CN111909279A

CN111909279A - 一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用

Info

Publication number: CN111909279A
Application number: CN202010820626.2A
Authority: CN
Inventors: 陈创夫; 吴鹏; 王震; 王勇; 尹欣悦
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111909279B

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用。本发明制备了三个融合蛋白，并用其免疫小鼠后，监测小鼠抗体水平，然后使用金黄色葡萄球菌标准株与无乳链球菌标准株对小鼠进行攻毒保护实验，记录小鼠存活时间与器官载菌量。结果：FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白与对照组相比可以减少脾脏和肝脏的载菌量。FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体。结论：FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白可以对金黄色葡萄球菌与无乳链球菌感染起到一定的保护作用。

Description

一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌的研究已有一个世纪的历史。葡萄球菌是兼性需氧革兰氏阳性细菌。在致病性葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的侵袭性传染致病菌。抗菌疗法是控制葡萄球菌性乳房炎的主要手段，大量抗生素的使用造成金黄色葡萄球菌耐药性增加，治愈率降低。尽管使用了抗生素治疗，但金黄色葡萄球菌引起的感染仍然常常复发。一种可能的原因是它们在宿主细胞内存活的能力。随着细菌抗生素耐药性的增加，了解致病菌对于设计新的防治方法至关重要。金黄色葡萄球菌被认为对公共健康具有严重威胁。金黄色葡萄球菌通过携带者传播，具有大量毒力因子，包括毒素、细胞壁相关的粘附素和分泌的外蛋白。金黄色葡萄球菌具有一系列粘附素，位于微生物表面，并与细胞外基质成分(如胶原蛋白，纤连蛋白，纤维蛋白原，层粘连蛋白和弹性蛋白)相互作用，具有较高的亲和力和特异性。一种葡萄球菌粘附素由具有胶原蛋白结合位点的N末端结构域和附着于细菌细胞壁并伸入细胞质的对映体结构域组成。

行业研究背景：一种金黄色葡萄球菌疫苗需要解决多种毒力因子。荚膜多糖成分、细胞壁相关蛋白、分泌的凝血因子和分泌的蛋白作为金黄色葡萄球菌感染的候选疫苗。金黄色葡萄球菌的从感染宿主组织的清除取决于病原体的调理吞噬作用(Opsonophagocytickilling，OPK)。然而，葡萄球菌已发展出抵抗OPK的毒力策略。金黄色葡萄球菌的标志是病原体凝结纤维蛋白原和部署表面蛋白以使其与纤维蛋白原纤维凝集的能力，以此作为抵抗OPK的手段。此外，金黄色葡萄球菌特异性免疫球蛋白的效应功能可以被SpA阻断，从而葡萄球菌OPK被干扰了。由COMBO 2疫苗所产生的抗体可以靶向通过中和纤维蛋白原结合蛋白(凝集因子和纤连蛋白结合蛋白)和SPA都毒力策略，因此即使在吞噬杀伤葡萄球菌能力严重受损的白细胞减少症小鼠中也可能促进OPK。金黄色葡萄球菌感染性心内膜炎(infective endocarditis,IE)的主要毒性因子是金黄色葡萄球菌ClfA和FnBPA。然而它们在动物模型中并不完全令人满意。这些失败可能与多种原因有关，包括所呈递抗原的性质，金黄色葡萄球菌表面蛋白过多等。2003年金黄色葡萄球菌疫苗(MASTIVACSI)在以色列获得专利，可以保护小鼠对金黄色葡萄球菌的免受感染。尽管临床前和早期临床研究取得令人鼓舞的结果，但尚未获得许可的金黄色葡萄球菌疫苗。用纯化的α-溶血素(α-hemolysin,Hla)、血浆凝固酶(Coagulase，Coa)、ClfA、铁表面决定簇B(iron surface determinant B，IsdB)免疫小鼠可引发抗原特异性免疫反应，保护动物免受金黄色葡萄球菌感染。然而，重组IsdB疫苗V710的临床试验，最近终止，V710免疫未显示出临床益处。人葡萄球菌单抗原疫苗试验近期失败的关键概念是金黄色葡萄球菌在小鼠模型中需要多种不相同的分泌产物才能引起疾病。如果是这样的话，可能需要疫苗诱导的几种不同毒力因子的中和来建立保护性免疫。相应的超抗原疫苗的临床开发尚未发展到可以评估该方法疗效的阶段。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)首先从患有乳房炎的牛中分离，之后从数个国家的孕妇和新生儿中分离出这种细菌。无乳链球菌在牲畜和各种水生鱼类流行病中也有发现。这种细菌可引起动物败血症和脑膜炎，死亡率高。人类下消化道和阴道生殖器粘膜的常见定殖细菌也含有B组链球菌或无乳链球菌。在某些情况下，GBS可侵犯粘膜屏障，引起全身性感染，包括败血症和脑膜炎。对于几种类型的链球菌，无乳链球菌，无乳链球菌和乳房链球菌都是可以引起乳房炎的感染。无乳链球菌感染的传播是通过直接接触被感染的牛奶或乳头，或者经过员工接触健康的母牛而传播的。此外，无乳链球菌出现了越来越多的耐药菌株。

行业研究背景：疫苗是预防动物乳房炎的合乎逻辑且有希望的方法。对于牛链球菌性乳房炎，可以使用由灭活细菌或减毒活细菌组成的一些常规疫苗。但是，这些疫苗不是很有效。关于灭活链球菌牛乳房炎疫苗，Neil Wedlock D等人使用了三种菌株的全菌株提取物，它们代表了引起新西兰奶牛乳房炎的无乳链球菌菌株的主要类型，并添加了EmμLisigen-D佐剂疫苗。通过接种于奶牛皮下，发现该疫苗可以诱导针对无乳链球菌的强大的细胞和体液免疫。研究发现，尽管针对链球菌乳房炎的活疫苗和灭活疫苗可以预防同源链球菌的侵袭，但它们对异源链球菌乳房炎引起的乳房炎并没有免疫力。这也是为什么灭活链球菌疫苗难以商业化的原因之一。李松建等使用大肠杆菌原核表达系统表达由IgGFcRn介导的Fc-Sip融合蛋白、无乳链球菌保护性表面抗原蛋白Sip，并与Fc-Sip亚基的佐剂混合制备疫苗。免疫牛后，总细菌分离率降低了46.6％，而链球菌无乳杆菌的总细菌分离率降低了33.3％。它还可以抑制其他牛乳房炎病原体的侵袭。胡昌民等制备了不含Sip的Sip亚单位疫苗和灭活疫苗，Sip亚单位疫苗免疫组的IgG和IgG亚类抗体滴度明显高于灭活疫苗组(P<0.01)。病理切片显示，Sip亚单位疫苗组的乳房组织结构比对照组更完整，被浸润程度最小是嗜中性粒细胞。Sip基因有望成为牛链球菌性乳房炎的候选蛋白。苏艳等构建含Kozak序列和不含Kozak序列的FnBPA-A基因真核表达载体，免疫C57BL/6小鼠检测其抗体水平，免疫效果来看，Kozak序列对增强FnBPA的重组DNA疫苗诱导的免疫应答起了不容忽视的作用。

金黄色葡萄球菌感染常导致慢性、亚临床疾病，具有高度传染性，很难或不能治愈，治愈率低于25％。尽管进行了数十年的研究，但尚无有效的疫苗可预防金黄色葡萄球菌，需要不断的研究与开发。链球菌广泛分布在健康的哺乳动物和人类中。动物抵抗力的降低或者外部环境的变化会导致动物和人类感染链球菌。导致牛乳房炎的主要致病性链球菌为无乳链球菌，停乳链球菌和乳房链球菌。

奶牛乳房炎是一种在畜牧业中最常见的疾病之一，全世界约有3％的奶牛被感染，其中隐性乳房炎的发生率最高，约占90％。隐性乳房炎没有任何临床症状，但是直接影响了奶牛的健康与牛奶品质，对经济具有较大的危害，仅在美国一年就可以造成20亿美元的损失。奶牛乳房炎造成的损失包括牛奶产量减少、奶牛失去泌乳能力以及动物屠宰价值降低。导致奶牛乳房炎的主要因素是细菌感染，通常会导致牛奶体细胞(SCC)、细胞因子的产生、抗体的分泌和细菌的增加。

已知的多种细菌可以引起奶牛乳房炎，其中最主要的致病菌是金黄色葡萄球菌与无乳链球菌。在治疗期间，所生产的牛奶需要丢弃，造成了一定的经济损失。奶牛乳房炎造成的损害不仅仅是经济损失。临床通过抗生素对奶牛乳房炎进行治疗，然而抗生素的大量使用，容易导致细菌的耐药性产生。抗生素的使用还可以导致肠道菌群失衡。在治疗过程中使用大量抗生素造成耐药菌株、超级细菌出现，这些细菌再感染人类，造成人类无药可用的境地。

疫苗是预防牛乳房炎的最佳选项之一。使用疫苗预防乳房炎，不会引起药物残留和耐药性的产生。在动物生产中使用疫苗代替抗生素作为治疗和预防方法已成为国内外研究的重点。因此在实际的奶牛生产中研究开发使用绿色安全的疫苗是十分必要。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原，所述免疫原为针对金黄色葡萄球菌的FC免疫原、针对无乳链球菌的GS免疫原以及即针对金黄色葡萄球菌又针对无乳链球菌的FCGS免疫原中的任一种；

所述FC免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.5；

所述GS免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.7；

所述FCGS免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.3。

一种载体，包含编码如上述的任一种免疫原的核苷酸序列。

进一步地，包含编码FC免疫原或FCGS免疫原的核苷酸序列的载体为pET32a载体；包含编码GS免疫原的核苷酸序列的载体为pET28a载体。

一种宿主细胞，包含如上述的载体。

一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌疫苗，包含药学上可接受的媒介物、任选的佐剂、以及药学上有效量的如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原。

如上述的金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原在制备金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌疫苗中的应用。

进一步地，所述疫苗能够引发针对金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌的保护性免疫。

进一步地，所述FC免疫原引发针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。

进一步地，所述GS免疫原引发针对无乳链球菌的保护性免疫。

进一步地，所述FCGS免疫原引发针对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的保护性免疫。

金黄色葡萄球菌的每个粘附素的功能也是不相同的，ClfA主要存在于细菌体表面，对病原菌定殖粘附宿主细胞有重要的作用。FnBP则是存在与细胞外基质中，其主要通过病原菌与宿主细胞表面的纤维连接素的粘附，从而使宿主被病原菌的侵染。鉴于这两种粘附素的作用机理的不同。表面免疫相关蛋白Sip和GapC都是无乳链球菌的表面蛋白，并且蛋白具有高度保守性与较好的免疫原性；本申请通过融合表达蛋白免疫实验动物后，去预防对动物机体的感染。

尽管大多数研究都集中在金黄色葡萄球菌的α毒素和荚膜多糖以及乳房链球菌和无乳链球菌的GapC亚单位疫苗上，但本申请研究金黄色葡萄球菌FnBP、ClfA和无乳链球菌GapC、Sip，在内的四个基因的融合蛋白，克服了FnBP、ClfA和GapC、Sip几个基因单独使用的缺陷。

本实验成功构建了3个原核表达载体，并成功的诱导、表达、纯化出3个蛋白，分别是FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白。三个蛋白经超声裂解之后蛋白在包涵体中，包涵体蛋白经诱导表达，收菌超声裂解后，经SDS-PAGE验证其蛋白还在包涵体中。使用蛋白纯化试剂盒对FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白进行了纯化，使用WB验证具有抗原特异性。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请挑选金黄色葡萄球菌Fnbp、ClfA与无乳链球菌GapC、Sip毒力因子，并对几个基因使用原核表达系统进行多种方式的融合表达。验证了金黄色葡萄球菌的FnBP+ClfA、无乳无乳链球菌的GapC+Sip以及FnBP+ClfA+GapC+Sip基因片段组合形式的融合表达蛋白对小鼠抵抗金黄色葡萄球菌、无乳链球菌的保护力，发现三者均能够迅速诱导小鼠产生高水平的特异性抗体，并能够降低脏器的载菌量，为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌疫苗的研发提供了基础研究工作。

附图说明

图1是表达质粒的双酶切验证；其中：A:MK：12000bp DNA Marker,泳道1：FnBP+ClfA-pET32a双酶切产物,泳道2：质粒对照；B:MK：12000bp DNA Marker,泳道1：GapC+Sip-pET28a双酶切产物,泳道2：质粒对；C:MK：12000bp DNA Marker；泳道1：FnBP+ClfA+GapC+Sip-pET32a双酶切产物；泳道2：质粒对照；

图2是目的基因连接pET-32a、28a菌液PCR验证；其中：A:FC融合蛋白，B:GS融合蛋白，C:FCGS融合蛋白，Mk：10000bp DNA Marker，泳道1-5：单克隆菌液PCR扩增，泳道6：阴性对照；

图3是蛋白诱导表达十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中：A：FCGS融合蛋白，B:FC融合蛋白，C:GS融合蛋白，MK：蛋白预染Marker，泳道1：诱导前、泳道2：上清、泳道3：沉淀；

图4是表达蛋白质印迹法验证；其中：泳道1：FC融合蛋白，泳道2:GS融合蛋白，泳道3:FCGS融合蛋白；

图5是致病菌不同浓度培养结果；其中：A:1×10⁶稀释度的金黄色葡萄球菌；B：1×10⁷稀释度的金黄色葡萄球菌；C：1×10⁵稀释度的无乳链球菌；D：1×10⁶稀释度的无乳链球菌；

图6是小鼠脾脏载菌量；其中A：金黄色葡萄球菌对照组，B:FCGS融合蛋白2组，C:FC融合蛋白组，D:无乳链球菌对照组，E:FCGS融合蛋白1组，F:GS融合蛋白组；

图7是无乳链球菌攻毒脾脏载菌量；其中：control group为注射PBS组阴性对照实验组；GS fusion protein group为注射GS融合蛋白的实验组。FCGS fusion proteingroup 1组为注射FCGS融合蛋白实验组。横坐标为天数，纵坐标为脾脏载菌量。小鼠差异显著性使用EXCEL的F-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图8是金黄色葡萄球菌攻毒脾脏载菌量；其中：control group为注射PBS组阴性对照实验组；FC fusion protein group为注射GS融合蛋白的实验组。FCGS fusion proteingroup 2组为注射FCGS融合蛋白实验组。横坐标为天数，纵坐标为脾脏载菌量。小鼠差异显著性使用EXCEL的F-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图9是小鼠肝脏载菌量；其中A：金黄色葡萄球菌对照组，B:FCGS融合蛋白2组，C:FC融合蛋白组D:无乳链球菌对照组，E:FCGS融合蛋白1组，F:GS融合蛋白组；

图10是无乳链球菌攻毒肝脏载菌量；其中：control group为注射PBS组阴性对照实验组；GS fusion protein group为注射GS融合蛋白的实验组。FCGS fusion proteingroup 1组为注射FCGS融合蛋白实验组。横坐标为天数，纵坐标为肝脏载菌量。小鼠差异显著性使用EXCEL的F-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图11是金黄色葡萄球菌攻毒肝脏载菌量；其中：control group为注射PBS组阴性对照实验组；FC fusion protein group为注射FC融合蛋白的实验组。FCGS fusionprotein group 1组为注射FCGS融合蛋白实验组。横坐标为天数，纵坐标为肝脏载菌量。小鼠差异显著性使用EXCEL的F-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图12是FC融合蛋白组抗体的检测结果；其中：control group为注射PBS组阴性对照小鼠；FC fusion protein group组为注射FC融合蛋白组小鼠。横坐标为天数，纵坐标为OD450值。差异显著性使用EXCEL的T-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图13是GS融合蛋白组抗体的检测结果；其中：control group为注射PBS组阴性对照小鼠；GS fusion protein group组为注射GS融合蛋白组小鼠。横坐标为天数，纵坐标为OD450值。差异显著性使用EXCEL的T-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图14是FCGS融合蛋白1组抗体的检测结果；其中：control group为注射PBS组阴性对照小鼠；FCGS fusion protein 1group组为注射FCGS融合蛋白组小鼠。横坐标为天数，纵坐标为OD450值。差异显著性使用EXCEL的T-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001；

图15是FCGS融合蛋白2组抗体的检测结果；其中：control group为注射PBS组阴性对照小鼠；FCGS fusion protein 2group组为注射FCGS融合蛋白组小鼠。横坐标为天数，纵坐标为OD450值。差异显著性使用EXCEL的T-TEXT分析，*＝P<0.05、**＝P<0.01、***＝P<0.001。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用。

本发明涉及的质粒与菌株：FC基因(金黄色葡萄球菌FnBP+ClfA基因)、GS基因(无乳链球菌GapC+Sip基因)、FCGS基因(金黄色葡萄球菌与无乳链球菌FnBP+ClfA+GapC+Sip基因)表达质粒pET32a由通用生物系统(安徽)有限公司合成，BL21(DE3)大肠杆菌菌株由通用生物系统(安徽)有限公司提供。

本发明涉及的酶、试剂：蛋白彩虹Maker均购自宝日医生物技术(大连)有限公司，灭活金黄色葡萄球菌、无乳链球菌免疫小鼠后采集的阳性血清、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG购自于博奥森公司，His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)购自于康为世纪生物科技有限公司,BCA蛋白浓度试剂盒购自于赛默飞科技有限公司，酶标板购自于Costar公司，氨苄霉素、NC膜、封口膜、BSA购自于索莱宝生物技术有限公司。

本发明的具体内容如下实施例所示。

实施例1融合蛋白的构建与表达

1、FnBP、ClfA、GapC、Sip基因序列的获取

通过SignalP 5.0Server在线软件预测分析各蛋白的信号肽、使用Kolaskar andTongaonkar方法B细胞抗原表位进行预测分析、通过SOPMA在线软件预测蛋白的二级结构、通过phyre2在线软件预测蛋白的三维结构、选取FnBP、ClfA、GapC、Sip基因序列中免疫原性较强的目的片段，共选择FnBP+ClfA+GapC+Sip；FnBP+ClfA；GapC+Sip三种基因组合模式。在序列两端加入限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ两个限制性酶切位点，并且在两个基因中间加上linker序列，送往通用生物系统(安徽)有限公司进行优化合成到pET32a载体，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌菌株中。

通过生物信息学分析将这四个蛋白分别组合，本实施例中构建出三个融合蛋白，其中包括针对金黄色葡萄球菌的融合蛋白、无乳链球菌的融合蛋白以及即针对金黄色葡萄球菌又针对无乳链球菌的融合蛋白。具体的，金黄色葡萄球菌融合蛋白是由FnBP氨基酸序列的第23-115位与ClfA氨基酸序列的第159-282位组成，中间加一个(GGGGSGGGGSGGGGS)linker；无乳链球菌融合蛋白是由GapC氨基酸序列的第183-312位与Sip氨基酸序列的第162-338位组成，中间加一个(GGGGSGGGGSGGGGS)linker；金黄色葡萄球菌与无乳链球菌融合蛋白是由FnBP氨基序列的第23-115位与ClfA氨基酸序列的第356-472位与GapC氨基酸序列的第88-162位与Sip氨基酸序列的第4-97位组成，每个蛋白中间加一个(GGGGSGGGGSGGGGS)linker。

本申请实际使用的优化后的核苷酸或氨基酸序列为：FCGS融合蛋白的碱基序列见SEQ ID NO.2，氨基酸序列见SEQ ID NO.3；FC融合蛋白的碱基序列见SEQ ID NO.4，氨基酸序列见SEQ ID NO.5；GS融合蛋白的碱基序列见SEQ ID NO.6，氨基酸序列见SEQ ID NO.7。

实验结果：

将合成的表达菌株进行双酶切验证，如图1所示。结果说明切下的基因片段大小与理论值大小相符，表明已成功构建原核表达载体。

将合成后的各表达载体重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)内，再次经过菌液PCR验证(如图2)，FnBP+ClfA(FC)融合蛋白(pET32a-FnBP+ClfA-DE3)在762bp处出现条带、GapC+Sip(GS)融合蛋白(pET28a-GapC+Sip-DE3)在966bp处出现条带、FnBP+ClfA+GapC+Sip(FCGS)融合蛋白(pET32a-FnBP+ClfA+GapC+Sip-DE3)在1584bp处出现条带、成功后便可进行下一步实验，蛋白的原核表达及纯化。

2、蛋白诱导表达

将合成的重组表达菌(pET32a-FnBP+ClfA+GapC+Sip-DE3)、(pET32a-FnBP+ClfA-DE3)、(pET28a-GapC+Sip-DE3)(由于pET32a-GapC+Sip-DE3表达菌株的蛋白不进行表达，故换成pET28a载体进行表达)穿刺菌株，使用平板画线的方法，画线于含有氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)LB平板培养板(Amp为50mg/L，Kan为50mg/L)。在37℃下孵育过夜。将过夜培养基置于无菌操作平台上，并收集光滑的表面和独立的单克隆菌落。添加到装有20mL LB培养基的锥形瓶中(添加Amp，Kan以50mg/L)。放置在恒温箱中，在37℃的恒温下以200r/min的速度进行培养，并在对数生长期培养。测定OD值。当OD600达到0.6时，停止培养。取10mL细菌溶液，将其加入10mL甘油中，等分放入EP管中，并将细菌溶液储存在-80℃。除去1mL细菌溶液，然后添加到600mL LB培养基中。放在摇床上，生长到对数生长期(37℃，200r/min)。最终IPTG浓度为0.1mmol/L诱导蛋白表达。诱导时间为6小时。将培养的细菌溶液添加到50mL离心管中，将其置于4℃离心机中，并以6000r/min的速度离心。收集沉淀物，并加入50mL裂解缓冲液读取读数。所有收获操作必须在冰上完成。将收集的细菌溶液在液氮中快速冷冻5min，然后溶解在37℃水浴中，重复冷冻和解冻循环3次。将冷冻并解冻的细菌溶液以25w的功率进行超声裂解，超声5s,然后停止3s。离心超声处理的细菌溶液，以6000r/min的速度离心30min，然后对上清液和沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE，以观察目标蛋白质的可溶性表达。

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳验证(SDS-PAGE)

(1)用中板验证蛋白质诱导的表达和蛋白质纯度。安装制造胶水的必要设备，并添加蒸馏水以确认胶水泄漏。

(2)准备12％的分离胶，混合并添加到制胶机中，并用长针收集产生的气泡。凝胶中不能留有气泡。使用移液器将水加到分离凝胶的顶部，以确保分离凝胶的顶部是平坦的。20min后，倒出水。水蒸发后，准备5％的凝胶浓缩胶倒入分离胶上并将所需孔数的梳子插入。将凝胶机放在测试台上，静置2h等待胶凝固。

(3)缓慢小心地从凝胶上除去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×电泳溶液并除去空间中的气泡。

(4)取20μL纯化蛋白，然后加入5×上样缓冲液80μL。充分混合后，煮沸10min。将煮沸的样品添加到浓缩凝胶中，每孔10-15μL，并添加蛋白质标记物。调节电压至80V进行电泳。3-4h后，等待溴酚蓝到达凝胶底部并停止电泳。

(5)分离凝胶并将其置于去离子水中进行洗涤。浸入染色溶液中，并在水平振荡器上染色35min。

(6)准备新鲜的漂白溶液，并在一定水平下将其漂白数次，直到带清晰为止。凝胶变色后，停止褪色并用去离子水冲洗。

(7)放在Bio-RAD冷凝室中，校正胶水的位置，调整图案的颜色和对比度，然后保存图像。

4、蛋白的纯化

将沉淀加入15mL 8mol/L尿素溶液，反复吹打，将沉淀彻底溶解。溶解之后，将溶液置于4℃摇床上过夜溶解，次日3000rmp离心30min将还未溶解的物质弃掉，上清液则用0.45μm滤膜过滤，后用康为世纪His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)(His-Tagged ProteinPurification Kit(Inclusion Body Protein))纯化目的蛋白。具体蛋白纯化步骤如下：

I缓冲液的准备

表1包涵体蛋白纯化缓冲液配方

II组装层析柱

(1)混合Ni-Agarose Resin填料后，将其添加到层析柱中，在室温下放置10min。等凝胶和溶液分层后，打开底部出口，使乙醇在重力作用下缓慢流动。

(2)将5倍体积的去离子水添加到填充柱中以冲洗乙醇，然后用8倍体积的BindingBuffer平衡柱。平衡完成后，可以加样品。

III包涵体蛋白的纯化

(1)收集细菌后，每100mg细菌(湿重)添加2mL细菌裂解液(每1mL细菌裂解液预先添加10μl蛋白酶抑制剂混合物)，如果可以，则进行超声裂解细菌。

(2)10,000×g，在4℃下离心15min，分离上清液和沉淀物，并收集沉淀物。

(3)将沉淀重悬于Binding Buffer中，并尽可能混合以完全溶解内含物。

(4)以10,000×g离心20min，收集上清液。注意：建议离心后，用孔径为0.22μm或0.45μm的过滤器过滤上清液。

(5)将上清液以柱体积/小时的10倍的流速加载到柱中并收集流速。

(6)用15倍体积的Binding Buffer冲洗色谱柱以除去蛋白质。

(7)用适当量的Elution Buffer洗脱并收集洗脱液。注意：洗脱液可以收集在单独的试管中，用蛋白质监控器进行监控，每1mL一支。

(8)洗脱后，用5倍体积的Binding Buffer，5倍体积的去离子水洗涤色谱柱，并用3倍体积的20％乙醇平衡(将乙醇浸入包装中)。包装后存放在2-8℃。

Ⅳ靶蛋白的折叠和富集

(1)煮沸透析袋：将透析袋切成15cm长，将透析袋放入2％NaHCO3和0.5mmol/LEDTA溶液中，煮沸10min。用蒸馏水洗涤透析袋后，将其在0.5mmol EDTA中煮沸10min。取出透析袋并彻底清洗。放入蒸馏水中煮沸10min。透析袋冷却后，将其浸入蒸馏水中以备后用。

(2)取出处理过的透析袋，用夹子夹住两端，将蒸馏水倒入透析袋中并检查是否泄漏。检查后，将纯化的蛋白质注入透析袋中。

(3)将透析袋中的蛋白质浸入6mol/L的尿素溶液中6h，然后将尿素溶液的pH值调节至8.0。随后，蛋白质在pH 8.0的浓度为4mol/L，2mol/L和1mol/L的尿素溶液中透析6h。透析期间，相同浓度的尿素溶液必须更换几次。尿素中的复性完成后，将蛋白质置于pH8.0PBS溶液中以完全去除尿素，以确保包涵体表达的蛋白质具有复性作用。

(4)在PBS中重折叠后，用蔗糖浓缩。将蔗糖放入透析袋中，在4℃的冰箱中浓缩。达到浓缩目的后，将蛋白质放入EP管中，并在-80℃的冰箱中保存。

实验结果：

将0h、上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定其蛋白表达方式。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明FCGS融合蛋白、FC融合蛋白、GS融合蛋白经超声裂解之后蛋白在包涵体中，结果如图3所示。

5、纯化后蛋白的浓度测定

通过BCA法测定纯化的目标蛋白质的浓度，并根据蛋白质浓度测定试剂盒的使用说明书制作BCA标准曲线。通过标准曲线确定纯化的靶蛋白的浓度。蛋白质测量步骤如下：

(1)试剂盒的溶液A和溶液B由49:1的比例组成的样品工作溶液组成，取96孔微量滴定板，向每个孔中加入200μL样品工作溶液，并以25μL不同的浓度添加要测试的标准样品和蛋白质，对每个要测试的标准样品和蛋白质重复3次，再将酶标板置于微孔震荡仪上震荡1min，贴上封板膜，置于37℃恒温培养箱中放应30min。

(2)反应后，在酶标仪上用波长570nm测量待检测蛋白的吸光度。

(3)然后将待测蛋白质的平均OD570值纳入标准曲线，以获取纯化后目标蛋白质的浓度。

6、Western blot(WB)验证

(1)对纯化的靶蛋白进行SDS-PAGE，并根据蛋白标记大致确定靶蛋白的位置。用小刀小心地将蛋白质标记物和目标蛋白质的位置切成膜转移溶液，并取6张滤纸和1张NC。将膜切成与目的蛋白质相同的形状，并置于膜转移溶液中，并浸没5min。按照三张滤纸放置在转膜仪中的最下层，再将带有目的蛋白和蛋白Marker的凝胶放在第三层，NC膜放在第二层，最后将剩下三张滤纸放在最上面一层，用镊子将所有滤纸、NC膜和凝胶摆放整齐，排出各层中的气泡，盖上石墨电极板恒定电流200mA转膜速度1KD/min进行转膜。转膜时间根据蛋白的大小来判定。

(2)转移完成后，取出NC膜，置于Ponceau Red中，染色30s以观察目标蛋白带的转移。然后用TBST将膜清洗2-3次，每次5min，目的是洗去Ponceau红色显影液。将清洗后的NC膜放入杂交瓶中，没有目标蛋白的一侧与杂交瓶紧密接触，加入5mL 5％脱脂奶粉封闭液，拧紧瓶盖，并在37℃下封闭2h。

(3)封闭后，向杂交瓶中加入5mL TBST，洗膜3次，每次洗涤10min，洗去多余的脱脂奶粉封闭液，然后继续添加5mL 1：100阳性抗体血清和将其放入杂交烘箱中37℃孵育1h。孵育后，每次用5mL TBST洗涤膜3次，每次10min，然后加入5mL 1：10000兔抗小鼠酶标记的二抗，继续在杂交箱中于37℃孵育1h。ECL显色液显色，曝光并拍照。

FCGS融合蛋白，FC融合蛋白，GS融合蛋白的大量表达。将FCGS融合蛋白，FC融合蛋白，GS融合蛋白按上述操作步骤进行大量表达与纯化。收集蛋白准备进行后续实验。

实验结果：

条带与理论上目的蛋白大小相符，证明目的蛋白能与金黄色葡萄球菌、无乳链球菌抗体阳性血清反应，具有良好的反应原性(图4)。

实施例2融合蛋白免疫效果评价

本实施例涉及的实验菌株、试剂：金黄色葡萄球菌标准株(ATCC 25923)、无乳链球菌标准株(ATCC 13813)购于美国模式培养物集存库，ELISA包被液、可溶性单组份TMB底物显色液、10×PBST、10×PBS购于北京索莱宝科技有限公司，酶标板购自于Costar公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG购自于北京博奥森生物技术有限公司。实验动物：7周龄Balb/C雌性小鼠93只。

1、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌的培养

将冻存的金黄色葡萄球菌标准株、无乳链球菌标准株分别吸取20μL至20mL的BHI液体培养基中，放置于37℃恒温培养箱中，200r/min，培养至对数生长期。取100μL菌液至BHI固体培养基中，并用涂布棒涂匀，37℃，过夜培养。用接种环取单克隆菌株至20mL BHI液体培养基中，放置于恒温培养箱中(37℃，200r/min)培养至浑浊，取10mL菌液至100mL BHI液体培养基中，放置于37℃恒温培养箱中，200r/min，培养至对数生长期。

将培养好的菌液加入50mL离心管中，置于4℃离心机中，8000r/min进行离心。收集的沉淀，加入30mL无菌的PBS充分混匀，置于4℃离心机中，8000r/min进行离心，收集的沉淀，如此重复三次，后收取沉淀。收集的沉淀，加入10mL无菌的PBS充分混匀。

对每个菌株进行CFU计数，取10个1.5mL的无菌EP管，每管中加入900μL的无菌PBS，在每个第一管中加入100μL上面PBS混匀的菌液并充分混匀，将第一管中的菌液吸100μL加到第二管中充分混匀，将第二管中的菌液加至第三管中充分混匀，如此至第十管中充分混匀。取1×10⁵～1×10⁹管中的菌液100μL。分别加入BHI琼脂培养基中并用涂布棒涂匀，至于培养箱中37℃过夜培养，并做好标记。对过夜培养的培养基中的单克隆菌落进行计数。

对培养皿进行计数，并计算cfu。金黄色葡萄球菌标准株的滴度为3.5×10¹⁰cfu(图5A、图5B)；无乳链球菌标准株的滴度为5×10⁸cfu(图5C、图5D)。

2、BALB/c小鼠最小致死量的测定

将金黄色葡萄球菌菌液以5μL(1.05×10⁸cfu)、10μL(2.1×10⁸cfu)、15μL(4.2×10⁸cfu)、20μL(3.15×10⁸cfu)、200μL(4.2×10⁹cfu)、400μL(8.4×10⁹cfu)以腹腔注射的方式分别注射到小鼠体内，每个剂量3只，观察记录小鼠的临床表现及死亡时间等情况，连续观察7天。

无乳链球菌菌液以50μL(1.65×10⁹cfu)、100μL(3.3×10⁹cfu)、150μL(4.95×10⁹cfu)、200μL(6.6×10⁹cfu)、400μL(1.32×10¹⁰cfu)同样以腹腔注射的方式分别注射到小鼠体内，每个剂量3只，观察记录小鼠的临床表现及死亡时间等情况，连续观察7天。

腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液、无乳链球菌菌液，12h内实验组小鼠均出现一定的临床症状。攻毒后小鼠初期表现为，精神不振、行动较为迟缓、饮食饮水减少、蜷缩在一角且呼吸较为急促。小鼠在72h后不再出现死亡(见表2、表3)。最小致死量测定结果金黄色葡萄球菌最小致死量为4.2×10⁸cfu，无乳链球菌最小致死量为6.6×10⁹cfu。

表2金黄色葡萄球菌对小鼠最小致死量测定结果

表3无乳链球菌对小鼠最小致死量测定结果

3、BALB/c小鼠半数致死量的测定

以16μL(3.36×10⁸cfu)、18μL(3.9×10⁸cfu)、20μL(4.2×10⁸cfu)剂量的金黄色葡萄球菌菌液采用腹腔注射的方式分别注射到小鼠体内，每个剂量3只，观察记录小鼠的临床表现及死亡时间等情况，连续观察7天。

以160μL(5.28×10⁹cfu)、180μL(6.0×10⁹cfu)、200μL(6.6×10⁹cfu)剂量的无乳链球菌菌液采用腹腔注射的方式分别注射到小鼠体内，每个剂量4只，观察记录小鼠的临床表现及死亡时间等情况，连续观察7天。

腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液、无乳链球菌菌液，12h内实验组小鼠均出现一定的临床症状。72h后小鼠不再出现死亡(见表4、表5)。半数致死量测定结果：金黄色葡萄球菌半数致死量为3.9×10⁸cfu,无乳链球菌半数致死量为6.0×10⁹cfu。

表4金黄色葡萄球菌对小鼠半数致死量测定结果

表5无乳链球菌对小鼠半数致死量测定结果

4、BALB/c小鼠的免疫程序

以40μg/只的剂量给小鼠进行免疫。FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白测定好的终浓度为4.5mg/mL、0.13mg/mL、0.3mg/mL，将FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白用PBS稀释与纳米佐剂1:1充分混合，调终浓度至40μg/只，得到FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白配合纳米佐剂的疫苗。

取7周龄雌性健康SPF级BALB/c小鼠，饲养1周后，随机分为6组，每组6只。将上面制备的FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白配合纳米佐剂的疫苗以300μL(免疫原40μg)/只皮下注射免疫小鼠。同时将PBS与等体积纳米佐剂乳化作为对照(实验分组见表6)。

表6小鼠的免疫程序分组

5、FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白免疫后小鼠血清的收集

阳性血清制备：将金葡组、无乳组、融合蛋白1组、融合蛋白2组的小鼠每组随机取3只，分别在0天，第7天，第14天，第21天对BALB/c小鼠进行眼眶后静脉丛采血。将采集的全血于37℃恒温培养箱放置2h后，3000rpm/min离心10min，分离上层血清，标记对应小鼠序号后，-20℃保存备用。

阴性对照血清制备采集:通过眼眶后静脉丛采血发收集3只/组的第0天，第7天，第14天，第21天正常BALB/c小鼠全血，将收集到的全血于37℃恒温培养箱放置2h后，3000rpm/min离心10min，分离上层血清，标记对应小鼠序号后，-20℃保存备用。

6、ELISA检测抗体水平

采用眼眶采血方法在0d、7d、14d、21d采集小鼠血液，并分离血清。间接ELISA法检测小鼠血清中抗体水平，具体步骤如下：

(1)抗原包被:用包被溶液稀释抗原，将FC融合蛋白稀释至4.5ng/mL，GS融合蛋白稀释至2.6ng/mL，FCGS融合蛋白稀释至3ng/mL的浓度加至96孔板中，向每个孔中加入100μL，然后在37℃的培养箱中放置2h。

(2)封闭:弃去液体，3min/次每个孔中加入200μL PBST，然后在微量滴定板上干燥PBST。将96孔板拍干并重复操作3次；用5％脱脂乳封闭96孔板，向每个孔中加入100μL封闭溶液，并将板在4℃封闭过夜。

(3)加样:用PBST洗涤96孔板3次并干燥。将小鼠血清用PBST稀释至1:200和1:2000。向每个孔中加入50μL，并在37℃下孵育1h。

(4)加入酶标记的二抗:从培养箱中取出加入血清的96孔板。弃去液体并用PBST洗涤3次。3min/次，在吸水纸上干燥。用PBST把辣根酶标记兔抗鼠的IgG二抗按照说明书稀释1:5000倍，每个孔加入100μL的溶液，置37℃下进行孵育1h。

(5)加底物:拿出孵育箱内加过酶标二抗的96孔板，倒掉液体，用洗涤液对96孔板进行洗涤5次，每次3min，在吸水纸上拍干，每孔加可溶性单组份TMB底物显色液100μL，置于室温避光15min。

(6)终止反应:室温避光15min加过底物液的96孔板，每孔加入ELISA终止液50μL，加完终止液后30min内用酶标仪测定在450nm处吸光值(OD值)。

7、攻毒保护试验

在免疫后的21天，根据实验测得的半数致死量，把培养所得的金黄色葡萄球菌与无乳链球菌稀释到合适浓度，而后对小鼠进行腹腔注射攻毒。攻毒后，对各组小鼠的外观、精神情况等进行观察并对小鼠死亡情况进行记录(各组攻毒菌株和剂量见表7)。

表7各组攻毒菌株和剂量

使用金黄色葡萄球菌与无乳链球菌标准株对免疫蛋白21d后的小鼠进行攻毒实验，攻毒72h后结果见表8，蛋白组与对照组差异不显著。

表8小鼠攻毒免疫保护结果

对小鼠的致死保护率不显著是因为样本数量较少以及需采集小鼠脾脏导致观察时间较短导致。

8、器官载菌量的测定

攻毒72h后，处死剩余未死亡将小鼠浸于75％乙醇中，在无菌条件下对小鼠进行解剖。将肝、脾每个脏器分为两份，一份置于灭菌2mL EP管中进行分别称重，每管加入1mL高压灭菌后的PBS，用小剪刀将组织剪碎。对剪碎后的上清组织液进行倍比稀释至10,100。吸取100μL倍比稀释后的组织液与BHI琼脂培养基中并玻璃珠涂匀，后做好标记置于37℃恒温培养箱培养24～48h。记录菌落数，对实验结果进行统计分析。计算组织载菌量log cfu/g，cfu/g＝培养基的cfu平均数×5×匀浆液体积(mL)×稀释倍数/组织重量(g)。

脾脏载菌检测结果：

攻毒72h后，小鼠脾脏载菌量如图6。FCGS融合蛋白2组与FC融合蛋白组脾脏载菌量都要小于金黄色葡萄球菌对照组；FCGS融合蛋白1组和GS融合蛋白组脾脏载菌量都要小于无乳链球菌对照组。载菌量结果见图7、图8，表9、表10，FCGS融合蛋白1组与无乳链球菌对照组相比p＝0.0003(P<0.001)差异极显著；GS融合蛋白组与无乳链球菌对照组相比p＝0.02(P<0.05)差异显著；FC融合蛋白组与金黄色葡萄球菌对照组相比P＝0.00005(P<0.001)差异极显著，但FCGS融合蛋白2组与金黄色葡萄球菌对照组相比P＝0.49(P>0.05)差异不显著。

表9小鼠脾脏载菌量

注：同列数据后标不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，标相同字母者表示差异不显著(P>0.05)。

表10金黄色葡萄球菌攻毒脾脏载菌量

肝脏载菌检测结果：

攻毒72h后，小鼠肝脏载菌量如图9。具体载菌量测定见图10、图11，数据见表11、表12。FCGS融合蛋白1组与无乳链球菌对照组相比p＝0.0007(P<0.001)差异极显著；GS融合蛋白组与无乳链球菌对照组相比p＝0.21(P>0.05)差异不显著；FC融合蛋白组与金黄色葡萄球菌对照组相比P＝0.006(P<0.01)差异极显著，但FCGS融合蛋白2组与金黄色葡萄球菌对照组相比P＝0.58(P>0.05)差异不显著。

表11无乳链球菌攻毒肝脏载菌量

Table 3-10 Liver bacteria load of Streptococcus agalactiae challenge

表12金黄色葡萄球菌攻毒肝脏载菌量

9、血清抗体效价检测结果

使用FC融合蛋白包被ELISA板，检测FC融合蛋白免疫小鼠数据。在第14天实验组与对照组的P＝0.000<0.001，在第21天时实验组与对照组的P＝0.000<0.001，FC融合蛋白诱导小鼠产生的抗体水平显著高于对照组(图12)。值得注意的是在第7天时P＝0.039<0.05，代表着FC融合蛋白可以在第7天快速的诱导小鼠产生抗体。

表13 FC融合蛋白组抗体的检测结果

使用GS融合蛋白包被ELISA板，检测GS融合蛋白免疫小鼠数据。在第21天时，GS融合蛋白诱导小鼠产生的抗体水平高于对照组(图13、表14)。

表14 GS融合蛋白组抗体的检测结果

使用FCGS融合蛋白包被ELISA板，检测FCGS融合蛋白免疫小鼠数据。FCGS融合蛋白诱导小鼠产生的抗体水平显著高于无乳链球菌对照组，在第14天抗体水平与对照组的P值P＝0.002(P<0.01)差异极显著，21天时P值P＝0.000(P<0.001)差异极显著(图14、表15)。

表15 FCGS融合蛋白1组抗体的检测结果

在第14天与金黄色葡萄球菌对照组相比P＝0.005<0.01差异极显著，21天时P＝0.001<0.01差异极显著，FCGS融合蛋白诱导小鼠产生的抗体水平显著高于金黄色葡萄球菌对照组(图15、表16)。

表16 FCGS融合蛋白2组抗体的检测结果

本申请制备的FC融合蛋白、GS融合蛋白及FCGS融合蛋白均能使小鼠产生特异性抗体。其中FC融合蛋白在第7天就可以快速诱导小鼠产生抗体P＝0.039<0.05，说明FC融合蛋白抗原特异性良好，可以快速的被抗原递呈细胞识别。而且FC融合蛋白在第14天与21天诱导产生高水平的抗体P<0.000，与此同时FC融合蛋白显著降低了小鼠的脾脏载菌量P<0.000。由此推断出FC融合蛋白具有很大的应用前景，是本研究筛选出的优秀抗原蛋白，具有作为金黄色葡萄球菌疫苗的潜力。FC融合蛋白中的Fnbp+ClfA片段对小鼠的保护效果要优于FCGS(FnBP+ClfA+GapC+Sip)融合蛋白中的Fnbp+ClfA片段。虽然FC融合蛋白与FCGS融合蛋白中均含有Fnbp基因、ClfA基因，但是所选取的目的片段不同。同时，FCGS融合蛋白也可以产生针对金黄色葡萄球菌的特异性抗体，并降低脾脏的载菌量。

本实施例的实验结果证明：FC融合蛋白、GS融合蛋白、FCGS融合蛋白均可以诱导BALB/c小鼠产生特异性的抗体。其中以FC融合蛋白对金黄色葡萄球菌的保护效果最好，可以在第7天迅速诱导小鼠产生抗体，并显著的降低了脏器的载菌量。FCGS融合蛋白产生针对无乳链球菌的抗体水平要优于GS融合蛋白。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原融合表达及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggsggggs ggggs 15

<210> 2

<211> 1272

<212> DNA

<213> FCGS

<400> 2

cgtcagacca tctatgttaa tccgagcggt gacaatgtta ttgcaccggt tctgaccggc 60

aatctgaaac cgaataccga tagcaatgca ctgattgatc agcagaatac cagcattaag 120

gtgtataaag tggataatgc cgccgatctg agcgaaagct attttgtgaa tccggaaaat 180

tttgaagacg ttaccaatag tgtgaatatt acctttccga atccgaatca gtataaagtg 240

gagtttaata ccccggatga tcagattacc accccgtata ttgtggtggt gaatggtcat 300

attgatccga atagtaaagg cgatctggcc ctgcgtagta ccctgtatgg cggtggcggt 360

ggcagcggtg gtggcggttc aggtggcggt ggtagtggcg gcaatattgt tgatattgat 420

tttgatagcg tgccgcagat tcatggtcag aataatggta atcagagttt tgaagaagac 480

accgaagaag ataaaccgaa atatgaacag ggcggcaata tcattgatat tgatttcgat 540

agcgtgcctc agattcatgg ctttaataag cataatgaaa tcatcgaaga ggataccaat 600

aaggataaac cgaattatca gtttggcggt cataatagtg tggattttga acgctatacc 660

agtaaagtga gcctgggtgg tggcggcagc ggtggaggtg gtagtggtgg tggcggaagc 720

gatggcgtgg atattgttct ggaagcaacc ggctttttcg caagcaaagc cgcagccgaa 780

cagcatattc atgccaatgg cgcaaaaaag gttgttatta ccgcaccggg tggcaatgat 840

gttaaaaccg ttgtttataa taccaaccat gatattctgg atggcaccga aaccgttatt 900

agcggcgcca gttgcaccac caattgcctg gcaccgatgg ccaaaggtgg tggcgggagc 960

ggcggcggtg gttcaggtgg tggtggtagc aataagaaag tgctgctgac cagcaccatg 1020

gcagccagtc tgctgagcgt ggccagtgtt caggcacagg aaaccgatac cacctggacc 1080

gcacgtaccg tgagcgaagt taaagcagat ctggtgaaac aggataataa gagtagttat 1140

accgttaaat acggcgatac cctgagtgtg attagtgaag ccatgagtat tgatatgaat 1200

gtgctggcaa aaattaacaa tatcgccgat attaacctga tctatccgga aaccaccctg 1260

accgttacct at 1272

<210> 3

<211> 424

<212> PRT

<213> FCGS

<400> 3

Arg Gln Thr Ile Tyr Val Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro

1 5 10 15

Val Leu Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile

20 25 30

Asp Gln Gln Asn Thr Ser Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala

35 40 45

Asp Leu Ser Glu Ser Tyr Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Val

50 55 60

Thr Asn Ser Val Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val

65 70 75 80

Glu Phe Asn Thr Pro Asp Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val

85 90 95

Val Asn Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg

100 105 110

Ser Thr Leu Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val

130 135 140

Pro Gln Ile His Gly Gln Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp

145 150 155 160

Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp

165 170 175

Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Phe Asn Lys His Asn

180 185 190

Glu Ile Ile Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe

195 200 205

Gly Gly His Asn Ser Val Asp Phe Glu Arg Tyr Thr Ser Lys Val Ser

210 215 220

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Asp Gly Val Asp Ile Val Leu Glu Ala Thr Gly Phe Phe Ala Ser Lys

245 250 255

Ala Ala Ala Glu Gln His Ile His Ala Asn Gly Ala Lys Lys Val Val

260 265 270

Ile Thr Ala Pro Gly Gly Asn Asp Val Lys Thr Val Val Tyr Asn Thr

275 280 285

Asn His Asp Ile Leu Asp Gly Thr Glu Thr Val Ile Ser Gly Ala Ser

290 295 300

Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Met Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser

305 310 315 320

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Lys Lys Val Leu Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala

340 345 350

Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp Thr Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys

355 360 365

Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp Asn Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr

370 375 380

Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn

385 390 395 400

Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro

405 410 415

Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr Tyr

420

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> FC

<400> 4

aacaaggatg ttgtgaatca ggccgttaat accagtgccc cgcgcatgcg tgcctttagt 60

ctggccgccg ttgcagccga tgcaccggca gctggcaccg atattaccaa tcagctgacc 120

aatgtgaccg tgggcattga tagcggtacc accgtgtatc cgcatcaggc aggctatgtt 180

aaactgaatt atggttttag cgtgccgaat agcgccgtta aaggtgacac ctttaaaatt 240

accgtgccga aagaactgaa tctgaatggc gtgaccagta ccgcaaaagt gccgccgatt 300

atggcaggtg accaggttct ggccaatggt gtgattgata gtgatggtaa tgttatctat 360

acctttaccg atggtggcgg cggtagtggt ggcggtggta gtggtggtgg cggcagtggc 420

cagaatagcg gtaatcagag ttttgaagaa gataccgaag aagataaacc gaaatatgaa 480

cagggcggta atattgttga tattgatttt gatagcgtgc cgcagattca tggccagaat 540

aatggtaatc agtcatttga agaagacacc gaagaagaca aaccgaaata cgaacagggt 600

ggcaatatta ttgatattga tttcgatagc gtgcctcaga ttcatggttt taataagcat 660

aatgagatca tcgaagagga taccaataag gataaaccga attatcagtt tggtggccat 720

aatagtgttg attttgaacg ttataccagc aaagttagcc tg 762

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> FC

<400> 5

Asn Lys Asp Val Val Asn Gln Ala Val Asn Thr Ser Ala Pro Arg Met

1 5 10 15

Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Thr Asp Ile Thr Asn Gln Leu Thr Asn Val Thr Val Gly Ile Asp Ser

35 40 45

Gly Thr Thr Val Tyr Pro His Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr

50 55 60

Gly Phe Ser Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile

65 70 75 80

Thr Val Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys

85 90 95

Val Pro Pro Ile Met Ala Gly Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile

100 105 110

Asp Ser Asp Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr Asp Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Asn Ser Gly

130 135 140

Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu Asp Lys Pro Lys Tyr Glu

145 150 155 160

Gln Gly Gly Asn Ile Val Asp Ile Asp Phe Asp Ser Val Pro Gln Ile

165 170 175

His Gly Gln Asn Asn Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Asp Thr Glu Glu

180 185 190

Asp Lys Pro Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Asn Ile Ile Asp Ile Asp Phe

195 200 205

Asp Ser Val Pro Gln Ile His Gly Phe Asn Lys His Asn Glu Ile Ile

210 215 220

Glu Glu Asp Thr Asn Lys Asp Lys Pro Asn Tyr Gln Phe Gly Gly His

225 230 235 240

Asn Ser Val Asp Phe Glu Arg Tyr Thr Ser Lys Val Ser Leu

245 250

<210> 6

<211> 966

<212> DNA

<213> GS

<400> 6

ggtgaccaga tggtgctgga tggtccgcat cgtggtggcg atctgcgccg cgcacgcgca 60

gcagcagcta atattgttcc gaatagcacc ggcgccgcca aagccattgg cctggttatt 120

ccggaactga atggcaaact ggatggcgcc gcacagcgtg ttccggtgcc gacaggtagc 180

gtgaccgaac tggttgccgt gctggaaaaa gataccagcg tggaagaaat taatgcagcc 240

atgaaagcag ccgcaaatga tagctatggt tataccgaag atgcaattgt gagcagcgat 300

attgtgggta ttagttatgg cagcctgttt gatgcaaccc agaccaaagt gcagaccgtg 360

gatggcaatc agctggtgaa agttgtgagc ggtggtggtg gcagcggcgg tggtggtagt 420

ggtggcggtg gtagttatag cagcgcaccg gccctgaaaa gcaaagaagt tctggcccag 480

gaacaggcag tgagtcaggc cgccgccaat gaacaggtta gtccggcacc ggtgaaaagt 540

attaccagcg aagtgccggc agccaaagaa gaagttaaac cgacccagac cagtgttagc 600

cagagtacca ccgtgagccc ggccagcgtg gcagctgaaa ccccggctcc ggtggcaaaa 660

gtgagtccgg ttcgcaccgt tgcagccccg cgtgtggcaa gcgcaaaagt tgttaccccg 720

aaagtggaaa ccggtgccag cccggaacat gtgagcgccc cggctgttcc ggttaccacc 780

accagcaccg caaccgatag taaactgcag gcaaccgaag ttaaaagtgt tccggttgca 840

cagaaagccc cgaccgccac cccggtggct cagcctgtta gcaccaccaa tgcagttgca 900

gcacatccgg aaaatgcagg tctgcagccg catgttgccg catataaaga aaaagtggcc 960

agtacc 966

<210> 7

<211> 322

<212> PRT

<213> GS

<400> 7

Gly Asp Gln Met Val Leu Asp Gly Pro His Arg Gly Gly Asp Leu Arg

1 5 10 15

Arg Ala Arg Ala Ala Ala Ala Asn Ile Val Pro Asn Ser Thr Gly Ala

20 25 30

Ala Lys Ala Ile Gly Leu Val Ile Pro Glu Leu Asn Gly Lys Leu Asp

35 40 45

Gly Ala Ala Gln Arg Val Pro Val Pro Thr Gly Ser Val Thr Glu Leu

50 55 60

Val Ala Val Leu Glu Lys Asp Thr Ser Val Glu Glu Ile Asn Ala Ala

65 70 75 80

Met Lys Ala Ala Ala Asn Asp Ser Tyr Gly Tyr Thr Glu Asp Ala Ile

85 90 95

Val Ser Ser Asp Ile Val Gly Ile Ser Tyr Gly Ser Leu Phe Asp Ala

100 105 110

Thr Gln Thr Lys Val Gln Thr Val Asp Gly Asn Gln Leu Val Lys Val

115 120 125

Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln

145 150 155 160

Glu Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu Gln Val Ser Pro Ala

165 170 175

Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val

180 185 190

Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala

195 200 205

Ser Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ser Pro Val

210 215 220

Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala Ser Ala Lys Val Val Thr Pro

225 230 235 240

Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu His Val Ser Ala Pro Ala Val

245 250 255

Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr

260 265 270

Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro

275 280 285

Val Ala Gln Pro Val Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu

290 295 300

Asn Ala Gly Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala

305 310 315 320

Ser Thr

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原，其特征在于：所述免疫原为针对金黄色葡萄球菌的FC免疫原、针对无乳链球菌的GS免疫原以及即针对金黄色葡萄球菌又针对无乳链球菌的FCGS免疫原中的任一种；

所述FC免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.5；

所述GS免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.7；

所述FCGS免疫原的氨基酸序列见SEQ ID NO.3。

2.一种载体，其特征在于：包含编码如权利要求1中任一种免疫原的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：包含编码FC免疫原或FCGS免疫原的核苷酸序列的载体为pET32a载体；包含编码GS免疫原的核苷酸序列的载体为pET28a载体。

4.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求3所述的载体。

5.一种金黄色葡萄球菌与无乳链球菌疫苗，其特征在于：包含药学上可接受的媒介物、任选的佐剂、以及药学上有效量的如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原。

6.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌与无乳链球菌免疫原在制备金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述FC免疫原引发针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述GS免疫原引发针对无乳链球菌的保护性免疫。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述FCGS免疫原引发针对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的保护性免疫。