CN102250870B - 实现热放大的量热法检测重金属用固定化酶的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种实现热放大，适用于量热法快速检测重金属固定化酶的制作方法，其特点是所述的固定化酶是醇氧化酶和过氧化氢酶通过共价偶联法固定在控制多孔玻璃微珠上，制作方法步骤为：(1)氨基活化；(2)引入偶联试剂；(3)酶的固定化。本发明方法制作的固定化酶利用级联反应大大提高了量热法快速检测重金属的原始热信号强度以及检测的灵敏度和分辨率，并且可方便进行固定化酶的再生，节约成本，保证连续重复使用。实现了重金属的量热法快速测定，不受样品电化学活性物质或颜色、浑浊的干扰。

Description

实现热放大的量热法检测重金属用固定化酶的制作方法
技术领域
本发明涉及一种用于量热法快速检测重金属的固定化酶的制作方法，尤其是能够实现热放大的量热法快速检测重金属用固定化酶的制备方法，属重金属检测领域。
背景技术
重金属(汞、铜、铅等)对环境的影响日趋严重，并已成为危害人类健康的重大隐患，对其进行快速、有效检测和监控具有非常重要的现实意义。
目前，国内外重金属的快速检测大多为光学和电化学方法等，这些方法利用重金属对酶的抑制作用，通过检测酶反应的电化学活性或有色产物的多少反映样品中重金属的量。然而，这些方法容易受样品中其他电化学活性物质或光学物质的干扰，造成结果的不准确性。量热法通过测量生化反应过程的热量变化进行分析，与光学、电化学等方法比较，其通用性强，不受试样自身颜色、浑浊、及电化学等属性的干扰，能够满足实际试样的检测要求，尤其适合现场速测，并且检测原理简单、可靠，有利于微型系统的开发。
酶促反应伴随着热量变化，然而，酶促反应产生的热量往往比较小，使用量热法进行酶促反应的分析测量时，其有效信号常会被干扰信号掩盖，灵敏度低，分辨率下降，测量将非常困难，限制了量热法的应用。虽然市场存在一些商用微量热计能够满足微小热量变化测量的要求，但它们稳定时间长(几个小时)，价格高(几十万到上百万人民币)，使用环境要求苛刻，只能实验室中使用，不适用于快速检测和现场使用。同时，用于现场快速检测的量热系统受成本、环境的限制，其灵敏度不近如人意，故采用热放大这一有效手段，酶反应热可通过连续的酶促反应来提高，即同时使用多种酶，先前酶反应的产物可以被连续地催化，最终的热信号是各级酶反应热的总和，能增强有效热信号强度，提高系统灵敏度、分辨率和选择性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有快速检测重金属方法中，容易受样品中电化学活性物质或颜色、浑浊的干扰，造成结果不准确的缺点，提供一种产生的热量大，易于测量的适用于量热法快速检测重金属用固定化酶的制作方法，通过热放大可有效改善量热有效信号低的不足，提高检测的灵敏度和分辨率。
本发明的技术方案是：实现热放大的量热法快速检测重金属用固定化酶的制作方法，其特点是，所述的固定化酶是醇氧化酶和过氧化氢酶通过共价偶联法固定在控制多孔玻璃微珠(Controlled Porosity Glass，CPG)上，制作方法步骤为：
1、氨基活化
粒径125-140nm，孔径50nm的控制多孔玻璃微珠加入1M的硝酸溶液，真空脱气去除控制多孔玻璃微珠微孔内的空气，加热沸腾条件下酸洗1小时，冷却后蒸馏水洗去硝酸，在120℃条件干燥4小时，移入干燥器内冷却至常温，将控制多孔玻璃微珠加入含10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的二甲苯溶液，真空脱气后在75℃反应4小时，反应后控制多孔玻璃微珠先用乙醇冲洗，再以蒸馏水冲洗，在95℃条件干燥4小时后，置于干燥器内冷却备用；
2、引入偶联试剂
氨基活化后的控制多孔玻璃微珠按17mg∶1ml的比例加入含2.5％戊二醛的0.1M、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，减压脱气30分钟后常压反应30分钟，此时，控制多孔玻璃微珠呈砖红色；
3、酶的固定化
醇氧化酶和过氧化氢酶按1∶1～1∶2的活力比例混合，与已偶联戊二醛的控制多孔玻璃微珠在4℃条件混合震荡17小时完成固定化过程，在0.1M、pH 7.0磷酸盐缓冲液冲洗后，加入25mg的乙醇胺中断未反应的基团，最后用0.1M、pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗后放置于该缓冲液中于4℃冰箱内保存备用。
本发明方法制作的固定化酶是由醇氧化酶和过氧化氢酶组成，前者被重金属竞争性抑制，后者能催化前者催化产生的水解产物-过氧化氢，其反应原理为：
Figure BSA00000511353500021
Figure BSA00000511353500022
其中Q1和Q2分别为酶促反应(1)和(2)两个过程放出的热量。本发明方法制作的固定化酶与使用单级醇氧化酶酶促反应(1)相比，其总热量Q是酶促反应(1)和(2)过程的放热和(Q1+Q2)，增加了酶促反应(2)的放热量Q2，由于Q2约为87kJ/mol，反应热量大，可以大大提高灵敏度和分辨率。
进行重金属检测时，样液中存在重金属，利用重金属对醇氧化酶的抑制作用，醇氧化酶的活性降低，与未受抑制的同种酶体系进行比较，过氧化氢的产量降低，放热量Q1减少；酶促反应(2)的反应放热量Q2也随着过氧化氢浓度的降低进一步减少，测得有无重金属抑制的反应热量之差ΔQ，通过标定，这个热量差就反映了样品中重金属的浓度。所以，由相同重金属浓度引起的热量变化会由于酶促反应(2)的存在大幅度升高，引起的热量变化能提高几十到上百倍，故本发明方法制作的由醇氧化酶和过氧化氢酶组成的固定化酶与单独使用醇氧化酶相比，大大降低了测热的难度，提高了检测灵敏度和分辨率。
对于基于抑制作用的固定化酶分析重金属的方法，为保证分析检测的连续进行一般考虑固定化酶的一次性使用或再生，前者成本高，并且更换固定化酶的流程繁琐，易引入干扰；后者可通过添加金属络合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或特定的还原剂。对本发明方法涉及的醇氧化酶，损失的酶活度是由于重金属的竞争性抑制引起的，能够使用甲醇冲刷固定化酶再生，这一再生方式对于基于流动注射分析的量热检测方法十分方便，能够自动完成。
本发明的有益效果是：实现了重金属的量热法快速测定，不受样品电化学活性物质或颜色、浑浊的干扰；同时，由本发明方法制作的固定化酶利用级联反应(酶促反应(1)和酶促反应(2))将酶促反应总热量Q由原来的Q1提高到了Q＝(Q1+Q2)，大大提高了量热法快速检测重金属的原始热信号强度以及灵敏度和分辨率；并且，通过引入甲醇可方便进行固定化酶的再生，节约成本，保证连续重复使用。
附图说明
图1不同条件下TAMAir微量热计的热流曲线
图中：曲线A-固定化醇氧化酶酶促反应的热流曲线；
曲线A′-固定化醇氧化酶经Hg(II)抑制后酶促反应的热流曲线；
曲线B-本发明方法制作的固定化酶酶促反应的热流曲线；
曲线B′-本发明方法制作的固定化酶经Hg(II)抑制后酶促反应的热流曲线；
具体实施方式
一种能够实现热放大，适用于量热法快速检测重金属的固定化酶的制作方法，其特点是所述的固定化酶是醇氧化酶和过氧化氢酶通过共价偶联法固定在控制多孔玻璃微珠(Controlled Porosity Glass，CPG)上，制作方法步骤为：
1、氨基活化
粒径125-140nm，孔径50nm的控制多孔玻璃微珠加入1M的硝酸溶液，真空脱气去除控制多孔玻璃微珠微孔内的空气，加热沸腾条件下酸洗1小时，冷却后蒸馏水洗去硝酸，在120℃条件干燥4小时，移入干燥器内冷却至常温，将控制多孔玻璃微珠加入含10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的二甲苯溶液，真空脱气后在75℃反应4小时，反应后控制多孔玻璃微珠先用乙醇冲洗，再以蒸馏水冲洗，在95℃条件干燥4小时后，置于干燥器内冷却备用；
2、引入偶联试剂
氨基活化后的控制多孔玻璃微珠按17mg∶1ml的比例加入含2.5％戊二醛的0.1M、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，减压脱气30分钟后常压反应30分钟，此时，控制多孔玻璃微珠呈砖红色；
3、酶的固定化
醇氧化酶和过氧化氢酶按1∶1～1∶2的活力比例混合，与已偶联戊二醛的控制多孔玻璃微珠在4℃条件混合震荡17小时完成固定化过程，在0.1M、pH 7.0磷酸盐缓冲液冲洗后，加入25mg的乙醇胺中断未反应的基团，最后用0.1M、pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗后放置于该缓冲液中于4℃冰箱内保存备用。
具体检测实例1：
以0.05mg/L的Hg(II)标准溶液为样液，使用TAMAir微量热计(瑞典，ThermometricInc)，混合池，工作温度20℃，0.1M、pH 7.0磷酸盐缓冲液体系，反应池放置固定化醇氧化酶或本发明方法制作的固定化酶，注入0.5mM甲醇溶液作为底物，测量两类酶体系催化反应的放热量，得到如图1所示的热流曲线，基于不同情况的热流曲线数据，进行有无样液通过的酶体系的反应放热比较，图1中各热流曲线下的积分面积表示了不同情况的热量变化，由图1所示曲线下的积分面积直观可知，曲线B的积分面积远大于曲线A的积分面积，说明通过级联反应，实现了热放大；并且，Hg(II)的抑制引起醇氧化酶酶促反应的热量变化，即曲线A的积分面积减去曲线A’的积分面积，与添加过氧化氢酶后酶促反应的热量变化，即曲线B的积分面积减去曲线B’的积分面积，变化了几十倍，灵敏度和分辨率大大增强。
具体检测实例2：
以0.05mg/L的Hg(II)标准溶液为样液，使用文献(郑艺华等，用于有机磷农药残留快速检测的酶法量热式流动注射分析检测仪.仪器仪表学报，2005，26(7)：733-737)开发的量热式生物传感器(量热式流动注射分析检测仪)，使用0.1M、pH 7.0磷酸盐缓冲液，反应温度30℃，流速1mL/min，酶柱中放置单纯的固定化醇氧化酶，系统没有得到有效热信号，说明原始热信号的强度不能满足要求；酶柱中放置本发明方法制作的固定化酶，系统能够进行正常测试，变换不同浓度的Hg(II)标准溶液，得到线性范围0.001-0.04mg/L，检测限为0.0005mg/L；检测结果进一步与采用相同醇氧化酶的相同电化学方法的文献(D.Compagnoneaet al.Fast amperometric FIA procedure for heavy metal detection using enzyme inhibition.Analytical Letters，34(1)：17-27)比较，检测限由0.05mg/L提高到0.0005mg/L，提高了100倍。

Claims (1)

1.一种实现热放大的量热法快速检测重金属Hg II用固定化酶的制作方法，其特征在于，所述的固定化酶是醇氧化酶和过氧化氢酶通过共价偶联法固定在控制多孔玻璃微珠上，制作方法步骤为：
(a)氨基活化
粒径125-140nm，孔径50nm的控制多孔玻璃微珠加入1M的硝酸溶液，真空脱气去除控制多孔玻璃微珠微孔内的空气，加热沸腾条件下酸洗1小时，冷却后蒸馏水洗去硝酸，在120℃条件干燥4小时，移入干燥器内冷却至常温，将控制多孔玻璃微珠加入含10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的二甲苯溶液，真空脱气后在75℃反应4小时，反应后控制多孔玻璃微珠先用乙醇冲洗，再以蒸馏水冲洗，在95℃条件干燥4小时后，置于干燥器内冷却备用；
(b)引入偶联试剂
氨基活化后的控制多孔玻璃微珠按17mg∶1ml的比例加入含2.5％戊二醛的0.1M、pH7.0的磷酸盐缓冲液，减压脱气30分钟后常压反应30分钟，此时，控制多孔玻璃微珠呈砖红色；
(c)酶的固定化
醇氧化酶和过氧化氢酶按1∶1～1∶2的活力比例混合，与已偶联戊二醛的控制多孔玻璃微珠在4℃条件混合震荡17小时完成固定化过程，在0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液冲洗后，加入25mg的乙醇胺中断未反应的基团，最后用0.1M、pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗后放置于该缓冲液中于4℃冰箱内保存备用。
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