CN101514983A

CN101514983A - 测定血清总肉碱的试剂

Info

Publication number: CN101514983A
Application number: CNA2008100338188A
Authority: CN
Inventors: 张映新; 崔鹏飞
Original assignee: SHANGHAI AILEX TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI AILEX TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2009-08-26

Abstract

本发明提供了一种测定血清总肉碱的试剂，为含有如下浓度的组分的缓冲溶液：Thio－NAD⁺ 0.001g/L～10g/L，酰基肉碱酯酶0.1KU/L～50KU/L，NADH 0.01g/L～10g/L，肉碱脱氢酶0.5KU/L～500KU/L。本发明的试剂，可以用于检测血清总肉碱，配制简单、快捷，在临床实验室常见的全自动或半自动生化分析仪上即可完成操作，同时使临床对大量标本进行测定成为可能。本发明的试剂，具有较高的稳定性，可以广泛应用在临床体外诊断上，并降低试剂的浪费。在临床实验室常见的全自动或半自动生化分析仪上即可完成操作，可以替代高效液相(HPLC)法和质谱(MS)等方法。

Description

测定血清总肉碱的试剂

技术领域

本发明涉及用定量检测总肉碱(TOTAL CARNITINE，简称TCar)的方法，具体涉定量检测总肉碱(TOTAL CARNITINE，简称TCar)的试剂。

背景技术

肉碱是介导脂肪酸通过线粒体膜进入线粒体进行β-氧化产生供肌肉和其它细胞代谢所需能量的重要的辅因子。它是一种人体中天然存在的类维生素营养物质。其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸燃烧，为机体提供能量。通常情况下，肉碱缺乏会导致骨骼肌和心肌紊乱，因为这两种肌肉都是高能耗的组织。检测肉碱的含量可以对于和此组织相关的疾病进行诊断和治疗支持。此外肾病和透析病人的肉碱会出现代谢紊乱情况，对肉碱进行监测可以对临床措施的采取提供支持，此外，一些关于肉碱的临床意义还再发现中。

目前已报道的测定方法有高压液相色谱(HPLC)法和质谱(MS)法等，多数敏感度不够。有的需要使用放射性同位素，易造成放射性污染。有的方法复杂，需时较长，不能适应临床常规使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定血清总肉碱的试剂，以克服现有技术存在的上述缺陷。

技术原理：标本中的酰基肉碱在酰基肉碱酯酶(ACE)作用下转化为肉碱，肉碱在β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD⁺)氧化型存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的氧化成脱氢肉碱，同时β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD⁺)氧化型转化成在β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)还原型。而脱氢肉碱在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)存在下被肉碱脱氢酶(CDH)特异性的还原成肉碱，同时β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(NADH)也转化成β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD⁺)。如此肉碱和脱氢肉碱Thio-NAD⁺和NADH的存在下通过CDH进行酶循环反应导致Thio-NADH的不断累积，达到平衡后，Thio-NADH的生成量和样本中的肉碱的浓度呈一定比例，从而可以通过测定Thio-NADH的生成速度进行标本的游离肉碱定量。并且，Thio-NAD⁺和NADH可参与上述循环反应直到枯竭状态，灵敏度非常高。

本发明的试剂，为含有如下浓度的组分的缓冲溶液：

Thio-NAD⁺ 0.001g/L～10g/L

酰基肉碱酯酶(ACE) 0.1KU/L～50KU/L

NADH 0.01g/L～10g/L

肉碱脱氢酶(CDH) 0.5KU/L～500KU/L

所说的缓冲溶液没有特别限制，可以是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐、GOOD’S等常规缓冲剂，pH为4～9；

优选的，本发明的试剂中，除了上述必要组分外，还可以包含防腐剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂等；

所说的防腐剂可以是常用的叠氮钠(NaN₃)、硫柳汞、proclin系列、庆大霉素、氯霉素等抗生素或阳离子类表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化氨或十四烷基三甲基溴化氨；

所说的稳定剂可以选择牛血清白蛋白(BSA)、多羟基醇、氨基酸、金属离子、螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性剂或蛋白酶抑制剂，如蛋白酶抑制剂PMSF(对甲基磺酰氟)、抑肽酶、植酸、硼酸盐等，浓度没有特别限制，只要不影响正常的反应测定即可，优选的浓度为0.1～5g/L；

本发明的试剂，可以双试剂，即将试剂分为试剂(R1)和试剂(R2)，也可以将所有组分配在一起形成单试剂，也可以配成2个以上的部分形成多试剂，但以双试剂方式为佳。试剂可以以液体的形式出现；也可以采用先配成液体然后再冷冻保存，使用前解冻成液体使用；也可以制成冻干品保存，使用前用水或一定的缓冲液溶解后再使用。

所说的双试剂中，试剂(R1)的组分为和含量为：

主要成分	浓度范围
主要成分	浓度范围	Thio-NAD+	0.001g/L～10g/L
酰基肉碱酯酶(ACE)	0.1KU/L～50KU/L	Thio-NAD+	0.001g/L～10g/L

溶液的pH值为4-7

试剂(R2)的组分为和含量为：

主要成分	浓度范围
主要成分	浓度范围	NADH	0.01g/L～10g/L
肉碱脱氢酶(CDH)	0.5KU/L～500KU/L	NADH	0.01g/L～10g/L

溶液的pH值为8-9；

本试剂的具体配制方法，和本专业的常规生化试剂配制方法相同，本专业的技术人员可以按照本发明的原理和方法配制出各种类似的试剂，在此不再赘述，但并不脱离本发明的原理和应用范围。

本发明的试剂，可以用于检测血清总肉碱，配制简单、快捷、不需特殊仪器，在临床实验室常见的全自动或半自动生化分析仪上即可完成操作，整个过程只需10分钟，大大节省了人力和物力，同时使临床对大量标本进行测定成为可能。本发明的试剂，具有较高的稳定性，可以广泛应用在临床体外诊断上，并降低试剂的浪费。在临床实验室常见的全自动或半自动生化分析仪上即可完成操作，可以替代高效液相(HPLC)法和质谱(MS)等方法。

附图说明

图1为本法和HPLC法的对比。

图2为利用本方法测定的试剂线性。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步具体描述，但并不局限于此。

实施例1

按照下列配方配制试剂：

用上述试剂测定新鲜的病人血清中的TCar的含量，在日立7170型全自动生化分析仪进行检测，测定参数如下：

波长(副/主)：600/405nm

测定方式：rate A

测定温度：37℃

测定时间：600秒

测定操作步骤如下表：

用市售肉碱配制浓度为50μmol/L的溶液作为标准品

计算方法：

样本中总肉碱浓度(μmol/L)＝样本吸光度变化速率/标准品吸光度变化速率×50

用HPLC测定样本的总肉碱作为对照，结果如图1：

图1中，曲线1代表理论曲线，曲线2代表测定结果的回归曲线，纵坐标为本发明的测定结果，横坐标为HPLC测定结果，计量单位为μmol/L；统计：y＝0.948x+1.07

测定例数＝20

Claims

1.测定血清总肉碱的试剂，其特征在于，为含有如下浓度的组分的缓冲溶液：

Thio-NAD⁺ 0.001g/L～10g/L

酰基肉碱酯酶(ACE) 0.1KU/L～50KU/L

NADH 0.01g/L～10g/L

肉碱脱氢酶(CDH) 0.5KU/L～500KU/L。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所说的缓冲溶液是三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐或GOOD’S，pH为4～9。

3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包含防腐剂、螯合剂、稳定剂、表面活性剂或蛋白酶抑制剂。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所说的防腐剂是叠氮钠(NaN₃)、硫柳汞、庆大霉素、氯霉素等抗生素或阳离子类表面活性剂。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所说的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)、甘油、氨基酸、金属离子、螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性剂或蛋白酶抑制剂。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，为试剂(R1)和试剂(R2)组成的双试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所说的双试剂中，试剂(R1)的组分和含量为：

Thio-NAD+ 0.001g/L～10g/L

酰基肉碱酯酶(ACE) 0.1KU/L～50KU/L；

试剂(R2)的组分为和含量为：

NADH 0.01g/L～10g/L

肉碱脱氢酶(CDH) 0.5KU/L～500KU/L。

8.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，为冻干制剂。