CN106591327A - 重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法，属于生物制药领域。包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQ ID NO.1所示。构建方法主要步骤为：分离和鉴定金黄色葡萄球菌，提取其基因组DNA。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，设计引物扩增ClfA基因序列。将ClfA序列经连接

Description

重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系 的构建方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌在世界范围内广泛造成人和动物的多种感染，在人类主要引起局部化脓感染、肺炎、肠炎、心包炎等局部或全身感染，它还是导致人类食物中毒的主要病原菌之一；在兽医临床，金黄色葡萄球菌常引起多种动物的乳房炎、渗出性皮炎、尿路感染、脑膜炎、心内膜炎等全身或局部感染。由于临床分离的金黄色葡萄球菌菌株常对多种抗生素具有耐受性，不仅造成临床用药成本的增加，更是出现了耐甲氧西林等多种抗生素的菌株，被称为“超级细菌”。

目前，在科研领域虽然有金黄色葡萄球菌疫苗研发相关的报道，但是到目前为止尚没有一项能够广泛应用的高效的重组金黄色葡萄球菌疫苗。尤其是在畜牧养殖领域，集约化饲养模式对高质量疫苗的预防需求大大增加，除了进行环境卫生控制和自家疫苗预防之外，尚没有很好的疫苗产品能够满足这一需求。自家疫苗免疫的最大特点就是针对性强，对于一个独立的养殖场内的病原一般能够取得较好的预防效果；但是分离和纯化细菌菌株，到自家疫苗的制备均需要非常专业的技术人员和专门的生物安全操作环境，而目前国内绝大多数养殖场无法达到这样的标准。从整个生物安全系统和畜牧业发展趋势来看，开发一种高效的、安全的、能够普遍应用于兽医临床的重组基因工程疫苗，对于当代兽医学者来说是一项迫切需要完成的使命任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗；

本发明的另一个目的是提供一种真核表达工程细胞系的构建方法，以解决现有的疫苗研发过程中存在部分蛋白产物难以有效表达和纯化的问题。

一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQ ID NO.1所示。

优选的，金黄色葡萄球菌ClfA基因所使用的引物如下：上游引物为ClfA-1168F1，序列为GACAAAGCTTAATATGGGCGAAACGAGTG；下游引物ClfA-1168R1，序列为CTCGAGATCAATTTGGATTTGGGAA。

一种金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，包括如下步骤：

一、根据NCBI在线已发表的金黄色葡萄球菌基因组序列，设计ClfA基因引物；

二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，提取其基因组DNA，用引物ClfA-1168F1和ClfA-1168R1扩增ClfA基因序列；

三、将步骤二中纯化得到的ClfA序列经连接-T1 Simple Cloning Vector在DH5α扩增后，提取质粒并用Hind III和Xho I分别对ClfA和pcDNA 3.1 V5-His B进行双酶切，回收酶切产物并进行连接，得到重组质粒ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B；

四、将步骤三中所述的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆并在具有氨苄筛选压力的LB培养基中进行增殖；

五、将步骤四中得到的重组质粒ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，并使用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆；

六、用Ni-NTA亲和层析柱从步骤五中得到的阳性克隆细胞株中纯化重组质粒ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B的基因蛋白产物，定义为rClfA；

七、通过PCR、western blot技术对步骤五中得到的阳性克隆细胞进行鉴定，确认其具有金黄色葡萄球菌抗原特性；

八、用步骤七中得到的纯化后的重组蛋白rClfA免疫Balb/c，检测免疫动物的免疫学指标变化。

作为本发明的进一步改进，所述步骤五所涉及的转染细胞系为MCF-7细胞，所使用的转染试剂为脂质体2000，筛选阳性克隆细胞和筛选高表达阳性细胞克隆的过程中所使用的G-418的浓度为800μg/ml。

作为本发明的进一步改进，所述步骤二中的金黄色葡萄球菌具有清楚的生物学特性数据：毒力基因检测显示，对hlb、hld、hlg、hlg-2和seb阳性，agr、luks、lukE-lukD、lukM、hla、edin、eta、etb、tst、sea、sec、sec、se、see、seg、she、sei、sej、sej、sen、seo和sem阴性；耐受青霉素、红霉素、四环素、和万古霉素，对氨苄西林、环丙沙星和诺氟沙星敏感。

本发明将原核生物金黄色葡萄球菌的黏附素基因ClfA在人乳腺癌细胞中成功表达，构建了真核表达工程细胞系。该构建方法能够用于在原核生物中难以有效表达的基因序列的表达及其产物纯化。

主要步骤：分离和鉴定金黄色葡萄球菌，提取其基因组DNA。以提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，设计引物扩增ClfA基因序列。将该序列连接克隆载体并在大肠杆菌中扩增，提取质粒进行双酶切，并连接真核表达载体pcDNA 3.1 V5-His B，转染人乳腺癌细胞MCF-7，用G-418筛选高表达阳性细胞克隆，将高表达细胞进行增殖并提取总蛋白，用Ni-NTA亲和树脂纯化重组的ClfA蛋白(rClfA)，经与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠；免疫试验表明，皮下注射时，重组ClfA蛋白能够诱导受试动物产生显著高于对照组动物的免疫球蛋白IgGs，干扰素IFN-γ，白细胞介素IL-1、IL-2和IL-4；而黏膜免疫时能够诱导受试动物产生显著高于对照组动物的分泌性免疫球蛋白SIgA。将连接回收产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并提取重组质粒ClfA-pcDNA 3.1，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆。

本发明用于制备金黄色葡萄球菌等原核生物的基因工程重组疫苗，应用于在原核表达系统中难以有效表达、不易纯化或是不适合用原核表达系统表达的的基因序列的表达或纯化的原核基因序列。重组ClfA蛋白用于预防金黄色葡萄球菌时抗原种类单一，免疫原性强且没有生物安全性威胁的情况；所涉及的真核表达工程细胞系的构建方法，所得产物易于纯化且纯度高，不存在生物安全问题、不存在药物耐受及抗药性风险问题，不存在非特异性免疫，以及不存在毒性返强的可能性。

重组金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA蛋白疫苗，经过皮下注射免疫Balb/c小鼠，其诱导产生的IgGs、IFN-γ、IL-1、IL-2和IL-4水平，较之PBS对照组，差异极显著；经过黏膜免疫(鼻腔)Balb/c小鼠，其诱导产生的分泌性IgA(肺脏组织)水平，较之PBS对照组，差异极显著；重组蛋白(rClfA)的免疫保护效果优于重组质粒(ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B)免疫的免疫保护效果。得到的重组蛋白rClfA，保留了与天然金黄色葡萄球菌黏附素相同的抗原特征，能够给免疫动物提供有效的保护。

本发明所涉及的重组金黄色葡萄球菌疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法，通过对PCR技术筛选后的疫苗靶标基因进行表达和免疫保护试验，设计科学、可行性强。针对金黄色葡萄球菌分布的地区差异特性，筛选多个疫苗靶标，逐一进行免疫保护试验，最终将以多价、多位点疫苗的形式组合出来一种高效的、能够广泛应用于兽医临床的金黄色葡萄球菌疫苗产品，为畜牧业生产提供基础支持。

本发明以MCF-7作为表达目的基因的工程细胞，其产物经过Ni-NTA亲和层析后，去除了各种杂蛋白，具有抗原特性单一、针对性强和生物安全性高的特点，具有能够在多种动物中安全应用的特点。

以动物细胞系作为工程细胞表达原核生物基因的实例有限，本发明克服了原核基因表达系统在表达外源基因时容易以包涵体形式表达，产物不易纯化的缺点，为多种原核生物基因的有效表达提供了一个可选途径，具有原核表达系统无法替代的优势。其中，通过本发明的引物序列，能够克隆得到ClfA优势抗原表位序列。本发明能够克服原核生物表达长序列基因编码大分子量蛋白产物时，蛋白产物易于形成包涵体而不易纯化的问题。

附图说明

图1是ClfA转染后表达检测图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例中提取金黄色葡萄球菌基因组DNA试剂盒为成都福际生物技术有限公司产品。

实施例中的金黄色葡萄球菌来源甘肃农业大学动物医学院兽医产科实验室，编号 为MD2，向公众公开出售。该株细菌对hlb、hld、hlg和seb阳性，agr、luks、lukE-lukD、lukM、hla、edin、eta、etb、tst、sea、seb、sec、sed、sef、seh、seg、seh、sei、sej、sej、sem、sen和seo阴性；根据《美国临床抗菌药物敏感性试验执行标准》第22版及其补充材料描述的方法，选用微量肉汤稀释法对MD2进行耐药性检测，结果显示MD2可耐受青霉素、红霉素、四环素、和万古霉素，对氨苄西林、环丙沙星和诺氟沙星敏感。

实施例中涉及到的毒力基因缩写及全称见表1(金黄色葡萄球菌MD2相关毒力基因缩写及其中文名称)。

表1

实施例1.真核表达工程细胞系的构建方法如下：

步骤一、根据NCBI在线已发表的金黄色葡萄球菌基因组序列，设计ClfA基因引物；其中，上游引物ClfA-1168F1，序列为GACAAAGCTTAATATGGGCGAAACGAGTG，下游引物ClfA-1168R1，序列为CTCGAGATCAATTTGGATTTGGGAA。

步骤二、以金黄色葡萄球菌(编号为MD2)基因组DNA为模板，提取其基因组DNA，用引物ClfA-1168F1和ClfA-1168R1扩增ClfA基因序列。

对金黄色葡萄球菌的基因组DNA的提取方法为：

1.过夜培养菌液3ml，室温13000g离心1min收集菌体，用160μl Buffer EB，重悬菌体，再加入40μl溶菌酶(100mg/ml)，涡旋混匀后，37℃放置30min；5000g离心3min并弃上清；

2.向沉淀中加入380μl Buffer ML1，涡旋振荡至菌体彻底悬浮；

3.加入20μl福际蛋白酶(Foregene Protease)，涡旋混匀；

4.将离心管于65℃金属浴(或水浴)20-30min，每间隔10min涡旋混匀一次；

5.向离心管中加入380μl Buffer ML2，颠倒混匀，65℃金属浴中放置10min；

6.13000g离心5-10min；

7.吸取750μl上清至新的2ml离心管中；(注意：在吸取上清时应避免沉淀被吸入，如果所吸取的上清中存在较多固体杂质，可重复步骤6一次。)

8.加入150μl无水乙醇，剧烈震荡至充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀；

9.将混合液和絮状沉淀转移至离心柱中，13000g离心1min，弃掉收集管中的废液；

10.将离心柱放回收集管中，向离心柱中加入500μlBuffer PW，13000g离心1min，弃掉收集管中的废液；

11.将离心柱放回收集管中，向离心柱中加入700μlBuffer WB，13000g离心1min，弃掉收集管中的废液；

12.重复步骤11一次；

13.将离心柱放回收集管中，13000g空管离心2min；

14.将离心柱转移至新的1.5ml离心管中，向膜中央悬空滴加100μl已于65℃预热的Buffer EB，室温放置5min，13000g离心1min。再次向膜中央悬空滴加100μl已于65℃预热的Buffer EB，13000g离心1min。将两次收集的洗脱液合并。

注意：如果希望提高DNA的浓度，可将第1次离心得到的溶液重新加回离心柱中，12,000rpm(—13,400×g)离心1min。

涉及的扩增ClfA基因序列的PCR反应体系组成为(50μl反应体系)：

使用不同反应体系时，各组分成比例增加或减少即可。

涉及的扩增ClfA基因序列的PCR反应条件为：

94℃预变性5min；

94℃30s，60℃40s，72℃1min，40个循环；

72℃最后延伸10min。

步骤三、将步骤二中纯化得到的ClfA序列经连接-T1Simple CloningVector在DH5α扩增后，提取质粒并用Hind III和Xho I分别对ClfA和pcDNA 3.1 V5-His B进行双酶切，回收酶切产物并进行连接，得到重组质粒ClfA-pcDNA 3.1 V5-His B(简写ClfA-pcDNA 3.1，下同)。

所述的ClfA与-T1 Simple Cloning Vector的连接反应体系为：

轻弹混匀，室温反应5min，随即将离心管置于冰上。

所用核酸内切酶为Promega北京公司产品。

所涉及的ClfA与载体pcDNA 3.1 V5-His B的双酶切反应体系为(20μl)：

吹打均匀，然后加入限制性内切酶

Hind III(10u/μl) 0.5μl

Xho I(10u/μl) 0.7μl

用10μl移液器吹打均匀，盖上离心管盖，瞬时离心，使各组分沉于管底。室温酶切2.5h。

注：Promega公司推荐的20μl的单酶切反应体系中10×Buffer B的用量为2μl，我们在双酶切体系中将其用量提高到了2.5μl，目的是为了增强对酶解核酸过程中对酸碱的缓冲能力。

所述的ClfA与pcDNA 3.1 V5-His B的连接反应体系为：

轻弹混匀，室温反应5min，随即将离心管置于冰上。

步骤四、将步骤三中所述的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆并在具有氨苄筛选压力的LB培养基中进行增殖。

转化DH5α感受态细胞的操作方法为：

1.取1—5μl连接产物加入到刚解冻的50μl DH5α感受态细胞中，轻弹混匀；

2.置于42℃水浴热激30s，立即冰浴2min；

3.加600μl预平衡至室温的液体LB培养基，200rpm、37℃培养1h；

4.取100μl涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养9～12h；

5.用10μl吸头挑取白色菌落接种于含有3mL LB/Amp的5mL离心管中，200rpm、37℃培养约6～8h后，取样做菌液做PCR鉴定，阳性克隆有单一、明亮、大小在1100bp左右的条带，自连载体无条带，或出现小于200bp左右的杂带。

步骤五、将步骤四中得到的重组质粒ClfA-pcDNA 3.1，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，并使用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆。

涉及的lippo2000为Invitrogen公司产品。MCF-7人乳腺癌细胞系购买自上海瑞鹿有限公司，pcDNA 3.1 V5-His B购买自Invitrogen公司。

转染人乳腺癌细胞MCF-7的方法为：

1.将铺板率约85％—90％的MCF-7细胞用0.05％的胰蛋白酶——EDTA消化，充分吹打为单细胞悬浮液，用PBS离心洗涤1次，按照每瓶T25细胞加入20ml完全培养基(DMEM+10％胎牛血清)的比例重新悬浮，按照每孔2ml的量接种于6孔板中；

2.待细胞铺板率为75％—85％时(大约需要24—36h)进行转染；

3.脂质体按照每孔8μl的量用无血清培养基稀释至100μl；ClfA-pcDNA3.1按照每孔400—1000ng用量稀释至100μl；分别孵育15至45min后，将二者混合，轻弹混匀；5min以后将此转染混合物加入6孔板中；

4.将6孔板置于含5％CO₂的细胞培养箱中，培养4—6h以后，吸去转染混合物，按照每孔2ml的用量加入完全培养基。

所述的G-418筛选阳性克隆和荧光定量PCR筛选高表达克隆的方法如下：

1.转然后24h，更换完全培养基，并添加100×的G-418至800μg/ml；

2.每间隔2至4天换液一次，勿使培养基颜色变黄；

3.如此持续筛选14天，正常生长和增值的细胞克隆即为阳性细胞克隆。取样进行PCR和Western blot鉴定，以确定阳性克隆细胞集落有ClfA基因对应的mRNA的转录和ClfA蛋白产物的生成；

4.将上述阳性克隆细胞用0.05％的胰蛋白酶——EDTA消化，充分吹打为单细胞悬浮液，进行细胞计数；取适量细胞，用完全培养基稀释至浓度为0.5个/200μl，添加G-418至800μg/ml，并按照200μl/孔接种96孔培养板；

5.培养3至7天时，选择只有一个细胞集落的孔并做好标记，待克隆细胞增殖5—10代时，用胰蛋白酶消化标记的细胞集落，每个细胞集落酶解后分别接种至24孔板，一个细胞集落对应24孔板中的一孔；

6.培养至铺板率为85％—95％时，按照每孔细胞传6孔板中的2孔的方式进行扩大培养；

7.将6孔板中细胞按照一孔传2个T25细胞培养瓶的方式进行再次放大培养，待细胞铺板率达到85％左右时，收集细胞，通过实时荧光定量技术进行mRNA水平的鉴定，mRNA表达水平最高的细胞克隆，即认为高表达细胞克隆；

8.选择高表达细胞克隆进行增殖和保种，其余细胞进行无害化处理。

步骤六、用Ni-NTA亲和层析柱从步骤五中得到的阳性克隆细胞株中纯化重组质粒ClfA-pcDNA 3.1的基因蛋白产物，定义为rClfA。

用Ni-NTA从阳性克隆细胞中纯化rClfA的方法为：

1.总蛋白的准备：用含有1mM PMSF的商品化的RIPA蛋白裂解液溶解细胞，0.22μm的滤器过滤MCF-7细胞总蛋白，或12000rpm离心20min以除去固体物质；

2.装柱：将NTA树脂装入层析柱中，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer平衡，弃流出液；

3.将过滤后的MCF-7细胞总蛋白逐滴加入层析柱中，使目的蛋白能够结合在Ni-NTA交联琼脂糖树脂上，未结合的蛋白缓慢流出；

4.逐滴加入10倍体积的NTA-0Buffer洗涤柱床，使其自然流出，以洗去非特异性结合在树脂上的杂蛋白；

5.逐滴加入5倍体积的NTA-20Buffer洗脱rClfA，收集洗脱液；

6.逐滴加入5倍体积的NTA-25Buffer洗脱rClfA，收集洗脱液；

7.逐滴加入5倍体积的NTA-30Buffer洗脱rClfA，收集洗脱液；

8.将步骤2至步骤7中的流出液或洗脱液分别取样进行SDS-PAGE电泳，分析rClfA的洗涤和洗脱条件；

9.采用Bradford蛋白定量法，测定蛋白含量；

10.-20℃保存，备用。

步骤七、通过PCR、western blot技术对步骤五中得到的阳性克隆细胞进行鉴定，确认其具有金黄色葡萄球菌抗原特性。

所涉及的PCR检测转染阳性克隆细胞的方法为：

1)在转染24—72h提取转染细胞的总RNA并进行反转录；

2)以1)得到的反转录产物为模板，ClfA-1168F1为上游引物、ClfA-1168R1为下游引物进行PCR扩增，能够得到与步骤二中大小一致的目的条带，经胶回收、送样测序，结果显示所扩增目的条带序列与权利要求书1中所述序列一致；

3)Western blot检测时，以兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体为一抗，羊抗兔-HRP抗体为二抗进行检测，得到了大小符合预期的单一条带，结果如图1(ClfA转染后表达检测图)所示，图中M为蛋白marker，2、3和4泳道依次为顺转36小时分析产物表达情况、阴性对照样品和稳定转染筛选结束后提取的蛋白样品。

步骤八、用步骤七中得到的纯化后的重组蛋白rClfA免疫Balb/c，检测免疫动物的免疫学指标变化。

所述的用重组ClfA蛋白rClfA免疫Balb/c小鼠的方案为：

1)分组：

采用皮下注射+滴鼻免疫，重组蛋白+重组质粒免疫组合的方式进行免疫试验，共分7组：

重组质粒20μg皮下注射组

重组蛋白20μg皮下注射组

重组蛋白20μg滴鼻组

重组蛋白40μg皮下注射组

重组蛋白40μg滴鼻组

弗氏佐剂20μg注射组(阳性对照组)

PBS100μl皮下注射组(阴性对照组)

2)详细免疫程序见表2(用rClfA免疫Balb/c小鼠的详细免疫程序)：

表2

涉及的免疫Balb/c小鼠后检测的内容及检测方法如下：

主要包括其血清中的白细胞介素1、2、4和干扰素γ，肺脏组织中的白细胞介素1、2、4和干扰素γ，免疫球蛋白总蛋白IgGs分泌性免疫球蛋白SIgA水平的变化。免疫组和对照组之间白细胞介素和免疫球蛋白水平的检测均采用了商品化的免疫因子ELISA检测试剂盒，购买自艾莱萨生物科技(上海)有限公司，操作过程因试剂盒不同而略有差异：

a)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；

b)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；

c)样本孔中加入待测样本50μl；空白孔不加；

d)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；

e)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μl)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4-5次(也可用洗板机洗板)；

f)每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min；

g)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

免疫Balb/c小鼠免疫因子检测结果与对照组(PBS组)显著性检验结果(单因素方差分析方法，Dunnett t检验^a)，如表3(血清样品检测结果，与对照组相比血清中干扰素-γ和白介素1,2,4的变化情况)；表4(肺脏组织匀浆检测结果，与对照组相比肺脏组织匀浆中干扰素-γ和白介素1,2,4的变化情况)。

表3

*.均值差的显著性水平为0.05。**.均值差异极显著的水平为0.01。

p>0.05表示与对照组相比，差异不显著。

a.Dunnett t检验将一个组视为一个控制组，并将其与所有其他组进行比较。

表4

*.均值差的显著性水平为0.05。**.均值差异极显著的水平为0.01。

p>0.05表示与对照组相比，差异不显著。

a.Dunnett t检验将一个组视为一个控制组，并将其与所有其他组进行比较。

对免疫Balb/c小鼠进行了干扰素γ、白细胞介素1、2、4和总免疫球蛋白IgGs和分泌型免疫球蛋白SIgA的检测，结果表明，通过皮下注射免疫和滴鼻免疫，各免疫组均能够诱发受试动物产生强烈的免疫反应，各项免疫参数均明显优于未免疫的动物，具体表现在：

1)用剂量为20μg或40μg的重组蛋白进行皮下或滴鼻免疫时，所诱发的干扰素γ、白细胞介素1、2、4和总免疫球蛋白IgGs的水平均极显著地高于PBS对照组；而仅在滴鼻免疫时，诱导产生的分泌型免疫球蛋白SIgA水平极显著地高于对照组。说明重组蛋白rClfA皮下注射免疫诱导受试动物产生了有效的体液免疫和细胞免疫反应；而黏膜免疫能够有效地刺激SIgA水平的升高，增强第一道免疫屏障对病原的抵御能力；

2)用重组质粒20μg皮下注射组免疫时，除IL-1水平极显著地高于对照组意外，IL-2、IL-4、IFN-γ、IgGs和SIgA的水平明显高于对照组，或与对照组差异不明显；

3)重组蛋白rClfA诱导产生的免疫效应水平明显高于重组质粒ClfA-pcDNA3.1诱导的免疫反应水平。

实施例2：

本实施例与实施例1不同的是，步骤三中ClfA基因与载体pcDNA 3.1 V5-His B的双酶切的体系为50μl，酶切反应条件为2—8℃过夜酶切。

所涉及的双酶切反应体系为：

吹打均匀，然后加入限制性内切酶

Hind III(10u/μl) 0.5μl

Xho I(10u/μl) 0.7μl

用10μl移液器吹打均匀，盖上离心管盖，瞬时离心，使各组分充分混匀；2—8℃过夜酶切。

酶切后ClfA和pcDNA 3.1 V5-His B的连接反应体系为20μl，应条件为16℃过夜连接连接反应体系及反应条件为(1.5mL离心管)：

16℃过夜连接，8—16h，一般能够得到较为理想的结果。

步骤六中用Ni-NTA亲和层析柱从阳性细胞克隆中分离纯化rClfA时，采用的是15ml离心管离心法，其余与具体实施方式一相同。利用15ml离心管离心法纯化rClfA的方法如下：

1.总蛋白的准备：在4℃条件下，12000g离心15min，吸去上清(细胞总蛋白溶液)至干净的无菌离心管中；

2.装柱：将NTA树脂装入15ml离心管中，500g离心2min，去上清；

3.加入10倍体积的NTA-0Buffer，室温缓慢震荡5min，500g离心5min，去上清；

4.重复步骤3一次；

5.加入总蛋白溶液，加PMSF至1mM/L，室温缓慢震荡10min；

6.500g离心5min，去上清；

7.用10倍体积的NTA-0Buffer，4℃离心洗涤树脂与蛋白结合物2次，500g离心5min，去上清；

8.依次用5倍体积的NTA-20，NTA-25和NTA-30Buffer洗脱rClfA；

9.分别取步骤6至步骤9中的上清或洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，分析rClfA的最佳洗脱条件；

10.采用Bradford蛋白定量法，测定蛋白含量；

11.-20℃保存，备用。

实施例2也能够取得与实施例1相同的结果。

<110>甘肃农业大学

<120>重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗及其真核表达工程细胞系的构建方法

<130> 2016-01

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1165

<212> DNA

<213>金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 1

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caaacaagta atgaaacgac ttctaatgat actaatacag tatcatctgt aaattcacct 240

caaaattcta caaatgcgga aaatgtttca acaacgcaag atacttcaac tgaagcaaca 300

ccttcaaaca atgaatcagc tccacagagt acagatgcaa gtaataaaga tgtagttaat 360

caagcggtta atacaagtgc gcctagaatg agagcattta gtttagcggc tgtagctgca 420

gatgcaccgg cagctggcac agatattacg aatcagttga cgaatgtgac agttggtatt 480

gactctggta cgactgtgta tccgcaccaa gcaggttatg tcaaactgaa ttatggtttt 540

tcagtgccta attctgctgt taaaggtgac acattcaaaa taactgtacc taaagaatta 600

aacttaaatg gtgtaacttc aactgctaaa gtgcctccaa ttatggctgg agatcaagta 660

ttggcaaatg gtgtaatcga taatgatggt aatgttattt atacatttac agactatgta 720

aatactaaag atgatgttaa agcaactttg actatgcccg cttatattga ccctgaaaat 780

gttacaaaga caggtaatgt gacattggct actggcatag gtagtacaac agcaaacaaa 840

acagtattag tagattatga aaaatatggt aagttttata acttatctat taaaggtaca 900

attgaccaaa tcgataaaac aaataatacg tatcgtcaga caatttatgt caatccaagt 960

ggagataacg ttattgcgcc ggttttaaca ggtaatttaa aaccaaatac ggatagtaat 1020

gcattaatag atcagcaaaa tacaagtatt aaagtatata aagtagataa tgcagctgat 1080

ttatctgaaa gttactttgt gaatccagaa aactttgagg atgtcactaa tagtgtgaat 1140

attacattcc caaatccaaa ttgat 1165

Claims (5)

1.一种重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，其特征在于：包含金黄色葡萄球菌ClfA基因序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌ClfA蛋白疫苗，其特征在于：金黄色葡萄球菌ClfA基因所使用的引物如下：上游引物为ClfA-1168F1，序列为GACAAAGCTTAATATGGGCGAAACGAGTG；下游引物ClfA-1168R1，序列为CTCGAGATCAATTTGGATTTGGGAA。

3.一种金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

一、根据NCBI在线已发表的金黄色葡萄球菌基因组序列，设计ClfA基因引物；

二、以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，提取其基因组DNA，用引物ClfA-1168F1和ClfA-1168R1扩增ClfA基因序列；

三、将步骤二中纯化得到的ClfA序列经连接-T1 Simple Cloning Vector在DH5α扩增后，提取质粒并用Hind III和Xho I分别对ClfA和pcDNA 3.1V5-His B进行双酶切，回收酶切产物并进行连接，得到重组质粒ClfA-pcDNA 3.1V5-His B；

四、将步骤三中所述的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆并在具有氨苄筛选压力的LB培养基中进行增殖；

五、将步骤四中得到的重组质粒ClfA-pcDNA 3.1V5-His B，借助脂质体2000(lippo2000)转染人乳腺癌细胞MCF-7，并使用G-418筛选阳性细胞克隆和高表达克隆；

六、用Ni-NTA亲和层析柱从步骤五中得到的阳性克隆细胞株中纯化重组质粒ClfA-pcDNA 3.1V5-His B的基因蛋白产物，定义为rClfA；

七、通过PCR、western blot技术对步骤五中得到的阳性克隆细胞进行鉴定，确认其具有金黄色葡萄球菌抗原特性；

八、用步骤七中得到的纯化后的重组蛋白rClfA免疫Balb/c，检测免疫动物的免疫学指标变化。

4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤五所涉及的转染细胞系为MCF-7细胞，所使用的转染试剂为脂质体2000，筛选阳性克隆细胞和筛选高表达阳性细胞克隆的过程中所使用的G-418的浓度为800μg/ml。

5.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌黏附因子ClfA真核表达工程细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤二中的金黄色葡萄球菌具有清楚的生物学特性数据：毒力基因检测显示，MD2对hlb、hld、hlg、hlg-2和seb阳性，agr、luks、lukE-lukD、lukM、hla、edin、eta、etb、tst、sea、sec、sec、se、see、seg、she、sei、sej、sej、sen、seo和sem阴性；耐受青霉素、红霉素、四环素、和万古霉素，对氨苄西林、环丙沙星和诺氟沙星敏感。