CN102698260A - 预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。本发明的目的在于提供预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用，亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。本发明通过以下步骤完成：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
Description
一、技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。
二、背景技术：
乳房炎是奶牛和奶山羊养殖中危害最严重的疫病，通常导致产奶量下降和乳制品质量下降。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌是造成乳房感染，引起临床和隐性乳房炎的主要致病菌，抗生素治疗乳房炎副作用很多；
传统的乳房炎疫苗多为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
三、发明内容：
本发明的目的在于提供预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用，亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：
一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
上述步骤包括：将ClfA、Hla及Sbi三种蛋白的功能区通过原核表达并纯化，制成多价亚单位疫苗，且ClfA的A区、Sbi的Ⅰ-Ⅳ区为配体结合区。
步骤1）中包括：①设计引物；②制备模板；③PCR扩增与回收目的基因；④目的基因的原核表达与纯化。
上述步骤包括：
①设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
序列：ClfA Genbank No.AB245457.1
Hla Genbank No.AY449760.1
Sbi Genbank No.AB050860.1
H1:5'-CG GAATTC GCAGATTCTGA-3' EcoRI
H2: 5'-GC CTCGAG TTAATTTGTCAT -3' XhoI
C1: 5'-CG GAATTC GTAGCTGCAGAT-3' EcoRI
C2: 5'-CCG CTCGAG CTCATCAGGTTGTTCAGG-3' XhoI
S1: 5'-CG GAATTC GATCAACAAAAAGCTT-3' EcoRI
S2: 5'-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3' XhoI
②制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， -20℃保存备用。
③PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，C1/C2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（3）扩增目的基因Sbi的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；
（4）回收PCR扩增产物
目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， -20℃保存备用；
④目的基因的原核表达与纯化
（1）表达载体的构建
分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切；
酶切体系（40??L）：PCR产物或pET32a载体32??L，10×H Buffer 4??L，EcoRI / XhoI各2??L；
混匀后置于37℃水浴反应2～3h，目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物4℃保存；
连接反应体系：T4 Ligase Buffer 1??L，目的片段酶切产物6.5??L，pET32a 载体酶切产物1.5??L，T4 DNA Ligase1??L；
将连接产物转化入感受态细胞BL21（DE3），在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；
（2）重组质粒的诱导表达
将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB 培养基中，转速为220r/min、37℃震荡培养至OD600=0.8～1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下：
pET-Hla：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，6h；
pET-CA：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，2h；
pET-Sbi：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，4h；
表达产物用SDS-PAGE电泳检测；
（3）目的蛋白的纯化
收集诱导后的菌体，用PBS（pH7.4）洗涤2次后重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4℃离心5min，收集上清，用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白，纯化产物用SDS-PAGE电泳检测。
步骤2）的混合过程为：将纯化得到的Hla蛋白在60℃水浴条件下处理30min，然后将Hla、CA、Sbi三种蛋白用pH7.4的PBS稀释混合均匀，使各蛋白终浓度相同，再与转移因子佐剂等体积混匀。
上述亚单位疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：乳房炎亚单位疫苗即利用致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时省力具有显著疗效的新型疫苗。
四、附图说明
图1.基因clfa-A区的PCR的扩增结果图；
图2基因Hla的PCR 的扩增结果图；
图3基因sbi的PCR的扩增结果图；
图4重组蛋白clfa-A区的SDS-PAGE分析图；
图5重组蛋白Hla的SDS-PAGE分析图；
图6重组蛋白Sbi的SDS-PAGE分析图。
五、具体实施方式
乳房炎亚单位疫苗即利用致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。本疫苗研发时，选择基因基于以下事实：ClfA、Hla及Sbi是金黄色葡萄球菌产生的毒力因子，在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中以特定的结构域发挥毒力作用。ClfA的A区（ClfA-A）是结合宿主细胞外基质中前卫蛋白与纤维蛋白原的功能性区域；Hla通过各个单体之间的相互作用形成攻膜复合物，在靶细胞表面打孔使其裂解，；Sbi的功能区（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区）可以特异性地与宿主的IgG的Fc端结合，干扰抗体介导的调理吞噬作用从而抵抗宿主吞噬细胞的杀伤作用，还可以与补体C3d、补体调节蛋白H因子结合，阻止补体形成攻膜复合物。
本发明预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法包括：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
步骤1）中包括以下步骤：
1、设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
序列：ClfA Genbank No.AB245457.1
Hla Genbank No.AY449760.1
Sbi Genbank No.AB050860.1
H1:5'-CG GAATTC GCAGATTCTGA-3' EcoRI
H2: 5'-GC CTCGAG TTAATTTGTCAT -3' XhoI
C1: 5'-CG GAATTC GTAGCTGCAGAT-3' EcoRI
C2: 5'-CCG CTCGAG CTCATCAGGTTGTTCAGG-3' XhoI
S1: 5'-CG GAATTC GATCAACAAAAAGCTT-3' EcoRI
S2: 5'-CG CTCGAG TAATGCGTCTAATTGTTT-3' XhoI
ClfA、Hla与Sbi在金黄色葡萄球菌感染宿主的过程中分别起黏附、破坏宿主细胞、逃避免疫系统的作用。
2、制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样。均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜。取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， -20℃保存备用。
3、PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min，参见图2。
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，C1/C2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min，参见图1。
（3）扩增目的基因Sbi的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀。
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min，参见图3。
（4）回收PCR扩增产物
目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， -20℃保存备用。
4、目的基因的原核表达与纯化
（1）表达载体的构建
分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切。
酶切体系（40??L）：PCR产物或pET32a载体32??L，10×H Buffer 4??L，EcoRI / XhoI各2??L。
混匀后置于37℃水浴反应2～3h。目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物4℃保存。
连接反应体系：T4 Ligase Buffer 1??L，目的片段酶切产物6.5??L，pET32a 载体酶切产物1.5??L，T4 DNA Ligase1??L。
将连接产物转化入感受态细胞BL21（DE3），在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定。
（2）重组质粒的诱导表达
将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB 培养基中，转速为220r/min、37℃震荡培养至OD600=0.8～1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下：
pET-Hla：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，6h；
pET-CA：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，2h；
pET-Sbi：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，4h；
表达产物用SDS-PAGE电泳检测。图4是重组蛋白clfa-A区的SDS-PAGE分析图；图5是重组蛋白Hla的SDS-PAGE分析图；图6是重组蛋白Sbi的SDS-PAGE分析图。
（3）目的蛋白的纯化
收集诱导后的菌体，用PBS（pH7.4）洗涤2次后用重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4℃离心5min，收集上清。用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白。纯化产物用SDS-PAGE电泳检测。
步骤2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合（疫苗的制备）；
将纯化得到的Hla蛋白在60℃水浴条件下处理30min。然后将Hla、CA、Sbi三种蛋白用pH7.4的PBS稀释混合均匀，使各蛋白终浓度相同，再与转移因子佐剂等体积混匀。转移因子佐剂可以增强机体免疫功能。
本发明奶山羊乳房炎亚单位疫苗免疫效果（见下表）
| 疫苗 | 接种羊数（只） | 接种部位 | 观察时间（天） | 隐性乳房炎发病率 |
| 亚单位疫苗 | 60 | 乳腺皮内接种 | 60 | 8% |
| 金黄色葡萄球菌灭活苗 | 30 | 乳腺皮内接种 | 60 | 55% |
| PBS对照 | 30 | 乳腺皮内接种 | 60 | 80% |
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> 预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及其应用
<130> 2012
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
cggaattcgc agattctga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
gcctcgagtt aatttgtcat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
cggaattcgt agctgcagat 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
ccgctcgagc tcatcaggtt gttcagg 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
cggaattcga tcaacaaaaa gctt 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
cgctcgagta atgcgtctaa ttgttt 26
Claims (6)
1.一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合。
2.根据权利要求1所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：将ClfA、Hla及Sbi三种蛋白的功能区通过原核表达并纯化，制成多价亚单位疫苗，且ClfA的A区、Sbi的Ⅰ-Ⅳ区为配体结合区。
3.根据权利要求2所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1）中包括：①设计引物；②制备模板；③PCR扩增与回收目的基因；④目的基因的原核表达与纯化。
4.根据权利要求3所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：
①设计引物
根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：
序列：ClfA Genbank No.AB245457.1
Hla Genbank No.AY449760.1
Sbi Genbank No.AB050860.1
H1:5'-CG GAATTC GCAGATTCTGA-3' EcoRI
H2: 5'-GC CTCGAG TTAATTTGTCAT -3' XhoI
C1: 5'-CG GAATTC GTAGCTGCAGAT-3' EcoRI
C2: 5'-CCG CTCGAG CTCATCAGGTTGTTCAGG-3' XhoI
S1: 5'-CG GAATTC GATCAACAAAAAGCTT-3' EcoRI
S2: 5'-CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT-3' XhoI
②制备模板
提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， -20℃保存备用；
③PCR扩增与回收目的基因
（1）扩增目的基因hla
反应体系（50 μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（2）扩增目的基因ClfA的A区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，MgCl2 4 μL，C1/C2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；
（3）扩增目的基因Sbi的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区
反应体系（50μL）：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；
PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；
（4）回收PCR扩增产物
目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物用， -20℃保存备用；
④目的基因的原核表达与纯化
（1）表达载体的构建
分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切；
酶切体系（40??L）：PCR产物或pET32a载体32??L，10×H Buffer 4??L，EcoRI / XhoI各2??L；
混匀后置于37℃水浴反应2～3h，目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，得到重组质粒pET-Hla、pET-CA、pET-Sbi，产物4℃保存；
连接反应体系：T4 Ligase Buffer 1??L，目的片段酶切产物6.5??L，pET32a 载体酶切产物1.5??L，T4 DNA Ligase1??L；
将连接产物转化入感受态细胞BL21（DE3），在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；
（2）重组质粒的诱导表达
将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB 培养基中，转速为220r/min、37℃震荡培养至OD600=0.8～1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下：
pET-Hla：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，6h；
pET-CA：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，2h；
pET-Sbi：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，4h；
表达产物用SDS-PAGE电泳检测；
（3）目的蛋白的纯化
收集诱导后的菌体，用PBS（pH7.4）洗涤2次后用重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4℃离心5min，收集上清，用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白，纯化产物用SDS-PAGE电泳检测。
5.根据权利要求4所述的预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2）的混合过程为：将纯化得到的Hla蛋白在60℃水浴条件下处理30min，然后将Hla、CA、Sbi三种蛋白用pH7.4的PBS稀释混合均匀，使各蛋白终浓度相同，再与转移因子佐剂等体积混匀。
6.根据权利要求1所述的亚单位疫苗在预防山羊葡萄球菌乳房炎中的应用。
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2012
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