CN103725698A

CN103725698A - 化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用

Info

Publication number: CN103725698A
Application number: CN201310751324.4A
Authority: CN
Inventors: 李越希; 许桂丽; 蔡冉; 潘英; 李素芹; 李丙军; 陈乐如; 周洁; 张素芬; 马颖; 袁敬宇; 徐悦玥; 尚彦红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-04-16

Abstract

本发明化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、抗体和试剂盒领域。本发明是通过计算机分析，筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的强抗原表位，第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段。表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段，可用于金黄色葡萄球菌抗体的检测及用于免疫制备抗金黄色葡萄球菌的单抗和多抗等。

Description

化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用

技术领域

本发明涉及的是化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的ClfA片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及金黄色葡萄球菌快速检测等，本发明涉及基因工程技术和诊断试剂领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种重要的人兽共患病原菌，是一种世界公认的导致人类和动物化脓性疾病的致病因子，也是引起食物中毒的重要因子。它能导致皮肤和软组织感染以及危及生命的菌血症转移性并发症，如肺炎、心内膜炎、化脓性关节炎和骨髓炎。金黄色葡萄球菌在医院内是一个可以检测的病原体，它会导致免疫功能低下的宿主、手术病人和留置医疗设备感染。

传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌的方法步骤较多，并且具有一定的局限性。大多数免疫学技术例如荧光标记抗体实验、酶联免疫试验（ELISA）、放射性免疫试验等都得到广泛应用，但它们所需成本较高、耗时且需对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有重要的意义。

金黄色葡萄球菌产生的细胞外结合基质蛋白（ECMBP），包括FnBP、ClfA 和Ebp等，它们均为细菌表面的蛋白成分，具有相似的结构。其中， ClfA在细菌生长的各个阶段都出现，且几乎存在于所有金黄色葡萄球菌表面，是金黄色葡萄球菌表面重要的粘附素，可介导金黄色葡萄球菌粘附到宿主基质蛋白上，这是金黄色葡萄球菌感染的重要一步。金黄色葡萄球菌在生长期内都有产生ClfA，静止期内大量表达。不同菌株中ClfA的功能结构域高度保守，促使ClfA成为金黄色葡萄球菌抗体研究中的热门粘附因子。有报告指出，用免疫荧光技术分析野生型NewMan株和clfa::Tn917 NewMan突变株抗ClfA A区是裸露在细菌细胞表面的。通过用试纸条检测金黄色葡萄球菌菌液的阳性结果可以说明CIfA蛋白很可能是暴露与金黄色葡萄球菌加膜外蛋白或者说不被荚膜完全遮蔽。

发明内容

本发明是化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的ClfA的部分片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的部分片段 ,第40个氨基酸--第194个氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗，亦可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。

通过计算机软件分析，筛选出金黄色葡萄球菌的特异性表面蛋白ClfA抗原表位富集区，选择原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达。表达的蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，组装胶体金试剂条，为金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立奠定基础。

化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的155个氨基酸的基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的：

1．金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全氨基酸序列，发现金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的N端（第40氨基酸 — 第194 氨基酸）含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH I酶切位点（下画线部分），在3'端增加了终止密码子（TGA）和Xho I酶切位点（下画线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2的BamH I和Xho I酶切位点内。

筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的抗原表位氨基酸序列（第40个aa－第194个aa）：

Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr pro Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr pro Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln Asn Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln Ser Thr

化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位基因的DNA序列(480bp)：

GGATCC AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAA TCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG AAG ACG GAT GAC ACC AAT GTC TCG GAT ACG AAA ACC AGC TCT AAC ACG AAC AAT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG AAT CCG GCC CAG CAA GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GAA GAA ACG CCG GTT ACC GGT GAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC AAC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CAA TCG AGC AAC ACC AAT GCA GAA GAA CTG GTC AAT CAG ACC TCT AAC GAA ACG ACC TTT AAC GAC ACG AAT ACC GTG TCT AGT GTT AAT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GAA AAC GTG TCA ACG ACC CAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GAA TCA GCA CCG CAG TCA ACC TAA CTCGAG

2．表达金黄色葡萄球菌ClfA片段重组质粒的构建:

提取质粒pGEX4T-2,用 BamH I和Xho I双酶切，1.0%的琼脂糖凝胶电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水中。同样用BamHI和Xho I双酶切化学合成的金黄色葡萄球菌ClfA片段，1.0%的琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段,溶于去离子水中。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后的DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶16℃过夜连接，使金黄色葡萄球菌ClfA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白。

3．重组质粒的筛选与鉴定:

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含氨苄青霉素(100μg／ml)LB平板，置37℃ 过夜。次日随机挑取转化菌落, 接种至含4ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg／ml)的试管内振摇，提取重组质粒，用BamH I和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下约480bp的目的片段。将含有外源基因的质粒进行DNA测序分析，测序结果证实重组质粒含有金黄色葡萄球菌ClfA基因片段，序列完全正确：

AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAA TCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG AAG ACG GAT GAC ACC AAT GTC TCG GAT ACG AAA ACC AGC TCT AAC ACG AAC AAT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG AAT CCG GCC CAG CAA GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GAA GAA ACG CCG GTT ACC GGT GAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC AAC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CAA TCG AGC AAC ACC AAT GCA GAA GAA CTG GTC AAT CAG ACC TCT AAC GAA ACG ACC TTT AAC GAC ACG AAT ACC GTG TCT AGT GTT AAT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GAA AAC GTG TCA ACG ACC CAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GAA TCA GCA CCG CAG TCA ACC

构建的重组质粒表达金黄色葡萄球菌ClfA基因片段（155个氨基酸），在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长381个氨基酸,其氨基酸序列如下：

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr pro Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr pro Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln Asn Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln Ser Thr

4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含4ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg／ml)的试管内，37℃振荡培养4h，保存菌种。剩下的菌液加IPTG至终浓度0.2mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为42 kDa的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白，表达量约为25%，而对照菌pGEX4T-2无此蛋白条带。

5．表达金黄色葡萄球菌ClfA蛋白的纯化:

1）表达金黄色葡萄球菌ClfA蛋白工程菌的超声裂解

将诱导表达融合蛋白的工程菌8000 rpm，4℃，离心20 mins，菌体重悬于原培养液1/10体积的裂解液(20mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5%甘油)内，冰浴超声破菌75次，8000 rpm，4℃，离心20 mins弃沉淀，收集上清。收集的上清用于下一步的亲和层析纯化。

2）表达金黄色葡萄球菌ClfA蛋白的纯化

上清溶液加已经平衡的High-Affinity GSH Resin 10ml，4℃结合过夜,上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.0+10 mmol/L GSH）分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白片段。

6. 表达的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白片段用于金黄色葡萄球菌疫苗。

7. 将表达的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白片段，用于免疫Balb/C小鼠，制备特异性单克隆抗体。

8. 将表达的金黄色葡萄球菌ClfA蛋白片段，用于免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体抗体。

9．将制备的单抗和多抗组装胶体金试剂条，用于金黄色葡萄球菌的现场、快速检测。

所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

上述所述的方法制备的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，用于金黄色葡萄球菌抗体检测及单抗和多抗的制备，并用于胶体金试剂条的组装。

本发明与现有技术相比具有的优点

本发明表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA片段，有较多优点:

1.目前，缺少金黄色葡萄球菌疫苗。疫苗接种可提升体内特异性抗体滴度，同时也增加机体细胞免疫力，与抗生素有协同作用，并能降低抗生素所产生的选择压力，延缓耐药菌的产生。但由于金黄色葡萄球菌疫苗为灭活全菌疫苗，除保护性免疫原外，还含有很多不相关的和有毒的成分，毒副反应较大，使临床应用受限。研究者们也在积极致力于新型疫苗的研制。表面蛋白ClfA存在绝大多数的的金黄色葡萄球菌中，本发明选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。

2.目前，缺乏快速检测金黄色葡萄球菌的方法。本发明选用金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位富集区，免疫动物，制备特异性抗体，组装胶体金试剂条，提高金黄色葡萄球菌的检出率。

3．根据筛选出的金黄色葡萄球菌ClfA片段氨基酸序列，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，该基因适宜在原核细胞内高表达。

4．构建的表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的工程菌，表达量可达菌体蛋白的25%，且表达的是可溶性蛋白，易于纯化，可大量纯化制备该蛋白。目前未见表达该段蛋白的报道。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1是分子生物学软件对金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全长氨基酸序列抗原表位分析结果。结果显示，在N端从第 40个氨基酸到第194个氨基酸，含有强的亲水性抗原表位，即图内箭头标示的位置。

图2是表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的重组质粒构建流程图。

图3是用1.0％的琼脂糖凝胶检测重组质粒的双酶切图。M：DNA marker DL5000，1：重组质粒pGEX4T-2-clfa经BamH I和Xho I双酶切切下约480bp的目的片段，即图内箭头标示的位置2：质粒pGEX4T-2经BamH I和Xho I双酶切没有目的条带出现。

图4是表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA重组菌的SDS-PAGE分析结果。

M：蛋白marker(全式金)；C：对照菌含pGEX4T-2质粒；1～3:重组菌,三个重组子均表达相对分子量约为45kDa的融合蛋白，即图内箭头标示的位置。

图5是表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA纯化后的SDS-PAGE分析结果。M:蛋白marker(全式金)；1: High-Affinity GST Resin亲和层析柱纯化后的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA，OD₂₈₀=1.1,浓度约1.1mg/ml；2：1mg/ml的BSA。

图6是ELISA检测兔抗血清的结果。表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA免疫新西兰大白兔制备抗血清，血清效价达1:50000。

具体实施方式

本发明实施方式的详细说明：

金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位的分析、基因合成及表达

通过计算机分析金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全长氨基酸序列，筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的强抗原表位,选用原核生物偏爱的密码子，翻译成相应的核苷酸序列，化学合成金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA强抗原表位全新的基因序列。将基因片段克隆至质粒pGEX4T-2内的BamH I和XhoⅠ位点之间，与载体上的起始密码子的翻译框架一致，表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的工程菌，表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA占菌体蛋白总量的25%左右，且可溶。

材料与方法

1. 菌种与质粒: 大肠杆菌BL21(DE3)及表达载体pGEX4T-2为南京军区军事医学研究所医药生物所保存。

2. 分子生物学试剂:限制性内切酶BamH I、Xho I、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒为Promega公司产品。DTT及IPTG为BIOSHARP公司产品。其它试剂均为进口或国产分析纯。

3. 基因片段的合成: 由南京金斯瑞生物科技有限公司帮助合成。

4. 基因克隆方法: DNA的酶切、连接；质粒的提取、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。

5. DNA序列分析：用Promega公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。

结果

1.金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位筛选及基因片段的合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等分子生物学软件，通过计算机分析金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全长氨基酸序列（GeneBank ,ACCESSION：Z18852），筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的强抗原表位,即从第40个氨基酸到第194个氨基酸，见图1。其氨基酸序列如下：

根据筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的抗原表位氨基酸序列，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH I酶切位点（下画线部分），在3'端增加终止密码子TAA和Xho I酶切位点（下画线部分），使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamH I和Xho I酶切位点内。化学合成的含金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位基因的DNA 序列（480bp）如下：

2．表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA片段重组质粒的构建:

提取质粒pGEX4T-2，用 BamH I和Xho I双酶切，1.0%的琼脂糖凝胶电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。同样用BamH I和Xho I双酶切化学合成的基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。

取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA 连接酶16℃，过夜连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，构建流程见图2。

3．重组质粒的鉴定:

将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),将转化产物涂布含100μg／ml氨苄青霉素的固体LB培养基上，置37℃培养过夜。次日随机挑选2个转化子菌落，分别标记为1、2号，同时挑1个空质粒pGEX4T-2转化的对照菌，标记为C，分别接种到含4ml液体LB培养基的试管内，试管内培养基含氨苄青霉素100μg／ml，置37℃振荡培养5h,提取重组质粒。用BamH I和Xho I双酶切，用1.0％的琼脂糖凝胶进行检测。重组质粒切出480bp的目的基因片段，见图3，而含质粒pGEX4T-2的对照菌没有切出该基因片段。初步证实，转化子含有金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段。

提取重组子的质粒，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，序列完全正确：

构建的重组质粒表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA片段，长155个氨基酸，在其N端融合了载体上的226个氨基酸，全长381个氨基酸,其氨基酸序列如下：

4．表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA工程菌的筛选鉴定:

将含有重组质粒的阳性转化子和1个空质粒pGEX4T-2转化的对照菌，接种至含4ml LB培养基的试管内，试管内培养基含氨苄青霉素100μg／ml，37℃振荡培养4h，保存菌种后，加IPTG至终浓度0.2mmol/L,继续振荡培养25℃诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为45kDa的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA，表达量约为25%，而对照菌无此蛋白带，见图4。

表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的纯化

根据表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA融合有载体上的GST蛋白, 表达的GST融合蛋白可很方便用GSH琼脂糖凝胶FF分离，因此我们决定采用亲和层析法，用High-Affinity GSH Resin进行纯化。具体步骤如下：

材料和方法

1. 主要试剂:

High-Affinity GSH Resin为南京金斯瑞生物科技有限公司产品，IPTG、DTT为BIOSHARP公司产品。其它试剂均为国产或进口分析纯。

2. 表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA工程菌的超声裂解:

将培养的表达黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的工程菌倒入离心杯中，8000rpm, 4℃，离心20mins,弃上清，菌体重悬于原培养液1／10体积的裂解液内，裂解液为：20mmol/L PB pH8.0、10 mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5%甘油，冰浴超声破菌10mins，8000rpm，4℃，离心20mins，弃沉淀，收集上清。收集的上清用于亲和层析纯化。

3. 表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的纯化：

上清溶液加已经平衡的High-Affinity GSH Resin 10ml，4℃结合过夜,上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的1×PBS（含1mM pmsf）洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0+10 mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的金黄色葡萄球菌表面蛋白片段。

结果

将High-Affinity GSH Resin凝胶柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果显示，经诱导明显表达出ClfA/GST融合蛋白,表达产物主要存在于上清液中，分子量约45kDa见图5。洗脱后测得OD₂₈₀=1.1，计算得浓度约1.1mg/ml，SDS-PAGE显示表达产物纯度在90%以上。

纯化的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的应用

将纯化获得的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原，免疫新西兰大白兔，制备多抗血清。采用间接ELISA法检测抗血清效价，结果证实，金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA具有较好的免疫原性和抗原性。

材料和方法

1. 主要材料：

新西兰大白兔购自南京华埠康生物制品公司，96孔酶联板为深圳金灿华公司产品，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂为sigma公司产品，Goat Anti-rabbit IgG HRP为北京博奥森公司产品，TMB显色液为beyotime公司产品。其他试剂为国产或进口分析纯。

2. 动物免疫及抗血清制备：

挑取两只2kg左右的健康雌性新西兰大白兔，耳缘静脉取血约1ml，制备免疫前正常血清，作为阴性对照。首次免疫将纯化获得的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA与弗氏完全佐剂按体积比1:1在注射器内推成乳剂，进行背部皮下多点注射。在初次免疫后第2w、第4w将纯化获得的ClfA与弗氏不完全佐剂按体积比1:1在注射器内推成乳剂，进行背部皮下多点注射。在第6w注射ClfA纯抗原，1w后取血检测血清效价。颈动脉取血，室温放置1h，4℃静置过夜，以2500g离心30min，取上清，-20℃保存。

3. 免疫动物血清的ELISA检测:

将纯化获得的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA稀释至1μg/ml，每孔100μl包被96孔酶联板，4℃过夜。用PBST洗涤3次，每孔加20%小牛血清封闭液130μl，37℃封闭2h。兔抗血清从1:1000开始稀释，阴性对照按相同比例稀释，37℃反应1h。PBST洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗兔的IgG(1：5000)，37℃反应30min。PBST洗涤5次后，加入TMB显色液，37℃避光显色10min，以1mol/L HCl终止反应，用酶标仪检测A₄₅₀值。以P/N≥2.1的抗体最大稀释度作为效价终值。

结果

采用ELISA法检测抗血清的效价，兔抗血清从1:1000开始稀释，同时取免疫前的血清作为阴性对照，ELISA结果显示，ClfA纯抗原加强免疫后血清效价大于1：50000，阴性对照不显色，见图6。说明制备的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA具有较好的免疫原性和抗原性。

化学合成的ClfA抗原表位富集区的基因片段序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。

Claims

1.一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，即第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点，在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点，化学合成的基因序列全长480bp，序列如下：

GGATCC AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAA TCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG AAG ACG GAT GAC ACC AAT GTC TCG GAT ACG AAA ACC AGC TCT AAC ACG AAC AAT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG AAT CCG GCC CAG CAA GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GAA GAA ACG CCG GTT ACC GGT GAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC AAC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CAA TCG AGC AAC ACC AAT GCA GAA GAA CTG GTC AAT CAG ACC TCT AAC GAA ACG ACC TTT AAC GAC ACG AAT ACC GTG TCT AGT GTT AAT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GAA AAC GTG TCA ACG ACC CAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GAA TCA GCA CCG CAG TCA ACC TAA CTCGAG 。

2.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下：

金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段重组质粒的构建:

用 BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX4T-2和化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，电泳回收后，用T4 DNA 连接酶连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段插入到载体pGEX4T-2内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长381个氨基酸,该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的第40个氨基酸至第194个氨基酸，全长氨基酸序列如下：

表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定:

将重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布含100μg／ml氨苄青霉素的LB平板，置37℃ 过夜，次日随机挑取转化菌落和含质粒pGEX4T-2的对照菌，提取质粒，双酶切验证,切出480bp的目的条带；将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有金黄色葡萄球菌ClfA基因片段，序列完全正确；将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含氨苄青霉素100μg／mL 的LB培养基内，37℃振荡培养4h，加IPTG至终浓度0.2 mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量约为42 kD的金葡菌表面蛋白ClfA，表达量约为25%，而含空质粒pGEX4T-2的对照菌无此蛋白带；

表达金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的纯化：

将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收菌，菌体重悬于裂解液，裂解液为20mmol/L PB pH8.0、10mmol/L EDTA、1mmol/L DTT、5%甘油，冰浴超声破菌75次，离心收集上清，上清溶液加已经平衡的High-Affinity GSH Resin凝胶10ml，4℃结合过夜,上样，收集穿透液；用十倍柱床体积的1×PBS洗涤柱子，接着用50ml高浓度的GSH洗脱液，洗脱液为50 mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 10 mmol/L GSH，分三次洗脱目的蛋白,即为纯化的金葡菌ClfA蛋白片段。

3.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。

4.权利要求2或权利要求3所述的方法制备的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的片段，用于金黄色葡萄球菌抗体检测及单抗和多抗的制备，并用于胶体金试剂条的组装。