggcgggcg cgaagcg 57

Claims (1)

1.一种核酸适配体AI-57在检测河豚毒素中的用途，所述核酸适配体AI-57的序列为SEQ.ID.NO1所示。
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