CN106093438A - 一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列 - Google Patents

一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列，测血管内皮生长因子的方法大致为：在聚乙烯微孔上，形成VEGF与适配体和抗体形成抗体‑蛋白‑适配体的夹心结构，同时在适配体的末端包含有一段18碱基的延长序列，然后利用合成的两段蔗糖转移酶标记的辅助探针，这两段酶标探针以18碱基的延长序列为模板，引发链杂交扩增反应，从而在微孔中固定上大量的蔗糖转移酶，这些酶催化蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪指示产生的葡萄糖的浓度，本发明的检测方法便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高，且能有效的测出待分析目标物白血管内皮生长因子的含量。

Description

一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以 及该方法所用的核酸序列
技术领域
本发明涉及检测分析领域，特别涉及一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)是一类在细胞中发现的新型信号蛋白，它能增加微血管与小静脉血管的通透性，是促进血管再生的重要调控因子。VEGF的过表达也与许多疾病密切相关，如肺癌，乳腺癌，直肠癌，银屑病，增殖性视网膜病变和类风湿性关节炎等。因此，VEGF常常作为一种重要的生物标记物应用于临床疾病的诊断或作为愈后指标。
目前，常规的VEGF检测手段主要是基于免疫分析法，包括免疫组织化学，放射免疫分析法等。这类方法不仅耗时，更重要的是，在检测过程中需要复杂的试剂及精密的仪器，无法让普通人在日常生活中能随时随地地对VEGF的检测。同时，在这种免疫分析中，需要用到对VEGF识别的抗体，而抗体具有获得手段复杂，易失活，难修饰等缺点，不利于长期保存。
适配体是通过指数富集技术(SELEX)获得的特定序列的核酸分子，能识别各种目标物，如金属离子，小分子，蛋白质等。它与目标物的结合能力可以与抗体媲美，甚至优于抗体，同时，具有易合成，易修饰和易保存的优点，已经逐渐取代抗体并广泛应用在分析检测领域。VEGF有一段特异性的适配体，能与VEGF的肝素结合域进行结合(解离常数Kd＝315nM)，利用这段适配体，研究者构建了各种的适配体传感器用于VEGF的检测，如荧光，电化学，表面等离子体共振等。在检测过程中，研究者引入各种酶来实现信号放大来改善检测灵敏度，如DNA聚合酶或DNA外切酶等。虽然这一系列的适配体传感器能够成功地在实验室中实现VEGF的检测，但是，酶的储存需要严格的控温，酶的使用过程中繁琐的操作，以及需要大型昂贵的检测仪器和专业的操作人员，使得这些方法的应用常常局限在实验室中，难以应用到普通人家的日常检测中。因此，开发一种快速，高灵敏，便携式VEGF适配体传感器仍然是一种挑战。
近年来，利用便携式装置，如血糖仪，pH计等，研究者开发了一系列传感器，不仅拓展了这些商品化装置的使用范围，而且为实验室中传感器便携式地开发提供了一个新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测灵敏、快速且便捷的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，另外还提供了用于检测血管内皮生长因子的核酸适配体、核酸A1和核酸A2。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，它包括以下步骤：
1)将VEGF抗体在聚苯乙烯微孔板中固定并封闭；在聚苯乙烯微孔板中固定的VEGF抗体，用于特异性地结合VEGF蛋白。
2)目标物VEGF与VEGF抗体的结合：将不同浓度的VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应；
3)核酸适配体-VEGF-VEGF抗体夹心结构的形成：将一定浓度的核酸适配体缓冲溶液加入到步骤2)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应；所述的夹心结构是通过核酸适配体同被抗体捕获的VEGF特异性结合得到的。
4)制备活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液；
5)制备sulfo-SMCC活化的蔗糖转移酶溶液；所述的蔗糖转移酶来自面包酵母(酿酒酵母)
6)制备蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液：将步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液分别与步骤5)所得的sulfo-SMCC活化的蔗糖转移酶溶液进行混合、反应得到蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液；本发明在制备蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液时，利用sulfo-SMCC作为交联剂将巯基化的DNA与蔗糖转移酶通过化学交联的方法结合起来。其中蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行表征。
7)杂交链扩增反应的引发：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为0.4-2μM，以30-50μL/孔的添加量分别将浓度为0.4-2μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL；
所述的杂交链扩增反应是利用核酸适配体序列中的引发链，以步骤6)中得到的两段蔗糖转移酶功能化的核酸探针为原料，通过碱基互补配对的方式进行杂交来实现的。所述的扩增产物包含长的DNA链及蔗糖转移酶。蔗糖转移酶能够催化蔗糖转变成葡萄糖，血糖仪能够检测出生成的葡萄糖的浓度。
8)利用血糖仪进行检测：以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应10～60分钟，之后取10～20μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到与不同浓度的VEGF标准溶液相对应的不同血糖仪读数；
所述的血糖仪包括各种品牌的商品化血糖仪。
9)绘制VEGF检测标准曲线并获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程：根据步骤8)所得的血糖仪读数，绘制血糖仪读数与VEGF浓度的标准曲线，根据标准曲线，获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程；
10)VEGF待测样的检测：
以30-100μL/孔的添加量，将未知浓度的VEGF待测溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL，接着重复步骤3)、步骤7)后，以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应15～20分钟后，取10～20μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数，将该血糖仪读数代入步骤9)所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度；
其中，所述核酸适配体的序列为：
5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
该适配体中“5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA”这一段序列能够快速识别并与目标蛋白VEGF特异性结合；
另一端段延长序列“ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'”中的这18个碱基能够作为杂交链扩增的引发链。该适配体序列与目标蛋白VEGF和VEGF抗体在微孔板表面形成适配体-VEGF-抗体的夹心结构，从而利用适配体序列中的引发链与核酸探针A1以及核酸探针A2相互作用引发杂交链扩增过程，从而在聚苯乙烯微孔板的微孔中固定大量的蔗糖转移酶，这些酶能够快速的催化蔗糖转化为葡萄糖，从而放大检测信号，改善了血糖仪自身检测灵敏度不高的缺陷。
其中，所述核酸A1的序列为：
5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
所述核酸探针A1的序列为：
5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'
所述的核酸A2的序列为:
5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
所述核酸探针A2的序列为：
5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'
所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.05～0.2M氯化钠和0.007～0.02M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0～7.6，浓度为0.05～0.2M。
本发明所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法的检出限为12pg/mL。
所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，步骤1)的具体操作方法为：以30～50uL/孔的添加量，将10-20μg/mL的VEGF抗体溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0-37.5℃温育0.5-3小时，用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5分钟，之后以30～50uL/孔的添加量将1％-5％牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下振荡1-2小时，之后，再次用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5分钟。
步骤2)的具体操作方法为：VEGF溶于浓度为0.05～0.2M，pH为7.0～7.6的PBS缓冲液中，并配制成不同浓度的VEGF标准溶液，以30-100μL/孔的添加量，将不同浓度的VEGF标准溶液分别加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育30-60分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL。
步骤3)的具体操作方法为：将核酸适配体溶于含有0.05～0.2M NaCl的PBS缓冲溶液中，制成浓度为0.1-1μM的核酸适配体缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0～7.6，浓度为0.05～0.2M，之后以30-100μL/孔的添加量，将浓度为0.1-1μM的核酸适配体缓冲溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL。
步骤4)的具体操作方法为：
活化的核酸A1溶液的制备：将1～2μL 0.5～1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5～9μL 50～100μM的巯基修饰的核酸A1溶液中，再加入2～5μL 0.1～1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1-1.5小时，得到活化的核酸A1溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5～7.0；
活化的核酸A2溶液的制备：将1～2μL 0.5～1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5～9μL 50～100μM的巯基修饰的核酸A2溶液中，再加入2～5μL 0.1～1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1-1.5小时，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5～7.0；
步骤5)的具体操作方法为：将300-400μL 15-20mg/mL的蔗糖转移酶溶液与0.5-1mg的sulfo-SMCC混合后，在室温下振荡1-1.5小时后，用100K的超滤离心管离心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖转移酶溶液，其中所述的蔗糖转移酶溶液采用含有0.2～0.4MNaCl的磷酸盐缓冲液进行配置，磷酸盐缓冲液浓度为0.1-1M，pH为4.5～7.0。
步骤6)的具体操作方法为：将步骤5)所得的上清液加入到步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液中，室温反应48-50小时后，用100K的超滤离心管进行分离纯化，即得蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液。
本发明的发明人还尝试了以下检测方法：将核酸适配体先与蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2进行杂交链扩增反应，之后将所得的杂交链产物加入步骤2)所得的聚苯乙烯微孔板中进行孵育反应，最后在聚苯乙烯微孔板中加入蔗糖溶液反应60分钟，取反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，发现利用这种检测方法检测时，检测信号低。由此可见本发明检测血管内皮生长因子操作步骤的先后顺序不可以随意改变，只有将制得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2作用于核酸适配体-VEGF-VEGF抗体的夹心结构，才能得到很高的检测信号。
本发明的杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的检测原理如图1所示：在图中步骤1表示VEGF抗体固定于聚苯乙烯微孔板中；步骤2表示目标物VEGF与VEGF抗体结合；步骤3表示核酸配体-VEGF-VEGF抗体夹心结构的形成；步骤4表示发生杂交链扩增反应，且扩增产物中包含长的DNA链及蔗糖转移酶；步骤5表示蔗糖转移酶催化蔗糖转化为葡萄糖的催化过程，在步骤5中三角形代表葡萄糖，圆形代表蔗糖；步骤6表示血糖仪检测过程。
本发明的发明人还利用该方法来检测人体中常见的蛋白，人体中常见蛋白的响应图如图2所示。从图2可知，只有VEGF蛋白的响应最好，其他的蛋白几乎没有响应。
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸适配体，其序列为：5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A1，其序列为：5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A2，其序列为：5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
较之现有技术而言，本发明的优点在于：1)本发明利用杂交链反应，与便携式的商品化血糖仪相结合，建立一种高灵敏便携式的传感器，利用血糖仪间接的测出待分析目标物白血管内皮生长因子的含量；2)本发明提供了一种新颖的信号获取方式，其不需要大型、复杂、昂贵的检测仪器和设备，利用简单、低成本的血糖仪即可实现对血管内皮生长因子的有效检测，具有便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高等优点；3)本发明利用了杂交链反应，杂交链反应实现了无酶化的链扩增过程，并且使得蔗糖转移酶大量地富集在扩增产物链上，催化蔗糖转化为葡萄糖，同时结合商品化血糖仪，对产生的葡萄糖进行定量检测，实现了双重放大过程，即杂交链扩增放大与酶放大，大大改善了血糖仪自身检测灵敏度不高的缺陷；4)另外本发明的核酸适配体能够快速、有效的与目标蛋白VEGF结合，同时在该核酸适配体的末端包含有一段18碱基的延长序列，该延长序列能够与本发明合成的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2相互作用实现杂交链扩增反应，从而在聚苯乙烯微孔板的微孔中固定大量的蔗糖转移酶，这些酶能够快速的催化蔗糖转化为葡萄糖，从而放大检测信号，改善了血糖仪自身检测灵敏度不高的缺陷。
附图说明
图1是本发明的交链反应便携式检测血管内皮生长因子的检测原理图。
图2是利用本发明的检测方法检测人体中常见蛋白的响应图。
图3是本发明对不同浓度的VEGF标准溶液检测后所得的VEGF标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸适配体，其序列为：5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A1，其序列为：5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A2，其序列为：5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
在以下实施例一至实施例八中，利用了所述的用于检测血管内皮生长因子的核酸适配体、核酸A1以及核酸A2。
实施例一：测定当VEGF标准溶液的浓度为50pg/mL时，所对应的血糖仪读数—a
步骤1)：以50uL/孔的添加量，将10μg/mL的VEGF抗体溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0℃温育1小时，用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板3次，每次3分钟，之后以50uL/孔的添加量将1％-5％牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0℃下振荡1小时，之后，再次用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板3次，每次3分钟。
步骤2)：VEGF溶于浓度为0.1M，pH为7.5的PBS缓冲液中，并配制成浓度为50pg/mL的VEGF标准溶液，以50μL/孔的添加量，将该VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0℃下孵育30分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为200μL。
步骤3)：将核酸适配体溶于含有0.1M NaCl的PBS缓冲溶液中，制成浓度为1μM的核酸适配体缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M，之后以50μL/孔的添加量，将浓度为1μM的核酸适配体缓冲溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.0℃下孵育1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为200μL。
步骤4)：
活化的核酸A1溶液的制备：将2μL 1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到9μL100μM的巯基修饰的核酸A1溶液中，再加入2μL 1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1小时，得到活化的核酸A1溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为5.5；
活化的核酸A2溶液的制备：将2μL 1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到9μL100μM的巯基修饰的核酸A2溶液中，再加入2μL 1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1小时，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为5.5；
步骤5)的具体操作方法为：将400μL 20mg/mL的蔗糖转移酶溶液与1mg的sulfo-SMCC混合后，在室温下振荡1小时后，用100K的超滤离心管离心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖转移酶溶液，其中所述的蔗糖转移酶溶液采用含有0.3M NaCl的磷酸盐缓冲液进行配置，磷酸盐缓冲液浓度为0.1M，pH为7.0。
步骤6)的具体操作方法为：将步骤5)所得的上清液加入到步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液中，室温反应48小时后，用100K的超滤离心管进行分离纯化，即得蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液。
步骤7)：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为1μM，以50μL/孔的添加量分别将浓度为1μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.0℃下孵育1小时，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为200μL；
步骤8)以30μL/孔的添加量，将2M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应60分钟，之后取20μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数为7.7。
其中，所述核酸适配体的序列为：
5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
所述核酸A1的序列为：
5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
所述核酸探针A1的序列为：
5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'
所述的核酸A2的序列为:
5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
所述核酸探针A2的序列为：
5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'
所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.1M氯化钠和0.01M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M。
实施例二：测定当VEGF标准溶液的浓度为50pg/mL时，所对应的血糖仪读数—b
步骤1)：以30uL/孔的添加量，将20μg/mL的VEGF抗体溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.5℃温育0.5小时，用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2次，每次5分钟，之后以30uL/孔的添加量将1％-5％牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.5℃下振荡1.5小时，之后，再次用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2次，每次5分钟。
步骤2)：VEGF溶于浓度为0.2M，pH为7.0的PBS缓冲液中，并配制成浓度为50pg/mL的VEGF标准溶液，以30μL/孔的添加量，将该VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.5℃下孵育60分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150μL。
步骤3)：将核酸适配体溶于含有0.05M NaCl的PBS缓冲溶液中，制成浓度为0.1μM的核酸适配体缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0，浓度为0.2M，之后以30μL/孔的添加量，将浓度为0.1μM的核酸适配体缓冲溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.5℃下孵育0.5小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150μL。
步骤4)：
活化的核酸A1溶液的制备：将1μL 0.5mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5μL50μM的巯基修饰的核酸A1溶液中，再加入5μL 0.1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1.5小时，得到活化的核酸A1溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5；
活化的核酸A2溶液的制备：将1μL 0.5mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5μL50μM的巯基修饰的核酸A2溶液中，再加入5μL 0.1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1.5小时，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5；
步骤5)的具体操作方法为：将300μL 15mg/mL的蔗糖转移酶溶液与0.5mg的sulfo-SMCC混合后，在室温下振荡1.5小时后，用100K的超滤离心管离心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖转移酶溶液，其中所述的蔗糖转移酶溶液采用含有0.2M NaCl的磷酸盐缓冲液进行配置，磷酸盐缓冲液浓度为1M，pH为4.5。
步骤6)的具体操作方法为：将步骤5)所得的上清液加入到步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液中，室温反应50小时后，用100K的超滤离心管进行分离纯化，即得蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液。
步骤7)：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为2μM，以30μL/孔的添加量分别将浓度为2μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.5℃下孵育0.5小时，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150μL；
步骤8)以40μL/孔的添加量，将1M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应10分钟，之后取10μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数为7.6。
其中，所述核酸适配体的序列为：
5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
所述核酸A1的序列为：
5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
所述核酸探针A1的序列为：
5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'
所述的核酸A2的序列为:
5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
所述核酸探针A2的序列为：
5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'
所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.2M氯化钠和0.02M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0，浓度为0.2M。
实施例三 测定当VEGF标准溶液的浓度为50pg/mL时，所对应的血糖仪读数—c
步骤1)：以40uL/孔的添加量，将15μg/mL的VEGF抗体溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.3℃温育3小时，用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板4次，每次4分钟，之后以40uL/孔的添加量将1％-5％牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.3℃下振荡2小时，之后，再次用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板4次，每次4分钟。
步骤2)：VEGF溶于浓度为0.05M，pH为7.6的PBS缓冲液中，并配制成浓度为50pg/mL的VEGF标准溶液，以100μL/孔的添加量，将该VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.3℃下孵育50分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗4次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为180μL。
步骤3)：将核酸适配体溶于含有0.2M NaCl的PBS缓冲溶液中，制成浓度为0.5μM的核酸适配体缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.6，浓度为0.05M，之后以100μL/孔的添加量，将浓度为0.5μM的核酸适配体缓冲溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.3℃下孵育45分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗4次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为180μL。
步骤4)：
活化的核酸A1溶液的制备：将1.5μL 0.8mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到8μL 60μM的巯基修饰的核酸A1溶液中，再加入4μL 0.5M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1.2小时，得到活化的核酸A1溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0；
活化的核酸A2溶液的制备：将1.5μL 0.8mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到8μL 60μM的巯基修饰的核酸A2溶液中，再加入4μL 0.5M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1.2小时，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0；
步骤5)的具体操作方法为：将350μL 18mg/mL的蔗糖转移酶溶液与0.8mg的sulfo-SMCC混合后，在室温下振荡1.2小时后，用100K的超滤离心管离心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖转移酶溶液，其中所述的蔗糖转移酶溶液采用含有0.4M NaCl的磷酸盐缓冲液进行配置，磷酸盐缓冲液浓度为0.5M，pH为5.5。
步骤6)的具体操作方法为：将步骤5)所得的上清液加入到步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液中，室温反应49小时后，用100K的超滤离心管进行分离纯化，即得蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液。
步骤7)：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为0.4μM，以40μL/孔的添加量分别将浓度为0.4μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.3℃下孵育45分钟，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗4次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为180μL；
步骤8)以35μL/孔的添加量，将1.5M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应30分钟，之后取15μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数为7.1。
其中，所述核酸适配体的序列为：
5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
所述核酸A1的序列为：
5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
所述核酸探针A1的序列为：
5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'
所述的核酸A2的序列为:
5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
所述核酸探针A2的序列为：
5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'
所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.05M氯化钠和0.007M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.6，浓度为0.05M。
实施例四：绘制VEGF检测标准曲线并获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程：
在实施例一所述的实验条件下，分别再测试其他不同浓度的VEGF标准溶液，并获得相应的血糖仪读数，其中VEGF标准溶液的浓度分别为0，30，80，100，150，200，300，500，750以及1000pg/mL，所得的血糖仪读数分别为：0，3.6，10.9，14.3，17.7，21.9，26.5，30.8，32.3，33，根据实施例一中50pg/mL的VEGF标准溶液所对应的血糖仪读数、上述VEGF标准溶液的浓度以及相应的血糖仪读数绘制血糖仪读数与VEGF浓度的标准曲线(如图3所示)，根据标准曲线，获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程，方程为y＝-27.00+20.83x，R＝0.9859，其中，y是血糖仪读数，x是VEGF标准溶液浓度的对数值。
实施例五：
VEGF待测样的检测：以30μL/孔的添加量，将一未知浓度的VEGF待测溶液加入到实施例一步骤1)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0℃下孵育1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为200μL，接着重复实施例一中步骤3)以及实施例一步骤7)后，以30μL/孔的添加量，将2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应20分钟后，取10μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数7.5，将该血糖仪读数代入实施例四所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度为45.3pg/mL；
计算方法如下：将y＝7.5代入y＝-27.00+20.83x中，得x＝1.656，设待测样中VEGF的浓度为C，即lgC＝1.656，得C＝45.3pg/mL
其中，所述的冲洗缓冲液为含有0.1M氯化钠和0.01M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M。
实施例六：
VEGF待测样的检测：以50μL/孔的添加量，将一未知浓度的VEGF待测溶液加入到实施例一步骤1)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.3℃下孵育45分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗4次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为180μL，接着重复实施例一中步骤3)以及实施例一步骤7)后，以35μL/孔的添加量，将1.5M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应18分钟后，取15μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数12.3，将该血糖仪读数代入步骤9)所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度为77.1pg/mL；
计算方法如下：将y＝12.3代入y＝-27.00+20.83x中，得x＝1.887，设待测样中VEGF的浓度为C，即lgC＝1.887，得C＝77.1pg/mL
其中，所述的冲洗缓冲液为含有0.1M氯化钠和0.01M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M。
实施例七：
VEGF待测样的检测：以100μL/孔的添加量，将一未知浓度的VEGF待测溶液加入到实施例一步骤1)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.5℃下孵育0.5小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150μL，接着重复实施例一中步骤3)以及实施例一步骤7)后，以40μL/孔的添加量，将1M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应15分钟后，取20μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数5.8，将该血糖仪读数代入实施例四所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度为37.6pg/mL；
计算方法如下：将y＝5.8代入y＝-27.00+20.83x中，得x＝1.575，设待测样中VEGF的浓度为C，即lgC＝1.575，得C＝37.6pg/mL
其中，所述的冲洗缓冲液为含有0.1M氯化钠和0.01M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M。
实施例八：血清样品中VEGF的检测：
取一份人血清样品，用浓度为0.1M，pH为7.5的PBS缓冲液稀释10倍，然后以30μL/孔的添加量，将稀释后的人血清样品加入到实施例一步骤1)中所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0℃下孵育1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为200μL，接着重复实施例一中步骤3)以及实施例一步骤7)后，以30μL/孔的添加量，将2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应20分钟后，取10μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数2.6，将该血糖仪读数代入实施例四所得的线性回归方程中即得稀释后的人血清样品中VEGF的浓度26.36pg/mL；最后可知人血清样品中VEGF的浓度为263.6pg/mL；
计算方法如下：将y＝2.6代入y＝-27.00+20.83x中，得x＝1.421，设稀释后的人血清样品中VEGF的浓度为C，即lgC＝1.421，得C＝26.36pg/mL，则未稀释的人血清样品中VEGF的浓度为263.6pg/mL。
其中，所述的冲洗缓冲液为含有0.1M氯化钠和0.01M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.3，浓度为0.1M。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列
<160> 3
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtgggggtg gacgggccgg gtagaactaa aagggtctga ggg 43
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttttact cccccaggtg cccctcagac ccttttagt 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttttttgcac ctgggggagt aactaaaagg gtctgaggg 39

Claims (10)

1.一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1)将VEGF抗体在聚苯乙烯微孔板中固定并封闭；
2)目标物VEGF与VEGF抗体的结合：将不同浓度的VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应；
3)核酸适配体-VEGF-VEGF抗体夹心结构的形成：将一定浓度的核酸适配体缓冲溶液加入到步骤2)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应，
4)制备活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液；
5)制备sulfo-SMCC活化的蔗糖转移酶溶液；
6)制备蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液：将步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液分别与步骤5)所得的sulfo-SMCC活化的蔗糖转移酶溶液进行混合、反应得到蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液；
7)链杂交扩增反应的引发：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为0.4-2μM，以30-50μL/孔的添加量分别将浓度为0.4-2μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL；
8)利用血糖仪进行检测：以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应10～60分钟，之后取10～20μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到与不同浓度的VEGF标准溶液相对应的不同血糖仪读数；
9)绘制VEGF检测标准曲线并获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程：根据步骤8)所得的血糖仪读数，绘制血糖仪读数与VEGF浓度的标准曲线，根据标准曲线，获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程；
10)VEGF待测样的检测：
以30-100μL/孔的添加量，将未知浓度的VEGF待测溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL，接着重复步骤3)、步骤7)后，以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应15～20分钟后，取10～20μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数，将该血糖仪读数代入步骤9)所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度；
其中，所述核酸适配体的序列为：
5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
所述核酸A1的序列为：
5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；
所述核酸探针A1的序列为：
5'-SH-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'
所述的核酸A2的序列为:
5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
所述核酸探针A2的序列为：
5'-SH-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'
所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.05～0.2M氯化钠和0.007～0.02M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0～7.6，浓度为0.05～0.2M。
2.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤1)的具体操作方法为：以30～50uL/孔的添加量，将10-20μg/ml的VEGF抗体溶液滴加到聚苯乙烯微孔板上，在37.0-37.5℃温育0.5-3h，用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5min，之后以30～50uL/孔的添加量将1％-5％牛血清白蛋白加入聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下振荡1-2小时，之后，再次用蒸馏水冲洗聚苯乙烯微孔板2-4次，每次3-5min。
3.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤2)的具体操作方法为：VEGF溶于浓度为0.05～0.2M，pH为7.0～7.6的PBS缓冲液中，并配制成不同浓度的VEGF标准溶液，以30-100μL/孔的添加量，将不同浓度的VEGF标准溶液分别加入到步骤1)所得 的聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育30-60分钟后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL。
4.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤3)的具体操作方法为：将核酸适配体溶于含有0.05～0.2M NaCl的PBS缓冲溶液中，制成浓度为0.1-1μM的核酸适配体缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0～7.6，浓度为0.05～0.2M，之后以30-100μL/孔的添加量，将浓度为0.1-1μM的核酸适配体缓冲溶液加入到聚苯乙烯微孔板中，在37.0-37.5℃下孵育0.5-1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3-5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150-200μL。
5.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤4)的具体操作方法为：
活化的核酸A1溶液的制备：将1～2μL 0.5～1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5～9μL 50～100μM的巯基修饰的核酸A1溶液中，再加入2～5μL 0.1～1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1-1.5小时，得到活化的核酸A1溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5～7.0；
活化的核酸A2溶液的制备：将1～2μL 0.5～1mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液加入到5～9μL 50～100μM的巯基修饰的核酸A2溶液中，再加入2～5μL 0.1～1M磷酸盐缓冲溶液，混合液放置在暗处，于室温下反应1-1.5小时，得到活化的核酸A2溶液，其中所述磷酸盐缓冲溶液的pH为4.5～7.0。
6.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤5)的具体操作方法为：将300-400μL 15-20mg/mL的蔗糖转移酶溶液与0.5-1mg的sulfo-SMCC混合后，在室温下振荡1-1.5小时后，用100K的超滤离心管离心取上清液，即得到sulfo-SMCC活化蔗糖转移酶溶液，其中所述的蔗糖转移酶溶液采用含有0.2～0.4MNaCl的磷酸盐缓冲液进行配置，磷酸盐缓冲液浓度为0.1-1M，pH为4.5～7.0。
7.根据权利要求1所述的利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：步骤6)的具体操作方法为：将步骤5)所得的上清液加入到步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液中，室温反应48-50小时后，用100K的超滤离心管进行分离纯化，即得蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液。
8.一种用于检测血管内皮生长因子的核酸适配体，其特征在于：其序列为：5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA ACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
9.一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A1，其特征在于：其序列为：5'-TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT-3'。
10.一种用于检测血管内皮生长因子的核酸A2，其特征在于：其序列为：5'-TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
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