TW201414836A

TW201414836A - 具有替代血液凝固第ｖｉｉｉ因子之功能的多重專一性抗原結合分子

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Publication number: TW201414836A
Application number: TW102146541A
Authority: TW
Inventors: 井川智之; 三瓶全次郎; 小嶋哲郎; 添田哲弘; 武藤厚; 北澤剛久; 西田由紀子; 今井千史; 鈴木司; 吉橋一隆
Original assignee: 中外製藥股份有限公司
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2014-04-16
Also published as: JPWO2012067176A1; CN105859889A; US20220267470A1; TR201802772T4; HRP20180421T1; KR101398363B1; US20140037632A1; MX2013005394A; JP6823677B2; CN103298937A; AU2011330184B2; AU2016203564B2; LUC00076I2; JP6710131B2; EP2644698A1; RU2534564C3; JP6013915B2; NO2023034I1; BR112013012213A2; US20240059795A1

Abstract

本發明製作各種雙專一性抗體，其專一性地結合於血液凝固第IX因子/活化的血液凝固第IX因子及血液凝固第X因子兩者，且具有替代血液凝固第VIII因子之輔因子功能，亦即具有替代促進經活化的血液凝固第IX因子所為之使血液凝固第X因子活化之功能。該等抗體之中，成功發現替代血液凝固第VIII因子之功能的活性高的多重專一性抗原結合分子。

Description

具有替代血液凝固第VIII因子之功能的多重專一性抗原結合分子

本發明係關於具有替代增強酵素反應之輔因子，即血液凝固第VIII因子之功能的多重專一性抗原結合分子，及含有該分子當做有效成分之醫藥組成物。

血友病A係先天性之由於血液凝固第VIII因子(F.VIII)之功能低落或欠缺而引起的出血異常症。對於血友病A患者之出血，通常係投予F.VIII製劑(按需要(on-demand)投予)。又，近年來為了防止出血事件，也會預防性地投予F.VIII製劑(預防投予，非專利文獻1及2)。F.VIII製劑之血中半減期約12~16小時。是以，為了持續的預防，係每週3次對於患者投予F.VIII製劑(非專利文獻3及4)。又，按需要(on-demand)投予，為了防止再出血，會因應需要以固定間隔追加投予F.VIII製劑。又，F.VIII製劑之投予係對於靜脈內實施。因此，強烈需求比起F.VIII製劑的投予負擔為少的藥劑。

有時，血友病患者會產生對抗F.VIII之抗體(抑制因子)。抑制因子會消除F.VIII製劑之效果。對於已發生抑制因子之患者(抑制因子患者)的出血，係投予繞道(by pass)製劑。該等之作用機轉，並非依存於F.VIII之功能，亦即並非依存於活化血液凝固之第IX因子(F.IXa)所致之催化血液凝固第X因子(F.X)之活化的功能。所以，繞道製劑有時會有無法充分停止出血的案例。因此，強烈需求不受抑制因子存在之影響，且能替代F.VIII之功能的藥劑。

最近，就其解決方式，已有人揭示替代F.VIII之功能的抗體及其用途(專利文獻1、2及3)。該抗體據認為對於具有抗F.VIII之自體抗體的後天性血友病、及起因於von Willebrand因子(vWF)之功能異常或缺損之類血友病(von Willebrand病)亦為有效，但沒有足以絕對替代F.VIII之功能的活性。就顯示更高止血效果的藥劑而言，希望能有比起該抗體更能替代F.VIII之功能的高活性的抗體。

【先行技術文獻】【專利文獻】

【專利文獻1】 WO 2005/035754

【專利文獻2】 WO 2005/035756

【專利文獻3】 WO 2006/109592

【非專利文獻】

【非專利文獻1】 Blood 58, 1-13(1981)

【非專利文獻2】 Nature 312, 330-337(1984)

【非專利文獻3】 Nature 312, 337-342(1984)

【非專利文獻4】 Biochim.Biophys.Acta 871, 268-278(1986)

本發明之課題在於：提供具有替代增強酵素反應之輔因子F.VIII之功能的多重專一性抗原結合分子。

本案發明人等經過努力研究，結果從專一性地結合於F.IX/F.IXa及F.X兩者，且具有替代F.VIII之輔因子功能，亦即具有促進以F.IXa活化F.X之功能(F.Xa產生促進功能)的各種雙專一性抗體當中，成功地發現具有比起公知者具有更為優異之F.Xa產生促進活性的雙專一性抗體。

再者，成功地發現對於具有替代F.VIII之功能的活性雙專一性抗體的F.Xa產生促進活性提高為重要的該抗體之胺基酸序列的位置，藉由取代該胺基酸，成供地取得替代F.VIII功能之活性更為提高的雙專一性抗體。又，成功地取得了不僅替代F.VIII之功能的活性高而且F.Xase抑制作用低之滿足兩者的性質的非常困難的雙專一性抗體。

亦即，本發明係關於具有替代係增強酵素反應之輔因子F.VIII之功能的多重專一性抗原結合分子，及含有該分子當做有效成分的醫藥組成物，更具體而言係關於以下：

[1]一種多重專一性抗原結合分子，其係包含識別血液凝固第IX因子及/或活化血液凝固第IX因子之第一抗原結合部位，及識別血液凝固第X因子之第二抗原結合部位，且具有替代血液凝固第VIII因子之功能，其中，該替代血液凝固第VIII因子之功能，係起因於比起具有由序列識別號：165與166構成的H鏈及由序列識別號：167構成之共通L鏈的雙專一性抗體(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)，具有較高之活化血液凝固第X 因子(F.Xa)產生促進活性。

[2]如[1]之多重專一性抗原結合分子，其係包含：第一多胜肽，含有識別血液凝固第IX因子及/或活化血液凝固第IX因子之第一抗原結合部位；及第三多胜肽，含有識別血液凝固第IX因子及/或活化血液凝固第IX因子之第三抗原結合部位；及第二多胜肽，含有識別血液凝固第X因子之第二抗原結合部位；及第四多胜肽，含有識別血液凝固第X因子之第四抗原結合部位。

[3]如[2]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽與第三多胜肽各含有對抗血液凝固第IX因子或活化的血液凝固第IX因子之抗體之H鏈或L鏈的抗原結合部位，第二多胜肽與第四多胜肽各含有對抗血液凝固第X因子之抗體之H鏈或L鏈的抗原結合部位。

[4]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(a1)~(a11)中任一胺基酸序列構成的H鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能的抗原結合部位，第二多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(b1)~(b11)中任一胺基酸序列構成的H鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能的抗原結合部位：(a1)具有序列識別號：75、76、77(Q1之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a2)具有序列識別號：78、79、80(Q31之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a3)具有序列識別號：81、82、83(Q64之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a4)具有序列識別號：84、85、86(Q85之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a5)具有序列識別號：87、88、89(Q153之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a6)具有序列識別號：90、91、92(Q354之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a7)具有序列識別號：93、94、95(Q360之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a8)具有序列識別號：96、97、98(Q405之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a9)具有序列識別號：99、100、101(Q458之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a10)具有序列識別號：102、103、104(Q460之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a11)具有序列識別號：105、106、107(Q499之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b1)具有序列識別號：108、109、110(J232之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b2)具有序列識別號：111、112、113(J259之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b3)具有序列識別號：114、115、116(J268之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b4)具有序列識別號：117、118、119(J300之H鏈CDR) 記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b5)具有序列識別號：120、121、122(J321之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b6)具有序列識別號：123、124、125(J326之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b7)具有序列識別號：126、127、128(J327之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b8)具有序列識別號：129、130、131(J339之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b9)具有序列識別號：132、133、134(J344之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b10)具有序列識別號：135、136、137(J346之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b11)具有序列識別號：174、175、176(J142之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位。

[5]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(a1)~(a11)中任一胺基酸序列構成之H鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位，第二多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(b1)~(b11)中任一胺基酸序列構成之H鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能的抗原結合部位：(a1)具有序列識別號：35(Q1之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(a2)具有序列識別號：36(Q31之H鏈可變區)記載之H 鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a3)具有序列識別號：37(Q1之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a4)具有序列識別號：38(Q85之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a5)具有序列識別號：39(Q153之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a6)具有序列識別號：40(Q354之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a7)具有序列識別號：41(Q360之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a8)具有序列識別號：42(Q405之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a9)具有序列識別號：43(Q458之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a10)具有序列識別號：44(Q460之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a11)具有序列識別號：45(Q499之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b1)具有序列識別號：46(J232之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b2)具有序列識別號：47(J259之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b3)具有序列識別號：48(J268之H鏈可變區)記載之H 鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b4)具有序列識別號：49(J300之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b5)具有序列識別號：50(J321之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b6)具有序列識別號：51(J326之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b7)具有序列識別號：52(J327之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b8)具有序列識別號：53(J339之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b9)具有序列識別號：54(J344之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b10)具有序列識別號：55(J346之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b11)具有序列識別號：172(J142之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位。

[6]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中第三多胜肽與第四多胜肽所含之抗原結合部位，包含含有由選自於下述(c1)~(c10)中任一胺基酸序列構成的L鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(c1)具有序列識別號：138、139、140(L2之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c2)具有序列識別號：141、142、143(L45之L鏈CDR) 記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c3)具有序列識別號：144、145、146(L248之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c4)具有序列識別號：147、148、149(L324之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c5)具有序列識別號：150、151、152(L334之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c6)具有序列識別號：153、154、155(L377之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c7)具有序列識別號：156、157、158(L404之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c8)具有序列識別號：159、160、161(L406之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c9)具有序列識別號：137、138、139(L408之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c10)具有序列識別號：177、178、179(L180之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位。

[7]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中，第三多胜肽與第四多胜肽所含之抗原結合部位，包含含有由選自於下述(c1)~(c10)中任一胺基酸序列構成之L鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(c1)具有序列識別號：56(L2之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c2)具有序列識別號：57(L45之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c3)具有序列識別號：58(L248之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c4)具有序列識別號：59(L324之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c5)具有序列識別號：60(L334之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c6)具有序列識別號：61(L377之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c7)具有序列識別號：62(L404之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c8)具有序列識別號：63(L406之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c9)具有序列識別號：64(L408之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(c10)具有序列識別號：173(L180之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位。

[8]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一及第二多胜肽更包含抗體之H鏈恆定區，第三及第四多胜肽更包含抗體之L鏈恆定區。

[9]如[3]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一及第二多胜肽包含抗體之H鏈恆定區，第三及第四多胜肽包含抗體之L鏈恆定區，再者，第三多胜肽與第四多胜肽係共通L鏈。

[10]如[8]或[9]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含由選自於下述(d1)~(d6)之群組中任一胺基酸序列或選自於下述(d7)~(d9)之群組中任一胺基酸序列構成的抗體之H鏈恆定區，第二多胜肽包含由選自於與上述第一多胜肽不同的群組中任一胺基酸序列構成的抗體之H鏈恆定區：(d1)序列識別號：65(G4k)記載之H鏈恆定區、(d2)序列識別號：66(z7)記載之H鏈恆定區、(d3)序列識別號：67(z55)記載之H鏈恆定區、(d4)序列識別號：68(z106)記載之H鏈恆定區、(d5)序列識別號：69(z118)記載之H鏈恆定區、(d6)序列識別號：70(z121)記載之H鏈恆定區、(d7)序列識別號：71(G4h)記載之H鏈恆定區、(d8)序列識別號：72(z107)記載之H鏈恆定區、(d9)序列識別號：73(z119)記載之H鏈恆定區。

[11]如[8]或[9]之多重專一性抗原結合分子，其中，第三與第四多胜肽包含由下述(e)之胺基酸序列構成的抗體之L鏈恆定區：(e)序列識別號：74(k)記載之L鏈恆定區。

[12]如[8]或[9]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含選自於下述(a1)~(a14)中任一抗體H鏈，第二多胜肽包含選自於下述(b1)~(b12)中任一抗體H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽包含選自於下述(c1)~(c10)中任一抗體L鏈：(a1)由序列識別號：1(Q1-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a2)由序列識別號：2(Q31-z7)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a3)由序列識別號：3(Q64-z55)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a4)由序列識別號：10(Q64-z7)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a5)由序列識別號：11(Q85-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a6)由序列識別號：12(Q153-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a7)由序列識別號：13(Q354-z106)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a8)由序列識別號：14(Q360-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a9)由序列識別號：15(Q360-z118)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a10)由序列識別號：16(Q405-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a11)由序列識別號：17(Q458-z106)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a12)由序列識別號：18(Q460-z121)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a13)由序列識別號：19(Q499-z118)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a14)由序列識別號：20(Q499-z121)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b1)由序列識別號：4(J268-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b2)由序列識別號：5(J321-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b3)由序列識別號：6(J326-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b4)由序列識別號：7(J344-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b5)由序列識別號：21(J232-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b6)由序列識別號：22(J259-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b7)由序列識別號：23(J300-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b8)由序列識別號：24(J327-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b9)由序列識別號：25(J327-z119)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b10)由序列識別號：26(J339-z119)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b11)由序列識別號：27(J346-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b12)由序列識別號：170(J142-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(c1)由序列識別號：8(L2-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c2)由序列識別號：9(L45-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c3)由序列識別號：28(L248-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c4)由序列識別號：29(L324-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c5)由序列識別號：30(L334-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c6)由序列識別號：31(L377-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c7)由序列識別號：32(L404-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c8)由序列識別號：33(L406-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c9)由序列識別號：34(L408-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c10)由序列識別號：171(L180-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈。

[13]如[1]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含結合於與由如[12]之(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成的抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗原結合部位，第二多胜肽包含結合於與由如[12]之(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗原結合部位。

[14]如[8]或[9]之多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含選自於下述(e1)~(e3)中任一抗體之H鏈，第二多胜肽包含選自於下述(f1)~(f3)中任一抗體之H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽包含選自於下述(g1)~(g4)中任一抗體之L鏈：(e1)抗體之H鏈，其係結合於與由如[12]之(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基、(e2)抗體之H鏈，其係將選自於(e1)中任一抗體之H鏈當中從以Kabat編號為34位、35位、49位、61位、62位、96位、98位、100位、100b位及102位之胺基酸殘基選出的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸而成、(e3)抗體之H鏈，其中選自於(e1)中任一抗體之H鏈當中以Kabat編號為34位之胺基酸殘基為異白胺酸、35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸、49位之胺基酸殘基為絲胺酸、61位之胺基酸殘基為精胺酸、62位之胺基酸殘基為麩胺酸、96位之胺基酸殘基為絲胺酸或蘇胺酸、98位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、100位之胺基酸殘基為苯丙胺酸或酪胺酸、100b位之胺基酸殘基為甘胺酸、或102位之胺基酸殘基為酪胺酸、 (f1)抗體之H鏈，其係結合於與由如[12]之(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基、(f2)抗體之H鏈，其中，(f1)中任一抗體H鏈當中從以Kabat編號為35位、53位、73位、76位、96位、98位、100位及100a位之胺基酸殘基選出的至少1個胺基酸殘基係取代為其他胺基酸、(f3)抗體之H鏈，其係(f1)中任一抗體之H鏈，且以Kabat編號為35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、73位之胺基酸殘基為離胺酸、76位之胺基酸殘基為甘胺酸、96位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、98位之胺基酸殘基為酪胺酸、100位之胺基酸殘基為酪胺酸、或100a位之胺基酸殘基為組胺酸、(g1)抗體之L鏈，其係結合於與由如[12]之(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基、(g2)抗體之L鏈，其係結合於與由如[12]之(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基、(g3)抗體之L鏈，其中，(g1)及(g2)中任一抗體之L鏈當中從以Kabat編號法編為27位、30位、31位、32位、50位、52位、53位、54位、55位、92位、93位、94位及95位之胺基酸殘基中選出的至少1個胺基酸殘基係取代為其他胺基酸、(g4)如抗體之L鏈，其係(g1)及(g2)中任一抗體之L鏈，且Kabat編號法編為27位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、30位之胺基酸殘基為麩胺酸、31位之胺基酸殘基為精胺酸、32位之胺基酸殘基為麩醯胺酸、50位之胺基酸殘基為精胺酸或麩醯胺酸、52位之胺基酸殘基為絲胺酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、54位之胺基酸殘基為離胺酸、55位之胺基酸殘基為麩胺酸、92位之胺基酸殘基為絲胺酸、93位之胺基酸殘基為絲胺酸、94位之胺基酸殘基為脯胺酸、或95位之胺基酸殘基為脯胺酸。

[15]如[1]至[14]中任一項之多重專一性抗原結合分子，其中，該多重專一性抗原結合分子為多重專一性抗體。

[16]一種以下(a)~(u)中任一項記載之雙專一性抗體：

(a)雙專一性抗體(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：1記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：4記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：9記載之共通L鏈。

(b)雙專一性抗體(Q1-G4k/J321-G4h/L45-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：1記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：5記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：9記載之共通L鏈。

(c)雙專一性抗體(Q31-z7/J326-z107/L2-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：2記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：6記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：8記載之共通L鏈。

(d)雙專一性抗體(Q64-z55/J344-z107/L45-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：3記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：7記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：9記載之共通L鏈。

(e)雙專一性抗體(Q64-z7/J326-z107/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：10記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：6記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：30記載之共通L鏈。

(f)雙專一性抗體(Q64-z7/J344-z107/L406-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：10記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：7記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：33記載之共通L鏈。

(g)雙專一性抗體(Q85-G4k/J268-G4h/L406-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：11記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：4記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：33記載之共通L鏈。

(h)雙專一性抗體(Q85-G4k/J321-G4h/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：11記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：5記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：30記載之共通L鏈。

(i)雙專一性抗體(Q153-G4k/J232-G4h/L406-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：12記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：21記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：33記載之共通L鏈。

(j)雙專一性抗體(Q354-z106/J259-z107/L324-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：13記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：22記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：29記載之共通L鏈。

(k)雙專一性抗體(Q360-G4k/J232-G4h/L406-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：14記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：21記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：33記載之共通L鏈。

(l)雙專一性抗體(Q360-z118/J300-z107/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：15記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：23記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：30記載之共通L鏈。

(m)雙專一性抗體(Q405-G4k/J232-G4h/L248-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：16記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：21記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：28記載之共通L鏈。

(n)雙專一性抗體(Q458-z106/J346-z107/L408-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：17記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：27記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：34記載之共通L鏈。

(o)雙專一性抗體(Q460-z121/J327-z119/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：18記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：25記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：30記載之共通L鏈。

(p)雙專一性抗體(Q499-z118/J327-z107/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：19記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：24記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：30記載之共通L鏈。

(q)雙專一性抗體(Q499-z118/J327-z107/L377-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：19記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：24記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：31記載之共通L鏈。

(r)雙專一性抗體(Q499-z118/J346-z107/L248-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：19記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：27記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：28記載之共通L鏈。

(s)雙專一性抗體(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：20記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：25記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：32記載之共通L鏈。

(t)雙專一性抗體(Q499-z121/J339-z119/L377-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：20記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：26記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：31記載之共通L鏈。

(u)雙專一性抗體(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：12記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：170記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：171記載之共通L鏈。

[17]一種核酸，其係編碼為如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體。

[18]一種載體，其係插入有如[17]之核酸。

[19]一種細胞，其係含有如[17]之核酸或如[18]之載體。

[20]一種如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體之製造方法，其係藉由培養如[19]之細胞。

[21]一種醫藥組成物，其係包含：如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體，及藥學上可容許之載體。

[22]如[21]之醫藥組成物，其係用於出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之預防及/或治療。

[23]如[22]之醫藥組成物，其中，出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病，係由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病。

[24]如[23]之醫藥組成物，其中，由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病為血友病A。

[25]如[23]之醫藥組成物，其中，由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病，係出現對於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之抑制因子之疾病。

[26]如[23]之醫藥組成物，其中，由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病為後天性血友病。

[27]如[23]之醫藥組成物，其中，由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落而發病及/ 或進展之疾病，為類血友病(von Willebrand病)。

[28]一種預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之方法，包含以下步驟：投予如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體，或如[21]至[27]中任一項之醫藥組成物。

[29]一種套組，其係使用於如[28]之預防及/或治療方法，至少包含：如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體，或如[21]至[27]中任一項之醫藥組成物。

又，本發明係關於以下。

[30]一種如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體，或如[21]至[27]中任一項之組成物之用途，係用於製造出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防及/或治療劑。

[31]一種如[1]至[15]中任一項之多重專一性抗原結合分子或如[16]之雙專一性抗體，或如[21]至[27]中任一項組成物之用途，係用於預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病。

又，本發明係關於包含具有替代係增強酵素反應之輔因子F.VIII之功能的雙專一性抗體及該抗體當做有效成分的醫藥組成物，更具體而言，係關於以下。

[32]一種以下(a)~(u)中任一項之雙專一性抗體，其係包含識別血液凝固第IX因子及/或活化血液凝固第IX因子之第一抗原結合部位，及識別血液凝固第X因子之第二抗原結合部位，且具有替代血液凝固第VIII因子之功能；

[33]一種核酸，其係編碼為如[32]之雙專一性抗體。

[34]一種載體，其係插入有如[33]之核酸。

[35]一種細胞，其係包含如[33]之核酸或如[34]之載體。

[36]一種製造如[32]之雙專一性抗體之方法，係藉由培養如[35]之細胞。

[37]一種醫藥組成物，其係包含如[32]之雙專一性抗體，及藥學上可容許之載體。

[38]如[37]之醫藥組成物，係其用於出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之預防及/或治療。

[39]如[38]之醫藥組成物，其中，該出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病，係由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病。

[40]如[39]之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII 因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病為血友病A。

[41]如[39]之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病，係出現對於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之抑制因子之疾病、。

[42]如[39]之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性之低落或缺損而發病及/或進展之疾病為後天性血友病。

[43]如[39]之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落而發病及/或進展之疾病為類血友病(von Willebrand病)。

[44]一種預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之方法，包含以下步驟：投予如[32]之雙專一性抗體、或如[37]至[43]中任一項之醫藥組成物。

[45]一種套組，係用於如[44]之預防及/或治療方法，其係包含如[32]之雙專一性抗體、或如[37]至[43]中任一項之醫藥組成物。

[46]一種如[32]之雙專一性抗體、或如[37]至[43]中任一項之醫藥組成物之用途，係使用於出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防/或治療劑之製造。

[47]一種如[32]之雙專一性抗體、或如[37]至[43]中任一項之醫藥組成物之用途，係使用於出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防及/或治療。

依照本發明，提供一種多重專一性抗原結合分子，其係識別酵素及該酵素之基質兩者之抗體，且替代F.VIII之功能的活性高。又，提供一種多重專一性抗原結合分子，其係識別酵素及該酵素之基質兩者的抗體，且替代F.VIII之功能的活性高，而且F.Xase抑制作用低。人類化抗體一般而言據認為於血中的安定性高而免疫原性亦低，因此可認為本發明之多重專一性抗體當做醫藥品極有前景。

圖1係說明F.Xase抑制作用。

(a)F.VIIIa與F.IXa形成複合體(F.Xase)並活化F.X。

(b)雙專一性抗體結合於F.IXa及F.X並活化F.X。

(c)F.VIIIa及雙專一性抗體之兩者未競爭而活化F.X。

(d)雙專一性抗體藉由結合於F.IXa及/或F.X而抑制F.Xase與F.X之複合體形成。

(e)雙專一性抗體藉由結合於F.IXa及/或F.X而抑制F.Xase之活性。

圖2說明篩選。製作約200種對抗人類F.IXa及人類F.X之抗體基因並嵌入動物細胞表現載體。就抗F.IXa抗體與抗F.X抗體之組合而言，短暫表現4萬種以上之雙專一性抗體。評價F.Xa產生促進活性及F.Xase抑制作用，篩選F.Xa產生促進活性高且F.Xase抑制作用低之雙專一性抗體。並視需要藉由施行胺基酸取代，而製作原型抗體。

圖3顯示hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ、Q1-G4k/J268-G4h/L45-k、Q1-G4k/J321-G4h/L45-k、Q31-z7/J326-z107/L2-k、Q64-z55/J344-z107/L45-k之F.Xa產生促進活性。抗體溶液之濃度為300、30、3μg/mL(Human Factor IXa,Novact(註冊商標)M,Human Factor X與抗體溶液混合後之濃度為100、10、1μg/mL)，酵素反應時間為10分鐘、發色時間為50分鐘。結果，該等抗體比起WO 2006/109592記載之HA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ，顯示高F.Xa產生促進活性。

圖4顯示hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ、原型抗體、及、導入有胺基酸取代之改變抗體之F.Xa產生促進活性。抗體溶液之濃度為300、30、3μg/mL(Human Factor IXa,Novact(註冊商標)M,Human Factor X與抗體溶液混合後之濃度為100、10、1μg/mL)、酵素反應時間為2分鐘，發色時間為20分鐘。結果該等改變抗體比起原型抗體顯示較高F.Xa產生促進活性。

圖5顯示hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ、原型抗體、及導入有胺基酸取代之改變抗體之F.Xase抑制作用，係顯示hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ、Q1-G4k/J268-G4h/L45-k、Q31-z7/J326-z107/L2-k、Q1-G4k/J321-G4h/L45-k、Q64-z55/J344-z107/L45-k、Q85-G4k/J268-G4h/L406-k、Q85-G4k/J321-G4h/L334-k、Q64-z7/J344-z107/L406-k、Q64-z7/J326-z107/L334-k、Q153-G4k/J142-G4h/L180-k、Q405-G4k/J232-G4h/L248-k、Q360-G4k/J232-G4h/L406-k、Q153-G4k/J232-G4h/L406-k、Q458-z106/J346-z107/L408-k、Q360-z118/J300-z107/L334-k、Q499-z118/J327-z107/L377-k、 Q499-z121/J327-z119/L404-k、Q499-z121/J339-z119/L377-k、Q499-z118/J346-z107/L248-k、Q354-z106/J259-z107/L324-k、Q460-z121/J327-z119/L334-k、及Q499-z118/J327-z107/L334-k於F.VIIIa存在下，對於F.IXa所為之活化F.X之影響。抗體之F.Xase抑制作用，係以添加有抗體之反應液之吸光度減去無添加抗體之反應液之吸光度的值表示。抗體溶液之濃度為300、30μg/mL(Human Factor IXa,F.VIIIa,Human Factor X與抗體溶液混合後之濃度為100、10μg/mL)、酵素反應時間為6分鐘、發色時間為14分鐘。橫軸之F.Xase抑制作用之值愈往正，F.Xase抑制作用愈弱。結果，WO 2006/109592記載之HA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ顯示強F.Xase抑制作用。本發明之抗體與hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ比較，均顯示弱F.Xase抑制作用，或未顯示抑制作用。

圖6A顯示原型抗體、及導入有胺基酸取代之改變抗體之胺基酸序列。Ref列未記載序列名時，記載Name列之可變區序列。以Kabat編號法於該編號沒有胺基酸之處，係「-(連字號)」表示。比較Name列與Ref列之可變區，相同胺基酸處以「.(點)」表示，不同處表示Name列之可變區之胺基酸。對於F.Xa產生促進活性提高明顯重要之胺基酸以框圍住表示。

圖6B係接續圖6A。

圖6C係接續圖6B。

圖6D係接續圖6C。

【實施發明之形態】

本說明書中記載之多重專一性抗原結合分子，包含能對於至少2種不同的抗原專一性結合的第一抗原結合部位與第二抗原結合部位。第一抗原結合部位與第二抗原結合部位，只要各對於F.IX及/或F.IXa與F.X具有結合活性即不特別限定，例如為抗體、Scaffold分子(類抗體分子)、胜肽等對於與抗原結合為必要之部位、或含有該部位之片段。Scaffold分子，係指藉由與標靶分子結合而發揮功能之分子，只要是能與至少1個標的抗原結合之在立體構造方面為安定之多胜肽即可，如何的多胜肽均可使用。如此的多胜肽，例如抗體可變區、纖維黏連蛋白(Fibronectin)(WO2002/032925)、Protein A結構域(WO1995/001937)、LDL受體A結構域(WO2004/044011,WO2005/040229)、ankyrine(WO2002/020565)等，此外，例如Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology,7：463-469(1997)、Journal of Immunol Methods,290：3-28(2004))、Binz等人(Nature Biotech 23：1257-1266(2005))、Hosse等人(Protein Science 15：14-27(2006))記載之分子。又，也可使用如Curr Opin Mol Ther.2010 Aug；12(4)：487-95.或Drugs.2008；68(7)：901-12.所記載之能夠結合於標的抗原之胜肽分子。

本發明，多重專一性抗原結合分子只要是能結合於至少2種不同抗原的分子即不特別限定，例如，抗體或Scaffold分子及該等之片段等含有上述抗原結合部位之多胜肽、由核酸分子或胜肽構成之適體(Aptamer)等，可為單一分子也可為該等之多元體。較佳之多重專一性抗原結合分子，例如能對於至少2個不同的抗原專一性結合之多重專一性抗體。本發明之具有替代F.VIII之功能的活性的抗體中，尤佳的抗體例如：能對於2個不同抗原專一性結合之雙專一性抗體(bispecific antibody；BsAb)(有時也稱為二種專一性抗體)。

本發明中，「共通L鏈」係指與不同的2種以上之H鏈組合，且能對於各自的抗原顯示結合能力之L鏈。在此，「不同的H鏈」，較佳為係指對抗不同抗原之抗體之H鏈，但不限於此，意指胺基酸序列彼此不同的H鏈。共通L鏈，例如可依照WO2006/109592記載之方法取得。

本發明中，多重專一性抗原結合分子(較佳為雙專一性抗體)，係由對於2種以上之不同抗原具有專一性之抗體或抗體片段構成的分子。本發明之抗體無特殊限制，但以單株抗體為佳。本發明使用之單株抗體，不僅包含來自於人類、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、羊、駱駝、猴等動物之單株抗體，也包含嵌合抗體、人類化抗體、雙專一性(bispecific)抗體等經過人為改變的基因重組型抗體。

又，成為本發明之多重專一性抗原結合分子的抗體之L鏈，可為不同，但較佳為具有共通之L鏈。

本發明中，多重專一性抗原結合分子較佳為使用基因重組技術產生之重組型抗體。(例如，參照Borrebaeck CAK and Larrick JW,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990)。重組型抗體，可藉由將編碼為其之DNA由融合瘤、或產生抗體之感作淋巴球等抗體產生細胞選殖，並嵌入適當的載體，並將其導入寄主(寄主細胞)使生產而獲得。

再者，本發明中，抗體不僅為完整(whole)抗體，也可包含抗體片段或低分子化抗體，以及抗體修飾物。

例如，抗體片段或低分子化抗體，包含雙鏈抗體(diabody；Db)、線状抗體、單鏈抗體(以下也記載為scFv)分子等。在此，「Fv」片段為最小的抗體片段，包含完全的抗原識別部位與結合部位。

「Fv」片段係1個H鏈可變區(VH)及L鏈可變區(VL)以非共價鍵強力連結成的二元體(VH-VL二元體)。各可變區的3個互補鏈決定區域(complementarity determining region；CDR)彼此作用，在VH-VL二元體的表面形成抗原結合部位。6個CDR對於抗體提供抗原結合部位。但是，即使是1個可變區(或僅含對於抗原為專一的3個CDR即Fv的一半)，雖比起全部結合部位的親和性低，但仍會識別抗原且有結合能力。

又，Fab片段(也稱為F(ab))，更包含L鏈之恆定區及H鏈之恆定區(CH1)。Fab'片段與Fab片段不同之點在於，附加具有來自於抗體之鉸鏈區域的含有1或更多半胱胺酸的H鏈CH1區域的羧基末端來源的數個殘基。Fab'-SH，係指恆定區的1或更多半胱胺酸殘基具有游離之硫醇基的Fab'。F(ab')片段，可藉由將F(ab')₂胃蛋白酶消化物之鉸鏈部之半胱胺酸中的雙硫鍵切斷而製造。經化學性鍵結的其他抗體片段亦為該技術區域之人士所已知。

雙鏈抗體，係指藉由基因融合而構建的二價(bivalent)的低分子化抗體(Holliger P et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097號、WO93/11161號等)。雙鏈抗體，係由2條多胜肽鏈構成之二元體，多胜肽鏈，分別在同鏈中，L鏈可變區(VL)及H鏈可變區(VH)藉由以彼此無法鍵結的程度的短的，例如2~12個殘基較佳，更佳為3~10個殘基，尤佳為約5個殘基程度的連結子(linker)鍵結。在同一多胜肽鏈上所編碼的VL與VH，由於其之間的連結子短，故無法形成單鏈可變區片段，而形成二元體，故雙鏈抗體具有2個抗原結合部位。

單鏈抗體或scFv抗體片段中，含有抗體之VH及VL區域，該等區域存在於單一的多胜肽鏈中。一般而言，Fv多胜肽在VH及VL區域之間還會含有多胜肽連結子，藉此scFv可形成對於抗原結合為必要之構造(關於scFv之總論，參照Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113(Rosenburg and Moore ed(Springer Verlag,New York)pp.269-315,1994))。本發明中，連結子只要是不會抑制連結於其兩端之抗體可變區表現即可，無特別限定。

IgG型雙專一性抗體，可藉由使將產生IgG抗體之2種融合瘤融合而產生的融合融合瘤(hybrid hybridoma)(quadroma)分泌(Milstein C et al.Nature 1983,305：537-540)。又，也可藉由將構成目的之二種IgG的L鏈及H鏈的基因，合計4種基因導入細胞而藉此共表現而使分泌。

此時，也可藉由對於H鏈之CH3區域施以適當的胺基酸取代，使針對H鏈為異質組合的IgG優先分泌(Ridgway JB et al.Protein Engineering 1996,9：617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology 1998,16：677-681、WO2006/106905、Davis JH et al.Protein Eng Des Sel.2010,4：195-202.)。

又，關於L鏈，由於L鏈可變區比起H鏈可變區多樣性低，因此可期待獲得能賦予對於兩H鏈之結合能力的共通之L鏈，本發明之抗體之特徵為具有共通之L鏈。藉由將該共通L鏈與兩H鏈基因導入細胞，使IgG表現，可表現效率良好的雙專一性IgG。

又，也可藉由將Fab’進行化學交聯而製作雙專一性抗體。例如，將從其中之一之抗體製備的Fab’以o-PDM(ortho-phenylenedi-maleimide)馬來醯亞胺化，並使其與從其中另一抗體製備的Fab’反應，而製作使來自於不同抗體的Fab’彼此交聯成的雙專一性F(ab’)₂(Keler T et al.Cancer Research 1997,57：4008-4014)。又，將Fab’-硫硝基苯甲酸(TNB)衍生物與Fab’-硫醇(SH)等抗體片段以化學性鍵結之方法亦為已知(Brennan M et al.Science 1985,229：81-83)。

替代化學交聯，也可使用來自於Fos、Jun等的白胺酸拉鏈(leucine zipper)。Fos、Jun也會形成均二元體，但係利用優先形成異二元體者。表現並製備加成Fos白胺酸拉鏈之Fab’以及加成Jun白胺酸拉鏈的另一Fab’。於溫和條件將已還原的單體Fab’-Fos、Fab’-Jun混合並使反應，可形成雙專一性F(ab’)₂(Kostelny SA et al.J of Immunology,1992,148：1547-53)。該方法不限於Fab’，也可應用於scFv、Fv等。

又，IgG-scFv(Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4)：221-8)或BiTE等sc(Fv)₂(Drug Discov Today.2005 Sep 15；10 (18)：1237-44.)、DVD-Ig(Nat Biotechnol.2007 Nov；25(11)：1290-7.Epub 2007 Oct 14.、MAbs.2009 Jul；1(4)：339-47.Epub 2009 Jul 10.)等以外，(IDrugs 2010,13：698-700)、二合一(two-in-one)抗體(Science.2009 Mar 20；323(5921)：1610-4.、Immunotherapy.2009 Sep；1(5)：749-51.)、Tri-Fab或串列scFv、雙鏈抗體等雙專一性抗體亦為已知(MAbs.2009 November；1(6)：539-547.)。再者，使用scFv-Fc、scaffold-Fc等分子形式，也可藉由使異質組合的Fc優先分泌，(Ridgway JB et al.Protein Engineering 1996,9：617-621、Merchant AM et al.Nature Biotechnology 1998,16：677-681、WO2006/106905、Davis JH et al.Protein Eng Des Sel.2010,4：195-202.)，而有效率地製作雙專一性抗體。

雙鏈抗體也可製作雙專一性抗體。雙專一性雙鏈抗體，為二個交叉(cross-over)scFv片段的異二元體。亦即，可藉由使用將來自於二種抗體A、B之VH與VL以約莫5個殘基的較短連結子連接而製作之VH(A)-VL(B)、VH(B)-VL(A)，而構成異二元體而獲得(Holliger P et al.Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993,90：6444-6448)。

此時，也可藉由將二種scFv以約15個殘基的柔軟的較長的連結子連接(單鏈雙鏈抗體：Kipriyanov SM et al.J of Molecular Biology.1999,293：41-56)，進行適當的胺基酸取代(knobs-into-holes：Zhu Z et al.Protein Science.1997,6：781-788、VH/VL interface engineering：Igawa T et al.Protein Eng Des Sel.2010,8：667-77.)，而促進目的之構成。

藉由將二種scFv以約15個殘基之柔軟的較長連結子結接而製作的sc(Fv)₂，也可成為雙專一性抗體(Mallender WD et al.J of Biological Chemistry,1994,269：199-206)。

抗體修飾物，例如：與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。本發明之抗體，也包含該等抗體修飾物。本發明之抗體修飾物結合之物質不限。為了獲得如此的抗體修飾物，可藉由對於獲得之抗體施行化學性修飾而獲得。該等方法於該領域已經確立。

本發明之抗體，包含人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等，其來源不限定。且，也可為嵌合抗體或人類化抗體等基因改變抗體。

人類抗體之取得方法為已知，例如藉由將具有人類抗體基因之所有庫存的基因轉殖動物以目的抗原進行免疫，可獲得目的之人類抗體(參照國際專利申請案公開號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。

基因改變抗體可用已知的方法製造。具體而言，例如嵌合抗體係由免疫動物之抗體之H鏈、及L鏈之可變區，與人類抗體之H鏈及L鏈之恆定區構成的抗體。將編碼為免疫動物來源的抗體的可變區的DNA，與編碼為人類抗體之恆定區的DNA連結，並將其嵌入錶現載體並導入寄主使生產，可獲得嵌合抗體。

人類化抗體，係也稱為再構成(reshaped)人類抗體之改變抗體。人類化抗體，係藉由將免疫動物來源的抗體的 CDR移植到人類抗體之互補性決定區域而構建。其一般的基因重組方法亦為已知(參照歐洲專利申請案公開號EP 239400、國際專利申請案公開號WO 96/02576、Sato K et al,Cancer Research 1993,53：851-856、國際專利申請案公開號WO 99/51743)。

本發明之多重專一性抗原結合分子，係識別F.IX及/或F.IXa、及F.X，且具有替代輔因子之F.VIII之功能的多重專一性抗原結合分子，比起至今為止就具有替代F.VIII之功能的雙專一性抗體為公知的hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(記載於WO2006/109592)，具有高F.Xa產生促進活性的特徵。而且，本發明之抗體，通常具有含有抗F.IXa抗體中的可變區及抗F.X抗體中的可變區構造。

亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，包含識別F.IX及/或F.IXa之第一抗原結合部位及識別F.X之第二抗原結合部位且具有替代F.VIII之功能，該替代F.VIII的功能，係起因於比起具有由序列識別號：165與166構成之H鏈及由序列識別號：167構成的共通L鏈的雙專一性抗體(hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ)為高之F.Xa產生促進活性的功能。

本發明中，多重專一性抗原結合分子，包含：含有識別F.IX及/或F.IXa之抗原結合部位之第一多胜肽及第三多胜肽，及含有識別F.X之抗原結合部位的第二多胜肽及第四多胜肽。於第一多胜肽與第三多胜肽，以及第二多胜肽與第四多胜肽，含有抗體之H鏈之抗原結合部位，及抗體之L鏈之抗原結合部位。

例如，本發明中，多重專一性抗原結合分子，其第一多胜肽與第三多胜肽各含有對抗F.IX或F.IXa之抗體之H鏈或L鏈之抗原結合部位，第二多胜肽與第四多胜肽各含有對抗F.X之抗體之H鏈或L鏈之抗原結合部位。

此時，第一多胜肽與第三多胜肽、以及第二多胜肽與第四多胜肽所含之抗體之L鏈之抗原結合部位，也可為共通之L鏈。

本發明中，含有抗體之L鏈之抗原結合部位之多胜肽，較佳為含有結合於F.IX、F.IXa及/或F.X之抗體之L鏈之全部或一部分序列者。

本發明之抗體之第一多胜肽之抗原結合部位之較佳態樣，具體而言，例如後述實施例記載之由以下之胺基酸序列構成之抗原結合部位，或與該等為同等功能之抗原結合部位。

Q1之H鏈之CDR1、2、3之各序列(序列識別號：75、76、77)、Q31之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：78、79、80)、Q64之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：81、82、83)、Q85之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：84、85、86)、Q153之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：87、88、89)、 Q354之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：90、91、92)、Q360之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：93、94、95)、Q405之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：96、97、98)、Q458之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：99、100、101)、Q460之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：102、103、104)、Q499之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：105、106、107)、又，第二多胜肽之抗原結合部位，較佳態樣具體而言，例如後述實施例記載之由記載之胺基酸序列構成之抗原結合部位，或與該等為同等功能之抗原結合部位。

J232之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：108、109、110)、J259之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：111、112、113)、J268之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：114、115、116)、J300之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：117、118、119)、J321之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：120、121、 122)、J326之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：123、124、125)、J327之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：126、127、128)、J339之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：129、130、131)、J344之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：132、133、134)、J346之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：135、136、137)、J142之H鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：174、175、176)、亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中第一多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(a1)~(a11)中任一胺基酸序列構成之H鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位，第二多胜肽之抗原結合部位具有含有由選自於下述(b1)~(b11)中任一胺基酸序列構成之H鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(a1)具有序列識別號：75、76、77(Q1之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a2)具有序列識別號：78、79、80(Q31之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、 (a3)具有序列識別號：81、82、83(Q64之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a4)具有序列識別號：84、85、86(Q85之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a5)具有序列識別號：87、88、89(Q153之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a6)具有序列識別號：90、91、92(Q354之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a7)具有序列識別號：93、94、95(Q360之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a8)具有序列識別號：96、97、98(Q405之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a9)具有序列識別號：99、100、101(Q458之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a10)具有序列識別號：102、103、104(Q460之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(a11)具有序列識別號：105、106、107(Q499之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b1)具有序列識別號：108、109、110(J232之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b2)具有序列識別號：111、112、113(J259之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b3)具有序列識別號：114、115、116(J268之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、 (b4)具有序列識別號：117、118、119(J300之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b5)具有序列識別號：120、121、122(J321之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b6)具有序列識別號：123、124、125(J326之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b7)具有序列識別號：126、127、128(J327之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b8)具有序列識別號：129、130、131(J339之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b9)具有序列識別號：132、133、134(J344之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b10)具有序列識別號：135、136、137(J346之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(b11)具有序列識別號：174、175、176(J142之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位。

又，第三與第四多胜肽之抗原結合部位之較佳態樣，具體而言例如後述實施例記載之由以下記載之胺基酸序列構成之抗原結合部位，或與其為同等功能之抗原結合部位。L2之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：138、139、140)、L45之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：141、142、143)、L248之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：144、145、 146)、L324之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：147、148、149)、L334之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：150、151、152)、L377之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：153、154、155)、L404之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：156、157、158)、L406之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：159、160、161)、L408之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：162、163、164)、L180之L鏈CDR1、2、3之各序列(序列識別號：177、178、179)、亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第三多胜肽與第四多胜肽所含之抗原結合部位，係包含含有由選自於下述(c1)~(c10)中任一胺基酸序列構成之L鏈CDR的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(c1)具有序列識別號：138、139、140(L2之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c2)具有序列識別號：141、142、143(L45之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c3)具有序列識別號：144、145、146(L248之L鏈CDR) 記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c4)具有序列識別號：147、148、149(L324之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c5)具有序列識別號：150、151、152(L334之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c6)具有序列識別號：153、154、155(L377之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c7)具有序列識別號：156、157、158(L404之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c8)具有序列識別號：159、160、161(L406之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位、(c9)具有序列識別號：137、138、139(L408之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之有抗原結合部位、(c10)具有序列識別號：177、178、179(L180之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位。

本發明記載之Q1、Q31、Q64、Q85、Q153、Q354、Q360、Q405、Q458、Q460、Q499之H鏈可變區之胺基酸序列，各以下列序列識別號代表。

Q1：序列識別號：35

Q31：序列識別號：36

Q64：序列識別號：37

Q85：序列識別號：38

Q153：序列識別號：39

Q354：序列識別號：40

Q360：序列識別號：41

Q405：序列識別號：42

Q458：序列識別號：43

Q460：序列識別號：44

Q499：序列識別號：45

本發明記載之J232、J259、J268、J300、J321、J326、J327、J339、J344、J346、J142之H鏈可變區之胺基酸序列，各以下列序列識別號代表。

J232：序列識別號：46

J259：序列識別號：47

J268：序列識別號：48

J300：序列識別號：49

J321：序列識別號：50

J326：序列識別號：51

J327：序列識別號：52

J339：序列識別號：53

J344：序列識別號：54

J346：序列識別號：55

J142：序列識別號：172

亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(a1)~(a11)中任一胺基酸序列構成之H鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位，第二多胜肽之抗原結合部位包含含有由選自於下述(b1)~(b11)中任一胺基酸序列構成之H鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(a1)具有序列識別號：35(Q1之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(a2)具有序列識別號：36(Q31之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a3)具有序列識別號：37(Q1之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a4)具有序列識別號：38(Q85之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a5)具有序列識別號：39(Q153之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a6)具有序列識別號：40(Q354之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a7)具有序列識別號：41(Q360之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a8)具有序列識別號：42(Q405之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a9)具有序列識別號：43(Q458之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a10)具有序列識別號：44(Q460之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(a11)具有序列識別號：45(Q499之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、 (b1)具有序列識別號：46(J232之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b2)具有序列識別號：47(J259之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b3)具有序列識別號：48(J268之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b4)具有序列識別號：49(J300之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b5)具有序列識別號：50(J321之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b6)具有序列識別號：51(J326之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b7)具有序列識別號：52(J327之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b8)具有序列識別號：53(J339之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b9)具有序列識別號：54(J344之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b10)具有序列識別號：55(J346之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位、(b11)具有序列識別號：172(J142之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位。

又，本發明記載之L2、L45、L248、L324、L334、L377、L404、L406、L408、L180之L鏈可變區之胺基酸序列，各以下列序列識別號代表。

L2：序列識別號：56

L45：序列識別號：57

L248：序列識別號：58

L324：序列識別號：59

L334：序列識別號：60

L377：序列識別號：61

L404：序列識別號：62

L406：序列識別號：63

L408：序列識別號：64

L180：序列識別號：173

亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第三多胜肽與第四多胜肽所含之抗原結合部位，係包含含有由選自於下述(c1)~(c10)中任一胺基酸序列構成之L鏈可變區的抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位：(c1)具有序列識別號：56(L2之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c2)具有序列識別號：57(L45之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c3)具有序列識別號：58(L248之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c4)具有序列識別號：59(L324之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c5)具有序列識別號：60(L334之L鏈可變區)記載之L 鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c6)具有序列識別號：61(L377之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c7)具有序列識別號：62(L404之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c8)具有序列識別號：63(L406之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c9)具有序列識別號：64(L408之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位、(c10)具有序列識別號：173(L180之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列的抗原結合部位。

又，各序列之CDR1~3及FR1~4之胺基酸序列如圖3A~D所記載。

使用本發明揭示之可變區製作全長抗體時，恆定區不特別限定，可使用該技術領域之人士公知之恆定區，例如可使用Sequences of proteins of immunological interest,(1991),U.S.Department of Health and Human Services.Public Health Service National Institutes of Health，或An efficient route to human bispecific IgG,(1998).Nature Biotechnology vol.16,677-681等記載之恆定區。本發明之抗體恆定區之較佳例，例如IgG抗體之恆定區。使用IgG抗體之恆定區時，其種類不限定，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等次類別之IgG恆定區。又，也可對於該等次類別的IgG的恆定區，於恆定區部分的導入胺基酸變異。導入之胺基酸變異，例如，使對於Fcγ受體之結合增大或減低者(Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Mar 14；103(11)：4005-10.、MAbs.2009 Nov；1(6)：572-9.)、使對於FcRn之結合增大或減低者(J Biol Chem.2001 Mar 2；276(9)：6591-604、Int Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69.、JBiol Chem.2006 Aug 18；281(33)：23514-24.)等，但不限於該等。為了製作雙專一性抗體，需要將2種H鏈予以異質組合化。為了經由CH3結構域將2種H鏈予以異質組合化，可使用knobs-into-hole技術(J Immunol Methods.2001 Feb 1；248(1-2)：7-15、J Biol Chem.2010 Jul 2；285(27)：20850-9.)、靜電排斥(WO2006/106905)、SEEDbody技術(Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4)：195-202.)等。再者，本發明之抗體也可經糖鏈改變及缺損。糖鏈經改變之抗體，例如，經糖基化修飾之抗體(WO99/54342等)、於糖鏈加成之海藻糖有欠缺的抗體(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913等)、具有二等分(bisecting)GlcNAc之具糖鏈之抗體(WO02/79255等)等。製備糖鏈欠缺的IgG抗體之方法，已知有對於EU編號法第297號天冬醯胺酸導入變異之方法(J Clin Pharmacol.2010 May；50(5)：494-506.)、使大腸菌產生IgG之方法(J Immunol Methods.2002 May 1；263(1-2)：133-47.、J Biol Chem.2010 Jul 2；285(27)：20850-9.)等。又，IgG之C末端之離胺酸欠缺所伴隨之不勻性或IgG2之鉸鏈區域之雙硫鍵的錯接所伴隨之不勻性，藉由導入胺基酸之欠缺.取代也能使減低(WO2009/041613))。

例如，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一及第二多胜肽包含抗體之H鏈恆定區，第三及第四多胜肽包含抗體之L鏈恆定區。

又，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含由選自於下述(d1)~(d6)之群組中任一胺基酸序列或選自於下述(d7)~(d9)之群組中任一胺基酸序列構成的抗體之H鏈恆定區，第二多胜肽包含由與上述第一多胜肽不同之群組選出之任一胺基酸序列構成之抗體之H鏈恆定區：(d1)序列識別號：65(G4k)記載之H鏈恆定區、(d2)序列識別號：66(z7)記載之H鏈恆定區、(d3)序列識別號：67(z55)記載之H鏈恆定區、(d4)序列識別號：68(z106)記載之H鏈恆定區、(d5)序列識別號：69(z118)記載之H鏈恆定區、(d6)序列識別號：70(z121)記載之H鏈恆定區、(d7)序列識別號：71(G4h)記載之H鏈恆定區、(d8)序列識別號：72(z107)記載之H鏈恆定區、(d9)序列識別號：73(z119)記載之H鏈恆定區。

再者，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第三與第四多胜肽包含由下述(e)之胺基酸序列構成之抗體之L鏈恆定區：(e)序列識別號：74(k)記載之L鏈恆定區。

本發明中，「替代F.VIII之功能」，係指識別F.IX及/或F.IXa及F.X，且促進F.X之活化(促進F.Xa產生)。

本發明中，「F.Xa產生促進活性」，可藉由將本發明之多重專一性抗原結合分子以例如由F.XIa(F.IX活化酵素)、F.IX、F.X、F合成基質S-2222(F.Xa之合成基質)、磷脂質構成的測定系進行評價而確認。該測定系與血友病A症例中的疾病之重症度及臨床症狀顯示相關性(Rosen S,Andersson M,Blomba^‥ck M et al.Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity.Thromb Haemost 1985；54：811-23)。亦即，於該測定系，顯示較高F.Xa產生促進活性之受測物質，可期待對於血友病A的出血症狀顯示較優異的止血效果。由此結果，就具有替代F.VIII之功能的活性的多重專一性抗原結合分子而言，若為具有比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ為更高活性之分子，則能獲得優異之血液凝固促進活性，就當做出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之預防及/或治療用之醫藥成分可獲得優異效果。為了獲得就該醫藥成分而言之優異效果，例如以[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性，宜為hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ以上，尤以與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k為同等或更高為較佳。又，在此所指F.Xa產生促進活性，係將抗體溶液之20分鐘的吸光度變化值減去溶劑20分鐘之吸光度變化值所得之值。

本發明之較佳態樣，為識別F.IX及/或F.IXa、及F.X，且具有替代F.VIII之功能之功能的多重專一性抗體。

本發明之上述多重專一性抗體，較佳為包含抗F.IX/F.IXa抗體之H鏈CDR或與其為同等功能之CDR，以及抗F.X抗體之H鏈CDR或與其為同等功能之CDR的抗體。

又，本發明之抗體，較佳為包含抗F.IX/IXa抗體當中，由序列識別號：75、76、77(Q1之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：78、79、80(Q31之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：81、82、83(Q64之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：84、85、86(Q85之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：87、88、89(Q153之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：90、91、92(Q354之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：93、94、95(Q360之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：96、97、98(Q405之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：99、100、101(Q458之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：102、103、104(Q460之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：105、106、107(Q499之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、構成之抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位，以及於抗F.X抗體中，由序列識別號：108、109、110(J232之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：111、112、113(J259之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：114、115、116(J268之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：117、118、119(J300之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：120、121、122(J321之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：123、124、125(J326之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：126、127、128(J327之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：129、130、131(J339之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：132、133、134(J344之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：135、136、137(J346之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、或序列識別號：174、175、176(J142之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列、構成之抗原結合部位或與其為同等功能之抗原結合部位的抗體。

又，本發明中，抗原結合部位在功能上為同等，係指含有該抗原結合部位之多重專一性抗原結合分子所具有之替代F.VIII之功能之活性為同等。

本發明中，「同等」不一定需為同程度之活性，也可為活性增強，又，只要是於上述測定系為比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ為高之活性，或較佳為以[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性為與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k同等或具有更高之活性，活性也可減少。

上述抗體，只要是在上述段落之測定系為比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ高之活性，較佳為以[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性為與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k同等或具有更高活性，則也可於可變區(CDR序列及/或FR序列)之胺基酸序列中有1或多數胺基酸發生取代、缺失、加成及/或插入。用於使胺基酸序列中的1或多數胺基酸發生取代、缺失、加成及/或插入之該技術領域之人士熟知的方法，已知有於蛋白質導入變異之方法。例如，若為該技術領域中之人士，可藉由部位專一性變異誘發法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(l984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)等對於胺基酸序列導入適當變異，而製備目的之與具有替代F.VIII之功能的活性的多重專一性多胜肽多元體在功能上為同等的變異體。

如此，於可變區已有1或多數胺基酸變異，於上述段落之測定系比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ為較高活性，較佳為於[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性為與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k同等或具有更高活性之抗體，也包含在本發明之抗體。

改變胺基酸殘基時，理想為變異為保存胺基酸側鏈之性質的其他胺基酸。例如，就胺基酸側鏈之性質，例如：疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具脂肪族側鏈之胺基酸(G、A、V、L、I、P)、具含羥基之側鏈的胺基酸(S、T、Y)、具有含硫原子之側鏈的胺基酸(C、M)、具含羧酸及醯胺側鏈的胺基酸(D、N、E、Q)、具有含鹼側鏈之胺基酸(R、K、H)、及具有含芳香族側鏈之胺基酸(H、F、Y、W)(括弧內均代表胺基酸之單文字標記)。該等各群組內之胺基酸之取代稱為保守性取代。具有對於某個胺基酸序列將1或多個胺基酸殘基利用缺失、加成及/或取代為其他胺基酸而修飾成的胺基酸序列的多胜肽維持其生物學活性，係為已知(Mark,D.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：5662-6；Zoller,M.J.and Smith,M.,Nucleic Acids Res.(1982)10：6487-500；Wang,A.et al.,Science(1984)224：1431-3；Dalbadie-McFarland,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79：6409-13)。如此的變異體，與本發明之可變區(例如CDR序列、FR序列、可變區全體)之胺基酸序列具有至少70%，更佳為至少75%，又更佳為至少80%，再更佳為至少85%，又再更佳為至少90%，且最佳為至少95%之胺基酸序列之同一性。本說明書中，序列之同一性係定義為：以使序列同一性成為最大之方式，視需要排列序列並導入適宜間隙後，與原本的重鏈可變區或輕鏈可變區之胺基酸序列之殘基為相同之殘基之比例。胺基酸序列之同一性，可依照後述方法決定。

又，於可變區(CDR序列及/或FR序列)之胺基酸序列，有1或多數胺基酸經取代、缺失、加成及/或插入，於上述段落之測定系比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ為高之活性，較佳為以[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性為與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k同等或具有更高活性之可變區之胺基酸序列，可由在嚴苛條件下對於由編碼為該可變區之胺基酸序列之鹼基序列構成之核酸雜交之核酸獲得。為了單離在嚴苛條件下對於由編碼為可變區之胺基酸序列之鹼基序列構成之核酸雜交之核酸所使用的嚴苛的雜交條件，例如：6M尿素、0.4% SDS、0.5 x SSC、37℃之條件，或與其為同等嚴苛度之雜交條件。若使用嚴苛度更高之條件，例如，6M尿素、0.4% SDS、0.1 x SSC、42℃之條件，可期待單離相同性更高之核酸。經單離之核酸之序列決定，可依照後述公知方法進行。經單離的核酸的相同性，以鹼基序列全體計，具有至少50%以上，更佳為70%以上，又更佳為90%以上(例如，95%、96%、97%、98%、99%以上)的序列的同一性。

替代上述利用雜交技術之方法，也可以利用使用依據編碼為可變區之胺基酸序列的鹼基序列資訊而合成的引子的基因放大法，例如，利用聚合酶連鎖反應(PCR)法，單離由編碼為可變區之胺基酸序列之鹼基序列構成的核酸以及於嚴苛條件下雜交的核酸。

鹼基序列及胺基酸序列之同一性，可依照Karlin與Altschul所為之演算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-7)決定。依據該演算法，有人開發了稱為BLASTN和BLASTX的程式(Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)。當依據BLAST以BLASTN解析鹼基序列時，參數例如設定為score=100、wordlength=12。又，當依據BLAST以BLASTX解析胺基酸序列時，參數例如定為score=50、wordlength=3。使用BLAST與Gapped BLAST程式時，係使用各程式的預設參數。該等解析方法之具體手法參照公知(NCBI(National Center for Biotechnology Information)之BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)之網頁； http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

又，本發明也提供結合於與上述抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗體。

某抗體是否識別與其他抗體為重複之抗原決定基，可藉由兩者對於抗原決定基之競爭而確認。抗體間之競爭，可利用競爭結合試驗進行評價，其方法例如：酵素結合免疫吸附檢定法(ELISA)、螢光能量轉移測定法(FRET)或螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))等。結合於抗原之該抗體之量，間接相關於競爭之候選競爭抗體(受測抗體)對於重複之抗原決定基的結合的結合能力。亦即，受測抗體對於重複之抗原決定基的之量或親和性愈大，則該抗體對於抗原之結合量降低，受測抗體對於抗原之結合量增加。具體而言，針對抗原，同時添加經適當標示的該抗體與待評價的抗體，並利用標示檢測有結合的該抗體。結合於抗原之該抗體量，可藉由預先將該抗體標示而能輕易測定。該標示不特別限定，可選擇因應方法之標示方法。標示方法，具體而言，例如螢光標示、放射標示、酵素標示等。

例如，對於固定化有F.IX、F.IXa或F.X之珠粒，同時添加經螢光標示之該抗體，以及非標示之該抗體或受測抗體，並以螢光微量測定技術檢測經標示之該抗體。

在此所指「結合於重複之抗原決定基的抗體」，係指相對於該經標示之抗體，就對於由於非標示之該抗體之結合使結合量降低50%的濃度(IC₅₀)，受測抗體能於非標示之該抗體之IC₅₀之通常100倍，較佳為80倍，更佳為50倍，又更佳為30倍，再更佳為10倍的高濃度，使經標示之該抗體之結合量降低至少50%之抗體。

具有結合於與上述抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基之抗體之抗原結合部位的多重專一性抗原結合分子，可獲得優異的替代F.VIII功能的活性。又，結合於與上述抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗體之抗原結合部位，為了獲得更優異的替代F.VIII功能的活性，可改變1或多數胺基酸。改變抗原結合部位之胺基酸後，藉由以上述測定系選擇比起hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ有更高活性，較佳為於[實施例2]記載之條件測定時之F.Xa產生促進活性為與Q153-G4k/J142-G4h/L180-k同等或具有更高活性之多重專一性抗原結合分子，可獲得更優異之替代F.VIII功能之活性。為了獲得本發明之優異的替代F.VIII功能的活性，尤其改變以下胺基酸較佳。

(1)將識別F.IX及/或F.IXa之抗體H鏈當中，選自於Kabat編號法編為34位、35位、49位、61位、62位、96位、98位、100位、100b位及102位之胺基酸殘基的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

(2)將識別F.X之抗體H鏈當中，選自於Kabat編號法編為35位、53位、73位、76位、96位、98位、100位及100a位之胺基酸殘基的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

(3)將抗體L鏈中，選自於Kabat編號為27位、30位、31位、32位、50位、52位、53位、54位、55位、92位、93位、94位及95位之胺基酸殘基的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

又，本發明中，為了獲得更優異之替代F.VIII功能之活性，較佳的抗體之胺基酸，例如以下(4)~(6)。該等胺基酸，可為抗體H鏈預先具有如此的胺基酸，也可為藉由改變胺基酸而成為具有如此序列的抗體H鏈。

(4)識別F.IX及/或F.IXa之抗體H鏈中，Kabat編號法編為34位之胺基酸殘基為異白胺酸、35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸、49位之胺基酸殘基為絲胺酸、61位之胺基酸殘基為精胺酸、62位之胺基酸殘基為麩胺酸、96位之胺基酸殘基為絲胺酸或蘇胺酸、98位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、100位之胺基酸殘基為苯丙胺酸或酪胺酸、100b位之胺基酸殘基為甘胺酸、或102位之胺基酸殘基為酪胺酸之抗體之H鏈。

(5)識別F.X之抗體H鏈中，Kabat編號法編為35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、73位之胺基酸殘基為離胺酸、76位之胺基酸殘基為甘胺酸、96位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、98位之胺基酸殘基為酪胺酸、100位之胺基酸殘基為酪胺酸、或100a位之胺基酸殘基為組胺酸之抗體之H鏈。

(6)抗體L鏈當中，Kabat編號法編為27位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、30位之胺基酸殘基為麩胺酸、31位之胺基酸殘基為精胺酸、32位之胺基酸殘基為麩醯胺酸、50位之胺基酸殘基為精胺酸或麩醯胺酸、52位之胺基酸殘基為絲胺酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、54位之胺基酸殘基為離胺酸、55位之胺基酸殘基為麩胺酸、92位之胺基酸殘基為絲胺酸、93位之胺基酸殘基為絲胺酸、94位之胺基酸殘基為脯胺酸、或95位之胺基酸殘基為脯胺酸之抗體之L鏈。

上述(1)~(6)之抗體之胺基酸殘基之中，為了獲得特別優異之類似F.VIII活性的較佳位置之胺基酸殘基，例如以下(1)~(3)。

(1)識別F.IX及/或F.IXa之抗體H鏈中，Kabat編號法編為34位、35位、61位、98位、100位及100b位之胺基酸殘基，其中較佳為61位及100位之胺基酸殘基。

(2)識別F.X之抗體H鏈中，Kabat編號法編為35位、53位、73位、96位、98位、100位及100a位之胺基酸殘基。

(3)抗體L鏈中，Kabat編號法編為Kabat編號法編為27位、30位、31位、32位、50位、52位、53位、93位、94位及95位之胺基酸殘基，其中較佳為27位、30位、31位、50位、53位、94位及95位之胺基酸殘基。

亦即，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽係由選自於下述(a1)~(a14)中任一抗體H鏈與選自於下述(c1)~(c10)中任一抗體L鏈構成，第二多胜肽係由選自於下述(b1)~(b12)中任一抗體H鏈與選自於下述(c1)~(c10)任一抗體L鏈構成：(a1)由序列識別號：1(Q1-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a2)由序列識別號：2(Q31-z7)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、 (a3)由序列識別號：3(Q64-z55)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a4)由序列識別號：10(Q64-z7)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a5)由序列識別號：11(Q85-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a6)由序列識別號：12(Q153-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a7)由序列識別號：13(Q354-z106)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a8)由序列識別號：14(Q360-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a9)由序列識別號：15(Q360-z118)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a10)由序列識別號：16(Q405-G4k)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a11)由序列識別號：17(Q458-z106)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a12)由序列識別號：18(Q460-z121)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a13)由序列識別號：19(Q499-z118)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(a14)由序列識別號：20(Q499-z121)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、 (b1)由序列識別號：4(J268-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b2)由序列識別號：5(J321-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b3)由序列識別號：6(J326-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b4)由序列識別號：7(J344-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b5)由序列識別號：21(J232-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b6)由序列識別號：22(J259-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b7)由序列識別號：23(J300-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b8)由序列識別號：24(J327-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b9)由序列識別號：25(J327-z119)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b10)由序列識別號：26(J339-z119)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b11)由序列識別號：27(J346-z107)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、(b12)由序列識別號：170(J142-G4h)記載之胺基酸序列構成之抗體H鏈、 (c1)由序列識別號：8(L2-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c2)由序列識別號：9(L45-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c3)由序列識別號：28(L248-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c4)由序列識別號：29(L324-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c5)由序列識別號：30(L334-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c6)由序列識別號：31(L377-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c7)由序列識別號：32(L404-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c8)由序列識別號：33(L406-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c9)由序列識別號：34(L408-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈、(c10)由序列識別號：171(L180-k)記載之胺基酸序列構成之抗體L鏈。

再者，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含結合於與由上述(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗原結合部位，第二多胜肽包含結合於與由上述(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基的抗原結合部位。

再者，本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其中，第一多胜肽包含選自於下述(e1)~(e3)中任一抗體之H鏈，第二多胜肽包含選自於下述(f1)~(f3)中任一抗體之H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽係包含選自於下述(g1)~(g4)中任一抗體之L鏈：

(e1)抗體之H鏈，其結合於與由上述(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基。

(e2)抗體之H鏈，其中，選自於上述(e1)中任一抗體之H鏈當中，Kabat編號為34位、35位、49位、61位、62位、96位、98位、100位、100b位及102位之胺基酸殘基選出的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

(e3)抗體之H鏈，其中選自於上述(e1)中任一抗體之H鏈當中，Kabat編號為34位之胺基酸殘基為異白胺酸、35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸、麩醯胺酸或絲胺酸、49位之胺基酸殘基為絲胺酸、61位之胺基酸殘基為精胺酸、62位之胺基酸殘基為麩胺酸、96位之胺基酸殘基為絲胺酸或蘇胺酸、98位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、100位之胺基酸殘基為苯丙胺酸或酪胺酸、100b位之胺基酸殘基為甘胺酸、或102位之胺基酸殘基為酪胺酸。

(f1)抗體之H鏈，其係結合於與由上述(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基。

(f2)抗體之H鏈，其中，上述(f1)中任一抗體H鏈當中，從Kabat編號為35位、53位、73位、76位、96位、98位、100位及100a位之胺基酸殘基選出的至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

(f3)抗體之H鏈，係為上述(f1)中任一抗體H鏈，其中，Kabat編號為35位之胺基酸殘基為天冬醯胺酸酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、73位之胺基酸殘基為離胺酸、76位之胺基酸殘基為甘胺酸、96位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、98位之胺基酸殘基為酪胺酸、100位之胺基酸殘基為酪胺酸、或100a位之胺基酸殘基為組胺酸。

(g1)抗體之L鏈，其係結合於與由上述(a1)~(a14)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基。

(g2)抗體之L鏈，其係結合於與由上述(b1)~(b12)中任一抗體之H鏈與上述(c1)~(c10)中任一抗體之L鏈構成之抗體所結合之抗原決定基為重複之抗原決定基。

(g3)抗體之L鏈，其中，上述(g1)及(g2)中任一抗體之L鏈當中，選自於Kabat編號法編為27位、30位、31位、32位、50位、52位、53位、54位、55位、92位、93位、94位及95位之胺基酸殘基中至少1個胺基酸殘基取代為其他胺基酸。

(g4)抗體之L鏈，其係上述(g1)及(g2)中任一抗體之L 鏈，其中，Kabat編號法編為27位之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸、30位之胺基酸殘基為麩胺酸、31位之胺基酸殘基為精胺酸、32位之胺基酸殘基為麩醯胺酸、50位之胺基酸殘基為精胺酸或麩醯胺酸、52位之胺基酸殘基為絲胺酸、53位之胺基酸殘基為精胺酸、54位之胺基酸殘基為離胺酸、55位之胺基酸殘基為麩胺酸、92位之胺基酸殘基為絲胺酸、93位之胺基酸殘基為絲胺酸、94位之胺基酸殘基為脯胺酸、或95位之胺基酸殘基為脯胺酸。

又，針對本發明之抗體(選殖體)，也可為了避免脫醯胺化、甲硫胺酸化等或為了抗體之構造安定化，而進行胺基酸殘基取代。

獲得本發明之多重專一性抗原結合分子之方法不特別限制，可以用任何方法取得。例如，就雙專一性抗體之製造方法之一例，可依照WO2006/109592或WO2005/035756、WO2006/106905、WO2007/114325記載之方法製作雙專一性抗體後，選擇具有目的之輔因子功能代替活性之抗體而取得。

例如，本發明提供以下(a)~(u)中任一雙專一性抗體：

(d)雙專一性抗體(Q64-z55/J344-z107/L45-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：3記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：7記載之胺基酸序列構成之H鏈及第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號：9記載之共通L鏈。

(k)雙專一性抗體(Q360-G4k/J232-G4h/L406-k)，其係由以下構成：第一多胜肽係由序列識別號：14記載之胺基酸序列構成之H鏈、第二多胜肽係由序列識別號：21記載之胺基酸序列構成之H鏈，且第三多胜肽與第四多胜肽係序列識別號： 33記載之共通L鏈。

本發明之抗體，視後述產生抗體之細胞或寄主或精製方法，其胺基酸序列、分子量、等電點或糖鏈有無或形態等可能會不同。但是，獲得之抗體只要是與本發明之抗體具有同等功能，都包含在本發明。例如，使原核細胞例如大腸菌表現本發明之抗體時，係在原本的抗體之胺基酸序列的N末端加成甲硫胺酸殘基。本發明之抗體也包含如此的抗體。

本發明之雙專一性抗體可依照該技術領域之人士公知的方法製造。

例如，可依據獲得之抗F.IX/F.IXa抗體或抗F.X抗體之序列，使用對於該技術領域之人士為公知之基因重組技術製作抗體。具體而言，依據抗F.IX/F.IXa抗體或抗F.X抗體之序列構建編碼為抗體之多核苷酸，將其導入表現載體後，使適當的寄主細胞表現即可(例如參照Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663；Rousseaux,J.etal.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669；Bird,R.E.andWalker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。

載體之例，例如：M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又，為了將cDNA次選殖、切出時，除了上述載體以外，例如尚有pGEM-T、pDIRECT、pT7等。為了本發明之抗體生產使用載體時，尤以表現載體為有用。表現載體，例如，以於大腸菌表現為目的時，載體除了具有於大腸菌放大的特徵以外，當寄主為JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大腸菌時，尚必需具備使大腸菌能以良好效率表現之起動子，例如，lacZ起動子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546；FASEB J.(1992)6,2422-2427)、araB起動子(Better等人，Science(1988)240,1041-1043)、或T7起動子等。如此的載體，除了上述載體以外，例如：pGEX-5X-1(Pharmacia製)、「QIAexpress system」(Qiagen製)、pEGFP、或pET(於此情形，寄主為表現T7RNA聚合酶之BL21較佳)等。

又，表現質體之載體也可含有用於抗體分泌之信號序列。用於抗體分泌之信號序列，於大腸菌之胞外質產生時，可使用pelB信號序列(Lei,S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169,4379)。載體導入寄主細胞例如例可使用氯化鈣法、電穿孔法進行。

大腸菌以外，用於製造本發明之抗體的載體，例如：來自於哺乳動物之表現載體(例如，pcDNA3(Invitrogen公司製)，或pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、來自於昆蟲細胞之表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(Gibco BRL製)、pBacPAK8)、來自於植物之表現載體(例如pMH1、pMH2)、來自於動物病毒之表現載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自於反轉錄病毒之表現載體(例如，pZIPneo)、來自於酵母之表現載體(例如，「Pichia Expression Kit」(Invitrogen製)、pNV11、SP-Q01)、來自於枯草菌之表現載體(例如，pPL608、pKTH50)。

於以CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞表現為目的時，表現質體之載體必需具有用於在細胞內表現為必要之起動子，例如SV40起動子(Mulligan等人，Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR起動子、EF1α起動子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMV起動子等，若具有用於淘選對於細胞轉形之基因(例如，利用藥劑(新黴素(neomycin)、G418等)能判別之藥劑耐受性基因)則更佳。具有如此的特性的載體，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

又，於使基因安定表現且放大於細胞內的基因副本數為目的時，例如有在欠缺核酸合成路徑之CHO細胞中導入具有與其為互補之DHFR基因的載體(例如，pSV2-dhfr(「Molecular Cloning 2nd edition」Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))等)，並利用胺甲葉酸(Methotrexate，MTX)使放大之方法，又，當以基因之短暫表現為目的時，例如使用染色體上具有表現SV40 T抗原之基因的COS細胞，以具有SV40之複製起點的載體(pcD等)進行轉形之方法。複製起始點，尚可使用來自於多瘤病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等者。再者，為了於寄主細胞系將基因副本數放大，表現載體就選擇標記而言，可包含胺基配糖體轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等。

藉此獲得之本發明之抗體，可從寄主細胞內或細胞外(培養基等)單離，精製成為實質上為純且均勻的抗體。抗體之分離、精製使用通常之抗體之精製使用的分離、精製方法即可，無任何限定。例如適當選擇層析管柱、濾器、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沈降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結晶等並組合，可將抗體分離、精製。

層析例如：親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。該等層析可使用液相層析，例如HPLC、FPLC等液相層析實施。親和性層析使用之管柱，例如：Protein A管柱、Protein G管柱。例如，使用Protein A之管柱，例如Hyper D、POROS、Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)等。本發明也包含使用該等精製方法而高度精製之抗體。

獲得之抗體可精製至均質。抗體之分離、精製，可使用通常之蛋白質使用之分離、精製方法。例如，適當選擇並組合親和性層析等層析管柱、濾器、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺電泳、等電點電泳等，可將抗體分離、精製(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)，但不限於該等。親和性層析使用之管柱，例如Protein A管柱、Protein G管柱等。

本發明中，抗體之1個態樣，從具有替代輔因子 F.VIII之功能的觀點，本發明之抗體期待成為對於起因於該輔因子之活性(功能)低落的疾病為有效藥劑。上述疾病例如，出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病等。尤其，據認為對於由於F.VIII/F.VIIIa之功能低落或欠缺起因之出血異常症、血友病具有優異的治療效果。其中，可期待能成為對於在血友病當中由於先天性F.VIII/F.VIIIa功能低落或欠缺引起之出血異常症、血友病A的優異的治療劑。

本發明中，提供包含本發明記載之抗體及藥學上可容許之載體的(醫藥)組成物。例如，本發明之抗體為識別F.IX或F.IXa、及F.X兩者，且替代F.VIII之功能之抗體，且期待成為例如出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之預防及/或治療用的醫藥品(醫藥組成物)或藥劑。

本發明中，出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病，較佳為由於F.VIII及/或活化的血液凝固第VIII因子(F.VIIIa)之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病。如此的疾病，例如上述血友病A、對於F.VIII/F.VIIIa出現抑制因子的疾病、後天性血友病、類血友病(von Willebrand病)等，但不特別限於該等疾病。

以治療或預防為目的而使用之含有本發明之抗體為有效成分之醫藥組成物，可視需要與對於此等為鈍性的適當的藥學上可容許之載體、介質等混合而製劑化。例如，滅菌水或生理食鹽水、安定劑、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、組胺酸、其他有機酸等)、防腐劑、界面活性劑(PEG、Tween等)、螯合劑(EDTA等)、黏結劑等。又，也可含有其他低分子量的多胜肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸酸、甲硫胺酸、精胺酸及離胺酸等胺基酸、多糖及單糖等糖類或碳水化物、甘露醇或山梨糖醇等糖醇。當做注射用水溶液時，例如生理食鹽水、或含葡萄糖或其他輔助藥之等張液、例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性界面活性劑(polysorbate 80、polysorbate 20、poloxamer 188、HCO-50)等。又，藉由在製劑中混合玻糖醛酸酶(hyaluronidase)，可用更大的液量實施皮下投予(Expert Opin Drug Deliv.2007 Jul；4(4)：427-40.)。

又，視需要，可將本發明之抗體封入微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚[甲基甲基丙烯酸]等微膠囊)，或製成膠體藥物傳遞系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳化液、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed.(1980)等)。再者，將藥劑製成緩釋性藥劑之方法亦為公知，可適用於本發明之抗體(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.15：267-277(1981)；Langer,Chemtech.12：98-105(1982)；美國專利第3,773,919號；歐洲專利申請案公開(EP)第58,481號；Sidman et al.,Biopolymers 22：547-556(1983)；EP第133,988號)。

本發明之醫藥組成物之投予量，係考慮劑型種類、投予方法、患者之年齡或體重、患者症狀、疾病種類或進行程度等，最終由醫師的判斷而適當決定，一般而言，大人每日可將0.1~2000mg分成1~數次投予。更佳為，0.2~1000mg/日，又更佳為0.5~500mg/日，再更佳為1~300mg/日，又再更佳為3~100mg/日，最佳為5~50mg/日。該等投予量視患者體重或年齡、投予方法等而變動，但如為該技術領域中之人士，可適當選擇適當的投予量。投予期間也可因應患者之治癒過程而適當決定較佳。

又，本發明提供編碼為本發明之抗體的基因或核酸。又，也考慮將編碼為本發明之抗體的基因或核酸嵌入基因治療用載體並實施基因治療。投予方法，除了利用裸露質體直接投予，尚可包裝在微脂體等，或形成反轉錄病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、痘病毒載體、腺病毒關連載體、HVJ載體等各種病毒載體的形式(Adolph『病毒基因體法』，參照CRC Press，Florid(1996))，或被覆於膠體金粒子等之珠粒載體(WO93/17706等)並投予。但是，也可於活體內使抗體表現，並利用能發揮其作用的任意方法投予。較佳為，經由適當的非經口路徑(靜脈內、腹腔內、皮下、皮內、脂肪組織內、乳腺組織內、吸入或肌肉內路徑，以注射、注入、或氣體誘導性粒子衝撃法(利用電子鎗等)、經由點鼻藥等黏膜路徑之方法等)，投予充分的量。也可於生物體之外(ex vivo)，利用微脂體轉染、粒子衝撃法(美國專利第4,945,050號)、或病毒感染投予到血液細胞及骨髓來源細胞等，並將該細胞再導入患者而投予編碼為本發明之抗體的基因。基因治療中，可使用編碼為本發明之抗體的任意基因，例如包含編碼為前述Q1、Q31、Q64、Q85、Q153、Q354、Q360、Q405、Q458、Q460、Q499、J232、 J259、J268、J300、J321、J326、J327、J339、J344、J346、J142、L2、L45、L248、L324、L334、L377、L404、L406、L408、L180之CDR的鹼基序列的基因。

又，本發明提供用於預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之方法，其包含投予本發明之抗體或組成物的步驟。抗體或組成物之投予，例如可依照前述方法實施。

再者，本發明提供上述方法使用的套組，其至少包含本發明之抗體或組成物。該套組，此外也可預先包裝有注射筒、注射針、藥學上可容許之介質、醇綿布、絆創膏、或記載使用方法之指示書等。

又，本發明係關於本發明之多重專一性抗原結合分子或雙專一性抗體、或組成物之用途，係使用於製造出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防及/或治療劑。

又，本發明係關於出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防及/或治療用之本發明之多重專一性抗原結合分子或雙專一性抗體、或組成物。

又，本說明書引用之所有先前技術文獻，納入於本說明書中當做參照。

【實施例】

以下依照實施例更具體說明本發明，但本發明不限於該等實施例。

[實施例1]具有F.Xa產生促進活性之雙專一性抗體之製作

WO 2006/109592中，就具有替代F.VIII之功能的活性的雙專一性抗體而言，取得hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ。但是，該抗體據認為可能會有抑制F.IXa將F.VIIIa當做輔因子而活化F.X之反應的作用。

如圖1，結合於F.IX/F.IXa或F.X之抗體，可能抑制F.IXa與F.VIIIa之複合體(Factor Xase(F.Xase))形成，或抑制F.Xase活性(F.X之活化)。以下，將F.Xase形成抑制及/或F.Xase活性抑制作用，記載為F.Xase抑制作用。F.Xase抑制作用，係抑制以F.VIIIa當做輔因子之凝固反應，可能會抑制患者殘留的F.VIII之功能、或投予之F.VIII製劑之功能。所以，希望雙專一性抗體之目的F.Xa產生促進活性高，但進一步希望F.Xase抑制作用亦為低。尤其，於維持有F.VIII之功能的患者或接受F.VIII製劑治療之患者的情形，更希望F.Xa產生促進活性與F.Xase抑制作用儘量能分離。

但是，F.Xase抑制作用，係由於結合於抗原(F.IXa及/或F.X)之所謂抗體之基本性質，另一方面，具有F.Xa產生促進活性之(替代F.VIII之功能)的雙專一性抗體也需要結合於抗原(F.IXa及F.X)。所以，可以料想取得不具F.Xase抑制作用而具F.Xa產生促進活性的(替代F.VIII之功能)的雙專一性抗體係非常困難。同樣，藉由對於雙專一性抗體導入胺基酸取代，而減低F.Xase抑制作用且同時使目的F.Xa產生促進活性上升，可料想係非常困難。

本案發明人等，藉由以該技術領域之人士公知之方法，亦即從經抗原(人類F.IXa或人類F.X)免疫之動物之抗體產生細胞取得抗體基因，並視需要導入胺基酸取代，藉此製作約200種對抗人類F.IXa及人類F.X的抗體基因。將各抗體基因嵌入動物細胞表現載體。

藉由將抗人類F.IXa抗體H鏈表現載體、抗人類F.X抗體H鏈表現載體及共通抗體L鏈表現載體，同時對於HEK293H細胞等哺乳類細胞轉染，以抗F.IXa抗體與抗F.X抗體組合之形式短暫表現4萬種以上的雙專一性抗體。又，就比較對照而言，製備WO 2006/109592記載之雙專一性抗體hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ(序列識別號：165/166/167)。

由於將WO 2006/106905或WO 1996/027011記載之變異導入各H鏈之CH3結構域，故據認為主要會表現雙專一性抗體。將細胞培養上清中之抗體，使用Protein A依照該技術領域中之人士公知的方法精製。

本案發明人等，以如下方法測定該等抗體之F.Xa產生促進活性。反應均於室溫實施。

將含有0.1%牛血清白蛋白之以Tris緩衝生理食鹽水(以下稱為TBSB)稀釋的抗體溶液5μL，與27ng/mL之Human Factor IXa beta(Enzyme Research Laboratories)2.5μL及6IU/mL Novact(註冊商標)M(化學及血清療法研究所)2.5μL混合後，於384孔盤中於室溫溫育30分鐘。

該混合液中之酵素反應於添加24.7μg/mL之Human Factor X(Enzyme Research Laboratories)5μL後開始，10分鐘後，添加0.5M EDTA 5μL使停止。發色反應，藉由添加發色基質溶液5μL而開始。於50分鐘發色反應後，使用 SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)測定405nm之吸光度變化。F.Xa產生促進活性，係以添加有抗體之反應液之吸光度減去無添加抗體之反應液的吸光度而獲得之值代表。

Human Factor IXa、Novact(註冊商標)M及Human Factor X之溶劑，為TBCP(含93.75μM磷脂質溶液(SYSMEX CO.),7.5mM CaCl₂,1.5mM MgCl₂之TBSB)。將發色基質溶液S-2222^TM(CHROMOGENIX)以精製水溶解成1.47mg/mL，並用於本分析。

本案發明人等，為了評價抗體之F.Xase抑制作用，以下列方法測定於F.VIIIa存在下，F.IXa對於F.X活化之影響。反應均於室溫實施。

再添加1.8IU/mL之F.VIIIa(製作方法如後述)2.5μL，30秒後，該混合液中之酵素反應藉由添加24.7μg/mL之Human Factor X(Enzyme Research Laboratories)5μL而開始。6分鐘後，添加0.5M EDTA 5μL使停止。發色反應，係藉由添加發色基質溶液5μL而開始。14分鐘發色反應後，使用SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)測定405nm之吸光度變化。抗體之F.Xase抑制作用，係以添加有抗體之反應液之吸光度減去無添加抗體之反應液之吸光度的值表示。

又，F.VIIIa，係藉由將5.4IU/mL之Kogenate(註冊商標)FS(Bayer藥品(股)公司)與1.11μg/mL之Human alpha Thrombin(Enzyme Research Laboratories)以1：1的容量比混合，並於室溫溫育1分鐘後，添加混合液的一半容量的7.5U/mL之Hirudin(Merck KgaA)而製備。製備的溶液為1.8IU/mL的 FVIIIa，添加Hirudin 1分鐘後，用於分析。

Human Factor IXa、Human Factor X、Kogenate(註冊商標)FS、Human alpha Thrombin、Hirudin之溶劑，為TBCP(含93.75μM磷脂質溶液(SYSMEX CO.)、7.5mM CaCl₂、1.5mM MgCl₂之TBSB)。將發色基質溶液S-2222^TM(CHROMOGENIX)以精製水溶解成1.47mg/mL，並用在本分析。

各雙專一性抗體之F.Xa產生促進活性如圖3、圖4所示，各雙專一性抗體之F.Xase抑制作用如圖5所示。發現了使F.Xa產生促進活性上升的各種胺基酸取代，但是，如預想，使F.Xa產生促進活性上升的胺基酸取代幾乎都會使F.Xase抑制作用也上升，要同時抑制F.Xase抑制作用以及升高F.Xa產生促進活性非常困難。

於此狀況下，本申請案發明人等就F.Xa產生促進活性高且F.Xase抑制作用低的雙專一性抗體而言，獲得Q1-G4k/J268-G4h/L45-k、Q1-G4k/J321-G4h/L45-k、Q31-z7/J326-z107/L2-k、Q64-z55/J344-z107/L45-k。又，就抗人類F.IXa抗體H鏈而言，取得Q1-G4k(序列識別號：1)、Q31-z7(序列識別號：2)、Q64-z55(序列識別號：3)，就原型抗人類F.X抗體H鏈，取得J268-G4h(序列識別號：4)、J321-G4h(序列識別號：5)、J326-z107(序列識別號：6)、J344-z107(序列識別號：7)，就原型共通抗體L鏈，取得L2-k(序列識別號：8)、L45-k(序列識別號：9)。序列名之連字號前代表可變區，連字號後代表恆定區。各雙專一性抗體名，藉由與轉染的各鏈的序列名隔間隔而代表。

具有接近hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ之F.Xa產生促進活性的雙專一性抗體，大致如料想具有高F.Xase抑制作用，但發現：該等雙專一性抗體(Q1-G4k/J268-G4h/L45-k、Q1-G4k/J321-G4h/L45-k、Q31-z7/J326-z107/L2-k、Q64-z55/J344-z107/L45-k)比起WO 2006/109592記載之hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ具有更高的F.Xa產生促進活性且有低F.Xase抑制作用。本案發明人等，對於該等4種抗體的原型抗體，進一步進行使F.Xa產生促進活性上升、F.Xase抑制作用減弱的探討。針對使F.Xa產生促進活性上升、使F.Xase抑制作用減弱之雙專一性抗體之篩選如圖2所示。

[實施例2]改變抗體之製作

本案發明人等，利用變異導入用的PCR等該技術領域之人士公知之方法，對於原型抗體之各鏈將於實施例1發現到的對於F.Xa產生促進活性及F.Xase抑制作用會產生影響的各種胺基酸變異予以組合並導入，並且大規模實施經改變的鏈的組合的評價，藉此實施使4種原型抗體之F.Xa產生促進活性更上升、F.Xase抑制作用減弱之胺基酸取代的篩選。

將導入有胺基酸取代的各改變雙專一性抗體，與原型抗體以同樣方法短暫表現並精製。該等抗體之F.Xa產生促進活性係以下列方法測定。反應均於室溫實施。

將含0.1%牛血清白蛋白之以Tris緩衝生理食鹽水(以下稱為TBSB)稀釋的抗體溶液5μL，與27ng/mL之Human Factor IXa beta(Enzyme Research Laboratories)2.5μL及6IU/mL Novact(註冊商標)M(化學及血清療法研究所)2.5μL混合後，於384孔盤中於室溫溫育30分鐘。

該混合液中之酵素反應，係添加24.7μg/mL之Human Factor X(Enzyme Research Laboratories)5μL而使開始，2分鐘後，添加0.5M EDTA 5¼L使停止。發色反應，係藉由添加發色基質溶液5μL而開始。20分鐘發色反應後，使用SpectraMax 340PC³⁸⁴(Molecular Devices)測定405nm之吸光度變化。F.Xa產生促進活性，係以添加有抗體之反應液之吸光度減去無添加抗體之反應液之吸光度獲得之值表示。

Human Factor IXa、Novact(註冊商標)M及Human Factor X之溶劑，為TBCP(含93.75μM磷脂質溶液(SYSMEX CO.)),7.5mM CaCl₂,1.5mM MgCl₂之TBSB)。發色基質溶液S-2222^TM(CHROMOGENIX)係使用以精製水溶解成1.47mg/mL者。

也利用已記載之方法評價抗體之F.Xase抑制作用。

各改變雙專一性抗體之F.Xa產生促進活性如圖4，各雙專一性抗體之F.Xase抑制作用如圖5。

本案發明者人等，就F.Xa產生促進活性高而F.Xase抑制作用低之雙專一性抗體，獲得Q85-G4k/J268-G4h/L406-k、Q85-G4k/J321-G4h/L334-k、Q64-z7/J344-z107/L406-k、Q64-z7/J326-z107/L334-k。又，就抗人類F.IXa抗體H鏈而言，獲得Q64-z7(序列識別號：10)、Q85-G4k(序列識別號：11)，就F.Xa產生促進活性上升之共通抗體L鏈而言，發現L334-k(序列識別號：30)、L406-k(序列識別號：33)。Q85-G4k/J268-G4h/L406-k、Q85-G4k/J321-G4h/L334-k、Q64-z7/J344-z107/ L406-k、Q64-z7/J326-z107/L334-k，雖F.Xase抑制作用僅些微上升，但是F.Xa產生促進活性大幅上升。該等改變抗體，比起F.Xase抑制作用之升高，F.Xa產生促進活性非常之大，因此，比起原型抗體，更能使F.Xa產生促進活性與F.Xase抑制作用分離。如此，發現了：能抑制F.Xase抑制作用且同時使F.Xa產生促進活性上升的組合。

為了以雙專一性抗體替代F.VIII之功能，發現到的原型型抗體之F.Xa產生促進活性以較高為宜，但另一方面，為了對於維持F.VIII之功能之患者或接受F.VIII製劑治療中的患者在臨床使用，據認為F.Xase抑制作用較低為宜。所以，進一步改變，製作F.Xase抑制作用不上升而F.Xa產生促進活性進一步上升的雙專一性抗體。

其結果，就F.Xa產生促進活性高且F.Xase抑制作用低的雙專一性抗體而言，獲得Q153-G4k/J232-G4h/L406-k、Q354-z106/J259-z107/L324-k、Q360-G4k/J232-G4h/L406-k、Q360-z118/J300-z107/L334-k、Q405-G4k/J232-G4h/L248-k、Q458-z106/J346-z107/L408-k、Q460-z121/J327-z119/L334-k、Q499-z118/J327-z107/L334-k、Q499-z118/J327-z107/L377-k、Q499-z118/J346-z107/L248-k、Q499-z121/J327-z119/L404-k、Q499-z121/J339-z119/L377-k、Q153-G4k/J142-G4h/L180-k。又，就抗人類F.IXa抗體H鏈而言，獲得Q153-G4k(序列識別號：12)、Q354-z106(序列識別號：13)、Q360-G4k(序列識別號：14)、Q360-z118(序列識別號：15)、Q405-G4k(序列識別號：16)、Q458-z106(序列識別號：17)、Q460-z121(序列識別號：18)、 Q499-z118(序列識別號：19)、Q499-z121(序列識別號：20)，就F.Xa產生促進活性上升的抗人類F.X抗體H鏈而言，發現J232-G4h(序列識別號：21)、J259-z107(序列識別號：22)、J300-z107(序列識別號：23)、J327-z107(序列識別號：24)、J327-z119(序列識別號：25)、J339-z119(序列識別號：26)、J346-z107(序列識別號：27)、J142-G4h(序列識別號：170)，就共通抗體L鏈而言，發現L248-k(序列識別號：28)、L324-k(序列識別號：29)、L377-k(序列識別號：31)、L404-k(序列識別號：32)、L408-k(序列識別號：34)、L180-k(序列識別號：171)。

該等抗體，F.Xa產生促進活性極高，另一方面，F.Xase抑制作用受抑制，因此可認為具有對於F.VIII之功能維持的患者或接受F.VIII製劑治療中的患者也極有用的性質。抗體一般而言半衰期長，可皮下投予，因此該等雙專一性抗體，比起血友病A的利用既存FVIII製劑的靜脈內投予的定期補充療法，可認為能對於血友病A患者提供高價值。

實施例1及實施例2使用之各鏈之可變區的序列比較如圖6A~D。為了提高雙專一性抗體之F.Xa產生促進活性，例如以下之胺基酸明顯為重要。抗人類F.IXa抗體H鏈中，34位之異白胺酸、35位之天冬醯胺酸或麩醯胺酸或絲胺酸、49位之絲胺酸、61位之精胺酸、62位之麩胺酸、96位之絲胺酸或蘇胺酸、98位之離胺酸或精胺酸、99位之絲胺酸或麩胺酸、100位之苯丙胺酸或酪胺酸、100b位之甘胺酸、102位之酪胺酸等。抗人類F.X抗體H鏈中，35位之天冬醯胺酸酸、53位之精胺酸、73位之離胺酸、76位之甘胺酸、96位之離胺酸或精胺酸、98位之酪胺酸、100位之酪胺酸、100a位之組胺酸等。共通抗體L鏈中之27位之離胺酸或精胺酸、30位之麩胺酸、31位之精胺酸、32位之麩醯胺酸、50位之精胺酸或麩醯胺酸、52位之絲胺酸、53位之精胺酸、54位之離胺酸、55位之麩胺酸、92位之絲胺酸、93位之絲胺酸、94位之脯胺酸、95位之脯胺酸等(可變區之胺基酸號碼係依照Kabat編號法(Kabat EA et al．1991．Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH))。

【產業上利用可能性】

依照本發明提供一種多重專一性抗原結合分子，其係識別酵素及該酵素之基質兩者的抗體，且替代F.VIII之功能的活性高。又，提供多重專一性抗原結合分子，其係識別酵素及該酵素之基質兩者的抗體，替代F.VIII之功能之活性高，且F.Xase抑制作用低。

人類化抗體一般而言，據認為於血中之安定性高且免疫原性亦低，故本發明之多重專一性抗體可認為當做醫藥品極有前景。

<110> 中外製藥股份有限公司

<120> 具有替代血液凝固第VIII因子之功能的多重專一性抗原結合分子

<130> C1-A1007-TW

<150> JP 2010-257022

<151> 2010-11-17

<160> 179

<170> PatentIn version 3.4

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<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 91

<210> 92

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 92

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 93

<210> 94

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 94

<210> 95

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 95

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 96

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 97

<210> 98

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 98

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 99

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 100

<210> 101

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 101

<210> 102

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 102

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 103

<210> 104

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 104

<210> 105

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 105

<210> 106

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 106

<210> 107

<211> 14

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 107

<210> 108

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 108

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 109

<210> 110

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 110

<210> 111

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 111

<210> 112

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 112

<210> 113

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 113

<210> 114

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 114

<210> 115

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 115

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 116

<210> 117

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 117

<210> 118

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 118

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 119

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 120

<210> 121

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 121

<210> 122

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 122

<210> 123

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 123

<210> 124

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 124

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 125

<210> 126

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 126

<210> 127

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 127

<210> 128

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 128

<210> 129

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 129

<210> 130

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 130

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 131

<210> 132

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 132

<210> 133

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 133

<210> 134

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 134

<210> 135

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 135

<210> 136

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 136

<210> 137

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 137

<210> 138

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 138

<210> 139

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 139

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 140

<210> 141

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 141

<210> 142

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 142

<210> 143

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 143

<210> 144

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 144

<210> 145

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 145

<210> 146

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 146

<210> 147

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 147

<210> 148

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 148

<210> 149

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 149

<210> 150

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 150

<210> 151

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 151

<210> 152

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 152

<210> 153

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 153

<210> 154

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 154

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 155

<210> 156

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 156

<210> 157

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 157

<210> 158

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 158

<210> 159

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 159

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 160

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 161

<210> 162

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 162

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 163

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 164

<210> 165

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 166

<210> 167

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

<210> 168

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 168

<210> 169

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 444

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 170

<210> 171

<211> 214

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 171

<210> 172

<211> 119

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 172

<210> 173

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 173

<210> 174

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 174

<210> 175

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 175

<210> 176

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 176

<210> 177

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 177

<210> 178

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 178

<210> 179

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造的

<220>

<223> 人工序列

<400> 179

Claims

一種雙專一性抗體，其識別血液凝固第IX因子及/或活化的血液凝固第IX因子，及識別血液凝固第X因子，其中，抗體L鏈為與第一抗體H鏈以及第二抗體H鏈形成對，第一抗體H鏈包括含有由下述(a11)之胺基酸序列所構成之H鏈CDR的抗原結合部位，第二抗體H鏈包括含有由選自於下述(b7)、(b8)與(b10)中任一之胺基酸序列所構成之H鏈CDR的抗原結合部位，而抗體L鏈包括含有由選自於下述(c3)與(c5)~(c7)中任一之胺基酸序列所構成之L鏈CDR的抗原結合部位：(a11)具有序列識別號：105、106、107(Q499之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列的抗原結合部位；(b7)具有序列識別號：126、127、128(J327之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列的抗原結合部位；(b8)具有序列識別號：129、130、131(J339之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列的抗原結合部位；(b10)具有序列識別號：135、136、137(J346之H鏈CDR)記載之H鏈CDR1、2、3之胺基酸序列的抗原結合部位；(c3)具有序列識別號：144、145、146(L248之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位；(c5)具有序列識別號：150、151、152(L334之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位；(c6)具有序列識別號：153、154、155(L377之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位； (c7)具有序列識別號：156、157、158(L404之L鏈CDR)記載之L鏈CDR1、2、3之胺基酸序列之抗原結合部位。
如申請專利範圍第1項之雙專一性抗體，其中，第一抗體H鏈包括含有由下述(a11)之胺基酸序列所構成之H鏈可變區的抗原結合部位，第二抗體H鏈包括含有由選自於下述(b7)、(b8)與(b10)中任一之胺基酸序列所構成之H鏈可變區的抗原結合部位，而抗體L鏈包括含有由選自於下述(c3)與(c5)~(c7)中任一之胺基酸序列所構成之L鏈可變區的抗原結合部位：(a11)具有序列識別號：45(Q499之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(b7)具有序列識別號：52(J327之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(b8)具有序列識別號：53(J339之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(b10)具有序列識別號：55(J346之H鏈可變區)記載之H鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(c3)具有序列識別號：58(L248之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(c5)具有序列識別號：60(L334之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(c6)具有序列識別號：61(L377之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位；(c7)具有序列識別號：62(L404之L鏈可變區)記載之L鏈可變區之胺基酸序列之抗原結合部位。
如申請專利範圍第2項之雙專一性抗體，其中，第一抗體H鏈包含由下述(d5)或(d6)之胺基酸序列或下述(d8)或(d9)之胺基酸序列所構成的抗體之H鏈恆定區，第二抗體H鏈包含由選自於與上述第一抗體H鏈不同之群組之任一的胺基酸序列所構成的抗體之H鏈恆定區，而抗體L鏈包含由下述(e)之胺基酸序列所構成的抗體之L鏈恆定區：(d5)序列識別號：69(z118)記載之H鏈恆定區；(d6)序列識別號：70(z121)記載之H鏈恆定區；(d8)序列識別號：72(z107)記載之H鏈恆定區；(d9)序列識別號：73(z119)記載之H鏈恆定區；(e)序列識別號：74(k)記載之L鏈恆定區。
如申請專利範圍第3項之雙專一性抗體，其中，第一抗體H鏈包含下述(a13)或(a14)之抗體H鏈，第二抗體H鏈包含選自於下述(b8)~(b11)中任一之抗體H鏈，而抗體L鏈包含選自於下述(c3)與(c5)~(c7)中任一之抗體L鏈：(a13)由序列識別號：19(Q499-z118)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈；(a14)由序列識別號：20(Q499-z121)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈；(b8)由序列識別號：24(J327-z107)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈；(b9)由序列識別號：25(J327-z119)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈； (b10)由序列識別號：26(J339-z119)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈；(b11)由序列識別號：27(J346-z107)記載之胺基酸序列所構成之抗體H鏈；(c3)由序列識別號：28(L248-k)記載之胺基酸序列所構成之抗體L鏈；(c5)由序列識別號：30(L334-k)記載之胺基酸序列所構成之抗體L鏈；(c6)由序列識別號：31(L377-k)記載之胺基酸序列所構成之抗體L鏈；(c7)由序列識別號：32(L404-k)記載之胺基酸序列所構成之抗體L鏈。
如申請專利範圍第1至4項之任一項之雙專一性抗體，其中，抗體L鏈為共通L鏈。
一種雙專一性抗體，為以下(p)~(t)中任一項記載之雙專一性抗體：(p)雙專一性抗體(Q499-z118/J327-z107/L334-k)，其係由以下構成：第一多胜肽由序列識別號：19記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第二多胜肽由序列識別號：24記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽為序列識別號：30記載之共通L鏈；(q)雙專一性抗體(Q499-z118/J327-z107/L377-k)，其係由以下構成：第一多胜肽由序列識別號：19記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第二多胜肽由序列識別號：24記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽為序列識別號：31記載之共通L鏈；(r)雙專一性抗體(Q499-z118/J346-z107/L248-k)，其係由以下構成：第一多胜肽由序列識別號：19記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第二多胜肽由序列識別號：27記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽為序列識別號：28記載之共通L鏈；(s)雙專一性抗體(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，其係由以下構成：第一多胜肽由序列識別號：20記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第二多胜肽由序列識別號：25記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽為序列識別號：32記載之共通L鏈；(t)雙專一性抗體(Q499-z121/J339-z119/L377-k)，其係由以下構成：第一多胜肽由序列識別號：20記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第二多胜肽由序列識別號：26記載之胺基酸序列所構成的H鏈，第三多胜肽與第四多胜肽為序列識別號：31記載之共通L鏈，其中，第一多胜肽與第三多胜肽連結，而第二多胜肽與第四多胜肽連結。
一種核酸，其係編碼如申請專利範圍第1至6項中任一項之雙專一性抗體。
一種載體，其係插入有如申請專利範圍第7項之核酸。
一種細胞，其係包含如申請專利範圍第7項之核酸或如申請專利範圍第8項之載體。
一種製造雙專一性抗體之方法，係經由培養如申請專利範圍第9項之細胞。
一種醫藥組成物，其係包含：如申請專利範圍第1至6項中任一項之雙專一性抗體，及藥學上可容許之載體。
如申請專利範圍第11項之醫藥組成物，用於出血、伴隨出血之疾病、或起因於出血之疾病之預防及/或治療，其中該疾病係由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病。
如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病為血友病A。
如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病，係出現對於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之抑制因子的疾病。
如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落或缺損而發病及/或進展之疾病，為後天性血友病。
如申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中，該由於血液凝固第VIII因子及/或活化的血液凝固第VIII因子之活性低落而發病及/或進展之疾病為類血友病(von Willebrand病)。
一種套組，係用於出血、伴隨出血之疾病或起因於出血之疾病之預防及/或治療方法，至少包含：如申請專利範圍第1 至6項中任一項之雙專一性抗體。