CN110988347A - 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法 - Google Patents

一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110988347A
CN110988347A CN201911321766.9A CN201911321766A CN110988347A CN 110988347 A CN110988347 A CN 110988347A CN 201911321766 A CN201911321766 A CN 201911321766A CN 110988347 A CN110988347 A CN 110988347A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanopore
vegf
pdgf
tumor markers
hemolysin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201911321766.9A
Other languages
English (en)
Inventor
郗冬梅
崔梦洁
房真
葛亚仙
刘丽萍
张书圣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Linyi University
Original Assignee
Linyi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Linyi University filed Critical Linyi University
Priority to CN201911321766.9A priority Critical patent/CN110988347A/zh
Publication of CN110988347A publication Critical patent/CN110988347A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用纳米孔检测两种肿瘤标志物的方法，属于生化分析技术领域。该方法包括(1)双链DNA底物探针的制备、(2)蛋白质与底物探针混合孵育反应、(3)α‑溶血素纳米孔的组装、(4)利用α‑溶血素纳米孔检测输出DNA，共4个步骤。本发明是基于双链DNA的探针，该探针由核酸适配体、捕获臂以及cDNA组成。本发明一方面可以实现两种蛋白质的准确区分，另一方面通过分析释放DNA的频率可以实现对两种蛋白质的定量检测。本发明的方法可以实现灵敏、高效、免标记、免扩增定量检测PDGF‑BB和VEGF165。

Description

一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法
技术领域
本发明涉及一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，属于生化分析技术领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一。目前临床诊断方法主要包括医学影像学成像技术和组织病理切片分析，然而影像学检查的分辨率较低，组织病理切片需通过手术切除选取标本，对患者造成创伤。近年来，研究者发现了多种与癌症相关的生物活性分子，为癌症的生物检测提供了研究对象。这些活性分子是反映肿瘤自身存在的一类物质，在癌变的发生和增殖过程中，以核酸、蛋白质、酶或代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或体液中，在肿瘤发生早期表达量极低。针对肿瘤相关活性分子，发展一种灵敏度高、特异性强的检测新技术，对于癌症的诊断筛查和指导治疗具有重要的科学意义和临床价值。
血小板衍生因子(PDGF-BB)和血管内皮生长因子(VEGF165)是常见的肿瘤相关活性分子。VEGF165在维持许多细胞和组织的生理血管稳态中是必不可少的，在肿瘤生长和转移的分子机制中起关键作用。PDGF-BB是一种参与细胞增殖调控的生长因子，在胚胎发育和血管生成中起重要作用。一般而言，许多疾病的发生和发展往往与多种生物标志物的表达变化密切相关。对于复杂的疾病，往往需要在同一样本中对多种肿瘤标志物进行同时检测以提高诊断的准确性。但是，与血液中的其他血浆蛋白相比，蛋白质肿瘤标志物的浓度极低，并且不同标志物的检测可能存在相互干扰，所以在单一样品中同时检测多种肿瘤标志物面临着较大的挑战。目前，特异性生物标志物荧光探针为多重分析提供了一种强大的工具，但测量多色荧光往往受到发射光谱重叠的限制，需要多个光源激发不同的荧光团。电化学免疫传感器和酶联免疫吸附试验可以识别蛋白质生物标志物，但这些方法样品制备较复杂，限制了它们在快速分析生物标志物中的应用。基于质谱的方法也有很多，具有灵敏度高、精度高、通用性强等优点，但它们需要昂贵的仪器和复杂的操作。
近年来，纳米孔传感技术因其快速、低成本、无需标记等优点，在化学和生物等诸多研究领域得到广泛应用，已发展成为一种新颖的、独具特色的单分子分析手段。由于单个分子在纳米通道中的物理占位作用等，改变了通道的电阻，从而引发流经纳米通道的离子电流发生变化，形成阻断电流信号。离子流阻断程度和阻断时间等可反映分子的组成、结构特征等信息，信号频率可反映分子的浓度。将纳米孔传感技术应用于生物标志物的灵敏检测，对于疾病的诊断筛查和指导治疗具有重要的科学意义和临床价值。
如何设计有效的检测策略从而实现两种肿瘤标志物的高效、快速、灵敏、同时检测，是本领域内亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决传统方法操作复杂、灵敏度低，现有技术依赖于各种标记或信号扩增的问题，发明人提出一种简单、灵敏、无需标记和扩增的利用生物纳米孔同时检测两种肿瘤标志物血小板衍生因子(PDGF-BB)和血管内皮生长因子(VEGF165)的方法。
本发明采用以下技术方案：
一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，它包括以下步骤：
(1)双链DNA底物探针的制备：分别取适量捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165混匀后在95℃加热5min；同时分别取适量捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB混匀后在95℃加热5min；然后使两种混合液分别缓慢降温至室温得到两种杂交链反应液；分别取两种不同的杂交反应液25μL、25μL超纯水、50μL链霉亲和素磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟，反应完毕后，磁性分离去掉上清液，得到两种与磁珠结合的双链DNA底物探针，备用；
(2)蛋白质与底物探针混合孵育反应：取相同体积的两种双链DNA底物探针混合在一起，然后向里面同时加入两种蛋白质PDGF-BB和VEGF165，放在恒温振荡器中37℃孵育40分钟，反应结束后，用磁铁将磁珠和上清液分开，得到的上清液用于纳米孔检测；
(3)α-溶血素纳米孔的组装：用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液；将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜，在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃，在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA；
(4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的pA级电流通过电流放大器放大采集，并通过低通滤波器进行滤波，滤波频率为5kHz，放大器采集得到的模拟信号通过数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上，通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，由于两种释放DNA的长度不同，稳定性不同，穿过α-溶血素纳米孔时产生的特征信号不同，进而实现对两种蛋白质同时进行检测。
所述步骤(1)中捕获臂VEGF165序列为：C30TGTTGTGTGGTTAATCTACCCGGCCC；cDNA-12序列为：AACCACACAACA；适配体VEGF165序列为：
biotin-T10TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA。
所述步骤(1)中捕获臂PDGF-BB序列为：
C30GCTGTGGTAGGTTGTGTGGTTGGCGAACAGGATCATGGT；cDNA-25序列为：
CGCCAACCACACAACCTACCACAGC；适配体PDGF-BB序列为：
biotin-T10CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。其中C30是指30个C，T10是指10个T。
所述步骤(1)中捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165的浓度均为10-6M，用量均为20μL；所述捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB的浓度均为10-6M，用量均为20μL。
所述步骤(1)中链霉亲和素磁珠浓度为10mg/mL，直径为1.0μm。
所述步骤(2)中两种双链DNA底物探针浓度为2×10-7M，体积为100μL；其中蛋白质PDGF-BB加入量为浓度10-10M，体积100μL；VEGF165加入量为10-10M/10-9M/10-8M/10-7M，体积100μL。
所述步骤(3)a)中涂抹的磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正癸烷溶液。
所述步骤(3)a)中α-溶血素的加入量为1μL 5μg/mL的α-溶血素。
本发明所述检测方法的原理为：如图1所示，本发明的方法设计一个基于双链DNA的探针，探针由核酸适配体、捕获臂以及cDNA组成，适配体连接于磁珠表面，蛋白质存在时，适配体与蛋白质特异性结合。通过磁性分离将捕获臂与cDNA的杂交产物释放下来，则释放DNA分子的量与靶蛋白的量成正比。由于两种释放DNA的长度不同，稳定性不同，穿过α-溶血素纳米孔时产生的特征阻断电流信号不同，所以一方面可以实现两种蛋白质的准确区分，另一方面通过分析释放DNA的频率可以实现对两种蛋白质的同时定量检测。由于纳米孔技术具有无需标记、灵敏度高等优点，因此该方法可以实现灵敏、高效、免标记、免扩增定量检测PDGF-BB和VEGF165。
本发明所述链霉亲和素磁珠是指从公司Invitrogen(California,U.S.A.)购买得到的DynabeadsMyOneTMStreptavidin T1(10mg/mL，直径1.0μm)。
本发明的有益效果是：
(1)特异性好：由于本方法基于蛋白质与核酸适配体的特异性识别和结合，反应的特异性极高；不仅如此，发明人对具体的反应条件也进行了较为全面细致的优化，因此几乎不发生非特异性反应；生成的产物在纳米孔中会产生高度特征性的阻断信号，这也大大提高了该方法的特异性。
(2)灵敏度高：纳米孔是一种非常灵敏的单分子分析手段，而且实验操作时使用了较高的电压160mV，大大提高了检测的灵敏度，本发明所述方法对于PDGF-BB的检测下限可达3.51×10-11M，对于VEGF165的检测下限可达4.06×10-11M。
(3)无需标记和循环放大：本方案中没有进行任何标记，没有引入任何循环扩增，仅仅利用纳米孔的高灵敏度优点即可同时实现对PDGF-BB和VEGF165的定量检测。这是其他检测方法如荧光法、比色法做不到的。
(4)应用范围广：只需改变底物探针中的核酸适配体序列，即可实现其他蛋白质、核酸或小分子的特异性、高灵敏检测。
附图说明
图1为本发明利用纳米孔同时检测两种肿瘤标记物PDGF-BB和VEGF165的原理图。
图2为释放DNA单独进行纳米孔检测。其中(A)VEGF165、cDNA-12的杂交产物释放DNAH12穿过纳米孔时的电流迹线。(B)PDGF-BB、cDNA-25的杂交产物释放DNA H25穿过纳米孔时的电流迹线。(C)H12(红色)和H25(蓝色)穿过纳米孔时阻断电流与持续时间的散点图。
图3为定量检测VEGF165、PDGF-BB的数据图。其中A、C为存在VEGF165、PDGF-BB时的电流迹线。B、D为事件频率与VEGF165、PDGF-BB浓度的相关性。
图4为同时检测两种蛋白质。(A)存在10-8M VEGF165和PDGF-BB的情况下检测到的电流迹线。(B)当PDGF-BB的浓度为10-10M且保持不变时，信号频率与VEGF165浓度(10-10～10-7)的关系。(C)比较靶蛋白在单独测量(灰色条)和同时测量(黑色条)中产生的电流信号频率。
图5为健康人血清中两种靶蛋白的回收实验。(A)将两种蛋白加入到血清样本中的电流迹线。(B-C)将不同浓度(10-10～10-8M)的VEGF165(B)和PDGF-BB(C)加入人血清，然后用纳米孔法测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，它包括以下步骤：
(1)双链DNA底物探针的制备：将DNA样品分别用0.15M NaCl和0.02M Tris-HCl,pH7.9缓冲溶液进行稀释，得到100×10-6M的原液。取捕获臂(VEGF165)、cDNA-12、适配体(VEGF165)(浓度均为10-6M)各20μL混匀后在95℃温度下孵育5min，同时取捕获臂(PDGF-BB)、(cDNA-25)、适配体(PDGF-BB)(浓度均为10-6M)各20μL混匀后在95℃温度下孵育5min，然后使其缓慢降温至室温得到杂交链反应液；先用1mL 1×BW缓冲液(1M NaCl,10-3M EDTA,10- 4M Tris-HCl,pH 7.5)将磁珠(50μL,10mg/mL)洗三次，然后将25μL杂交DNA、25μL超纯水和磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟，反应完毕后，磁性分离去掉上清液，得到两种与磁珠结合的双链DNA底物探针，备用；
其中VEGF165的序列为C30TGTTGTGTGGTTAATCTACCCGGCCC，cDNA-12的序列为AACCACACAACA和适配体VEGF165的序列为biotin-T10TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA。另一条杂交双链DNA中的PDGF-BB的序列为C30GCTGTGGTAGGTTGTGTGGTTGGCGAACAGGATCATGGT，cDNA-25的序列为CGCCAACCACACAACCTACCACAGC和适配体PDGF-BB的序列为biotin-T10CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。
(2)蛋白质与底物探针混合孵育反应：对于两种蛋白同时检测，取相同体积的两种双链DNA底物探针混合在一起，然后向其中同时加入两种蛋白质PDGF-BB和VEGF165，放在恒温振荡器中37℃孵育40分钟，反应结束后，用磁铁将磁珠和上清液分开，得到的上清液用于纳米孔检测；其中两种双链DNA底物探针浓度为为2×10-7M，体积为100μL；蛋白质PDGF-BB加入量为浓度10-10M，体积100μL；VEGF165加入量为10-10M/10-9M/10-8M/10-7M，体积100μL。上清液中的杂交DNA称之为输出DNA。VEGF165对应的杂交DNA为H12，PDGF-BB对应的杂交DNA为H25。上清液中的杂交DNA也称之为释放DNA。
(3)α-溶血素纳米孔的组装：将磷脂氯仿溶液抽空抽干，加入正癸烷配置成30mgmL-1溶液。用000号貂毛笔在1mL trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹30mg mL-1磷脂正癸烷溶液。将cis检测池和trans检测池组装后分别加人1M KCl电解质溶液。将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加+100mV电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜。在cis检测池中加入1μL 5μg mL-1的α-溶血素。当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃。在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA。
(2)利用α-溶血素纳米孔检测上清液。将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号。实验产生的pA级电流通过电流放大器放大采集，并通过低通滤波器进行滤波，滤波频率为5kHz。实验产生的电流通过Axopatch 200B(Axon Instruments公司,美国)放大采集，通过DigitalData1440A数模转换器(Axon Instruments公司，美国)转换为数字量，并传输到电脑上。通过PClamp10.6软件(Axon Instruments公司，美国)实时观测并记录纳米通道单分子实验数据。利用OriginLab9.0进行数据分析。
实施例2
将本发明实施例1中制备的磁珠-DNA复合物探针用于单个靶标蛋白的检测，将不同浓度的PDGF-BB、VEGF165和探针(2×10-7M)在37℃下孵育40分钟，偶有涡旋。用磁铁将磁珠和上清液分开，得到100μL的杂交DNA用于纳米孔检测，结果如图2所示。由于碱基长度不同，二者穿过纳米孔时的阻断时间差异较大。
实施例3
利用本发明的方法分别对VEGF165、PDGF-BB进行定量检测，评估本技术方案在检测PDGF-BB、VEGF165的灵敏度，将目标蛋白(0-10-7M)与探针混合，分析每种蛋白的频率与浓度的相关性，具体结果如图3所示。随VEGF165、PDGF-BB浓度的提高，其反应产物在纳米孔实验中的信号频率随之增加，频率与蛋白的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。经过计算，本实验所述方法对于PDGF-BB的检测下限可达3.51×10-11M，对于VEGF165的检测下限可达4.06×10-11M。因此本方法具有较高的检测灵敏度。
实施例4
利用本发明的方法同时检测VEGF165、PDGF-BB，具体结果如图4所示。A)存在10-8MVEGF165和PDGF-BB的情况下检测到的电流迹线。(B)当PDGF-BB浓度为10-10M固定不变时，信号频率与VEGF165浓度(10-10～10-7)的关系。(C)比较靶蛋白在单独测量(灰色条)和同时测量(黑色条)中产生的电流信号频率。结果表明，不同浓度的靶蛋白(VEGF165)的特征频率与其浓度成正比，而另一个靶蛋白(PDGF-BB)在恒定浓度下的特征频率几乎没有变化。这些发现表明，一个或多个蛋白的定量独立于其他蛋白探针复合物的存在。
实施例5
本发明还检测了健康人血清中两种靶蛋白的回收实验，具体结果如图5所示。在血清中加入两种蛋白后产生了大量的特异性信号，这些信号很容易相互区分。这些电流信号的频率与非血清样品的频率相当。各蛋白含量的测定与峰值浓度有良好的一致性，其中高于100％的回收率被认为是由于测量中观测误差造成的。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccccccccc cccccccccc cccccccccc tgttgtgtgg ttaatctacc cggccc 56
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaccacacaa ca 12
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttttttttt tgtgggggtg gacgggccgg gtaga 35
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccccccccc cccccccccc cccccccccc gctgtggtag gttgtgtggt tggcgaacag 60
gatcatggt 69
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgccaaccac acaacctacc acagc 25
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt caggctacgg cacgtagagc atcaccatga tcctg 45

Claims (8)

1.一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)双链DNA底物探针的制备：分别取适量捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165混匀后在95℃加热5min；同时分别取适量捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB混匀后在95℃加热5min；然后使两种混合液分别缓慢降温至室温得到两种杂交链反应液；分别取两种不同的杂交反应液25μL、25μL超纯水、50μL链霉亲和素磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟，反应完毕后，磁性分离去掉上清液，得到两种与磁珠结合的双链DNA底物探针，备用；
(2)蛋白质与底物探针混合孵育反应：取相同体积的两种双链DNA底物探针混合在一起，然后向里面同时加入两种蛋白质PDGF-BB和VEGF165，放在恒温振荡器中37℃孵育40分钟，反应结束后，用磁铁将磁珠和上清液分开，得到的上清液用于纳米孔检测；
(3)α-溶血素纳米孔的组装：用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1M KCl电解质溶液；将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜，在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃，在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA；
(4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的pA级电流通过电流放大器放大采集，并通过低通滤波器进行滤波，滤波频率为5kHz，放大器采集得到的模拟信号通过数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上，通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，由于两种释放DNA的长度不同，稳定性不同，穿过α-溶血素纳米孔时产生的特征信号不同，进而实现对两种蛋白质同时进行检测。
2.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂VEGF165序列为：C30TGTTGTGTGGTTAATCTACCCGGCCC；cDNA-12序列为：AACCACACAACA；适配体VEGF165序列为：
biotin-T10TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA。
3.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂PDGF-BB序列为：
C30GCTGTGGTAGGTTGTGTGGTTGGCGAACAGGATCATGGT；cDNA-25序列为：
CGCCAACCACACAACCTACCACAGC；适配体PDGF-BB序列为：
biotin-T10CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。
4.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂VEGF165、cDNA-12、适配体VEGF165的浓度均为10-6M，用量均为20μL；所述捕获臂PDGF-BB、cDNA-25、适配体PDGF-BB的浓度均为10-6M，用量均为20μL。
5.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中链霉亲和素磁珠浓度为10mg/mL，直径为1.0μm。
6.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中两种双链DNA底物探针浓度为2×10-7M，体积为100μL；其中蛋白质PDGF-BB加入量为浓度10-10M，体积100μL；VEGF165加入量为10-10M/10-9M/10-8M/10-7M，体积100μL。
7.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(3)a)中涂抹的磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正癸烷溶液。
8.根据权利要求1所述的利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤(3)a)中α-溶血素的加入量为1μL 5μg/mL的α-溶血素。
CN201911321766.9A 2019-12-20 2019-12-20 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法 Withdrawn CN110988347A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911321766.9A CN110988347A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911321766.9A CN110988347A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110988347A true CN110988347A (zh) 2020-04-10

Family

ID=70065623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911321766.9A Withdrawn CN110988347A (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110988347A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150354001A1 (en) * 2013-02-07 2015-12-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Hybrid nanopores and uses thereof for detection of analytes
US20160007893A1 (en) * 2013-02-06 2016-01-14 Loxbridge Research Llp Systems and methods for early disease detection and real-time disease monitoring
CN106093438A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 福建农林大学 一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列
CN108192948A (zh) * 2018-01-18 2018-06-22 临沂大学 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法
CN109541211A (zh) * 2018-11-15 2019-03-29 广东工业大学 一种肿瘤标志物在纳米孔中的快速检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160007893A1 (en) * 2013-02-06 2016-01-14 Loxbridge Research Llp Systems and methods for early disease detection and real-time disease monitoring
US20150354001A1 (en) * 2013-02-07 2015-12-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Hybrid nanopores and uses thereof for detection of analytes
CN106093438A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 福建农林大学 一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列
CN108192948A (zh) * 2018-01-18 2018-06-22 临沂大学 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法
CN109541211A (zh) * 2018-11-15 2019-03-29 广东工业大学 一种肿瘤标志物在纳米孔中的快速检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘丽萍: "基于DNA探针的生物纳米孔传感分析" *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Eivazzadeh-Keihan et al. Recent advances on nanomaterial based electrochemical and optical aptasensors for detection of cancer biomarkers
CN106950206B (zh) 一种基于核酸适配体的荧光传感器检测腺苷的方法
Balkourani et al. Emerging materials for the electrochemical detection of COVID-19
Xu et al. Electrochemical biosensors based on magnetic micro/nano particles
Rusling Nanomaterials‐based electrochemical immunosensors for proteins
CN108802142B (zh) 基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性dna酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法
Huang et al. Solid-state nanochannels for bio-marker analysis
Wang et al. Recent advances in the rapid detection of microRNA with lateral flow assays
CN107841527A (zh) 一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法
Fang et al. Unambiguous discrimination of multiple protein biomarkers by nanopore sensing with double-stranded DNA-based probes
Wen et al. Ultramultiplex NaLnF4 nanosatellites combined with ICP-MS for exosomal multi-miRNA analysis and cancer classification
Kumar et al. Electrochemical detection: Cyclic voltammetry/differential pulse voltammetry/impedance spectroscopy
Chen et al. Signal-off/on electrogenerated chemiluminescence deoxyribosensors for assay of early lung cancer biomarker (NAP2) based on target-caused DNA charge transfer
CN113624823B (zh) 基于四面体纳米结构dna的信号探针、其制备方法和用途
CN111500686A (zh) 以磁性材料与核酸外切酶iii构建的癌胚抗原电化学传感器
CN105567808B (zh) 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用
Chen et al. Advances of aptamer-based small-molecules sensors in body fluids detection
Park et al. Nanopore based detection of Bacillus thuringiensis HD-73 spores using aptamers and versatile DNA hairpins
Xu et al. A new method for early detection of pancreatic cancer biomarkers: detection of microRNAs by nanochannels
CN114199969A (zh) 一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器及其应用
Wu et al. One-step and label-free ratiometric fluorescence assay for the detection of plasma exosome towards cancer diagnosis
Zhang et al. Advanced extracellular vesicle bioinformatic nanomaterials: from enrichment, decoding to clinical diagnostics
Jiang et al. A dual-labeled fluorescence quenching lateral flow assay based on one-pot enzyme-free isothermal cascade amplification for the rapid and sensitive detection of pathogens
Ly et al. Diagnosis of human hepatitis B virus in non-treated blood by the bovine IgG DNA-linked carbon nanotube biosensor
CN110988347A (zh) 一种利用纳米孔同时检测两种肿瘤标志物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200410