CN111487412A - 骨桥蛋白多肽的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种骨桥蛋白多肽的新应用，具体涉及OPN多肽在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。本发明的发明人经过长期研究及大量试验发现，OPN的含量变化对肝癌的状态具有明显的相关性，将其作为标志物并用OPN制备检测OPN含量的试剂盒，能够准确辅助诊断肝癌的存在、分期和转移。

Description

骨桥蛋白多肽的新应用

技术领域

本发明涉及肝癌的诊断领域，并具体涉及一种骨桥蛋白多肽的新应用。

背景技术

人们谈癌色变。21世纪以来，恶性肿瘤对人类健康的威胁已日趋严重。其致死率仅次于心脑血管疾病，位居第三。肿瘤患者死亡率高的主要原因是不能早期诊断，早期诊断与早期治疗是防治肿瘤与降低死亡率的最有效方法。

随着肿瘤细胞的发生，肿瘤患者体内某些蛋白质会发生变化，或产生新的与肿瘤关联的异常蛋白。这些能反应肿瘤存在的化学类物质人们总称为肿瘤标志物。由于肿瘤标志物或不存在于正常成人组织而仅见于肿瘤组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，因此通过对这些异常的蛋白质的检测不仅可以用来诊断肿瘤的发生也可以用来监控药物对肿瘤的治疗进展，对肿瘤的诊治将起到重要作用。用于临床诊断的肿瘤标志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和细胞表面肿瘤抗原等6大类。美国FDA批准了以下血清肿瘤标志物用于肿瘤的辅助诊断：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，癌抗原CA19-9，癌抗原CA153，前列腺特异性抗原(fPSA,tPSA)，甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)，β人绒毛膜促性腺激素(HCGb)，和人附睾分泌蛋白4(HE4)。另外其他常用于临床诊断的肿瘤标志物还包括神经原特异性烯醇化酶(NSE)，降钙素(PCT)，铁结合蛋白(Ferritin)，β2－微球蛋白(beta 2-Microglobin)，胃蛋白酶原(Pepsinogen 1,2)，和催乳素(Prolactin)等。

总体上来讲，肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于基因的表达水平的变化而生成或减少的抗原和其他生物活性物质，可用于肿瘤的早期诊断、分期、监测肿瘤进程，和评价药物的治疗效果(ASCO，1996)。它会对肿瘤的临床治疗带来巨大的影响，尤其当它能够在临床病症出现之前被检测到，或者可以用于治疗效果的实时检测时。目前，为了满足肿瘤的临床诊断和治疗的需求，肿瘤标志物的研发亟待加速。

但是，目前用于早期诊断的肿瘤标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能在体检中广泛应用。对于肝癌，甲胎蛋白和超声波检查是普遍采用的诊断高危病人的方式，并且确实显著提高了肝癌病人的生存率，但灵敏度比较低；肿瘤抗原CA125有更高的灵敏度，但却缺乏特异性。同样地，用于乳腺癌检测的血液肿瘤标志物CA153因灵敏度低在早期诊断中几乎没用。因此，肿瘤的早期诊断、以及良性和恶性肿瘤的区分仍然是一个临床难题，需要新的技术和方法来发现新的肿瘤标志物和提高肿瘤标志物检测的灵敏度和可信度。

骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种具有多种功能的分泌性磷酸化糖蛋白，可促进细胞的黏附和迁移，被认为是恶性转化的分泌性蛋白，分布广泛。其在恶性肿瘤患者的肿瘤组织和血液中的表达水平，与肿瘤患者筛选、病情预测和预后有着重要的联系。肿瘤转移是导致病人复发的主要原因，骨桥蛋白在转移的肿瘤组织中表达很高，体外研究发现同外源性OPN能够通过整合素受体促进肿瘤细胞的黏附和迁移，并产生抗凋亡信号，促进肿瘤细胞的生长，具有促进肿瘤细胞迁移的能力。体内实验表明OPN促进了肿瘤组织的生长，此外OPN可以参与调控多种信号通路，并进一步激活转移相关基因，促进细胞迁移。OPN通过促进肿瘤细胞生长，诱导局部新生血管形成，抑制转移微环境对肿瘤细胞的凋亡诱导，促进肿瘤的淋巴转移等方式参与恶性肿瘤的进展和转移。骨桥蛋白基于其生物学特性，其作为肿瘤标志物的功能已备受关注，例如：现有技术公开了一种用于多项肿瘤骨转移标志物并行检测的液相芯片及其制备方法，该技术方案涉及到以OPN作为肿瘤骨转移标志物。

但是，目前市面上还未有采用OPN用于肝癌检测的产品。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种OPN多肽的新应用，具体涉及OPN多肽作为标准品在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种骨桥蛋白多肽作为标准品在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途，所述骨桥蛋白多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的是提供一种用于骨桥蛋白检测的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的再一目的是提供上述多肽作为标准品在检测待测样本所含骨桥蛋白中的应用。

在其中一个实施例中，所述的待测样本为血液样本。

在其中一个实施例中，所述的检测采用酶联免疫法检测。

在其中一个实施例中，所述的检测采用免疫印迹法检测。

本发明的又一目的是提供一种骨桥蛋白ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒包含有上述的多肽作的标准品。

本发明的还一目的是提供一种骨桥蛋白的ELISA检测方法，所述检测方法包括包被、封闭、加抗原、加酶标二抗、加底物显色和终止的步骤；其中：所述的加抗原步骤包括：将待测样本、骨桥蛋白标准品溶液分别加入酶标板孔，所述的标准品包括上述的多肽。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明的发明人经过长期研究及大量试验发现，OPN的含量变化对肝癌的状态具有明显的相关性，将其作为标志物并用OPN制备检测OPN含量的试剂盒，能够准确辅助诊断肝癌的存在、分期和转移。

发明人发现传统的技术方案通常以OPN原核重组蛋白作为标准品，该标准品不易与特异性抗体结合，导致检测的可信度受到负面影响。为克服该缺陷，发明人进一步提供一种SEQ ID No.2所示的多肽，该多肽是获取SEQ ID No.1的第56位氨基酸至第76位氨基酸的序列并将第60位脯氨酸(Pro)突变为赖氨酸(Lys)制备而成。以该SEQ ID No.2所示的多肽作为标准品用于OPN检测时，很容易与OPN的抗体发生特异性免疫结合，确保检测结果的准确度，提升检测可信度。并且，该SEQ ID No.2所示的多肽的肽链结构非常稳定，不易被降解，确保标准品质量，为获得可信度高的检测结果进一步提供了保障；并且该多肽的亲水性也比较好，克服了国内生产商研发的重组蛋白溶解性低导致不利于试剂盒的制备的缺陷。

附图说明

图1为实施例1中肝癌标志物的筛选流程图；

图2为实施例1中训练组的17种因子的ROC曲线图；

图3为实施例1中17种因子的交叉验证示意图；

图4为实施例1中训练组的6种因子的ROC曲线图；

图5为实施例1中6种因子的交叉验证示意图；

图6为实施例2中反向蛋白芯片分别检测β2微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白的结果扫描图；

图7为实施例2的肝癌样品和健康样品中的OPN含量对比图；

图8为不同OPN标准品检测样本中的OPN的效果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本发明中，术语“本发明的多肽”指，其包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或由SEQID No.1的氨基酸序列，以及其衍生的氨基酸序列组成。优选地，术语“本发明的多肽”在本发明中指的是由SEQ IDNo.1的氨基酸序列衍生组成的多肽。在本申请中，术语“血浆或血清中的OPN”等价地指存在于血液中的非细胞内和细胞表面的OPN蛋白，它可单独游离存在，也可以与其他血液中的细胞外蛋白相结合的形式存在。在本发明中，术语“多肽”可与“蛋白质”互换使用。

本发明通过ELISA或免疫印迹方法检测血液中OPN的含量。可使用以抗原抗体反应为原理的其他检测手段，以及其他原理的、可以直接或间接的反映OPN的浓度的手段，比如通过化学发光法，时间分辨荧光免疫法反映OPN的浓度。

测定OPN浓度的标准曲线所使用的OPN标准品纯化于肿瘤病人的血样，也可以通过基因重组表达获得，包括OPN的全长、片段，以及包含有OPN序列的重组蛋白和与其他基团相偶联的复合物。“OPN浓度的标准曲线”指的是使用已知浓度的OPN标准样品，用ELISA方法测定的浓度和吸光度测定值的对应曲线。“OPN标准品”指的是纯度大于95％的OPN蛋白、重组OPN蛋白、片段以及衍生物样品，优先溶解较高的OPN多肽。

反向蛋白芯片，能平行检测数以千计的病人样本中的单一或者有限的指标，所以RPPA已经用于检测疾病尤其是癌症等相关信号通路的因子。反向蛋白芯片的操作原理为：采用斑点杂交技术，同时检测上千个样本的蛋白表达水平，通过微孔固相载体探测高特导性的抗体。反相蛋白质检测芯片是用破碎的微量组织或者细胞样品点样制成的芯片，代表在某种状态下整个细胞的蛋白质，然后用特定抗体进行检测。样品中的待测蛋白质或多肽及其他生物分子通过化学键连接于固相载体上而被固定，固相载体表面经过封闭后，加入标记的探针，与固相生物分子进行杂交反应，洗去未结合的物质后，样品点的发光强度与样品中待测成分的浓度成正比。

实施例1、肝癌标志物的筛选实验

本实施例的实验志愿者包括癌症患者、其他癌症患者和健康人群，肝癌标志物的筛选流程参照图1所示。基于ELISA法，使来自实验志愿者提供的血清样品充分接触包被有针对274个血清标记物的抗体的抗体芯片，对抗体芯片测试结果进行人工神经网络分析。设置78个肝癌样本、40个其它癌症样本以及80个健康样本，对抗体芯片提供的数据进行归一化处理。采用相关标准品得出目标因子的标准品曲线，根据标准品曲线测定蛋白浓度。由此发现，有21种因子在肝癌样本中的含量明显有别于在其他癌症样本和健康样本中的含量。根据P值<0.01的要求，从中选择符合该要求的17种因子进行统计建模。这17个因子是AFP(甲胎蛋白)、GDF15(人生长分化因子-15)、OPN、MMP9(基质金属蛋白酶9)、GP73(高尔基蛋白73)、B2M(β2-微球蛋白)、IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、ACRP30(脂肪细胞补体相关蛋白)、Ferritin(铁蛋白)、Axl(受体酪氨酸激酶)、LYVE-1(淋巴管内皮细胞透明质酸受体)、Fas(脂肪酸合成酶)、DKK-1、HGF(肝细胞生长因子)、IL8(白细胞介素-8)、FGF9(成纤维细胞生长因子9)、Nidogen1(巢蛋白1)。综合筛选出的17个因子，分别采用逻辑回归(LR)、线性判别分析(LDA)、随机森林(RF)和支持向量机(SVM)4组模型评价选中因子的灵敏度，特异度及准确率。

本实施例采用了留一交叉验证筛选方法(leave-one cross-validationapproach)：每一回合把样本N分成训练组N-1和预测组1，就会得到N个模型，用N个模型最终的预测组的分类准确率的平均数作为此下分类样本的性能指标。此筛选方法的优点是每一回合中几乎所有的样本皆用于训练模型，因此最接近原始样本的分布，这样评估所得的结果比较可靠；实验过程中没有随机因素会影响实验数据，确保实验过程是可以被复制的。从训练组得出模型，再采用预测组进行验证。

从图2可以看出根据上述4种模型采集关于训练组的17种因子的受试者工作特征曲线(ROC曲线)下的面积接近1，准确率高。本申请继续减少模型的因子数量来测试，从17种因子到6种因子，观察到β2微球蛋白、IGFBP3蛋白、GP73蛋白、GDF15蛋白、OPN蛋白和AFP蛋白这6种因子的准确率与17种因子相当，6种因子的ROC曲线(如图4所示)下的面积也接近1，17种因子和6种因子交叉验证的精确度和KAPPA值如图3、图5所示。对比表1和表2提供的数据，表格中的灵敏度、特异度和精确度都很接近1，说明受试样本中17种因子和6种因子的检测结果能够正确地识别区分肝癌的患者与非患者，据此对实验者进行肝癌状态的诊断具有较高的可靠性。

表1、17种因子模型的性能评估

表2、6种因子模型的性能评估

实施例2、反向蛋白芯片操作步骤

本实施例采用反向蛋白芯片技术对实施例1所得6个因子进行比较分析，反向蛋白芯片的操作步骤如下：

表3、本实施例采用的试剂

(1)样品处理：对实验者提供的血清样品采用适当缓冲液及连续稀释处理。

(2)标准品制备：将6个因子重组蛋白(见表3)配制成浓度为100g/ml(原液)，按照各个因子标准曲线的起始浓度按照不同1/3倍数稀释5次，设置空白对照。

(3)膜片制备：将步骤(1)稀释的血清样品、步骤(2)制备的梯度稀释标准品、阳性对照及空白对照点样到膜片；其中，800cw标记的链霉亲和素作为阳对照，含有体积分数为1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液作为阴性对照。

点样后，将膜片自然干燥并储存于-80℃。

(4)膜片检测：将膜片平衡至室温后，分别用封闭缓冲液孵育30分钟；分别加入生物素标记的检测抗体(表3)溶液孵育2个小时；加入1×800cw标记的链霉亲和素(用封闭液稀释8000倍)，室温孵育2h；洗涤后由Genepix 4000B激光扫描仪在532nm下进行扫描。

本实施例所述的封闭液为Thermo Fisher cat#37525。

采用ImageQuant LAS4000化学发光成像分析系统扫描：1)扫描仪器：ImageQuantLAS4000Scanner；2)品牌：美国GE公司(GE Healthcare Corporate)；3)产地：USA；4)扫描参数：high resolution(高分辨度)。

采用仪器自带分析软件提取数据，采用IBM SPSS分析软件来进行数据分析。

通过数据分析如图6，得知6个因子具有显著性差异(P<0.05)。

另外肝癌样品和健康样品中OPN蛋白含量对比图如图7，根据图7可知，OPN蛋白在健康样品和肝癌样品中表达量差异显著。

实施例3、稳定的OPN标准品多肽的制备

OPN是由314个氨基酸组成的蛋白，如SEQ ID No.1如下所示：

MRIAVICFCL LGITCAIPVK QADSGSSEEK QLYNKYPDAV ATWLNPDPSQKQNLLAPQNAVSSEETNDFKQETLPSKSNE SHDHMDDMDD EDDDDHVDSQ DSIDSNDSDD VDDTDDSHQSDESHHSDESD ELVTDFPTDL PATEVFTPVV PTVDTYDGRG DSVVYGLRSK SKKFRRPDIQ YPDATDEDITSHMESEELNG AYKAIPVAQD LNAPSDWDSR GKDSYETSQL DDQSAETHSH KQSRLYKRKA NDESNEHSDVIDSQELSKVS REFHSHEFHS HEDMLVVDPK KEEDKHLKFRI SHELDSAS SEVN

本发明经过大量的研究发现，采用OPN重组蛋白作为校准品检测样品中的OPN时，由于原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，标准品的稳定性较天然蛋白更差。而且在纯化重组蛋白过程中得到不溶的包涵体，不易与特异性抗体结合。目前没有见到稳定性优良的OPN标准品。如图6所示，采用标准品OPN重组蛋白抗原的第一梯度STD1扫描孔出现弥散现象，导致后续计算误差增大。因此制备单个指标的酶免试剂盒，必须选择适合的标准品。

本发明提供的OPN多肽由上海吉尔生化合成，序列如下SEQ ID No.2所示：APQNKVSSEETNDFK QETLPS。

本实施例经过抗原表位设计经验，通过突变掉OPN(SEQ ID No.1)第56位氨基酸至第76位氨基酸的序列中的第60位丙氨酸(Ala)为赖氨酸(Lys)并以获得的SEQ ID No.2所示短多肽为标准品，使肽链结构相对稳定，具体地：突变前，OPN(SEQ ID No.1)的第56位氨基酸至第76位氨基酸中存在较多脯氨酸，在该情况下脯氨酸采用顺式酰胺键存在于多肽中，反而影响结构的稳定性及其在溶液中的可溶性。突变后的SEQ ID No.2所示的多肽序列不仅稳定性好，而且亲水性比SEQ ID No.1的重组蛋白的更好，更容易包被在酶标板上。

分别以纯度为95％的SEQ ID No.2所示的多肽为标准品、实施例2表1所示的OPN重组蛋白作为标准品，采用反向蛋白芯片技术(步骤参照实施例2)，对健康组实验志愿者和来自肝癌组实验志愿者提供的血清样本进行检测。检测结果如图8所示。图8中，左侧(即图中“多肽抗原”对应部分)为采用本实施例SEQ ID No.2所示的多肽为标准品所示结果，右侧(即图中“重组蛋白”对应部分)为采用市购重组蛋白作为标准品所示结果。通过图8可知，以本实施例SEQ ID No.2所示的多肽为标准品、以市购重组蛋白作为标准品都能够通过对OPN的检测而显著区分健康组和肝癌组。

实施例4、OPN ELISA检测试剂盒

OPN酶联免疫试检测剂盒，试剂盒的组成如下：

1、ELISA酶标板：采用吸附性能好，空白值低，批次稳定的聚苯乙烯板包被捕获抗体，预先用封闭液处理。

2、检测抗体：生物素化抗OPN单克隆抗体，最佳稀释浓度为0.1mg/L。

3、洗涤液：含0.1％Tween 20的20×浓缩洗涤液。

4、标准品：含SEQ ID No.2所示的OPN多肽的标准品抗原干粉。

5、稀释液A:用于稀释样本的15ml 5×浓缩稀释液(0.02mol/LpH7.4的PBS，0.05wt％Tween-20)。

6、稀释液B:用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5×浓缩稀释液7.200μl 300×浓缩HRP-链亲和素溶液。

7、底物：12ml TMB溶液。

8、终止液：8ml浓度为0.2M的硫酸溶液。

采用该OPN酶联免疫试检测剂盒进行待测样本检测的步骤包括：

(1)分别加入用稀释液梯度稀释的标准品与待检测的血清样品，每个样品做两个重复，每孔加100μl，37℃反应40分钟；

(2)配置1×洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟；

(3)将稀释液B加入生物素化的检测抗体和HRP-链亲和素混匀，加入微孔板中孵育40分钟；

(4)再次洗涤并加入底物反应10分钟，加入终止液显色，于酶标板上读数，根据读数计算标准曲线，可以得出读数与标准品之间的线性关系，将样品的OD值代入线性公式得出样品的含量。上述整个过程不超过2个小时。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州瑞博奥生物科技有限公司

广州瀚普创展医学检验实验室有限公司

<120> 骨桥蛋白多肽的新应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

245 250 255

His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu

260 265 270

Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

Pro Lys Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His Glu

290 295 300

Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn

305 310

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Pro Gln Asn Lys Val Ser Ser Glu Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln

1 5 10 15

Glu Thr Leu Pro Ser

20

Claims (8)

1.一种骨桥蛋白多肽作为标准品在制备用于定量检测肝癌标志物的试剂盒中的用途，所述骨桥蛋白多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种用于骨桥蛋白检测的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求2所述的多肽作为标准品在检测待测样本所含骨桥蛋白中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的待测样本为血液样本。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测采用酶联免疫法检测。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测采用免疫印迹法检测。

7.一种骨桥蛋白ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求2所述的多肽作的标准品。

8.一种骨桥蛋白的ELISA检测方法，其特征在于，所述检测方法包括包被、封闭、加抗原、加酶标二抗、加底物显色和终止的步骤；其中：所述的加抗原步骤包括：将待测样本、骨桥蛋白标准品溶液分别加入酶标板孔，所述的标准品包括权利要求2所述的多肽。

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