KR102652906B1 - 이중 특이적 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인자 VII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위 및 TLT-1에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체, 이러한 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 제형, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

이중 특이적 항체
본 발명은 개선된 약학적 특성을 나타내는 이중 특이적 항체, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 이러한 항체 및 조성물의 용도, 예컨대 약학적 용도 및 치료적 용도에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 서열 목록과 전자 형식으로 출원된다. 서열 목록의 전체 내용은 참조로서 본원에 통합된다.
혈액 응고 과정에는 여러 단백질이 관여하는데, 이들은 혈관 손상 후에 함께 작용하여 체액의 심각한 손실 및/또는 병균 침입을 방지하는 혈전을 생성한다. 혈전 형성을 유도하는 이벤트의 연쇄 작용은 내인성 경로(접촉) 및 외인성 경로(조직 인자)로 알려진 2개의 경로를 통해 개시될 수 있다. 각각의 경로는, 새로 활성화된 효소가 프로트롬빈이 트롬빈으로 변환될 때까지 다음 지모겐의 활성화를 연속으로 촉매하는 일련의 지모겐 활성화 단계로 구성된다. 트롬빈은 피브리노겐을 피브린 메시워크에 변환하고, 혈소판을 활성화시켜 혈소판 플러그를 형성함으로써, 함께 안정한 혈전을 형성한다. 외인성 응고 경로의 개시는, 혈관 벽의 손상에 의해 노출되는 막 결합 조직 인자(TF)와 낮은 수준의 순환 인자 VIIa(FVIIa) 간의 복합체 형성에 의해 매개된다. FVIIa:TF 복합체는 소량의 응고 인자 IX(FIX) 및 인자 X(FX)를 활성화함으로써 응고 연쇄 작용을 개시한다. 초기 단계 동안, 낮은 농도의 FXa가 인자 XI 및 보조 인자 VIII 및 V를 활성화시킬 수 있는 미량의 트롬빈을 생성한다. 전파 단계 동안, 응고촉진 복합체가 조립되고, 이들은 테나제(FIXa, FVIIIa, Ca2+, 인지질) 복합체 및 프로트롬빈 분해효소(FXa, FVa, Ca2+지질) 복합체 각각에 의해 FXa 및 트롬빈의 생성을 유의하게 향상시킨다.
A형 및 B형 혈우병(각각 HA 및 HB)을 가진 사람들의 경우, 기능적 FVIII 및 FIX 각각의 부재 또는 불충분한 존재로 인해 응고 연쇄 작용에 기능 장애가 생긴다. 이는 혈액 응고에 장애를 일으켜 불충분한 혈액 응고를 유발하고, 잠재적으로 생명을 위협하는 출혈을 초래하거나 관절과 같은 내부 기관을 손상시킨다.
재조합 FVIIa(rFVIIa)는 억제제가 존재하는 혈우병(A 및 B)(HwI) 환자를 대상으로 출혈을 치료하는 대증 요법(on-demand, OD)용 우회제(bypassing agent)로서 널리 사용되어 왔다. rFVIIa는 정맥 내(IV) 투여 시 2~3시간의 짧은 전신 반감기를 가지며, 피하(SC) 투여 시 낮은 생체이용률을 갖는다. rFVIIa의 짧은 전신 반감기는, 혈장 억제제인 항트롬빈 III(AT)(Agersø H 등의 문헌[(2010) J. Thromb. Haemost. 9:333-8]) 및 알파-2-마크로글로불린(α2M)에 의한 억제뿐만 아니라 신장의 의한 제거를 포함하여, 여러가지 메카니즘의 관여로 인한 것으로 여겨진다. rFVIIa의 짧은 전신 반감기 및 낮은 SC 생체이용률은 rFVIIa를 예방적 치료에 사용하는 것을 어렵게 한다. 또한, rFVIIa의 낮은 고유 활성으로 인해 더 높은 rFVIIa 투여량을 투여하는 것이 필요하다.
결과적으로, 더 낮은 빈도의 투여 및 SC 투여를 통한 예방적 치료를 뒷받침할 수 있는 개선된 화합물이 필요하다.
로슈(Roche)는, HA 환자 및 억제제가 존재하는 HA(HAwI) 환자를 대상으로 SC 투여를 통해 주 1회 투여하는 일상적인 예방요법에 적합한 이중 특이적 항체인 에미시주맙(emicizumab)을 최근에 출시했다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 작용 메커니즘을 가진 안전하고 효용이 있는 분자의 개발은 혈우병 환자의 표준 치료를 개선하고 보충하기 위한 주요 관심 영역으로 남아 있다.
본 발명은 개선된 약학적 특성을 나타내는 이중 특이적 항체에 관한 것으로서, 구체적으로는 선천성 및/또는 후천성 응고병증을 앓고 있는 대상체의 치료, 예를 들어, 억제제가 존재하거나 존재하지 않는 A형 또는 B형 혈우병 환자의 치료에 사용될 수 있는 이중 특이적 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 응고 인자 VII(FVII(a)) 및 TREM-유사 전사체 1(TLT-1)에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 (i) FVII(a)에 결합하는 제1 항원 결합 부위, 및 (ii) TLT-1에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 항체는 내인성 FVIIa 활성의 손실 없이 내인성 FVIIa의 활성 순환 반감기를 연장시키고, 활성화된 혈소판에 선택적으로 국소화함으로써 내인성 FVIIa 활성을 자극한다.
본 발명의 일 구현예에서, 이중 특이적 항체는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역은 순환 중 반감기를 연장시키는 이중 특이적 항체의 재순환을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 경쟁 ELISA 검정에서 FVII(a)에 결합하기 위해 아래에 표시된 것과 같은 경쇄 가변 도메인(VL) 및 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항-FVII(a) 항체 중 어느 하나와 경쟁한다:
· mAb0522 (VL: 서열번호 846 및 VH: 서열번호 850),
· Fab0883 (VL: 서열번호 814 및 VH: 서열번호 818),
· mAb0005 (VL: 서열번호 750 및 VH: 서열번호 754),
· mAb0004 (VL: 서열번호 14 및 VH: 서열번호 18),
· mAb0013 (VL: 서열번호 46 및 VH: 서열번호 50),
· mAb0018 (VL: 서열번호 62 및 VH: 서열번호 66),
· mAb0544 (VL: 서열번호 694 및 VH: 서열번호 698),
· mAb0552 (VL: 서열번호 702 및 VH: 서열번호 706),
· mAb0001 (VL: 서열번호 710 및 VH: 서열번호 714),
· mAb0007 (VL: 서열번호 718 및 VH: 서열번호 722),
· mAb0578 (VL: 서열번호 726 및 VH: 서열번호 730),
· mAb0701 (VL: 서열번호 734 및 VH: 서열번호 738), 및
· mAb0587 (VL: 서열번호 742 및 VH: 서열번호 746).
본 발명의 추가 구현예에서, 이중 특이적 항체의 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)(서열번호 1)의 아미노산 잔기 H115, T130, V131, 및 R392를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 항체는 본 발명의 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 제형으로 제형화된다.
본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 항체는 정맥 내, 근육 내, 또는 피하와 같이 비경구 투여된다. 본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 항체는 A형 혈우병, B형 혈우병, 억제제가 존재하는 A형 혈우병, 또는 억제제가 존재하는 B형 혈우병과 같은 선천성 및/또는 후천성 응고병증 환자의 예방적 치료를 가능하게 한다. 따라서, 이중 특이적 항체는 출혈에 대한 지혈 커버리지를 제공하도록 설계된다. 본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 항체는, 예컨대 매주 1회, 매월 1회 또는 더 낮은 빈도로 투여하기에 적합하도록 설계된다.
본 발명의 이중 특이적 항체를 이용한 의학적 치료는 주사 사이의 더 긴 지속 기간, 더 편리한 투여, 및 주사 사이의 잠재적으로 개선된 지혈 보호와 같은 많은 이점을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 이중 특이적 항체는 억제제가 존재하거나 존재하지 않는 A형 또는 B형 혈우병 환자의 삶의 질에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
서열 목록의 간단한 설명
표 1은 항체 및 상응하는 VL 및 VL 도메인 서열에 대한 이들의 상응하는 서열번호의 개요이다. 중쇄 불변 도메인의 유형은 표 2a에 정의된 바와 같다("M"은 쥣과 IgG1 불변 도메인을 나타낸다).
표 2a는 2가 항체, 1가(OA) 항체, 및 이중 특이적 항체의 재조합 발현에 사용된 상이한 포맷의 개요이다. 열거된 것은 제1 중쇄(HC-1) 및 제2 중쇄(HC-2, 또는 OA 항체의 경우 절단된 중쇄(trHC))에 상응하는 서열번호이다. 경쇄 불변 도메인은 모든 경우에 서열번호 12에 상응하는 인간 카파였다.
표 2b는 본 발명의 쥣과 항-FVII(a) 항체의 개요이다. 클론명, 완전한 쥣과 항체(재조합적으로 발현된 mAb0765를 제외하고, 하이브리도마 유래 항체) 및 상응하는 쥣과/인간 키메라 변이체(쥣과 가변 도메인, 인간 IgG4 S228P 불변 도메인)에 대한 약어 사이의 관련성.
표 2c는 쥣과 동물 및 인간화 11F2 계통의 항체의 개요이다.
표 2d는 항-TLT-1 mAb0012 계통의 항체의 개요이다.
항체 표적 VL
서열번호 		VH
서열번호 		불변 도메인
mAb0004 FVII(a) 14 18 M
mAb0048 FVII(a) 22 26 A
Fab0076 FVII(a) 30 34 G
mAb0077(OA) FVII(a) 38 42 E
mAb0013 FVII(a) 46 50 M
mAb0099 FVII(a) 54 58 F
mAb0018 FVII(a) 62 66 M
mAb0108 FVII(a) 70 74 A
mAb0109 FVII(a) 78 82 A
mAb0110 FVII(a) 86 90 A
mAb0111 FVII(a) 94 98 A
mAb0112 FVII(a) 102 106 A
mAb0113 FVII(a) 110 114 A
mAb0114 FVII(a) 118 122 A
mAb0115 FVII(a) 126 130 A
mAb0116 FVII(a) 134 138 A
mAb0117 FVII(a) 142 146 A
mAb0118 FVII(a) 150 154 A
mAb0119 FVII(a) 158 162 A
mAb0120 FVII(a) 166 170 A
mAb0121 FVII(a) 174 178 A
mAb0122 FVII(a) 182 186 A
mAb0123 FVII(a) 190 194 A
mAb0124 FVII(a) 198 202 A
mAb0125 FVII(a) 206 210 A
mAb0126 FVII(a) 214 218 A
mAb0127 FVII(a) 222 226 A
mAb0128 FVII(a) 230 234 A
mAb0129 FVII(a) 238 242 A
mAb0130 FVII(a) 246 250 A
mAb0137(OA) FVII(a) 254 258 E
mAb0138(OA) FVII(a) 262 266 E
mAb0139(OA) FVII(a) 270 274 E
mAb0140(OA) FVII(a) 278 282 E
mAb0141(OA) FVII(a) 286 290 E
mAb0142(OA) FVII(a) 294 298 E
mAb0143(OA) FVII(a) 302 306 E
mAb0153 FVII(a) 310 314 A
mAb0154 FVII(a) 318 322 A
mAb0155 FVII(a) 326 330 A
mAb0156 FVII(a) 334 338 A
mAb0157 FVII(a) 342 346 A
mAb0158 FVII(a) 350 354 A
mAb0159 FVII(a) 358 362 A
mAb0160 FVII(a) 366 370 A
mAb0161 FVII(a) 374 378 A
mAb0162 FVII(a) 382 386 A
mAb0163 FVII(a) 390 394 A
mAb0164 FVII(a) 398 402 A
mAb0165 FVII(a) 406 410 A
mAb0166 FVII(a) 414 418 A
mAb0167 FVII(a) 422 426 A
mAb0168 FVII(a) 430 434 A
mAb0169 FVII(a) 438 442 A
mAb0170 FVII(a) 446 450 A
mAb0171 FVII(a) 454 458 A
mAb0172 FVII(a) 462 466 A
mAb0173 FVII(a) 470 474 A
mAb0174 FVII(a) 478 482 A
mAb0175 FVII(a) 486 490 A
mAb0176 FVII(a) 494 498 A
mAb0177 FVII(a) 502 506 A
mAb0178 FVII(a) 510 514 A
mAb0203 FVII(a) 518 522 A
mAb0228 FVII(a) 526 530 A
mAb0253 FVII(a) 534 538 A
mAb0278 FVII(a) 542 546 A
mAb0303 FVII(a) 550 554 A
mAb0328 FVII(a) 558 562 A
mAb0353 FVII(a) 566 570 A
mAb0378 FVII(a) 574 578 A
mAb0403 FVII(a) 582 586 A
mAb0428 FVII(a) 590 594 A
mAb0453 FVII(a) 598 602 A
mAb0478 FVII(a) 606 610 A
mAb0503 FVII(a) 614 618 A
mAb0528 FVII(a) 622 626 A
mAb0553 FVII(a) 630 634 A
mAb0578 FVII(a) 638 642 A
mAb0603 FVII(a) 646 650 A
mAb0705(OA) FVII(a) 654 658 F
mAb0706(OA) FVII(a) 662 666 F
mAb0707(OA) FVII(a) 670 674 F
mAb0709(OA) FVII(a) 678 682 F
mAb0710(OA) FVII(a) 686 690 F
mAb0544 FVII(a) 694 698 M
mAb0552 FVII(a) 702 706 M
mAb0001 FVII(a) 710 714 M
mAb0007 FVII(a) 718 722 M
mAb0578 FVII(a) 726 730 M
mAb0701 FVII(a) 734 738 M
mAb0587 FVII(a) 742 746 M
mAb0005 FVII(a) 750 754 M
mAb0842(OA) FVII(a) 758 762 F
mAb0864 FVII(a) 766 770 B
mAb0865 FVII(a) 774 778 B
mAb0872 FVII(a) 782 786 B
mAb0873 FVII(a) 790 794 B
mAb0874 FVII(a) 798 802 B
mAb0875 FVII(a) 806 810 B
Fab0883 FVII(a) 814 818 G
mAb7250 FVII(a) 822 826 M
mAb0350 FVII(a) 830 834 D
mAb0351 FVII(a) 838 842 C
mAb0522 FVII(a) 846 850 K
mAb0524 TLT-1 854 858 J
mAb0012 TLT-1 862 866 A
mAb0023 TLT-1 870 874 A
mAb0051 TLT-1 878 882 A
mAb0061 TLT-1 886 890 A
mAb0062 TLT-1 894 898 A
mAb0082 TLT-1 902 906 A
mAb1038 TLT-1 910 914 A
mAb1047 TLT-1 918 922 A
mAb1049 TLT-1 926 930 A
mAb1076 TLT-1 934 938 A
[표 2a]
[표 2b]
[표 2c]
[표 2d]
본 발명에서, 재조합적으로 생산된 항체는 모두 인간 IgG4 배경에서 발현되었고, 모두 표준 힌지 안정화 치환 S228P(EU 넘버링)를 함유하였다. 일부 변이체에서, 중쇄의 C-말단 라이신(생체 내에서 신속하게 절단되는 K447; Cai 등의 문헌[Biotechnol. Bioeng. 2011 vol. 108, pp 404-412])을 결실시켰다(델타-lys로 지칭함). 이중 특이적 항체 및 1가 항체의 바람직한 서열 페어링을 확보하거나(듀오바디 돌연변이 F405L R409K (Labrijn 등의 문헌[PNAS 2013, vol. 110, pp. 5145-5150]), 및 놉-인-홀 돌연변이(Carter 등의 문헌[J. Imm. Methods 2001, vol. 248, pp. 7-15] 참조) T366W(놉)와 T366S L368A Y407V(홀)), 생체 내 반감기를 연장시키기 위해(YTE 돌연변이, M252Y S254T T256E(Dall'Acqua 등의 문헌[J. Biol. Chem. 2006, vol. 18, pp.23514-23524] 참조)) 표 2a에 따라 추가 치환을 중쇄 불변 도메인에 도입하였다. 본 발명의 모든 재조합적으로 생산된 항체는 인간 카파 경쇄 불변 도메인(서열번호 12)을 갖는다.
본 발명은 개선된 약학적 특성을 나타내는 항체 조성물의 설계 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 응고 FVII(a) 및 TLT-1에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체에 관한 것이다.
항체
본원에서의 용어 "항체(antibody)"는 면역글로불린 서열 유래의 단백질을 지칭하며, 이는 항원 또는 이의 일부에 결합할 수 있다. 용어 항체는 임의의 클래스(또는 이소형)의 전장 항체, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및/또는 IgY를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
치료 항체에 대한 주된 관심은 IgG 하위 클래스인데, 이는 이들의 중쇄 불변 영역의 서열에 기초하여 인간에서, 4개의 하위-클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 나누어진다. 경쇄는 이의 서열 성분 차이에 기초하여 2가지 유형, 즉 카파 및 람다 사슬로 나누어질 수 있다. IgG 분자는 2개 이상의 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄, 및 이황화 결합에 의해 중쇄에 각각 부착된 2개의 경쇄로 구성된다. IgG 중쇄는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 최대 3개의 중쇄 불변 도메인(CH), 즉 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 일반적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 다음의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 초가변 영역(CDR)을 함유하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 항원과 상호 작용할 수 있는 구조를 형성하는 반면, 항체의 불변 영역은 항체가 Fc 수용체, 및 고전적인 보체 시스템의 C1 복합체의 제1 성분인 C1q에 결합하는 것을 매개할 수 있다.
용어 "항원 결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합을 가능하게 하는 항체의 부분을 지칭한다.
항체의 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"이라는 용어는 이의 동족 항원, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 FVII(a), TLT-1, 또는 다른 표적 분자에 결합하는 능력을 가진 항체의 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', Fab2, Fab'2, Fv, 단쇄 Fv(scFv), 또는 단일 VH 또는 VL 도메인을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 아암(one-armed) 항체"는 항체 중쇄, Fab 영역이 결여된 절단된 중쇄, 및 단일 경쇄로 이루어진 1가 항체 단편의 특정 유형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일 특이적(monospecific)" 항체는 하나의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다(2차 항체를 포함하되 이에 한정되지 않음).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이적(bispecific)" 항체 및 "biAb"는 2개의 상이한 항원, 예컨대 FVII(a) 및 TLT-1, 또는 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본 발명의 이중 특이적 항체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래된다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 항체 및 항체의 항원 결합 단편의 융합체 또는 접합체, 예컨대 Fab, Fab', Fab2, Fab'2, 또는 scFv일 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 항체 단편의 융합체 또는 접합체일 수도 있다. 항체 및 항체 단편으로부터 유래된 이중 특이적 항체에 대한 광범위한 분자 포맷이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Spiess 등의 문헌[Molecular Immunology 67, (2015), pp. 95-106] 및 Brinkmann과 Kontermann의 문헌[MABS, 9 (2017), pp 182-212] 참조).
이중 특이적 항체는 당업계에 기술된 다양한 방식으로 제조될 수 있다(예를 들어, Spiess 등의 문헌[Molecular Immunology 67, (2015), pp. 95-106] 및 Brinkmann과 Kontermann의 문헌[MABS, 9 (2017), pp 182-212] 참조). 예를 들어, 원하는 중쇄 페어링은 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 영역의 이량체화 계면을 조작함으로써 달성될 수 있다. 이의 일례는, 입체적으로 부피가 큰 측쇄(노브)가 반대쪽 Fc 상의 입체적으로 작은 측쇄(홀)에 의해 정합된 하나의 Fc에 도입되어 이종이량체화를 촉진하는 입체 상보성을 생성하는 소위 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이이다. 이종이량체화 Fc 계면을 조작하기 위한 다른 방법은 정전기 상보성(electrostatic complementarity), 비-IgG 이종이량체화 도메인에 대한 융합, 또는 인간 IgG4의 자연적인 Fab-아암 교환 현상을 이용해 시험관 내에서 이종이량체화를 수행하는 것이다. 이종이량체화된 이중 특이적 항체의 예는 예를 들어 Klein C 등의 문헌[MAbs. 2012 4, pp 653-663]에 잘 기술되어 있다. 이종이량체 항체의 경쇄에는 특별한 주의를 기울여야 한다. LC와 HC의 정확한 페어링은 공통 경쇄의 사용에 의해 달성될 수 있다. LC/HC 계면의 조작을 사용해 CrossMab에서와 같이 이종이량체화 또는 경쇄 교차 조작(cross-over engineering)을 촉진할 수 있다. 완만한 감소 조건 하에서, 적절한 돌연변이를 함유하는 2개의 개별 IgG로부터 항체를 시험관 내에서 재조립하는 것이 이중 특이적 항체를 생성하는데 사용될 수도 있다(예를 들어, Labrijn 등의 문헌[PNAS, 110 (2013), pp 5145-5150]). 자연적인 Fab-아암 교환 방법도 정확한 경쇄 페어링을 보장하는 것으로 보고된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다중 특이적(multispecific)" 항체는 2개 이상의 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 따라서 다중 특이적 항체는 이중 특이적 항체를 포함한다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다른 항체 및 항체 단편과 조합되어 이중 특이적, 삼중 특이적, 또는 다중 특이적 항체 분자를 생성할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 이러한 항체는, 예를 들어, 적절한 항체 디스플레이 또는 면역화 플랫폼 또는 당 분야에서 공지된 다른 적절한 플랫폼 또는 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또는 이의 일부분도 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예: 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 도입되거나 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이).
인간 항체는 인간 생식계열 서열의 선택에 기초하여 구축된 서열 라이브러리로부터 단리될 수 있으며, 천연 및 합성 서열 다양성으로 더 다양화될 수 있다.
인간 항체는 시험관 내에서 인간 림프구를 면역화하고, 이어서 림프구를 엡스타인-바 바이러스로 형질전환함으로써 제조될 수 있다. 인간 항체는 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해 생산될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 비인간 면역글로불린 유래의 서열(CDR 영역 또는 이의 일부분)을 함유하는 인간/비인간 항체를 지칭한다. 따라서, 인간화 항체는, 수혜자(recipient)의 적어도 초가변 영역으로부터의 잔기가 비인간 종(예: 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류) 유래의 항체(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 치환되는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이며, 상기 치환된 잔기는 원하는 특이성, 친화도, 서열 성분 및 기능을 갖는다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 이러한 변형의 예는, 일반적으로 공여자 항체로부터 유래된 아미노산 잔기인 하나 이상의 소위 복귀 돌연변이(back-mutation)를 도입하는 것이다. 항체의 인간화는 당업자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Benny K. Lo(편집자)의 Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, 참조). 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에 대한 적절한 인간 수혜자 프레임워크는, 예를 들어, 서열 상동성 또는 구조적 상동성에 의해 식별될 수 있다. 대안적으로, 고정된 수혜자 프레임워크가, 예를 들어, 구조, 생물물리학적 및 생화학적 특성에 대한 지식에 기초하여 사용될 수 있다. 수혜자 프레임워크는 생식계열로부터 유래되거나 성숙한 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 공여자 항체로부터의 CDR 영역은 CDR 이식에 의해 전달될 수 있다. CDR이 이식된 인간화 항체는, 공여자 항체로부터의 아미노산 잔기의 재도입(복귀 돌연변이)이 인간화 항체의 특성에 유익한 영향을 미치는 중요한 프레임워크 위치의 식별에 의해, 예를 들어 친화도, 기능 및 생물물리학적 특성에 대해 추가로 최적화될 수 있다. 공여자 항체 유래의 복귀 돌연변이에 추가하여, 인간화 항체는 생식계열 잔기의 CDR 또는 프레임워크 영역 내 도입, 면역원성 에피토프의 제거, 부위-지향성 돌연변이 유발, 친화도 성숙 등에 의해 조작될 수 있다.
또한, 인간화 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 인간화 항체는, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로는 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 선택적으로 포함할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 2개 이상의 종으로부터 유래된 항체의 부분을 포함하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 항체를 암호화하는 유전자는 2개의 상이한 종 기원의 불변 도메인을 암호화하는 유전자 및 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 마우스 단클론 항체의 가변 도메인을 암호화하는 유전자는 인간 기원의 항체 불변 도메인을 암호화하는 유전자에 결합될 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 이들의 상보성 결정 영역(CDR)과 관련하여 정의될 수 있다. 용어 "상보성 결정 영역(complementarity-determining region)"이 본원에서 사용되는 경우, 이는 항원 결합에 관여하는 아미노산 잔기가 일반적으로 위치하는 항체의 영역을 지칭한다. CDR은 항체 가변 도메인들 중 가장 높은 변동성을 갖는 영역으로서 식별될 수 있다. Kabat 데이터베이스와 같은 데이터베이스가 CDR 식별에 위해 사용될 수 있으며, CDR은, 예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)를 포함하는 것으로 정의된다; (Kabat 등의 1991 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 일반적으로, 이러한 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등의 전술한 문헌에 기술된 방법에 의해 수행된다. 본원에서의 "Kabat 위치", "Kabat 잔기", 및 "Kabat에 따른"과 같은 구절은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이러한 넘버링 시스템을 지칭한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면, 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 프레임워크(FR) 또는 CDR의 단축, 또는 이들에 대한 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 다음에 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a, 52b 및 52c)을 포함할 수 있고 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예: Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 주어진 항체를 대상으로 하는 잔기의 Kabat 넘버링은 상동성 영역에서 항체의 서열을 "표준" Kabat 넘버링 서열과 정렬함으로써 결정될 수 있다. 넘버링은 구체적으로 언급되는 경우에만 Kabat에 따르고, 그렇지 않으면 명시된 서열번호에 따라 연속된다.
용어 "프레임워크 영역(framework region)" 잔기 또는 "FR" 잔기는, 본원에 정의된 바와 같이, CDR 내에 없는 VH 또는 VL 아미노산 잔기들을 지칭한다.
본 발명의 항체는 본원에 개시된 특이적 항체 중 하나 이상의 CDR 영역을 포함할 수 있다.
용어 "항원(antigen; Ag)"은 Ag를 인식하는 항체(Ab)를 생산하기 위해 면역적격(immunocompetent) 척추 동물의 면역화에 사용되는 분자 엔티티를 지칭한다. 본원에서, Ag는 보다 광범위하게 지칭되며, 일반적으로 Ab에 의해 인식되는 표적 분자를 포함하도록 의도된다.
본 발명은 본 발명의 항체의 변이체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 이들은 본원에 개시된 개별 서열에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
"치환" 변이체는 바람직하게는 하나 이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 항체(Ab)와 같은 "항원 결합 폴리펩티드"와 이의 상응하는 항원(Ag) 간의 분자 상호 작용의 맥락에서 정의된다. 일반적으로, "에피토프"는 Ab가 결합하는 Ag 상의 부위 또는 영역, 즉 Ab와 물리적으로 접촉하는 부위 또는 영역을 지칭한다. 본 발명에서, 에피토프는 Ab(예: Fab 단편)와 이의 Ag 사이에서 복합체의 공간 좌표를 정의하는 X-선 유래 결정 구조를 사용하여 결정된다. 달리 명시되거나 문맥 상 모순되지 않는 한, 용어 에피토프는, Fab 내의 중원자로부터 4 Å의 거리 내에 중원자(즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 Ag(여기서는 FVII(a) 또는 TLT-1) 잔기로서 정의된다.
예를 들어, X-선 구조로부터 결정된, 아미노산 수준에서 설명된 에피토프는, 이들이 동일한 아미노산 잔기의 세트를 포함하는 경우에 동일한 것으로 본다. 적어도 하나의 아미노산 잔기가 에피토프에 의해 공유되는 경우, 에피토프는 중첩하는 것으로 본다. 에피토프에 의해 잔기가 공유되지 않는 경우, 에피토프는 별개인 (고유한) 것으로 본다.
용어 "파라토프(paratope)"에 대한 정의는 "에피토프"에 대한 위의 정의로부터, 관점을 반대로 함으로써 유래된 것이다. 따라서, 용어 "파라토프(paratope)"는 항원 또는 이의 단편이 결합하는 항체 상의 부위 또는 영역, 즉, 항원과 물리적으로 접촉하는 부위 또는 영역을 지칭한다. 달리 명시되거나 문맥 상 모순되지 않는 한, 용어 파라토프는, FVII(a) 또는 TLT-1 내의 중원자로부터 4 Å의 거리 내에 중원자(즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 Ab 잔기로서 정의된다.
항원 상의 에피토프는 하나 이상의 핫-스팟 잔기(hot-spot residues), 즉 동족 항체와의 상호 작용에 특히 중요한 잔기를 포함할 수 있고, 이 경우 상기 핫-스팟 잔기의 측쇄에 의해 매개되는 상호 작용은 항체/항원 상호 작용을 위한 결합 에너지에 상당히 기여한다(Peng 등의 문헌[PNAS 111 (2014), E2656-E2665] 참조). 핫-스팟 잔기는, 동족 항체에 결합하기 위해 단일 에피토프 잔기가, 예를 들어 알라닌으로 치환된 항원의 변이체를 시험함으로써 식별될 수 있다. 알라닌으로 에피토프 잔기를 치환하는 것이 항체에 대한 결합에 강한 영향을 미치는 경우, 상기 에피토프 잔기는 핫-스팟 잔기로 간주되고, 따라서 항원에 대한 항체의 결합에 특히 중요한 것으로 간주된다.
동일한 항원에 결합하는 항체들은 이들의 공통 항원에 동시에 결합하는 능력과 관련하여 특징을 가질 수 있고, "경쟁 결합(competition binding)"/"비닝(binning)"을 겪을 수 있다. 본 문맥에서, 용어 "비닝(binning)"은 동일한 항원에 결합하는 항체를 그룹화하는 방법을 지칭한다. 항체의 "비닝"은 표준 기술에 기초한 분석에서 2개의 항체가 이들의 공통 항원에 경쟁 결합하는 것에 기초할 수 있다. 항체의 "빈(bin)"은 기준 항체를 사용하여 정의된다. 제2 항체가 기준 항체와 동시에 항원에 결합할 수 없는 경우, 제2 항체는 기준 항체와 동일한 "빈"에 속하는 것으로 본다. 이 경우, 기준 항체와 제2 항체는 항원의 동일한 부분에 경쟁적으로 결합하여 "경쟁 항체"가 만들어 진다. 제2 항체가 기준 항체와 동시에 항원에 결합할 수 있는 경우, 제2 항체는 별도의 "빈"에 속하는 것으로 본다. 이 경우, 기준 항체와 제2 항체는 항원의 동일한 부분에 경쟁적으로 결합하지 않아 "비-경쟁 항체"가 만들어 진다.
항체가 결합을 위해 본원에 개시된 항-FVII(a) 또는 항-TLT-1 항체와 경쟁하는지 여부를 판단하기 위한 경쟁 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 경쟁 검정은 면역검정(예를 들어, ELISA 검정, RIA 검정), 표면 플라스몬 공명 분석(예: BIAcore?? 기기를 사용하는 분석), 바이오층 간섭법(ForteBio®), 및 유세포 계측법을 포함한다.
전형적으로, 경쟁 검정은 고체 표면에 결합되거나 세포 표면에서 발현된 항원, 시험 FVII- 또는 FVIIa 결합 항체, 및 기준 항체를 사용하는 것을 포함한다. 기준 항체는 표지되고 시험 항체는 표지되지 않는다. 경쟁 억제는, 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지된 기준 항체의 양을 결정함으로써 측정된다. 일반적으로, 시험 항체는 과량으로 (예를 들어, 1, 5, 10, 20, 100, 1000, 10000 또는 100000배로) 존재한다. 경쟁 분석에서 경쟁력을 갖는 것으로 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프를 포함하고, 입체 방해가 발생하도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 대해 충분한 근위에 있는 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
예시적인 경쟁 검정에서, 기준 항-FVII 또는 항-FVIIa 항체를 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 비오티닐화(biotinylated)한다. 바이오티닐화된 기준 항체를 시험 항체 또는 비표지 기준 항체(자기-경쟁 대조군)의 연속 희석물과 혼합하여, 표지된 기준 항체에 대한 시험 항체(또는 비표지 기준 항체)의 다양한 몰 비(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 100, 1000, 10000 또는 100000배)를 갖는 혼합물을 생성한다. 항체 혼합물을 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드가 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가한다. 그런 다음 플레이트를 세척하고, 검출 시약으로서 서양 고추냉이 퍼록시다아제(HRP)-스트렙파비딘을 플레이트에 첨가한다. 표적 항원에 결합된 표지된 기준 항체의 양은 당업계에 공지된 발색성 기질(예: TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 또는 ABTS(2,2"-아지노-디-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트)의 첨가 후 검출된다. 광학 밀도 판독(OD 단위)은 분광계(예: SpectraMax® M2 분광계(Molecular Devices))를 사용하여 이루어진다. 0% 억제에 상응하는 반응(OD 단위)은 경쟁 항체가 없는 웰에서 결정된다. 100% 억제, 즉 검정 배경에 상응하는 반응(OD 단위)은 임의의 표지된 기준 항체 또는 시험 항체가 없는 웰에서 결정된다. 각각의 농도에서 시험 항체(또는 표지되지 않은 기준 항체)에 의한 FVII 또는 FVIIa에 대한 표지된 기준 항체의 억제율은 다음과 같이 계산된다: 억제율(%) = (1- (OD 단위 - 100% 억제)/(0% 억제 - 100% 억제)) * 100.
당업자는, 2개 이상의 항-TLT-1 항체가 결합 영역, 빈을 공유하는지 및/또는 경쟁적으로 항원에 결합하는지를 결정하기 위해 유사한 검정을 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는, 당업계에 공지된 다양한 검출 시스템을 사용하여 경쟁 분석을 수행할 수 있다는 것도 이해할 것이다.
경쟁 결합 분석에서 측정된 바와 같이, 과량인 하나의 항체(예를 들어, 1, 5, 10, 20, 100, 1000, 10000 또는 100000배)가 다른 하나의 항체의 결합을, 가령 적어도 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제하는 경우, 시험 항체는 항원에 결합하기 위해 기준 항체와 경쟁한다.
달리 표시되지 않는 한, 경쟁은 전술한 바와 같이 및 실시예 7 및 실시예 32에 제공된 바와 같이 경쟁적 ELISA 검정을 사용하여 결정된다.
본원에서, 용어 "결합 친화도(binding affinity)"는 2개의 분자(예를 들어 항체 또는 이의 단편, 및 항원) 간의 비-공유 상호 작용의 강도에 대한 척도로서 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호 작용을 기술하는 데 사용된다.
1가 상호작용을 통한 2개의 분자(예를 들어 항체 또는 이의 단편, 및 항원) 간의 결합 친화도는 평형 해리 상수(KD)를 결정함으로써 정량화될 수 있다. KD는, 예를 들어 실시예 6 및 16에서 수행된 것과 같은 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 복합체의 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 결정될 수 있다. 1가 복합체의 결합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 결합 속도 상수 ka (또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd (또는 koff)로서 지칭된다. KD는 등식 KD = kd / ka를 통해 ka 및 kd와 연관된다.
상기 정의에 따르면, 주어진 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도를 비교하는 것과 같이 상이한 분자 상호 작용과 관련된 결합 친화도는 개별 항체/항원 복합체에 KD 값을 비교함으로써 비교될 수 있다.
본 발명의 항체와 이의 표적에 대한 KD는 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM, 예컨대 400 nM, 예컨대 600 nM, 예컨대 800 nM 미만일 수 있다.
하나의 이러한 구현예에서, 항체는 FVIIa에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 KD를 갖는 항-FVII(a) 아암; 및 TLT-1에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 KD를 갖는 제2 항-TLT-1 아암을 포함하는 이중 특이적 항체이다.
당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성(identity)"은 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드의 서열 간의 관계를 지칭한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 2개 이상의 아미노산 잔기의 스트링 간의 일치의 수에 의해 결정된 바와 같이, 폴리펩티드들 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램("알고리즘(algorithm)")에 의해 다루어지는 gap 정렬(존재하는 경우)을 사용해 둘 이상의 서열 중 더 작은 것들 간의 동일한 일치 백분율을 측정하는 것이다. 관련 폴리펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 본 발명에서, 유사성 및 동일성은 갭 개방 및 연장에 대해 각각 10 및 0.5의 파라미터를 사용하여(gapopen=10, gapextend=0.5) EMBOSS-6.6.0의 Needleman을 사용해 결정하였다(Needleman 등의 문헌[J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453]).
항체의 단편 결정화 가능 영역("Fc 영역"/"Fc 도메인")은 항체의 C-말단 영역이며, 힌지 도메인 및 불변 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체는, 야생형 아미노산 서열을 가질 수 있거나 항체의 작동자 기능을 조절하는 아미노산 치환을 포함할 수 있는 Fc 영역을 포함할 수 있다(예를 들어, Wang 등의 문헌[Protein Cell. 9(2018), pp. 63-73] 참조). 변형된 효과기 기능을 갖는 Fc 변이체의 특정 예는 Fc? 수용체에 대한 결합이 감소된 변이체이다. 이러한 변이체의 하나의 특정 예는 특정 Fc? 수용체 및 C1q에 대한 친화도가 감소된 치환 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S(EU 지수에 따른 잔기 넘버링임)를 포함하는 IgG1이다.
이중 특이적 분자
본원의 용어 "이중 특이적 분자"는 FVII(a) 및 TLT-1과 같은 상이한 표적에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 이중 특이적 분자의 결합 모이어티는 항체로부터 유래될 수 있거나 비-항체 기원일 수 있다. 이중 특이적 분자의 하나의 특정 예는 이중 특이적 항체이다.
본 발명의 일 양태에서, 이중 특이적 분자는 인자 VII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및 TREM-유사 전사체 1(TLT-1)에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 이중 특이적 분자는 대안적인 스캐폴드로도 지칭되는 비-항체 유래 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 분자는 대안적인 스캐폴드의 융합체 또는 접합체일 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 분자는 항체와 대안적인 스캐폴드의 융합체 또는 접합체일 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 분자는 항체 단편과 대안적인 스캐폴드의 융합체 또는 접합체일 수도 있다.
많은 수의 다양한 대안적인 스캐폴드가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 Simeon 및 Chen의 문헌[Protein Cell 9 (2018), pp. 3-14], Kφnning 및 Kolmar의 문헌[Microbial Cell Factories (2018), pp. 17-32], 및 Nygren 및 Skerra의 문헌[Journal of Immunological Methods 290 (2004), pp 3 - 28] 참조).
대안적인 스캐폴드의 구체적인 예는 아드넥틴(Adnectins), 아필린(Affilins), 애티컬린(Anticalins), 아비머(Avimers), 아트리머(Atrimers), FN3 스캐폴드, 파이노머(Fynomers), 오바디(OBodies), 크링글 도메인(Kringle domains), 쿠니츠 도메인(Kunitz domains), 노틴(Knottins), 아피바디(Affibodies), DARPins, 이환 펩티드, 및 Cys-매듭(Cys-knots)이다.
인자 VII(a)
본원에서의 용어 "인자 VII" 및 "FVII"는 응고 인자 VII의 지모겐을 지칭한다. 본원에서의 용어 "인자 VIIa" 및 "FVIIa"는 활성화된 응고 인자 VII를 지칭하는데, 이는 세린 프로테아제이다. 본원에서의 용어 "인자 VII(a)" 및 "FVII(a)"는 절단되지 않은 지모겐, 인자 VII(FVII) 뿐만 아니라 절단됨으로써 활성화된 프로테아제인 인자 VIIa(FVIIa)를 포함한다. 본원에서의 용어 "인자 VII(a)" 및 "FVII(a)"는 존재할 수 있는 FVII(a)의 천연 대립유전자 변이체를 포함한다. 하나의 야생형 인간 인자 VII(a) 서열은 서열번호 1에 제공되어 있다.
야생형 인간 응고 인자 VII(a) (서열번호 1):
ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP
야생형 FVII(a)는 406개의 아미노산 잔기로 이루어지고, 4개의 도메인으로 구성된다. N-말단 감마-카르복시글루탐산-풍부(Gla) 도메인이 있는데, 이 경우 10개의 글루타메이트 잔기(위의 서열에서 굵을 글씨로 강조됨)가 감마-카르복실레이트화될 수 있다. gla 도메인에 이어서 2개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 및 C-말단 세린 프로테아제 도메인이 연속된다. FVII 및 FVIIa 둘 다는 순환 중에 존재하지만, FVIIa만은 단지 낮은 풍부도로 존재한다(총 FVII(a) 풀의 약 1%; Morrissey JH, Broze Jr GJ.의 문헌[Tissue factor and the initiation and regulation (TFPI) of coagulation]; Marder VJ, Aird WC, Bennett JS, Schulman S, White II GC, editors의 문헌[Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. 6th ed. Wolters Kluwer & Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia; 2013. p. 163-78]). FVII는 잔기 Arg152와 Ile153 사이의 단백질 분해 절단에 의해 FVIIa로 활성화되어, 경쇄 및 중쇄로 이루어진 2개 사슬 FVIIa 분자를 생성할 수 있다. FVIIa 내의 2개의 사슬을 이황화 결합에 의해 연결(tethered)된다. 경쇄는 Gla 및 EGF-유사 도메인을 함유하고, 중쇄는 프로테아제 도메인을 함유한다. FVIIa는 그의 완전한 생물학적 활성에 도달하기 위해 그의 세포-표면 보조인자 조직 인자(TF)에 대한 결합을 필요로 한다.
예측된 전장 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis) FVII 이소형 X1은 406개의 아미노산으로 구성되며, NCBI 기준 서열번호는 XP_01529543.1이다. 본원에서의 용어 "cFVIIa-키메라"는 키메라 시노몰구스 원숭이 FVIIa 작제물을 지칭한다. cFVIIa-키메라의 아미노산 서열은, Gla 및 제1 EGF 유사 도메인(인간 FVIIa 서열과 정렬될 때의 아미노산 1-88)이 인간 FVII 서열(Uniprot ID P08709)을 포함하는 반면, 제2 EGF 유사 도메인 및 프로테아제 도메인(인간 FVIIa 서열과 정렬될 때의 아미노산 89-406)은 시노몰구스 원숭이 FVII 이소형 X1 서열(NCBI 기준 서열 ID XP_015295043.1)을 포함하도록 이루어진다.
인간에서 재조합 FVIIa(및 내인성 FVIIa)의 활성 반감기는 정맥 내 투여될 때 약 2 내지 3시간이다. 인자 VII(a)는 내인성 혈장에서 유래되거나 잘 알려진 생산 및 정제 방법을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 당질화, 감마-카르복실화, 및 기타 번역 후 변형의 정도 및 위치는 선택된 숙주 세포 및 이의 성장 조건에 따라 달라질 수 있다.
인자 VIIa는 상이한 형태로 발견될 수 있다. 인자 VIIa는 비활성 형태 또는 비활성 형태로 혈액 내에서 순환한다. 이러한 형태는 촉매 활성을 갖지 않는다. FVIIa는 활성 형태 또는 활성 유형으로 확인될 수도 있으며, 이는 본원에서 완전히 활성인 또는 완전히 활성화된 FVIIa로도 지칭된다. 용어 FVIIa는 비활성 유형 또는 형태의 FVIIa 및 활성 유형 또는 형태의 FVIIa를 포함한다. 예를 들어, FVIIa의 활성 형태는 FVIIa와 조직 인자(FVIIa/TF) 사이의 복합체를, 예를 들어 FVIIa/sTF(1-219)의 형태로 포함할 수 있거나(sTF(1-219)는 조직 인자의 절단된 가용성 형태임), FVIIa의 활성 형태는 활성 부위가 억제된 FVIIa(FVIIai)를 포함할 수 있다. FVIIai는 FVIIa의 촉매적으로 불활성 형태이며, 이는 FVIIa를 단실-Glu-Gly-Arg 클로로메틸 케톤 또는 Phe-Phe-Arg-클로로메틸 케톤(FFR-클로로메틸 케톤)으로 처리함으로써 생산될 수 있다(Wildgoose 등의 문헌[(1990) Biochemistry 29: 3413-3420] 및 Sørensen 등의 문헌[(1997) J Biol Chem 272: 11863-11868]) FVIIai는 TF에 대한 친화도를 보유하며, TF 결합에 의해 FVIIa에서 유도된 것과 동일한 구조를 채택하는 것으로 여겨진다. 따라서, FVIIai는 활성화된 입체형태를 가지며, 시험 화합물이 FVIIai에 결합한다는 것은 시험 화합물이 야생형 FVIIa의 활성화된 형태에도 결합할 것임을 나타낸다.
항-FVII(a) 항체의 표적 분자는 본원에 기술된 것과 같은 임의의 FVII(a) 분자일 수 있다.
TREM-유사 전사체 1(TLT-1)
골수 세포(TREM)에서 발현된 유발 수용체는 다양한 골수 계통의 생물학에서 잘 확립된 역할을 하며, 선천성 및 적응 면역의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. TREM-유사 전사체 1(TLT-1) 유전자가 단일 계통, 즉 거대핵세포 및 혈전구(혈소판)에서만 발현되고 거대핵세포 및 혈소판의 알파 과립에서만 독점적으로 발견되지만, TLT-1은 이러한 단백질 계열에 속한다. TLT-1은 알파-과립 방출 시 활성화된 혈소판의 표면에 노출되는 막관통 단백질이다. 현재까지, TLT-1은 휴지기 혈소판 표면이나 다른 세포 유형의 표면에서 발견된 적이 없다.
TLT-1은 세포외 구형 헤드, 줄기 영역, 막관통 도메인, 및 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프를 함유하는 세포내 도메인을 함유한다(Washington 등의 문헌[Blood, 2002; 100: 3822-3824]). 인간 TLT-1(hTLT-1)의 세포외 구형 헤드는 단일 면역글로불린 유사(Ig 유사) 도메인이다. 이는 줄기로 지칭되는 37-아미노산 링커 영역에 의해 혈소판 막에 연결된다(Gattis 등의 문헌[Jour Biol Chem, 2006, 281, 19, 13396-13403]).
hTLT-1의 추정 막관통 분절은 20개 아미노산 길이이다. TLT-1은 또한 세포내 신호 전달 모티프로서 기능할 수 있는 세포질 면역 수용체 티로신 기반 억제-모티프(ITIM)를 갖는다.
TLT-1의 분획은 혈소판 활성화 시 방출되어 가용성 형태(sTLT-1)를 형성한다(Gattis 등의 문헌[Jour Biol Chem, 2006, 281, 19, 13396-13403]). 절단 부위는 혈소판 막에 매우 근접하게 위치한다. 절단된 세포내 도메인을 갖는 TLT-1의 더 짧은 이소형도 혈소판에 존재한다.
TLT-1은 응고 조절에 관여하며, 가능하게는 손상 부위의 염증 조절에도 관여한다. TLT-1은 일부 혈소판 작용제의 준최적 농도에 반응하여 혈소판을 응집시키는 역할을 한다(Giomaelli 등의 문헌[Thromb Haemost 2007; 97: 955-963]). TLT-1에 대해 가장 잘 기술된 리간드는 피브리노겐이다(Washington 등의 문헌[J Clin Invest 2009; 119: 1489-3824]). 최근에는 TLT-1이 폰 빌레브란트 인자에도 결합하는 것으로 나타났다(Doer A 등의 문헌[PB359 at International Society of Thrombosis and Haemostasis 2019] 초록). sTLT-1은 백혈구 활성화를 감쇠시키고 혈소판-호중구 연관성(cross-talk)을 조절함으로써 패혈증과 관련된 출혈에서 역할을 하는 것으로 제안된다(Derive의 문헌[J Immunol 2012, 188: 5585-5592]).
본 발명의 관점에서, TLT-1은 임의의 포유동물과 같은 척추동물, 예컨대 설치류(예: 마우스, 랫트, 또는 기니 피그), 토끼목(예: 토끼), 우제류(예: 돼지, 소, 양, 또는 낙타), 또는 영장류(예: 원숭이 또는 인간)로부터 유래될 수 있다. TLT-1은, 바람직하게는 인간 TLT-1이다. TLT-1은 기능적 TLT-1 단백질을 생성하는 임의의 자연 발생 유전자형 또는 대립유전자로부터 번역될 수 있다. 하나의 인간 TLT-1의 비제한적인 예는 서열번호 2의 폴리펩티드 서열이다.
TLT-1 항체의 표적 분자는 본원에 기술된 것과 같은 임의의 TLT-1 분자일 수 있다.
항-FVII(a) 항체
본원에서 용어 "항-FVII(a) 항체"는 FVII(a)를 그의 표적으로 하는 항체를 지칭한다. 항-FVII(a) 항체는 본원에 기술된 것과 같은 FVII(a) 분자에 결합할 수 있으며, 상기 분자는 인간 혈장에서 발견되는 것과 같은 내인성 FVII(a), 재조합 야생형 인간 FVII(a)와 같은 외인성 FVII(a), 및 토끼, 마우스, 랫트, 개, 또는 원숭이 등의 동물 혈장에서 발견되는 내인성 FVII(a)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
항-FVII(a) 항체는 FVII(a)를 표적으로 하는 단클론, 단일 특이적 항체일 수 있다. 단일 특이적 항-FVII(a) 항체는 일반적으로 FVII(a)에 결합하는 2개의 동일한 항원 결합 부위를 포함하며; 비제한적인 예는 단클론 IgG4 항-FVII(a) 항체이다.
적절한 항-FVII(a) 항체는 표 3에 나타낸 항-FVII(a) 항체 중 어느 하나를 제한 없이 포함한다.
항체 표적 VL
서열번호 		VH
서열번호 		불변 도메인
mAb0522 FVII(a) 846 850 K
Fab0883 FVII(a) 814 818 G
mAb0005 FVII(a) 750 754 M
mAb0004 FVII(a) 14 18 M
mAb0013 FVII(a) 46 50 M
mAb0018 FVII(a) 62 66 M
mAb0544 FVII(a) 694 698 M
mAb0552 FVII(a) 702 706 M
mAb0001 FVII(a) 710 714 M
mAb0007 FVII(a) 718 722 M
mAb0578 FVII(a) 726 730 M
mAb0701 FVII(a) 734 738 M
mAb0587 FVII(a) 742 746 M
항-FVII(a) 항체는 FVII(a)에 결합하기 위해 표 3에 나타낸 항체 중 어느 하나와 경쟁할 수 있다. 항-FVII(a) 항체가 FVII(a)에 결합하기 위해 표 3에 나타낸 항체 중 어느 하나와 경쟁하는지 여부는 표면 플라스몬 공명(SPR), ELISA, 또는 유세포 계측법과 같은 잘 알려진 방법(즉, 경쟁 결합 검정)을 사용하여 결정될 수 있다. 실시예 7은 경쟁 ELISA를 사용하여 FVII(a)에 대한 경쟁 결합을 결정할 수 있는 방법을 기술한다.
일 구현예에서, 항-FVII(a) 항체는 높은 친화도로 FVII(a)에 결합한다. 항-FVII(a) 항체는 이의 표적에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 KD를 가질 수 있다. 생체 내에서, 고친화도 항-FVII(a) 항체는 FVII(a)와 복합체를 형성함으로써 FVII(a)가 제거되는 것을 감소시킨다. 이에 의해, 상기 항체는 FVII(a)의 반감기를 연장시키고 FVII(a)를 순환 중에 축적시킨다. 이러한 방식으로, 항체는 FVII(a)의 정태 농도를 올릴 수 있다.
일 구현예에서, 항-FVII(a) 항체는 FVII(a)의 생물학적 기능을 방해하지 않는다. 일 구현예에서, 항-FVII(a) 항체는 내인성 FVII가 FVIIa로 활성화되는 것을 방지하지 않는다. 예를 들어, 항-FVII(a) 항체는 (실시예 12에 기술된 바와 같이) TF에 결합되어 있는 동안, FVII이 FVIIa로 변환하는 (즉, 자동 활성화하는) 능력을 방해하지 않는다. 항-FVII(a) 항체는, FVII(a)가 조직 인자(TF)와 소위 개시 복합체를 형성하여 (실시예 10에 기술된 바와 같이) TF-의존적 또는 독립적인 방식으로 인자 X(FX)를 활성화하는 것을 방지하지 않는 것이 또한 바람직하다. 일 구현예에서, 항-FVII(a) 항체는 FVII(a) 기질 또는 보조 인자와 경쟁하지 않는다. 그러나, 항-FVII(a) 항체는 (실시예 11에 기술된 바와 같이) 항트롬빈(AT) 및 알파-2-마크로글로불린과 같은 FVIIa의 억제제와 경쟁할 수 있다.
항-TLT-1 항체
본원에서의 용어 "항-TLT-1 항체"는 TLT-1을 그의 표적으로 하는 항체를 지칭한다. 항-TLT-1 항체는 본원에 기술된 것과 같은 TLT-1 분자에 결합할 수 있다. TLT-1 항체는 단클론, 단일 특이적 항체일 수 있다.
적절한 항-TLT-1 항체는 표 4에 나타낸 항-TLT-1 항체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
항체 표적 VL
서열번호 		VH
서열번호 		불변 도메인
mAb0524 TLT-1 854 858 J
mAb0012 TLT-1 862 866 A
mAb0082 TLT-1 902 906 A
mAb1038 TLT-1 910 914 A
mAb1047 TLT-1 918 922 A
mAb1049 TLT-1 926 930 A
mAb0061 TLT-1 886 890 A
mAb0023 TLT-1 870 874 A
mAb0051 TLT-1 878 882 A
mAb0062 TLT-1 894 898 A
항-TLT-1 항체는 TLT-1에 결합하기 위해 표 4에 나타낸 항체 중 어느 하나와 경쟁할 수 있다. 항-TLT-1 항체가 TLT-1에 결합하기 위해 표 4에 나타낸 항체 중 어느 하나와 경쟁하는지 여부는 표면 플라스몬 공명(SPR), ELISA, 또는 유세포 계측법과 같은 잘 알려진 방법(즉, 경쟁 결합 검정)을 사용하여 결정될 수 있다. TLT-1에 대한 경쟁 결합은 경쟁 ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. 실시예 32은 경쟁 ELISA를 사용하여 TLT-1에 대한 경쟁 결합을 결정할 수 있는 방법을 기술한다.
항-TLT-1 항체는 이의 표적에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 KD를 가질 수 있다.
항-TLT-1 항체가 TLT-1의 기능을 방해하지 않고, 특히 혈소판 응집을 억제하지 않는 것이 바람직하다.
하나의 바람직한 구현예에서, 항-TLT-1 항체는 혈소판 응집을 방해하지 않고 TLT-1에 결합할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 항-TLT-1 항체는 TLT-1에 결합하기 위해 피브리노겐과 경쟁하지 않고 TLT-1에 결합할 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, TLT-1 항체는 TLT-1의 방출을 방해하지 않는다.
항-TLT-1 항체는 골수 세포(TREM) 상에서 발현된 TLT-1 이외에 임의의 다른 유발 수용체, 또는 휴지기 혈소판 또는 활성화된 혈소판 상의 임의의 다른 수용체에 결합하지 않거나 이에 대해 친화도를 거의 나타내지 않는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 항-TLT-1 항체는 TLT-1의 줄기에 결합한다.
이중 특이적 항-FVII(a)/항-TLT-1 항체
본 발명의 이중 특이적 항체는 FVII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및 TLT-1에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
항-FVII(a) 항원 결합 부위
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 FVII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 이중 특이적 항체의 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)에 결합하기 위해 표 3에 식별된 항-FVII(a) 항체 중 어느 하나와 경쟁하고; 표 3에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프를 가지고; 표 3에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 CDR 영역을 가지며; 표 3에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 VL 및 VH 영역을 갖는다.
항-TLT-1 항원 결합 부위
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 TLT-1에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 이중 특이적 항체의 제2 항원 결합 부위는 TLT-1에 결합하기 위해 표 4에 식별된 항-TLT-1 항체 중 어느 하나와 경쟁하고; 표 4에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 에피토프를 가지고; 표 4에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 CDR 영역을 가지며; 표 4에 식별된 항체 중 어느 하나와 동일한 VL 및 VH 영역을 갖는다.
변형된 효과기 기능
본 발명의 이중 특이적 항체는 야생형 아미노산 서열을 가질 수 있는 Fc 영역을 포함할 수 있거나, 항체의 효과기 기능을 조절하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다(예를 들어, Wang 등의 문헌[Protein Cell. 9(2018), pp. 63-73] 참조). 변형된 효과기 기능을 갖는 Fc 변이체의 구체적인 예는 Fc? 수용체에 대한 결합이 감소된 변이체이다. 이러한 변이체의 하나의 특정 예는 치환 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S(EU 지수에 따른 잔기 넘버링임)를 포함하고 특정 Fc? 수용체 및 C1q에 대한 친화도가 감소된 IgG1이다.
본 발명의 이중 특이적 항체의 원하는 특성은 긴 생체 내 반감기이다. Fc-영역을 포함하는 이중 특이적 항체는 재생되고 FcRn 수용체를 통해 구제되어, 궁극적으로 원하는 긴 반감기를 가질 수 있다. Fc-영역이 없는 본 발명의 이중 특이적 항체의 경우, 반감기는 다른 수단에 의해 연장될 수 있다. 폴리펩티드 및 항체의 연장된 반감기를 얻기 위한 상이한 방법 및 원리가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kontermann의 문헌[Expert Opinion on Biological Therapy, 16 (2016), pp. 903-915] 및 그 안의 참고문헌 참조).
폴리펩티드 및 항체의 Fc 기반 반감기 연장에 추가하여, 알부민 또는 알부민 변이체에 대한 융합 또는 접합이 반감기 연장에 있어서 효과적인 것으로 입증되었다. 또 다른 접근법은 XTEN 또는 PEG(삽입체 기준)와 같은 중합체를 부착하는 것이다. 또한, 연장된 생체 내 반감기는 알부민 결합 모이어티의 부착에 의해 수득될 수 있다(예를 들어, Tan 등의 문헌[Current Pharmaceutical Design 24 (2018), pp. 4932-4946]; Kontermann의 문헌[Expert Opinion on Biological Therapy, 16 (2016), pp. 903-915]; 및 Kontermann의 문헌[Current Opinion in Biotechnology 22 (2011), pp 868-876] 참조).
기능적 특징
FVII(a)에 결합함으로써, 본 발명의 이중 특이적 항체는 순환 중 FVIIa의 활성 순환 반감기를 연장시킬 수 있고; TLT-1에 결합함으로써, 이중 특이적 항체 및 결합된 FVII(a)는 활성화된 혈소판의 표면으로 유도된다. 이는 결국, 활성화된 혈소판 상에 FVIIa의 축적을 증가시키므로, 혈관 손상 부위에서 FVIIa 응고촉진 활성을 향상시킨다. 따라서, 본원에 기술된 이중 특이적 항체는 내인성 FVII(a)의 풀에 개선된 약동학적(PK) 및 약력학적(PD) 특성을 부여할 수 있다.
인간의 경우, 투여된 재조합 FVIIa의 활성 반감기는 약 2~3시간인 것으로 알려져 있다. 재조합 FVIIa의 짧은 반감기는 항트롬빈 III(AT)에 의한 억제, 알파-2-마크로글로불린(α2M)에 의한 억제, 및 신장에 의한 제거를 포함하는 여러 메커니즘의 관여로 인한 것으로 여겨진다. 내인성 FVIIa에도 유사한 메커니즘이 적용되어, 반감기가 짧아지는 것으로 여겨진다.
내인성 FVIIa의 반감기를 포함하여, FVIIa의 활성 반감기를 연장시키기 위해, 본원에 기술된 이중 특이적 항체는 항-FVII 아암 또는 소위 "제1 항원 결합 부위"에 의해 이들 제거 메커니즘 중 하나 이상을, 내인성 FVIIa 활성의 손실 없이 차단하는 것을 목표로 한다. biAb:FVIIa 복합체의 Fc 부분은, 엔도솜에서 및 FcRn에 대한 결합을 통해, 복합체의 재생을 매개하고 분해로부터 이를 구제하게 된다. 또한, 이중 특이적 항체의 고친화도 항-FVII 아암은, 유리 내인성 FVIIa의 크기 대비 biAb:FVIIa 복합체의 분자 크기 증가로 인해 α2M 억제 및 신장 제거로부터 내인성 FVIIa를 보호한다. 이중 특이적 항체의 항-TLT-1 아암은 연장된 내인성 FVIIa를 활성화된 혈소판에 선택적으로 국소화한다. 활성화된 혈소판에 FVIIa를 국소화하면 AT 억제에 대한 감수성을 증가시키지 않으면서 FVIIa 활성이 강화된다.
본 발명의 이중 특이적 항체는 내인성 또는 외인성 FVII(a)의 평균 체류 시간(MRT)을 증가시킬 수 있다. 이중 특이적 항체가 생체 내에서 FVII(a)의 활성을 강화시킬 수 있는 것이 바람직하다.
평균 체류 시간
평균 체류 시간(mean residence time, MRT)은 치료 활동에 이용할 수 있는 분자가 신체에 체류하는 평균 시간이다. MRT는 전신 제거율(CL)로 나눈 정태 분포용적(Vss)의 함수로서, 식 1에 따라 계산된다.
MRT = Vss/CL 식 1
결과는 시간으로 표현된다. MRT는 식 2에 따른 유효 혈장 반감기(t½)와 상관된다.
MRT = ln(2)*t1/2 식 2
항체가 FVII(a)의 MRT를 증가시키는 능력은 잘 알려진 방법, 예컨대 Gabrielsson와 Weinerin의 문헌[Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis: Concepts & Applications]에 기술된 방법들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 실험 동물(예: 마우스, 랫트, 또는 원숭이)에 IV 또는 SC 투여 후 FVII(a)의 혈장 농도 또는 활성 프로파일의 분석에 의해 결정할 수 있다. 항체가 FVII(a)의 기능적 MRT를 증가시키는 능력은 실시예 8에 기술된 FVIIa 활성 검정과 같은 (이에 한정되지는 않음) 검정으로 측정했을 때, FVII(a)의 혈장 활성 프로파일의 분석에 의해 결정될 수 있다.
항체가 MRT를 증가시키고 FVII(a)의 기능적 MRT를 증가시키는 능력은, 예를 들어 실시예 9 및 18에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는, 본 발명의 항체 없이 FVII(a)를 투여했을 때(FVII(a) 폴리펩티드만 투여했을 때)와 비교해 FVII(a)의 MRT를 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 40배 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는, 실시예 8에 기술된 FVIIa 활성 검정으로 측정했을 때, 본 발명의 이중 특이적 항체 없이 FVII(a)를 투여했을 때와 비교해 FVII(a)의 기능적 MRT를 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 40배 증가시킬 수 있다.
내인성 FVIIa의 축적
본 발명의 이중 특이적 항체가 순환하는 내인성 기능적 활성 FVIIa의 수준을 증가시키는 능력은, 예를 들어, 실시예 8에 기술된 FVIIa 활성 검정과 같은(이에 한정되지는 않음) 검정을 사용해 실험 동물(예: 마우스, 랫트, 또는 원숭이)에게 항체를 투여하기 전과 후에 내인성 FVIIa의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다.
항체가 순환하는 내인성 기능적 활성 FVIIa의 수준을 증가시키는 능력은, 예를 들어 실시예 27 및 28에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 순환하는 내인성 FVIIa의 수준을 이중 특이적 항체가 투여되지 않은 상태에서의 순환하는 내인성 FVIIa의 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 40배, 적어도 80배, 적어도 160배, 적어도 320배, 적어도 640배만큼 증가시킬 수 있다.
TLT-1-독립적 및 TF-독립적 트롬빈 생성
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 인자 VIIa가 TLT-1 독립적으로 및 TF-독립적으로 트롬빈을 생성하는 능력을 유지시키거나 증가시킬 수 있다.
항체가 FVII(a) 폴리펩티드의 트롬빈 생성을 증가시키는 능력은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어, 실시예 5에 기술된 바와 같은 트롬빈 생성 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 검정에서, 트롬빈 생성은 인지질, 25 nM FVIIa, 및 부가된 FVIIa의 포화에 가까운 농도의 항체의 존재 하에 A형 혈우병-유도 인간 혈장에서 측정된다. 예를 들어, 실시예 6에서 예시된 바와 같은 SPR에 의해 FVIIa-항체 상호작용에 대해 결정된 측정된 해리 상수에 따라 FVIIa의 >90%가 항체에 의해 결합될 때가 포화에 가깝다. 항체의 존재 및 부재 하의 피크 트롬빈 형성 비율에 기초하여, 항체는 자극성(>120%), 억제성(<90%), 또는 중성(90~120%)으로 분류된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 트롬빈 생성 검정에서 측정했을 때, 항체가 없는 상태에서의 FVII(a)와 비교하여 인자 VII(a) 폴리펩티드의 트롬빈 생성 능력을 유지(중성)/증가(자극)시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 트롬빈 생성 검정에서 측정했을 때, 항체가 없는 상태에서의 FVII(a)와 비교하여 인자 VII(a)의 트롬빈 생성 능력을 적어도 20%까지 증가시킬 수 있다.
항트롬빈 및/또는 알파-2-마크로글로불린에 의한 억제
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 항트롬빈(AT) 및/또는 알파-2-마크로글로불린에 의한 억제에 대한 FVIIa의 감수성을 감소시킬 수 있다.
항체가 항트롬빈(AT) 및/또는 알파-2-마크로글로불린에 의한 FVIIa의 억제를 감소시키는 능력은 실시예 5 및 11에 기술된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 항체가 없는 상태에서 FVIIa의 억제와 비교하여 항트롬빈(AT) 및/또는 알파-2-마크로글로불린에 의한 FVIIa의 억제를 감소시킬 수 있다.
TLT-1-의존성 FXa 생성(자극 활성 분석)
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 TLT-1-함유 응고촉진 막 표면의 존재 하에 FVIIa 폴리펩티드의 FX 활성화 촉진 능력을 유지시키거나 증가시킬 수 있다.
FVIIa 폴리펩티드의 FX 활성화 촉진 능력을 증가시키는 본 발명의 이중 특이적 항체의 능력은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 실시예 21에 기술된 바와 같은 TLT-1-의존성 자극 활성 분석에 의해 결정될 수 있다. 이 검정에서, FX 활성화는 FX(150 nM), FVIIa(2.5 nM), TLT-1(4 nM)를 함유하는 인지질 막, 및 항-FVII(a)/항-TLT-1 이중 특이적 항체의 존재 하에 측정된다. 이중 특이적 항체의 소위 자극 활성(배수 증가로 표현됨)은 이중 특이적 항체가 없는 상태에서 FVIIa에 의해 생성된 FXa의 양 대비 100 nM 이중 특이적 항체가 있는 상태에서 생성된 FXa의 양이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체의 자극 활성은 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 60배, 적어도 80배, 적어도 100배, 또는 적어도 150배이다.
TLT-1-의존성 전혈 혈전 형성
일 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 A형 혈우병 조건 하에서 치료 유효 농도의 재조합 FVIIa의 유사하거나 더 양호하게 혈전 형성을 촉진할 수 있다.
전혈 혈전 형성을 개선하는 이중 특이적 항체의 능력은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 실시예 29에 기술된 바와 같은 혈전탄성도 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 검정에서, 실시예 27, 28 및 29에 기술된 바와 같이 이중 특이적 항체의 반복 투여 시 상응하는 내인성 인자의 생체 내 정태 혈장 수준을 모방하는 농도에서 FVII, FVIIa, 및 FVIIa:AT와 함께 이중 특이적 항체가 첨가되는 인간 혈우병-A 유도 전혈에서 혈전 형성을 측정한다. 응고는 PAR1 작용제 펩티드인 SFLLRN 및 칼슘의 첨가에 의해 유도된다. 이러한 조건 하에서의 응고 시간을 항체가 없는 상태에서 25 nM FVIIa를 첨가함으로써 달성된 응고 시간과 비교한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 인간 A형 혈우병 유도 전혈에서, 25 nM FVIIa의 첨가에 의해 달성되는 것과 유사하거나 그 미만의 수준으로 응고 시간을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적 항체는 인간 A형 혈우병 유도 전혈에서, 2 nM FVIIa, 4 nM FVIIa, 6 nM FVIIa, 8 nM FVIIa, 10 nM FVIIa, 12 nM FVIIa, 16 nM FVIIa 또는 20 nM FVIIa의 첨가에 의해 달성되는 것과 유사하거나 그 미만의 수준으로 혈전 시간을 감소시킬 수 있다.
약학적 제형
일 양태에서, 본 발명은 본원에 이중 특이적 기술된 항체를 포함하는 조성물 및 제형을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 이중 특이적 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도, 예컨대 100~180 mg/ml의 농도로 존재하는 이중 특이적 항체를 포함하며, 상기 제형은 2.0 내지 10.0의 pH를 갖는다. 제형은 완충계(buffer system), 보존제, 등장화제(tonicity agent), 킬레이트제, 안정화제, 또는 계면활성제를 비롯하여 이들의 다양한 조합을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물에 보존제, 등장화제, 킬레이트제, 안정화제 및 계면활성제를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]를 참조할 수 있다.
일 구현예에서, 약학적 제형은 수성 제형이다. 이러한 제형은 통상적으로 용액 또는 현탁액이지만, 콜로이드, 분산액, 유화액, 및 다상 물질을 포함할 수도 있다. 용어 "수성 제형(aqueous formulation)"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 제형으로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액(aqueous solution)"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되며, 용어 "수성 현탁액(aqueous suspension)"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 동결 건조된 제형이며, 상기 제형은 사용 전에 의사 또는 환자가 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
추가 양태에서, 약학적 제형은 본원에 기술된 것과 같은 FVII(a) 폴리펩티드와 이중 특이적 항체의 수용액, 및 완충액을 포함하되, 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 제형은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 갖는다.
본 발명의 조성물은 비경구로, 예컨대 정맥 내, 예컨대 근육 내, 예컨대 피하 투여될 수 있으며; 바람직하게는 피하 투여된다. 본 발명의 조성물은 예방적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 응고병증 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 응고병증을 갖는 임의의 인간 환자 또는 비인간 척추동물을 포함한다.
의료적 사용
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 이를 필요로 하는 임의의 인간 또는 다른 동물 대상체의 의학적 요법을 지칭한다. 상기 대상체는 의사에게 신체 검사를 받았을 것이고, 상기 의사는 특정 치료제의 사용이 상기 인간 또는 다른 동물 대상체의 건강에 유익하다는 것을 나타내는 감별 진단(tentative diagnosis) 또는 확정 진단(definite diagnosis)을 내렸을 것으로 예상된다. 상기 치료의 시기 및 목적은 대상체의 현재 건강 상태에 따라 개인마다 다를 수 있다. 본 발명의 응고촉진 화합물의 방지적 또는 예방적 투여도 고려되며, 여기서 방지(prevention)는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발현 또는 악화를 지연시키거나 회피하거나 악화시키는 것으로서 정의된다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 완화적, 대증적("요구치료"), 및/또는 치유적일 수 있다.
본 발명의 관점에서, 예방적, 완화적, 및/또는 대증적 치료는 본 발명의 별도의 양태를 나타낼 수 있다.
출혈성 경향을 증가시키는 응고병증은 정상적인 응고 연쇄작용의 임의의 응고촉진 성분의 정성적 또는 정량적 결핍 또는 섬유소용해의 임의의 상향조절에 의해 야기될 수 있다. 이러한 응고병증은 선천성 및/또는 후천성 및/또는 의인성일 수 있고, 당업자에 의해 식별된다.
선천성 저응고병증의 비제한적인 예는 A형 혈우병, B형 혈우병, 인자 VII 결핍증, 인자 X 결핍증, 인자 X 결핍증, 인자 XI 결핍증, 폰 빌레브란트병, 및 글란즈만 혈소판무력증 및 베르나르-술리에 증후군과 같은 혈소판감소증이다.
후천성 응고병증의 비제한적인 예는 비타민 K 결핍으로 인한 세린 프로테아제 결핍증이며; 이러한 비타민 K 결핍은 와파린(warfarin)과 같은 비타민 K 길항제의 투여에 의해 야기될 수 있다. 후천성 응고병증은 광범위한 외상 후에 발생할 수도 있다. 달리 "혈액성 악순환"으로도 알려져 있는 이 경우는, 혈액희석(희석성 혈소판감소증 및 응고 인자의 희석), 저체온증, 응고 인자의 소비, 및 대사 이상(산증)을 특징으로 한다. 수액 요법 및 섬유소 용해 증가는 이러한 상황을 악화시킬 수 있다. 상기 출혈은 신체의 어느 부위에서든 발생할 수 있다.
"억제제"(즉, 인자 VIII 인자에 대한 동종 항체)를 가진 A형 혈우병 및 "억제제"(즉, 인자 IX에 대한 동종 항체)를 가진 B형 혈우병은 부분적으로 선천성이고 부분적으로 후천성인 응고병증의 비제한적인 예이다.
의인성 응고병증의 비제한적인 예는, 과도한 및/또는 부적절한 수액 요법에 의해 유도되는 것, 예컨대 수혈에 의해 유도될 수 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 출혈은 A형 혈우병과 관련이 있다. 본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에서, 출혈은 B형 혈우병과 관련이 있다. 바람직한 또 다른 구현예에서, 출혈은 후천성 억제제를 갖는 A형 또는 B형 혈우병과 관련이 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 출혈은 FVII 결핍과 관련이 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 출혈은 글란즈만 혈소판무력증과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 폰 빌레브란트병과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 중증 조직 손상과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 중증 외상과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 수술과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 출혈성 위염 및/또는 장염과 관련이 있다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 태반 조기 박리에서와 같은 과다 자궁 출혈이다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 두개 내, 이개 내, 또는 안구 내 출혈과 같이 기계적 지혈 가능성이 제한된 기관에서 발생한다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 항응고 요법과 관련이 있다.
또 다른 구현예에서, 출혈은 혈소판감소증과 관련이 있을 수 있다. 혈소판감소증을 앓고 있는 개체에게, 본원에 기술된 이중 특이적 항체가 혈소판과 공동 투여될 수 있다.
투여 경로
본원에 기술된 이중 특이적 항체는 비경구 투여, 바람직하게는 정맥내 및/또는 피하 투여에 적합할 수 있다. 피하 투여가 바람직한 투여 경로이다.
투여 요법
본원에 기술된 이중 특이적 항체의 생체이용률 및 반감기는, 후천성 및/또는 선천성 응고병증을 갖는 대상체의 예방적 피하 치료에 특히 매력적인 의약을 제공한다. 본원에 기술된 이중 특이적 항체는 후천성 및/또는 선천성 응고병증을 갖지만 출혈이 없는 대상체에게 매주 1회, 예컨대 2주마다 1회, 바람직하게는 매월 1회 투여될 수 있다. 본원에 기술된 이중 특이적 항체는, 응고병증을 가진 대상체로서 수술과 같은 침습적 절차가 예정된 대상체에게 수술-전 투여될 수 있다. 본원에 기술된 이중 특이적 항체는, 응고병증을 가진 대상체로서 수술과 같은 침습적 절차가 진행 중인 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기술된 이중 특이적 항체는 응고병증이 있거나 출혈 에피소드가 발생 중인 대상체의 대증 치료 또는 예방적 치료를 위해, 혈장 유래 또는 재조합 생산 FVIIa와 같은 외인성 FVIIa와 공동 투여될 수 있다.
응고병증이 있는 대상체에게 투여되는 투여량은 투여 경로, 예방적으로 또는 대증 치료용으로 투여되는지 여부, 및 개인 차에 따라 달라질 것이다. 피하 투여는 정맥내 투여보다 더 많은 투여량을 필요로 할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, 이중 특이적 항체는 1.0 내지 30.0 nmol/kg의 투여량으로 피하 투여된다.
본 명세서에 달리 언급되지 않는 한, 단수 형태로 제시된 용어는 복수인 형태도 포함한다.
구현예 목록
본 발명은 다음의 본 발명의 비 제한적 구현예 목록에 의해 추가로 기술된다:
1. 이중 특이적 항체로서,
(i) 인자 VII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및
(ii) TREM-유사 전사체 1(TLT-1)에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이적 항체.
2. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)에 결합하기 위해 표 3의 항-FVII(a) 항체 중 어느 하나와 경쟁하는, 이중 특이적 항체:
3. 구현예 1에 있어서, 항체는 실시예 7에 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA 검정에서 경쟁하는, 이중 특이적 항체.
4. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)(서열번호 1)의 아미노산 잔기 H115, T130, V131, 및 R392를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
5. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)(서열번호 1)의 아미노산 잔기 H115, T130, V131, 및 R392 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
6. 구현에 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 다음 FVII(a)(서열번호 1)의 아미노산 잔기 R113, C114, H115, E116, G117, Y118, S119, L120, T130, V131, N184, T185, P251, V252, V253, Q388, M391, R392를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
7. 구현에 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 다음 FVII(a)(서열번호 1)의 다음의 아미노산 잔기 R113, C114, H115, E116, G117, Y118, S119, L120, T130, V131, N184, T185, P251, V252, V253, Q388, M391, 및 R392 중 하나 이상을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
8. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는:
· 서열번호 847로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL1;
· 서열번호 848로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL2;
· 서열번호 849로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL3;
· 서열번호 851로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH1;
· 서열번호 852로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH2;
· 서열번호 853으로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH3.
9. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는:
· 서열번호 847로 표시된 CDRL1;
· 서열번호 848로 표시된 CDRL2;
· 서열번호 849로 표시된 CDRL3;
· 서열번호 851로 표시된 CDRH1;
· 서열번호 852로 표시된 CDRH2; 및
· 서열번호 853으로 표시된 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
10. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 표 13 또는 14에 열거된 항체에 따른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 서열을 포함하되, 친화도(KD)는 1 nM 이하인, 이중 특이적 항체.
11. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 표 13 또는 14에 열거된 항체에 따른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 서열을 포함하되, 친화도(KD)는 5 nM 이하인, 이중 특이적 항체.
12. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 표 13 또는 14에 열거된 항체에 따른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 서열을 포함하되, 친화도(KD)는 10 nM 이하인, 이중 특이적 항체.
13. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 표 13 또는 14에 열거된 항체에 따른 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 서열을 포함하되, 친화도(KD)는 25 nM 이하인, 이중 특이적 항체.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 항체는 FVII(a)에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 친화도(KD)를 갖는, 이중 특이적 항체.
15. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항체.
16. 구현예 15에 있어서, 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산 치환을 갖는, 이중 특이적 항체.
17. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는 TLT-1에 결합하기 위해 표 4의 항-TLT-1 항체 중 어느 하나와 경쟁하는, 이중 특이적 항체:
18. 구현예 17에 있어서, 항체는 실시예 32에 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA 검정에서 경쟁하는, 이중 특이적 항체.
19. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는 다음 TLT-1(서열번호 13)의 아미노산 잔기 K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20, A21을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
20. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 855로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL1;
· 서열번호 856으로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL2;
· 서열번호 857로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL3;
· 서열번호 859로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH1;
· 서열번호 860으로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH2;
· 서열번호 861로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
21. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 855로 표시된 CDRL1;
· 서열번호 856으로 표시된 CDRL2;
· 서열번호 857로 표시된 CDRL3;
· 서열번호 859로 표시된 CDRH1;
· 서열번호 860으로 표시된 CDRH2;
· 서열번호 861로 표시된 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
22. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 871로 표시된 CDRL1;
· 서열번호 872로 표시된 CDRL2;
· 서열번호 873으로 표시된 CDRL3;
· 서열번호 875로 표시된 CDRH1;
· 서열번호 876으로 표시된 CDRH2; 및
· 서열번호 877로 표시된 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
23. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 879로 표시된 CDRL1;
· 서열번호 880ㅇ,로 표시된 CDRL2;
· 서열번호 881로 표시된 CDRL3;
· 서열번호 883으로 표시된 CDRH1;
· 서열번호 884로 표시된 CDRH2; 및
· 서열번호 885로 표시된 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
24. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 895로 표시된 CDRL1;
· 서열번호 896으로 표시된 CDRL2;
· 서열번호 897로 표시된 CDRL3;
· 서열번호 899로 표시된 CDRH1;
· 서열번호 900으로 표시된 CDRH2; 및
· 서열번호 901로 표시된 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
25. 구현예 1에 있어서, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 이중 특이적 항체.
26. 구현예 25에 있어서, 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산 치환을 갖는, 이중 특이적 항체.
27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체는 TLT-1에 대해 1 pM 미만, 예컨대 10 pM 미만, 예컨대 100 pM 미만, 예컨대 200 pM 미만, 예컨대 400 pM 미만, 예컨대 600 pM 미만, 예컨대 1 nM 미만, 예컨대 5 nM 미만, 예컨대 10 nM 미만, 예컨대 20 nM 미만, 예컨대 50 nM 미만, 예컨대 100 nM 미만, 예컨대 200 nM 미만, 예컨대 400 nM 미만, 예컨대 600 nM 미만, 예컨대 800 nM 미만의 친화도(KD)를 갖는, 이중 특이적 항체.
28. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 항체는 Fc 영역을 포함하는, 이중 특이적 항체.
30. 구현예 29에 있어서, Fc 영역은 치환 L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S를 포함하는 IgG1의 Fc 영역의 Fc 변이체인, 이중 특이적 항체.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 항체는 항체의 항원 결합 단편의 융합체 또는 접합체인, 이중 특이적 항체.
32. 구현예 31에 있어서, 결합 단편 중 하나 이상은 Fab, Fab', Fab2, Fab'2, 및 scFv의 군으로부터 선택되는, 이중 특이적 항체.
33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 항체는 다중 특이적 항체인, 이중 특이적 항체.
34. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 5 및 4에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
35. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 943 및 942에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
36. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 7 및 6에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
37. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 4 및 5에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
38. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 942 및 943에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
39. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 6 및 7에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는, 이중 특이적 항체.
40. 구현예 1에 있어서, 항체는 FVII(a)에 결합하기 위해, 및 TLT-1에 결합하기 위해 표 5에 제시된 것과 같은 이중 특이적 항체 중 하나 이상과 경쟁하는, 이중 특이적 항체(여기서 불변 도메인 약어는 표 2a에 따라 정의됨):
biAb 항-FVII(a) mAb 항-TLT-1 mAb 불변 도메인
biAb0001 mAb0865 mAb1076 H
biAb0352 mAb0350 mAb0351 I
biAb0015 mAb0865 mAb1038 H
biAb0090 mAb0865 mAb1049 H
biAb0095 mAb0865 mAb1047 H
biAb0100 mAb0522 mAb0524 L
biAb0241 mAb0865 mAb0023 H
biAb0242 mAb0865 mAb0051 H
biAb0243 mAb0865 mAb0062 H
biAb0244 mAb0864 mAb1076 H
biAb0245 mAb0873 mAb1076 H
biAb0011 mAb0875 mAb1076 H
biAb0016 mAb0875 mAb1038 H
biAb0096 mAb0875 mAb1047 H
biAb0091 mAb0875 mAb1049 H
biAb0012 mAb0872 mAb1076 H
biAb0017 mAb0872 mAb1038 H
biAb0097 mAb0872 mAb1047 H
biAb0092 mAb0872 mAb1049 H
biAb0013 mAb0874 mAb1076 H
biAb0018 mAb0874 mAb1038 H
biAb0098 mAb0874 mAb1047 H
biAb0093 mAb0874 mAb1049 H
biAb0014 mAb0873 mAb1076 H
biAb0019 mAb0873 mAb1047 H
biAb0099 mAb0873 mAb1047 H
biAb0094 mAb0873 mAb1049 H
41. 구현예 38에 있어서, 항체는 경쟁 ELISA에서, FVII(a)에 결합하기 위해, 및 TLT-1에 결합하기 위해 표 5에 제시된 것과 같은 이중 특이적 항체 중 하나 이상과 경쟁하는, 이중 특이적 항체.
42. 구현예 38에 있어서, 항체는 실시예 7 및 실시예 32에 기술된 바와 같이 경쟁 ELISA 검정에서 경쟁하는, 이중 특이적 항체.
43. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 FVII(a)(서열번호 1)의 아미노산 잔기 H115, T130, V131, 및 R392를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 부위는 다음의 TLT-1(서열번호 13)의 아미노산 잔기 K8, I9, G10, S11, L12, A13, N15, A16, F17, S18, D19, P20, A21을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는, 이중 특이적 항체.
44. 구현예 1에 있어서, 제1 항원 결합 부위는:
· 아미노산 잔기(서열번호 847)로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL1;
· 아미노산 잔기(서열번호 848)로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL2;
· 아미노산 잔기(서열번호 849)로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL3;
· 아미노산 잔기(서열번호 851)로 표시되는 CDRH1;
· 아미노산 잔기(서열번호 852)로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH2;
· 아미노산 잔기(서열번호 853)로 표시되고, 0, 1, 2, 및 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH3을 포함하고,
제2 항원 결합 부위는:
· 서열번호 855로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL1;
· 서열번호 856으로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL2;
· 서열번호 857로 표시되고, 0, 1, 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 CDRL3;
· 서열번호 859로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH1;
· 서열번호 860으로 표시되고, 0, 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH2;
· 서열번호 861로 표시되고, 0 또는 1개의 아미노산 치환을 갖는 CDRH3을 포함하는, 이중 특이적 항체.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 항체는 실시예 8에 기술된 FVIIa 활성 검정으로 측정했을 때, FVII(a)의 기능적 MRT를 증가시키는, 이중 특이적 항체.
46. 구현예 41에 있어서, 항체는 본 발명의 이중 특이적 항체 없이 FVII(a)를 투여한 것과 비교하여, FVII(a)의 기능적 MRT를 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 또는 적어도 40배 증가시키는, 이중 특이적 항체.
47. 구현예 1 내지 구현예 46 중 어느 하나에 있어서, 항체는 실시예 27 및 28에 따라 결정했을 때, 투여된 이중 특이적 항체가 없는 상태에서의 순환하는 내인성 FVIIa의 수준과 비교하여, 순환하는 내인성 기능적 활성 FVIIa의 수준을 증가시킬 수 있는, 이중 특이적 항체.
48. 구현예 45에 있어서, 항체는 순환하는 내인성 기능적 활성 FVIIa의 수준을 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 40배, 적어도 80배, 적어도 160배, 적어도 320배, 적어도 640배만큼 증가시키는, 이중 특이적 항체.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 항체는 실시예 21에 기술된 것과 같은 자극 활성 검정에 의해 결정했을 때, FX 활성화를 촉진하는 FVIIa 폴리펩티드의 능력을 증가시킬 수 있는, 이중 특이적 항체.
50. 구현예 43에 있어서, 자극 활성은 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 60배, 적어도 80배, 적어도 100배, 또는 적어도 150배인, 이중 특이적 항체.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 따른 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 제형.
52. 구현예 1 내지 48에 있어서, 구현예 49에 따른 약학적 제형은 피하 투여에 의해 투여되는, 이중 특이적 항체.
53. 구현예 1 내지 48에 따른 이중 특이적 항체 또는 구현예 49에 따른 약학적 제형은 의약으로서 사용하기 위한 것인, 이중 특이적 항체.
54. 응고병증의 치료에 사용하기 위한 구현예 1 내지 48, 및 50 내지 51 중 어느 하나에 따른 이중 특이적 항체 또는 구현예 49에 따른 약학적 제형으로서, 상기 응고병증은 선천성 및/또는 후천성인, 이중 특이적 항체 또는 약학적 제형.
55. 구현예 52에 있어서, 상기 응고병증은 억제제가 있거나 없는 A형 혈우병 또는 억제제가 있거나 없는 B형 혈우병, FVII(a) 결핍증, 및 글란즈만 혈소판무력증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중 특이적 항체.
56. 구현예 1 내지 48, 및 50 내지 51에 있어서, 출혈을 치료하기 위한 이중 특이적 항체로서, 출혈은 선천성 또는 후천성 A형 혈우병, 선천성 또는 후천성 B형 혈우병, 억제제가 있는 A형 혈우병, 억제제가 있는 B형 혈우병, 또는 인자 VII(a) 결핍증과 관련이 있는, 이중 특이적 항체.
57. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 따른 이중 특이적 항체의 용도로서, 상기 이중 특이적 항체 또는 구현예 49에 따른 약학적 제형은 정맥 내, 근육 내 또는 피하 투여와 같이 비경구 투여되는, 용도.
실시예
실시예 1: 하이브리도마 기술을 사용한 항-FVII(a) 마우스 단클론 항체의 생성
국제 특허 출원 공개 번호 WO07/115953에 기술된 FVIIa Q64C-sTF(1-219) G109C 이황화-결합 복합체로 NMRCF1 마우스(Charles River)를 면역화하여 단클론 항체를 제조하였다.
마우스에게 FCA(Freund의 완전 보강제) 중 20 μg의 항원을 피하 주사로 초기 투여한 다음, IFA(Freund의 불완전 보강제) 중 20 μg 항원의 복강내 주사로 부스터 투여하였다. 비장을 무균 상태에서 제거하고 단일 세포 현탁액에 분산시켰다. 전기 융합을 사용해 비장세포를 X63Ag8.653 골수종 세포에 융합시켰다.
세포를 마이크로역가 플레이트에 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 선택용 HAT(Sigma)가 포함된 조직 배양 배지(RPMI 1640 + 10% 소태아 혈청)를 2회 변경하였다. 10일 동한 성장시킨 후, 하기 프로토콜을 사용하여 ELISA 스크리닝에 의해 특이적 항체-생산 하이브리도마 클론을 식별하였다. NUNC Maxiborb 플레이트를 FVIIa Q64C-sTF(1-219) G109C 이황화-결합 복합체, 또는 FVIIa(Thim 등의 문헌[(1988) Biochemistry 27:7785-7793] 및 Persson 등의 문헌[(1996) FEBS Lett 385:241-243]에 기술된 것과 같이 발현시키고 정제함)을 이용해 50 μl/웰(1 μg/ml)(5 mM CaCl2가 포함된 HEPES 완충액)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 5회 세척하고 세척 완충액(HEPES 완충액, 5 mM CaCl2, 0.05% TWEEN 20) 중에서 15분 동안 차단하였다. 50 μl 상청액을 각 웰에 옮기고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 5회 세척하고, 50 μl의 HRP-표지된 염소-항 마우스를 첨가하였다(Fc 감마 단편 특이적; Jackson의 권장 희석 배수 1/10000). 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 5회 세척하고, 50 μl TMB(TMB ONE ready to use; Kem-En-Tec)로 10분 동안 현상하였다. 50 μl의 4M H3PO4를 첨가하여 반응을 중단시키고, 450 및 620 nm에서 FLUOStar Optima 플레이트 판독기에서 판독하였다.
양성 결과를 산출하는 하이브리도마 세포를, 단클론성을 확보하기 위해 희석 배수를 제한하여 적어도 2회 서브클로닝하였다. 항체 정제는 표준 단백질 A 정제를 사용하여 수행하였다.
PK 연구에 사용하기 위한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 RPMI1640 + 10% FBS 배지에서 T-플라스크 또는 셰이커 플라스크 규모로 상향 조정하였다. 조정 배지를 원심분리에 의해 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하고, 이어서 탈염하였다.
실시예 2: 마우스 항-FVII(a) 항체의 클로닝 및 시퀀싱
본 실시예는 항-FVII(a) 항체의 가변 도메인을 암호화하는 쥣과 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) cDNA 서열의 클로닝 및 시퀀싱을 기술한다.
Qiagen의 RNeasy-Mini 키트를 사용해 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 이를 cDNA 합성을 위한 템플릿으로서 사용하였다. cDNA를 Clontech의 SMARTer RACE cDNA 증폭 키트를 사용해 5'-RACE 반응 키트에서 합성하였다. 이어서, HC의 가변 도메인(VH로 명명함) 서열 및 LC의 가변 도메인(VL로 명명함) 서열의 표적 증폭은, Phusion Hot Start 중합효소(Finnzymes)를 사용하고 SMARTer?? RACE 키트에 포함된 범용 프라이머 혼합물(UPM)을 정방향 프라이머로서 사용해 PCR에 의해 PCR에 의해 수행하였다. VH 증폭에 사용된 역방향 프라이머의 서열은 5' agctgggaaggtgtgcacac 3'였다. VL 증폭에 사용된 역방향 프라이머의 서열은 5' gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg 3'였다.
PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분리하고, GE Healthcare Bio-Sciences의 GFX PCR DNA & Gel Band 증폭 키트를 사용하여 추출하고, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 및 화학적으로 적합한 TOP10 E.coli(Invitrogen)를 사용하여 시퀀싱을 위해 클로닝하였다. 시퀀싱은 M13uni(-21)/M13rev(-29) 시퀀싱 프라이머를 사용하여 MWG Biotech(Martinsried Germany)에서 수행하였다. 모든 키트와 시약은 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
실시예 3: 2가 항체, 1가 항체(OA 항체), 및 항체 Fab 단편의 재조합 발현
2가 항체, 1가 항체(단일 아암형, OA-항체로 지칭함), 및 항체 Fab 단편을 HEK293 현탁 세포(293Expi, Invitrogen)의 일시적 형질감염을 사용해 발현시켰으며, 일시적 형질감염은 제조업체의 지침을 엄격하게 따랐다. 293Expi 세포는 1% P/S(GIBCO 카탈로그 번호 15140-122)로 보충된 Expi293F 발현 배지(Invitrogen, 카탈로그 번호 A1435104)에서 3 내지 4일마다 계대배양하였다. Expifectamine을 사용하여 Expi293F 세포를 2.5 내지 3백만개/mL의 세포 밀도로 형질감염시켰다. Expi293F 세포의 1리터마다, 총 1 mg의 플라스미드 DNA를 50 mL Optimem(GIBCO, 카탈로그 번호 51985-026, 희석물 A)에 희석시키고 2.7 mL Expifectamine을 50 mL Optimem(희석물 B)에 희석하여 형질감염을 수행하였다. VH-CH1-CH2-CH3 (HC) 및 VL-CL (LC) 플라스미드(1:1 비율)를 공동 형질감염시켜 2가 항체를 생산하였고, Fab 단편 플라스미드의 경우, VH-CH1 및 LC(1:1 비율)였다. OA 항체의 생산을 위해, 세포를 3개의 플라스미드, 즉 HC 플라스미드, LC 플라스미드, 및 절단된 HC(trHC)를 암호화하는 제3 플라스미드로 형질감염시켰다. OA-항체의 HC는 홀 돌연변이(T366S, L368A, Y407V) 및 trHC 노브(T366W) 돌연변이를 함유하였지만, 노브와 홀은 역전될 수도 있다. 노브/홀 돌연변이는 국제 특허 EP0979281B1에 기술되어 있고, 원하는 이종-이량체의 형성, 즉 HC와 trHC의 페어링을 최적화하고, 동종이량체의 원치 않는 형성, 즉 trHC와 trHC의 페어링 및 HC와 HC의 페어링을 억제하기 위해 도입된다. 희석물 A 및 B를 혼합하고 실온에서 10~20분 동안 배양하였다. 여기서부터, 형질감염 혼합물을 Expi293F 세포에 첨가하고, 세포를 37℃의 습윤된 인큐베이터 내에서 궤도 회전(85~125 rpm)시키면서 배양하였다. 형질감염 후 1일차에, 형질감염 세포를 5 ml의 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 및 50 ml의 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 2로 보충하였다. 세포 배양 상청액은 형질감염 후 4~5일차에 원심분리 후 여과에 의해 수확하였다.
2가 및 1가 항체를 당업자에게 알려진 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고, 필요한 경우, 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가 정제 단계를 수행하였다. Fab 단편을 Fab의 카파 사슬을 인식하는 친화도 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 4: 시험관 내 조립에 의한 이중 특이적 항체 및 OA 항체의 제조
시험관 내 조립에 의해 제조된 이중 특이적 항체
이중 특이적 항체는 Labrijn 등의 문헌[PNAS 2013, vol. 110, pp. 5145-5150]에 기술된 것과 유사하고, DuoBody® 기술(Genmab)로서 알려진 방법에 의해 2개의 부모 항체를 시험관 내에서 조립하여 생성하였다. 본 발명에서는 Labrijn 등이 사용한 IgG1 서브타입 대신에 IgG4를 사용하였다. 교환 반응은 75 mM 2-메르캅토에틸 아민(2-MEA)의 존재 하에 30℃에서 4시간 동안 수행하였다. 생성된 이중 특이적 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 이중 특이적 항체로부터 잔류 부모 항체를 분리하였다. 본 실시예에서, 제1 부모 항체의 중쇄 불변 영역(항-FVII(a))은 IgG4 S228P F405L R409K였고, 제2 부모 항체의 중쇄 불변 영역(항-TLT-1)은 IgG4 S228P였다(둘 다 EU 넘버링을 사용함). 경쇄 불변 도메인은 인간 카파였다. 2개의 부모 항체는 실시예 3에서 기술된 것과 같이 생산하였다. 이중 특이적 항-FVII(a)/항-TLT-1 항체는, 항-FVII(a) 항체의 불변 도메인이 IgG4 S228P이고 항-TLT-1 항체의 불변 도메인이 IgG4 S228P F405L R409K인 부모 항체 세트로부터 조립될 수도 있다.
시험관 내 조립에 의해 제조된 1가 항체
(1) 이중 특이적 항체를 형성하기 위해 2개의 항체를 조합하는 대신에, 항체와 trHC 이량체를 조합하여 1가 항체를 형성한 것을 제외하고는, 이중 특이적 항체에 대해 전술한 바와 같이 시험관 내 조립에 의해 1가 항체를 생성하였다. 본 실시예에서, trHC는 IgG4 S228P F405L R409K였고, HC는 IgG4 S228P였다(둘 다 EU 넘버링을 사용함). 경쇄 불변 도메인은 인간 카파였다. 전형적으로, 아암 교환 반응은 20~50% 몰 과량의 trHC 이량체로 수행하여 반응 혼합물 중 2가 항체의 양을 최소화하였다. 1가 항체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하고, 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가의 정제 단계에 의해 임의로 보충하였다.
실시예 5: 기능적 검정에서 항-FVIIa(a)의 시험관 내 특성 분석
내인성 FVIIa의 축적을 용이하게 하여 응고촉진 활성을 발휘할 수 있게 하기 위해서는, 본 발명의 항-FVII(a) 항체는 바람직하게는 FVIIa의 활성을 손상시키지 않아야 하며, 마찬가지로, 바람직하게는 이의 일차 혈장 억제제인 항트롬빈에 의해 FVIIa의 불활성화를 촉진하지 않아야 한다(Agersø H, 등의 문헌[(2011) J Thromb Haemost 9:333-338] 참조). 이들 양태를 연구하기 위해, 항-FVII(a) 항체가 FVIIa의 응고촉진 활성 및 항트롬빈에 의한 FVIIa의 불활성화에 미치는 효과를 아래에 기술된 검정을 사용하여 시험관 내에서 결정하였다.
A형 혈우병-유도 인간 혈장에서 항-FVII(a) 항체가 트롬빈 생성에 미치는 효과
2가 또는 1가 항-FVII(a) 항체가 트롬빈 생성에 미치는 효과는 96-웰 환경에서 카올린-유발 트롬빈 생성 검정(TGT)으로 측정하였다. 간략하게, A형 혈우병 유도 혈장은 항-hFVIII 항체 4F30(공개 번호 WO2012/035050의 국제 특허 출원에 기술됨)을 37.5 μg/ml의 최종 농도로 첨가하여 제조하였다. A형 혈우병 혈장에 인지질을 10 μM(Rossix)의 최종 농도로 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 정제된 항체(100 nM) 및 FVIIa(25 nM)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 항-FVII(a) 항체를 실시예 1, 2, 및 3에 기술된 바와 같이 생성하였다. 10 μl 카올린(Haemonetics)을 첨가한 다음, 10 μl FIIa FluCa-키트(Thrombinoscope BV)를 첨가하여 유발을 수행하고, EnVision 다중 표지 판독기 상에서 2시간 동안 형광(390 nm에서의 여기 및 460 nm에서의 방출)을 측정하였다.
트롬보그램을 측정된 형광의 평활화된 제1 유도체로서 계산하였다. 피크 트롬빈 높이를 트롬보그램의 최대값으로 계산하였다. 이어서, 이를 정규화하고; 관찰된 피크 높이를, 항체가 없을 때 25 nM FVIIa에 대해 관찰된 것에 상응하는 피크 높이로 나누어 백분율로서 표현하였다. 이에 기초하여, 항체를 자극성(>120%), 억제성(<90%) 또는 중성(90%-120%)으로 분류하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 모든 카테고리의 항체를 식별하였다. 바람직한 항체는 TGT 검정에서 자극성 또는 중성이었다.
혈장 유래 항트롬빈에 의한 FVIIa 불활성화에 항-FVII(a) 항체가 미치는 효과
2가 또는 1가 항-FVII(a) 항체의 존재 하에 혈장 유도 항트롬빈(AT)에 의한 FVIIa 활성의 억제는, 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.1% PEG8000, 1 mg/ml BSA, pH 7.3 중에서 저분자량 헤파린(Enoxaparin, 12 μM) 및 항체(200~1000 nM)와 FVIIa(200 nM)를 10분 동안 인큐베이션하여 측정하였다. 그런 다음, AT(5 μM)를 첨가하고, 10, 20, 30, 40, 60, 및 80분 시점에, 샘플을 새로운 마이크로역가 플레이트에 옮기고, 잔류 활성을 1 mM S-2288 발색성 기질(Chromogenix), 200 nM 가용성 조직 인자(sTF; Freskgard 등의 문헌[(1996) Protein Sci 5:1531-1540]에 의해 기술된 바와 같이 생산됨), 및 폴리브렌(0.5 mg/ml)의 존재하에 Spectramax 기기(Molecular Devices)를 이용해 405 nm에서 5분 동안 측정하였다. AT 대신에 완충액이 포함된 샘플은 억제되지 않은 FVIIa의 활성을 제공하였다.
잔류 아미도분해 활성을 억제제의 부재 시의 활성에 대한 시간의 함수로서 결정하였다. 억제 상수(kinh)는 데이터를 하나의 상 붕괴 모델에 피팅함으로써 추정하였다. 항체의 부재 시 결정된 kinh 값 중 FVII(a)-항체의 존재 시 kinh 값의 백분율을 kinh(%)라고 하며, 이는 표 6에서 각 항체에 대해 보고되어 있다.
추정 kinh(%)가 < 60%인 항체를 AT 억제로부터 FVIIa를 보호하는 것으로 분류하였다. 추정 kinh(%)가 60% 이상 및 150% 이하인 항체를 중성으로 분류한 반면, 추정 kinh(%)가 > 150%인 항체는 AT에 의한 FVIIa의 억제를 가속화하는 것으로 분류하였다. 표 6에 보고된 바와 같이, 모든 3가지 카테고리의 항체를 식별하였다. 바람직한 항체는 중성이거나 AT 억제로부터 FVIIa를 보호하였다.
시험된 항체 중에서, 11F2(완전한 쥣과 동물/인간 키메라에 각각 상응하는, mAbb005 및 mAb0048)를 포함하는 항체의 하위 집합은 전술한 것과 같은 원하는 시험관 내 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2에 기술된 바와 같은 트롬빈 생성(TGT) 검정 및 항트롬빈(AT) 억제 검정에서 항-FVII(a) 항체의 기능적 특성 분석.

항-FVII(a) 항체 		TGT 활성 (% FVIIa) TGT 활동에 기반한 순위 AT
억제
( k inh% ) 		AT에 기초한 순위
억제
mAb0048 n.d. 중화 109 중화
mAb0005 115 133
mAb0007 113 121
mAb0544 103 111
mAb0552 104 118
mAb0018 141 자극 525 가속화
mAb0004 75 억제 24 보호
mAb0001 109 중화 82 중화
mAb0578 91 중화 77 중화
mAb0587 93 중화 103 중화
mAb0013 128 자극 747 가속화
mAb7250 91 중화 23 보호
mAb0701 88 억제 26 보호
실시예 6: FVIIa에 대한 항체 결합 및 pH와 칼슘의 효과에 대한 SPR 분석
FVIIa에 대한 실시예 5의 항체의 결합을 표면 플라스몬 공명(Biacore T200)에 의해 프로브하였다. 표준 아민 결합 화학 키트(GE Healthcare)를 사용하여 CM4 센서 칩(GE Healthcare) 상에 항-쥣과 IgG(GE Healthcare)를 고정시켰다. 표 7에 따라 정제된 항-FVII(a) 항체(0.25 nM)fmf 10 μl/분의 유속으로 1분 동안 주입하였다. 이어서, 5, 15, 45, 및 135 nM의 FVIIa를 30 μl/분의 유속으로 7분 동안 주입하여 항-FVII(a) 항체에 결합시키고, 이어서 9분 동안 완충액을 주입하여 항-FVII(a) 항체로부터 해리시켰다. 10xHBS-P 완충액(GE Healthcare가 공급함)을 10배 희석하여 영동 완충액을 제조하고, 1 mg/ml BSA 및 5 mM CaCl2로 보충하여 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20(P20), pH 7.4, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 수득하였다. 영동 완충액은 항-FVII(a) 항체 및 FVII 샘플을 희석하는 데에도 사용하였다. 10 mM Gly-HCl pH 1.7(GE Healthcare가 공급함)로 이루어진 재생 완충액을 사용해 칩을 재생하였다. 결합 데이터는 제조사(Biacore AB, 스웨덴 웁살라)가 공급한 BiaEvaluation 4.1을 사용하여 1:1 모델에 따라 분석하였다. 분석 결과, 표 7에 보고된 결합 상수는 11F2를 포함하는 FVIIa에 대한 여러 항체(완전한 쥣과 및 쥣과/인간 키메라에 각각 상응하는 mAb005 및 mAb0048)의 고친화도 결합을 입증하였다.
FVIIa 및 cFVIIa-키메라에 대한 실시예 5의 선택 항체의 결합에 pH 및 CaCl2가 미치는 효과를 37℃에서 표면 플라스몬 공명(Biacore T200)에 의해 프로브하였다. cFVIIa-키메라 서열은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용이라는 제하의 섹션에 표시되어 있고, 실시예 16 및 26에 개략적으로 표현되어 된다. 표준 아민 결합 화학 키트(GE Healthcare)를 사용하여 CM4 센서 칩(GE Healthcare) 상에 항-쥣과 IgG(GE Healthcare)를 고정시켰다. 1.2 nM의 FVIIa 및 0.5 nM의 4F9(FVIIa EGF1 도메인에 결합하는 NN 내부 항-FVII 쥣과 Ab)의 사전 평형 혼합물을 10 μl/분의 유속으로 1분 동안 주입하였다. 이어서, 540, 180, 60, 20, 6.66, 2.22, 0.74, 0.25 nM의 항-FVII(a) 항체를 30 μl/분의 유속으로 7분 동안 주입하여 FVIIa에 결합시키고, 이어서 9분 동안 완충액을 주입하여 FVIIa로부터 해리시켰다. 2가지 영동 완충액을 제조하였다. 완충액 1은 10x HBS-P+ 완충액(GE Healthcare가 공급함)을 10배 희석하여 제조하고, 1 mg/ml BSA 및 5 mM CaCl2로 보충하여 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.4, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 수득하였다. 완충액 2는 10 xHBS-P+ 완충액(GE Healthcare가 공급함)을 10배 희석하여 제조하고, 1 mg/ml BSA, 5 μM CaCl2를 보충하고, pH를 6.0으로 조정하여(4 M HCl을 사용해 조정함) 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20, pH 6.0, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 수득하였다. FVIIa, 항-FVII 항체 4F9, 및 항-FVII(a) 항체를 2가지 영동 완충액 모두에서 별도로 희석하였다. 10 mM Gly-HCl pH 1.7(GE Healthcare가 공급함)로 이루어진 재생 완충액을 사용해 칩을 재생하였다. 결합 데이터는 제조사(Biacore AB, 스웨덴 웁살라)가 공급한 BiaEvaluation 4.1을 사용하여 1:1 모델에 따라 분석하였다. 분석 결과, 표 7b에 보고된 결합 상수는 FVIIa 항체와 항-FVII(a) 항체 간에 고친화도 결합이 유지됨을 입증하였다.
[표 7b]
실시예 7: 경쟁 ELISA에서 FVII(a)에 결합하기 위해 mAb0005(11F2)와 경쟁하는 항체의 식별
원하는 시험관 내 특성을 갖는 실시예 5의 항-FVII(a) 항체 및 이의 유도된 항체가 FVIIa(a)에 결합하기 위해 mAb0005(11F2)와 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상응하는 Fab 단편인 Fab0076와의 경쟁 연구를 수행하였다. FVIIa, H-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤(FFR-cmk; Bachem, Switzerland) 활성 부위 억제된 FVIIa(FVIIai; 실시예 9 참조)를 희석 완충액(20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl, pH 7.2C) 중 125 ng/ml의 농도로 NUNC 맥시소프 플레이트 상에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 플레이트를 세척하고 세척 완충액(20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mL/L Tween 20, pH 7.2)에서 15분 동안 차단하였다. 제조사의 지침에 따라 사용된 표준 비오티닐화 키트(EZ-Link, Thermo)를 사용해 11F2-Fab0076을 비오티닐화하였다. 경쟁 연구를 위해, 10 ng/ml의 최종 고정 농도로 비오티닐화된 Fab0076을 항-FVIIa(a) 항체의 연속 희석물과 조합하여 희석 완충액 중 100 mg/ml 내지 9.5 ng/ml 범위의 최종 농도를 제공하였다. 혼합물을 플레이트의 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고, HRP-표지된 스트렙타비딘-HRPO(희석 완충액 중 1:2000; Kirkegaard & Perry Labs)를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 세척하고 TMB ONE(KMENTEC)으로 10분 동안 현상하였다. H3PO4(4 M)를 첨가하여 반응을 중단시키고, 450 nm에서 FLUOStar Optima 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하고, 620 nm에서 측정된 배경 신호를 차감하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션을 실온에서 수행하였고, 플레이트는 세척 완충액을 사용하여 5회 세척하였다.
측정된 신호(OD 단위)로부터, 임의의 주어진 항체 농도에서의 경쟁을 다음과 같이 계산하였으며
억제 (%) = (1- (OD 단위 - 100% 억제)/(0% 억제 - 100% 억제))* 100
식 중, 0% 억제는 아무런 경쟁 항-FVII(a) 항체가 없는 웰의 신호로부터 결정하였고, 100% 억제는 비오티닐화된 Fab0076이 없는 웰의 신호(즉, 검정 배경에 상응하는 신호)로서 결정하였다. 최대 10000배 과량의 비오티닐화된 Fab0076에서 항체의 농도를 시험했을 때, 적어도 50%의 억제(억제(%))가 관찰되는 경우, 항체가 FVII(a)에 결합하기 위해 11F2(mAb0005)와 경쟁하는 것으로 간주하였다. 결과는 표 8에 요약되어 있다.
실시예 8: FVIIa 활성 분석
FVIIa 활성은 Morissey JH 등의 문헌[Blood, 1993; 81: 734-44]에 기술된 바와 같이 STAclot®VIIa-rTF 키트(Diagnostica Stago)의 시약을 사용해 측정하였다. 검정은 Instrumentation Laboratory의 ACLTOP500 자동화 응고 기기 상에서 수행하였다. 검정에는, 40 μl의 희석된 동물 혈장 샘플, 캘리브레이터(국제 WHO 기준에 대해 검교정된 재조합 FVIIa(rFVIIa) 기준 물질) 또는 40 μl의 FVII-결핍 혈장과 혼합된 정확도 검정(QC) 샘플, 및 인지질이 포함된 40 μl의 가용성 조직 인자(sTF)를 사용하였다. 40 μl 부피의 25 mM CaCl2를 첨가하여 반응을 개시하고, 기기로 응고 시간을 측정하였다. 샘플 응고 시간과 QC 응고 시간을, 혈장 간섭을 완화하기 위해 희석시킨 샘플과 동일한 농도의 혈장을 사용한 rFVIIa 검량선(calibration curves)에 대해 비교하였다. 검량선의 범위는 5~1000 mIU/mL이었고, 3차 다항식을 사용하여 피팅하였다. QC 결과 및 샘플 결과는 ACLTOP500 기기의 소프트웨어로 계산하였다. IU/mL 단위의 결과를 투여된 화합물의 특이적 활성(IU/pmol)을 사용해 nM로 변환하였다.
실시예 9: 랫트에서 항-FVII(a) 항체와 공동 제형화된 재조합 FVIIa의 약동학
원하는 시험관 내 특성을 갖는 실시예 5의 단클론 항-FVII(a) 항체를 20 nmol/kg 인간 FVIIa와의 공동 제형으로 수컷 스프래그 다울리 랫트에게 IV 투여하였다. FVIIa 대 항체의 몰비는 표 9에 나타낸 바와 같이 1:1 또는 1:5였다. 실험 동안, 동물이 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. FVIIa 혈장 활성은 실시예 8에 기술된 바와 같은 FVIIa 활성 검정을 사용하여 측정하였다.
약동학 분석은 WinNonlin을 사용하여 비구획 방법에 의해 수행하였다. 데이터로부터 평균 체류 시간(MRT)을 계산하였다. 결과는 표 9에 제공되어 있다.
바람직한 특성을 갖는 실시예 5의 항체 중에서, mAb0005(11F2) 및 mAb0001(11F26)은 인간 FVIIa에게 각각 7.9시간 및 7.5시간의 가장 긴 평균 체류 시간을 부여하였고, 이에 비해 유리 인간 FVIIa에게는 1.1시간의 유리 평균 체류 시간을 부여하였다(표 9 참조). mAb0005 및 mAb0001(mAb0759)은 FVII에 결합하기 위해 경쟁하는(실시예 7) 고친화도 항체이다(실시예 6).
표시된 바와 같이 20 nmol/kg의 FVIIa를 항체와 함께 1:1 또는 1:5의 몰비로 IV 투여한 후 스프래그 다우리 랫트에서 FVIIa 혈장 활성의 평균 체류 시간(MRT). 비히클은 FVIIa가 항체 대신에 완충액과 함께 투여되었음을 나타낸다.
항-FVII(a) 항체 FVIIa:항체 몰비 MRT (시간)
비히클 n.a. 1.1
mAb0005 1:5 7.9
mAb0007 1:1 3.9
mAb0018 1:5 1.1
mAb0004 1:5 3.6
mAb0001 1:1 7.5
mAb0587 1:1 4.0
mAb0578 1:1 4.2
실시예 10: 유리 FVIIa 또는 TF-복합체와 FVIIa에 의한 FX의 활성화에 11F2 항-FVII(a) 항체가 미치는 효과
바람직하게는, 본 발명의 항-FVII(a) 항체는 막 표면에서 FVIIa의 약리학적 작용 또는 응고 개시, 즉 FVIIa-TF 복합체에 의한 FX의 활성화를 방해해서는 안 된다. 이들 양태를 연구하기 위해, FVIIa의 TF-독립적 및 TF-의존적 단백질분해 활성에 11F2가 미치는 효과를 지질화 TF의 부재 또는 존재 하에 각각 결정하였다. 2개의 FVIIa 분자가 정상 2가 항체에 동시 결합함으로써 발생하는 결합능 효과를 피하기 위해 단일 아암 1가 항체 포맷을 사용하였다.
인지질 막의 존재 하에 FVIIa에 의한 FX 활성화에 11F2 항체가 미치는 효과
활성 측정은, 10 nM FVIIa, 0 또는 200 nM 항체(표 10 참조), 및 25:75비율의 포스파티딜 세린:포스파티딜 콜린 소포 25 μM(Haematology Technologies Inc.)를 함유하는 분석 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.3, 0.1% PEG8000, 및 1 mg/ml BSA)에서 수행하였다. 0~300 nM의 인간 혈장 유래 인자 X(FX)를 첨가하여 반응을 개시하고, 반응물을 96-웰 플레이트(n = 2)에서 100 μl의 총 반응 부피로 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 50 μl 퀀칭 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 80 mM EDTA, pH 7.3)을 첨가하여 반응을 퀀칭시킨 다음, 물 중 50 μl 1 mM S-2765 발색성 기질(Chromogenix)을 첨가하였다. 생성된 FXa에 의한 발색성 기질의 변환은 Spectramax 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 405 nm에서 10분 동안 선형 흡광도 증가의 기울기로서 측정하였다. 측정된 기울기를 알려진 양의 혈장 유래 인간 FXa와 유사한 조건 하에서 생성된 기울기와 연관시킴으로써, FXa 생성의 초기 속도를 몰 기준으로 추정할 수 있었다. 효소 동역학 파라미터는 데이터의 비선형 곡선을 GraphPad Prism을 사용하여 Michaelis-Menten 방정식(v = kcat * [FX] * [FVIIa-TF] / (Km + [FX])에 피팅하여 추정하였다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 1가 11F2는 인지질 소포의 존재 하에 유리 FVIIa에 의한 FX 활성화 속도에 영향을 미치지 않았다.
TF의 존재 하에 FVIIa에 의한 FX 활성화에 11F2 항체가 미치는 효과
활성 측정은 Smith 및 Morrissey에 의해 기술된 바와 같이(문헌[(2005) J. Thromb. Haemost., 2:1155-1162] 참조) 100 pM FVIIa, 0 또는 200 nM 항체(표 10 참조), 및 25:75 비율의 포스파티딜세린:포스파티디 콜린(PS:PC) 소포에 통합된 2 pM 대장균 유래 TF 단편 1-244를 함유하는 검정 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.3, 0.1% PEG8000, 및 1 mg/ml BSA)에서 수행하였다. 0~30 nM의 인간 혈장 유래 인자 X(FX)를 첨가하여 반응을 개시하고, 반응물을 96-웰 플레이트(n = 2)에서 100 μl의 총 반응 부피로 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응을 퀀칭시키고 FXa를 전술한 바와 같이 정량화하였다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 1가 11F2(mAb0077(OA))는 FVIIa/TF 복합체에 의한 FX 활성화 속도에 영향을 미치지 않았다.
실시예 10에 따른 FVIIa-TF 복합체에 의한 FX의 활성화를 위한 동역학 파라미터에 1가 포맷의 200 nM 11F2가 미치는 효과. 평균 ± SD(n = 3)로서 표시된 파라미터는 Michaelis-Menten 방정식에 피팅하여 추정하였다. kcat/KM은 항체가 없을 때 결정된 값에 대해 표시되어 있다.
11F2 항체 활성화제 K m
(nM) 		k cat
(초 -1 ) 		k cat / K M
(%)
없음 TF-FVIIa 3.9 ± 0.6 1.5 ± 0.1 100
mAb0077(OA) TF-FVIIa 3.9 ± 0.7 1.7 ± 0.1 110 ± 29
없음 FVIIa/PS:PC 137 ± 15 (2.8 ± 0.1) x 10-4 100
mAb0077(OA) FVIIa/PS:PC 89 ± 9 (2.6 ± 0.1) x 10-4 147 ± 5
실시예 11: 혈장 억제제에 의한 FVIIa의 억제에 11F2 항체가 미치는 효과
FVIIa는 순환 중 상대적으로 짧은 반감기를 나타내는데, 이는 부분적으로는 풍부한 혈장 억제제 항트롬빈(AT)에 의한 불활성화로 인한 것이다. 유사하게, 동물 연구는 FVIIa의 불활성화에 또 다른 혈장 억제제인 알파-2-마크로글로불린이 관련이 있음을 시사하였다. 정제된 혈장 유래 억제제를 사용하여, 이들 억제제에 의한 FVIIa의 불활성화에 1가 11F2 항체가 미치는 효과를 연구하였다.
항트롬빈에 의한 FVIIa의 억제에 11F2 항체가 미치는 효과
1가 11F2 항체(mAb0048, mAb0077(OA))의 존재 하에 인간 혈장 유래 AT에 의한 FVIIa를 억제를 위일차 조건(pseudo-first order conditions) 하에 수행하였다. 검정은, 200 nM FVIIa, 12 μM 저 분자량 헤파린(Enoxaparin, European Pharmacopeia Reference, Code E0180000, 배치 5.0, Id 00CK18) 및 0 또는 1000 nM 항체를 함유하는 분석 완충액(50 mM HEPES, 100 mM Nacl, 10 mM CaCl2, 0.1% PEG8000, 1 mg/ml BSA, pH 7.3) 중에서 200 μl의 부피로 실온에서 수행하였다. 10분간 사전 인큐베이션한 후, 5 μM AT(항트롬빈 III, Baxter, 로트 VNB1M007; 헤파린-세파로오스 컬럼에서 정제하여 제형으로부터 혈청 알부민을 제거함)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 선택된 시점에, 10 μl 분취물을 0.5 mg/ml 폴리브렌(Hexadimethrine Bromide, Sigma, 카탈로그 번호 H9268, 로트 SLBC8683V), 200 nM sTF, 및 1 mM S-2288(Chromogenix)이 포함된 200 μl의 총 부피로 옮겨, 반응을 퀀칭하고 sTF로 FVIIa를 포화시켜, 이로부터 405 nm에서 5분 동안 모니터링한 발색성 기질의 가수분해로부터 잔류 FVIIa 활성을 측정하였다. 잔류 아미도분해 활성은 블랭크를 차감한 후 선형 진행 곡선의 기울기로서 결정하였고, 이어서 이를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 1차 지수 붕괴 함수에 피팅하여 반응에 대한 위 1차 속도 상수(kapp)를 유도하였다. 겉보기 2차 속도 상수(kinh)는 kapp을 AT 농도로 나눈 값으로 추정하였다.
이 분석으로부터, 1가 11F2(mAb0077(OA))의 존재 시 FVIIa의 억제 속도는, 유리 FVIIa의 억제가 124 ± 7 M-1s-1인 것과 비교해 133 ± 10 M-1s-1인 것으로 밝혀졌다.
알파-2-마크로글로불린에 의한 FVIIa의 억제에 11F2 항체가 미치는 효과
0 또는 1000 nm의 1가 11F2 항체(mAb0077(OA))의 존재 하에 인간 혈장 유래 알파-2-마크로글로불린에 의한 FVIIa를 억제를 위일차 조건 하에 수행하였다. 검정은, 200 nM FVIIa 및 0 또는 1000 nM 항체를 함유하는 분석 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG8000, 0.01% Tween 80, pH 7.3) 중 100 μl의 부피로 실온에서 수행하였다. Bannbula 등의 문헌[(2005) J. Biochem., 138:527-537]에 따라 인간 혈장으로부터 정제한 0 또는 1000 nM의 알파-2-마크로글로불린을 첨가하여 반응을 개시하였다. 선택된 시점에, 10 μl 분취물을 200 nM sTF 및 1 mM S-2288(Chromogenix)이 포함된 190 μl 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG8000, 1 mg/ml BSA, pH 7.3)에 옮기고, 이로부터 405 nm에서 5분 동안 모니터링한 발색성 기질의 가수분해로부터 잔류 FVIIa 활성을 측정하였다. 잔류 아미도분해 활성은 블랭크를 차감한 후 선형 진행 곡선의 기울기로서 결정하였고, 이어서 이를 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 1차 지수 붕괴 함수에 피팅하여 반응에 대한 위 1차 속도 상수(kapp)를 유도하였다. 겉보기 2차 속도 상수(kinh)는 kapp을 알파-2-마크로글로불린 농도로 나눈 값으로 추정하였다.
항체 부재 시, 알파-2-마크로글로불린에 의한 FVIIa의 억제에 대한 겉보기 2차 속도 상수는 475 ± 21 M-1s-1인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 1가 11F2 항체(mAb0077(OA))의 존재 시, 125분차의 마지막 시점까지 FVIIa의 명백한 억제는 관찰되지 않았다. 이들 연구로부터, 11F2는 항트롬빈에 의한 FVIIa의 억제에 영향을 미치지 않지만, 알파-2-마크로글로불린에 의한 억제로부터 FVIIa를 보호한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 12: FVII 자가 활성화에 11F2 항체가 미치는 효과
혈관 손상 시, 내인성 FVII는 혈관 내피를 둘러싸는 세포에 노출되는 이의 보조인자 조직 인자(TF)에 높은 친화도로 결합한다. 이러한 과정 동안, FVII는 제한된 단백질분해에 의해 FVIIa로 변환된다. 활성화는 TF-매개 FVIIa-FVII 전사촉진의 결과로서 발생하는 것으로 여겨지며, 이는 자가 활성화로도 지칭된다. FVII 자가 활성화에 11F2 항체가 미치는 효과를 결정하기 위해, 지질화 TF, FVII, 제한 농도의 FVIIa, 및 1가 11F2 항체의 존재 하에 FVII의 활성화를 측정하였다.
활성 측정은, 2 nM FVIIa, 145 nM FVII, 0 또는 200 nM 1가 11F2 항체(mAb0077(OA))를 함유하는 분석 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG8000 및 1 mg/ml BSA 함유, pH 7.3)에서 수행하였다. Smith 및 Morrissey의 문헌[(2005) J. Thromb. Haemost., 2:1155-1162]에 기술된 바와 같이 25:75 비율의 PS:PC 소포에 혼입된 2 nM의 지질화된 대장균 유래 TF 단편 1-244를 첨가하여 반응을 개시하였다. 총 반응 부피는 100 μl였다. 선택된 시점(통상적으로 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 및 60분)에, 생성된 FVIIa를 후술하는 서브샘플링 절차에 따라 정량화하였다.
서브샘플링에 의한 FVIIa의 정량화 - 선택된 시점에, 10 μl 샘플을 0.1% PEG8000, 1 mg/ml BSA, 및 215 nM 가용성 조직 인자(sTF)가 포함된 140 μl 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA로 옮겨 퀀칭시켰다. 모든 샘플을 수집한 후, 60 mM CaCl2 중 50 μl S-2288(4 mM)을 첨가하여 FVIIa 발색 활성을 측정하였다. 생성된 FVIIa에 의한 발색성 기질의 변환은 Spectramax 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 10분 동안 선형 흡광도 증가의 기울기로서 측정하였다. 측정된 기울기를 알려진 양의 FVIIa와 유사한 조건 하에서 생성된 기울기와 연관시킴으로써, FVIIa의 몰 농도를 추정할 수 있었다.
FVIIa 자가 활성화는 TF-의존적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 표 11에서 측정된 FVIIa 활성이 1가 11F2 항체의 존재에 의해 손상되지 않는 것으로 나타났다.
200 nM 1가 11F2 항체 mAb0077(OA)의 부재 또는 존재 하에 실시예 12에 따른 FVIIa의 TF-매개 자가 활성화
시간
(분) 		활성
항체 없음 		활성
mAb0077(OA)
5 5.5 ± 0.1 6.0 ± 0.1
10 9.2 ± 0.1 11.2 ± 1.3
20 23.6 ± 1.1 27.6 ± 1.8
30 45.6 ± 1.6 52.7 ± 3.6
40 71.1 ± 2 78.2 ± 4.1
50 87.8 ± 1.4 100.0 ± 5.4
실시예 13: 활성 부위가 억제된 FVIIa 및 가용성 조직 인자와의 복합체에서 11F2-Fab0076의 결정 구조
FVII(a) 상에서 쥣과 항체 11F2에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위해, H-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤(FFR-cmk; Bachem, Switzerland) 활성 부위 억제된 FVIIa(FVIIai) 및 가용성 조직 인자 단편 1-219(sTF)와의 복합체에서 상응하는 Fab 단편(Fab0076)을 Kirchhofer. D. 등의 문헌[Proteins Structure Function and Genetics. (1995), 22, 419-425]에 따라 현적법(hanging-drop method)을 사용해 결정화하였다.
결정화
FVIIai/sTF 복합체와 1:1 몰비로 혼합된 Fab0076의 결정체를 18℃에서 현적 증기 확산 기술을 사용하여 성장시켰다. 10 mM HEPES, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.0 중 1 μl 4.6 mg/ml 단백질 복합체의 단백질 용액을 0.5 μl 100 mM 구연산나트륨, pH 6.2 및 침전제로서 20% PEG 6000과 혼합하고, 1 ml의 침전제 용액을 이용해 18℃의 온도에서 인큐베이션하여 복합체의 결정을 수득하였다.
회절 데이터 수집
결정은 액체 질소 중에서 급속 냉각(flash cooling)하기 전에 75 mM 구연산나트륨, pH 6.2, 15% PEG 6000, 4% 글리세롤, 4% 에틸렌 글리콜, 4.5% 수크로오스, 및 1% 글루코오스로 이루어진 용액 중에서 동결보호하였다. Mar Research의 marCCD225 검출기를 사용하여 MAX-lab(Lund, Sweden) 빔라인 I911-3으로 100K에서 회절 데이터를 수집하였다. 데이터 자동 색인, 통합 및 스케일링은 XDS 패키지의 프로그램을 사용해 수행하였다(회절 데이터 통계는 표 12에 요약되어 있음).
구조 결정 및 정제
구조는, 단백질 데이터 뱅크 엔트리 1YY8 및 단백질 데이터 뱅크 엔트리 3ELA의 사슬 A와 B를 사용해 프로그램 패키지 Phenix에서 구현된 바와 같이, 페이저(Phaser)를 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다. 비대칭 유닛은 2개의 Fab:FVIIai/sTF 복합체를 함유한다. 이 모델은 COOT에서 페닉스(Phenix) 정제 및 수동 재구성의 단계들을 사용하여 정제하였다. 정제 통계는 표 12에서 확인할 수 있다.
활성 부위 억제된 FVIIa, 가용성 조직 인자(sTF), 및 Fab0076 간 복합체의 X-선 결정학적 구조 결정으로부터 데이터 수집 및 정제 통계. 가장 높은 해상도 셸에 대한 통계는 괄호 안에 도시되어 있다.
Fab0076/FVIIai/sTF
파장 (Å) 1.0000
해상도 범위 47.88 - 3.02 (3.128 - 3.02)
공간군 P 21 21 21
단위 셀 101.02 149.02 179.86 90 90 90
총 반사 842454 (26830)
고유 반사 53490 (5172)
다중도 15.7 (5.1)
완성도(%) 99 (99)
평균 I/시그마(I) 4.45 (0.39)
Wilson B-인자 65.28
R-merge 0.8138 (4.973)
R-meas 0.8409 (5.535)
R-pim 0.2063 (2.382)
CC1/2 0.967 (0.14)
CC* 0.992 (0.496)
정제에 사용된 반사 53375 (5172)
R-free에 사용된 반사 1995 (193)
R-work 0.2820 (0.4497)
R-free 0.3393 (0.4832)
CC(work) 0.897 (0.319)
CC(free) 0.846 (0.303)
비-수소 원자 수 15284
거대분자 15224
리간드 59
용매 1
단백질 잔기 1966
RMS(결합) 0.003
RMS(각도) 0.59
라마찬드란 선호도 (%) 91
라마찬드란 허용도 (%) 7.3
라마찬드란 이상치 (%) 1.2
회전 이성질체 이상치 (%) 1.6
클래시스코어(Clashscore) 2.37
평균 B-인자 102.32
거대분자 102.32
리간드 104.51
용매 0.00
TLS 군의 수 78
에피토프(Fab0076 내의 비-수소 원자로부터 4 Å 이하의 거리 내에 위치된 비-수소 원자를 갖는 FVIIai 내의 잔기로서 정의됨)는 서열번호 1에 따른 다음의 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다:
R113
C114
H115
E116
G117
Y118
S119
L120
T130
V131
N184
T185
I186
P251
V252
E265
M391
R392
E394
파라토프(FVIIai 내의 비-수소 원자로부터 4 Å 이하의 거리 내에 위치된 비-수소 원자를 갖는 Fab0076 내의 잔기로서 정의됨)는 다음의 경쇄 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다:
Q27
G28
S30
D31
Y32
K49
Y50
Q53
H92
S93
F94
(서열번호 64에 따름)
및 중쇄 잔기:
D32
Y54
N59
N101
Y102
Y103
G104
N105
(서열번호 63에 따름).
실시예 14: 쥣과 11F2의 인간화
쥣과 항체 11F2(mAb0005)의 FVII(a)에 대한 고 결합 친화도를 보존하면서 이를 서열번호 754 및 서열번호 750에 각각 상응하는 VH 및 VL 도메인 서열로 인간화하기 위해, 인간 생식선에 관한 서열 동일성, Fab0076(실시예 12)과 활성 부위 억제된 FVIIa(실시예 9) 간의 복합체의 결정 구조에 대한 정보를 비롯하여 시험관 내 데이터도 조합하였다. 초기에, 블라스트 알고리즘을 사용하여 11F2의 쥣과 가변 도메인 서열에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 (중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 둘 다에 대한) VH, VL, 및 VJ을 인간 생식선의 데이터베이스에서 검색하였다. HC의 VH에 대한 서열 동일성이 가장 높은 서열은: IGHV4-30-4*01, IGHV4-28*01, IGHV4-28*06, 및 IGHV459*01이었고, HC의 VJ 분절의 경우 상위 생식선은: IGHJ5*01, IGHJ4*01이었다. LC의 경우, VL에 대한 상위 서열은: IGKV6D-41*01 및 IGKV3-11*01이었고, VJ-분절의 경우: IGKJ2*01 및 IGKJ2*02이었다(표 12). 다음으로, 인간 생식선과 쥣과 VH 및 VL 서열 간의 차이를 Fab0076/FVIIa 복합체의 결정 구조 상에 맵핑하였다. 에피토프 내의 잔기로부터 10 Å 이상의 거리만큼 분리된 쥣과 가변 도메인 내의 잔기는 결합 친화도에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않을 것으로 예상하고, 이들을 상응하는 인간 생식선 아미노산 엔티티로 교환하였다. 결과적으로, 파라토프를 구성하는 잔기는 친화도에 영향을 미치지 않고 치환하기에는 많은 문제가 있는 것으로 간주되었고, 여기서 쥣과 아미노산 엔티티를 보존하였다. 결합 친화도에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 결합 계면 근처의 잔기의 하위 집합을 식별하였다. 에피토프의 원위에 있는 잔기를 생식선 정렬에서의 인간 아미노산 엔티티로 돌연변이시켜 인간화 변이체를 생성하였다. 또한, 파라토프에 가까운 잔기를 하위 집합의 인간 개체로 돌연변이시켜 가능한 한 인간 생식선에 가까운 변이체를 만들었다. 세포에 포함한 것은, 쥣과 CDR이 HC 및 LC로 이루어진 완전한 인간 생식선 상에 이식된 변이체였다. 초기 분석으로부터, 12개의 LC 및 13개의 HC를 생성하고 표 13에 따라 23개의 변이체로 페어링하였다.
(표 13에 열거된) FVIIa에 대한 결합 친화도를 바이오층 간섭계(Fortebio)를 사용하여 인간화 항체에 대해 측정하였다. 모든 단계는 30℃의 영동 완충액(20 mM HEPES 완충액(pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.03% Tween 20, 1 mg/ml IgG-무함유 BSA)에서 수행하였다. 항체는 항-인간 팁(AHC, Fortebio) 상에 10 ug/ml의 농도로 3분 동안 포획하였다. 이어서 3분 동안 인큐베이션하여 베이스라인을 확립하였다. 이어서, 4가지 상이한 농도의 FVIIa(25 nm, 50 nM, 100 nM, 및 200 nM)를 사용하여 3분 동안 결합을 모니터링하고, 이어서 3분 동안 해리를 모니터링하였다. Fortebio 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 센서그램을 분석하였다. Fortebio 데이터를 사용하여 순위를 매겼는데, 절대 친화도 값은 SPR에 의해 결정된 값으로부터 벗어날 수 있다(실시예 6, 표 7).
[표 12]
쥣과 동물 11F2-mAb0048의 인간화 1회차에서 VH와 VL을 FVIIa에 대한 상응하는 항체의 측정된 친화도(본원에 기술된 바와 같이 결정됨)로 페어링하기. 일부 변이체의 경우, 결합 없음(nb)이 측정되었다.
항체 서열번호 (VH) 서열번호 (VL) K D (nM)
mAb0108 74 70 nb
mAb0109 82 78 11
mAb0110 90 86 4.2E+4
mAb0111 98 94 nb
mAb0112 106 102 13
mAb0113 114 110 1.8
mAb0114 122 118 1.5
mAb0115 130 126 1.5
mAb0116 138 134 32
mAb0117 146 142 1.4
mAb0118 154 150 1.7
mAb0119 162 158 1.0
mAb0120 170 166 1.7
mAb0121 178 174 2.0
mAb0122 186 182 1.7
mAb0123 194 190 5.8
mAb0124 202 198 1.8
mAb0125 210 206 1.7
mAb0126 218 214 2.5
mAb0127 226 222 nb
mAb0128 234 230 1.7
mAb0129 242 238 2.2
mAb0130 250 246 1.8
모체 쥣과 항체보다 동등하거나 더 높은 친화도를 갖는 변이체를 인간화 1회차에서 식별하였는데, 결합 친화도를 보존하거나 개선하는 것으로 밝혀진 돌연변이를 사용하여 변이체의 2회차를 설계하였다. 이미 원하는 친화도를 가진 인간화 HC 및 LC 외에 이들 돌연변이만큼 많은 수의 돌연변이를 삽입하여 이 돌연변이 세트로부터 변이체 2회차를 생성하였다. 분석으로부터, 19개의 VH 서열(서열번호 314, 514, 522, 530, 538, 546, 554, 562, 570, 578, 586, 594, 602, 610, 618, 626, 634, 642, 및 650에 상응함) 및 25개의 VL 서열(서열번호 310, 318, 326, 334, 342, 350, 358, 366, 374, 382, 390, 398, 406, 414, 422, 430, 438, 446, 454, 462, 470, 478, 486, 494, 및 502에 상응함)을 설계하고, 모든 VL과 VL을 조합하여 총 475개의 조합을 생성함으로써 이들 서열을 실험적으로 시험하였다. 전술한 바와 같이, 바이오층 간섭계(Fortebio)를 사용하여 생성된 475개의 인간화 항체에 대해 FVIIa에 결합하기 위한 해리 상수(KD) 값을 측정하였다. 측정된 KD 값은 표 14에 열거되어 있다.
인간화 11F2 변이체의 SPR 분석
선택된 인간화 11F2 변이체의 친화도는 실시예 6에 상술된 바와 같이 SPR 분석에 의해 결정하였다. 측정된 해리 상수는 표 15에 열거되어 있으며, 이는 변이체가 인간 FVIIa에 대한 고친화도 결합을 유지함을 보여준다.
실시예 6에 따라 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 결정했을 때, 1가 포맷의 인간화 11F2 항체 및 biAb와 FVIIa의 상호작용에 대한 추정 결합 상수(K D).

항-FVII(a) 항체 		K D (M)
mAb0077(OA) 4.1E-11
mAb0099(OA) 1.2E-10
mAb0138(OA) 1.3E-10
mAb0140(OA) 8.3E-11
mAb0141(OA) 7.8E-11
mAb0142(OA) 1.0E-09
mAb0143(OA) 7.9E-11
mAb0705(OA) 5.05E-11
mAb0706(OA) 5.42E-11
mAb0707(OA) 1.06E-10
mAb0709(OA) 1.04E-10
mAb0710(OA) 1.28E-10
biAb0001 0.06E-09
biAb0245 600E-09
인간화 11F2 변이체의 기능적 특성 분석
FVIIa의 활성 및 항트롬빈에 의한 억제에 대한 감수성에 선택된 인간화 11F2 변이체가 미치는 효과를 실시예 5에 상술된 바와 같이 결정하였다. 결과는 표 16에 열거되어 있으며, 이는 인간화 변이체가 이들 파라미터에 대해 바람직한 특성을 유지함을 보여준다.
실시예 5에 기술된 바와 같은, 트롬빈 생성(TGT) 검정 및 항트롬빈(AT) 억제 검정에서 항-FVII(a) 항체의 기능적 특성 분석.

항-FVII(a) 항체 		TGT 활성 (% FVIIa) AT
억제
( k inh% )
mAb0077(OA) 103 119
mAb0099(OA) 98 117
mAb0137(OA) 102 105
mAb0138(OA) 99 105
mAb0139(OA) 100 110
mAb0140(OA) 100 106
mAb0141(OA) 103 109
mAb0142(OA) 106 114
mAb0143(OA) 107 109
mAb0705(OA) 100 129
mAb0706(OA) 101 132
mAb0707(OA) 102 129
mAb0709(OA) 103 137
mAb0710(OA) 102 136
랫트에서 인간화 11F2 변이체와 공동 제형화한 FVIIa의 약동학
실시예 9에 상술한 바와 같이, 인간화 11F2 변이체 패밀리를 20 nmol/kg의 FVIIa와 공동 제형으로 수컷 스프래그 다울리 랫트에게 IV 투여하였다.
결과는 표 17에 제공되어 있으며, 이는 인간화 11F2 변이체 중 몇 개는 부모 항체와 동일한 긴 반감기를 FVIIa에 부여함을 보여준다.
20 nmol/kg의 FVIIa를 항체와 함께 상이한 몰비로 IV 투여한 후 스프래그 다우리 랫트에서 FVIIa 혈장 활성의 평균 체류 시간(MRT). 값은 평균 ± SD, n=3, n.a.: 해당 없음
항-FVII(a) 항체 FVIIa:항체 몰비 MRT (시간)
비히클 n.a. 1.1
mAb0005 1:5 7.9
mAb0077(OA) 1:1 11 ± 0.2
mAb0099(OA) 1:1 7.7 ± 0.4
mAb0137(OA) 1:1 7.0
mAb0139(OA) 1:1 2.7
mAb0140(OA) 1:1 7.7
mAb0141(OA) 1:1 7.7
mAb0705(OA) 1:1 7.7 ± 0.4
mAb0706(OA) 1:1 7.3 ± 0.3
mAb0707(OA) 1:1 6.4 ± 1.0
mAb0709(OA) 1:1 5.9 ± 0.4
mAb0710(OA) 1:1 5.7 ± 0.3
실시예 15: 활성 부위 억제된 FVIIa 및 가용성 조직 인자와의 복합체에서 11F2 Fab0883의 결정화 및 에피토프 맵핑.
FVII(a) 상에서 인간화 11F2, 즉 mAb0705(OA) 및 mAb0842(OA)에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위해, H-D-Phe-Phe-Arg 클로로메틸 케톤(FFR-cmk; Bachem, Switzerland) 활성 부위 억제된 FVIIa(FVIIai) 및 가용성 조직 인자 단편 1-219(sTF)와의 복합체에서 상응하는 Fab 단편 Fab0883을 Kirchhofer. D. 등의 문헌[Proteins Structure Function and Genetics. (1995), 22, 419-425]에 따라 현적법을 사용해 결정화하였다.
결정화
FVIIai/sTF와의 복합체 중 Fab의 SEC 정제된 복합체의 결정을 좌적 증기 확산 기술(sitting drop vapour diffusion technique)을 사용해 18℃에서 성장시켰다. 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.4 중 360 nl 단백질 복합체(4.5 mg/ml)의 단백질 용액을 0.15 M CsCl 및 15% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜 3350 및 360 nl 물을 함유하는 360 nl의 침전액과 혼합하고 80 μl의 침전액에 대해 평형화시켰다. 6주 이내에 결정체가 성장하였다.
회절 데이터 수집
결정은 액체 질소 중에서 급속 냉각하기 전에 0.15 M CsCl, 15% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜 3350, 및 20% (v/v) 글리세롤로 이루어진 용액 중에서 동결보호하였다. 회절 데이터는 Dectris Pilatus 1M 검출기가 구비된 Rigaku FRX 회전 양극 발생기에서 100K에서 수집하였다. XDS 패키지의 프로그램을 사용해 데이터 축소를 수행하였다(회절 데이터 통계는 표 18에 요약되어 있다).
구조 결정 및 정제
모든 결정학적 계산은 Phenix 결정학 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다. 실시예 13에서 기술된 바와 같이 수득된 복합체 구조의 좌표를 탐색 모델로서 사용해 Phase 프로그램을 사용해 분자 치환에 의해 구조를 결정하였다. 비대칭 유닛은 4개의 Fab:FVIIai/sTF 복합체를 함유한다. COOT 및 Phenix 정제를 사용하는 수동 재구축의 반복 사이클을 통해 최종 모델을 얻었하였다(표 18).
활성 부위 억제된 FVIIa, 가용성 조직 인자(sTF), 및 Fab0883 간 복합체의 X-선 구조 결정으로부터 데이터 수집 및 정제 통계. 가장 높은 해상도 셸에 대한 통계는 괄호 안에 도시되어 있다.
Fab0883
파장 1.542
해상도 범위 46.66 - 3.4 (3.52 - 3.4)
공간군 P 1 21 1 (번호 4)
단위 셀 144.78 100.79 181.74
90 101.23 90
총 반사 340556 (24056)
고유 반사 69058 (6446)
다중도 4.9 (3.7)
완성도(%) 96.4 (91.4)
평균 I/시그마(I) 3.59 (0.86)
Wilson B-인자 63.67
R-merge 0.31 (1.05)
R-meas 0.3465 (1.22)
R-pim 0.151 (0.603)
CC1/2 0.98 (0.697)
CC* 0.995 (0.906)
정제에 사용된 반사 68475 (6424)
R-free에 사용된 반사 1960 (180)
R-work 0.2968 (0.4173)
R-free 0.3323 (0.4271)
CC(work) 0.855 (0.660)
CC(free) 0.822 (0.503)
비-수소 원자 수 29262
거대분자 29251
리간드 11
단백질 잔기 3791
RMS(결합) 0.016
RMS(각도) 1.74
라마찬드란 선호도 (%) 90.11
라마찬드란 허용도 (%) 7.73
라마찬드란 이상치 (%) 2.16
회전 이성질체 이상치 (%) 0.12
클래시스코어(Clashscore) 30.81
평균 B-인자 57.11
거대분자 57.11
리간드 68.66
에피토프 맵핑
결정 내의 독립적으로 결정된 4개의 FVIIa 분자 모두가 Fab 내의 비-수소 원자로부터 4 Å 이하의 거리 내에 위치된 잔기의 비-수소 원자를 갖는 경우, 상기 잔기는 에피토프의 일부인 것으로 간주된다. 따라서, 에피토프는 서열번호 1에 따른 다음의 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다:
R113
C114
H115
E116
G117
Y118
S119
L120
T130
V131
N184
T185
P251
V252
V253
Q388
M391
R392
파라토프 결정
결정 내의 독립적으로 결정된 4개의 Fab 분자 모두가 FVIIa의 비-수소 원자로부터 4 Å 이하의 거리 내에 위치된 잔기의 비-수소 원자를 갖는 경우, 상기 잔기는 파라토프의 일부인 것으로 간주된다. 파라토프는 (서열번호 814에 따른) 다음의 경쇄 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다:
Q27
G28
Y32
Y50
H92
S93
F94
및 중쇄 잔기(서열번호 818에 따름):
D32
Y54
Y103
N105
실시예 16: SPR을 사용한 11F2 mAb0842(OA)의 핫스팟 분석
FVIIa의 알라닌 변이체의 발현
hFVII 알라닌 변이체를 안정한 에피솜 발현 시스템인 QMCF 기술(Icosagen)로 생성하였다. CHOEBNALT85 세포를 CO2 진탕 인큐베이터 내의 E125 플라스크에 담긴 Qmix1 배지(1L = 1:1 CD-CHO 및 SFM II (NVO11514701) + 10 ml 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, 15140-122) + 2 ml 퓨로마이신(Gibco, A11138-03))에서 배양하였다. 형질감염 당일에, 1Х10e7개의 CHOEBNALT85 세포를 전기천공(Bio-Rad Gene Pulcer Xcell Electroporation System, 300 V, 900 μF, 4 mm 큐벳)을 사용해 2 μg의 hFVII 변이체 암호화 플라스미드 및 50 μg의 연어 정자 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 1일차에, 세포를 Qmix2 배지(1 L = 1:1 CD-CHO 및 SFM II (NVO11514701) + 10 ml 페니실리/스트렙토마이신(Gibco, 15140-122) + 1 ml K-비타민(K.vit 13A 01311) + 14 ml G418(Gibco, 10131-027))로 옮겨 G418 선택을 시작하였다. G418 선택 후 10 내지 14일차에, 세포는 >95% 생존력에 도달하였다(Vi-Cell XR 세포 계수기). 세포를 2ХE1000 플라스크에서 2Х250ml Qmix2에 대해 0.4Х10e6개의 세포/ml로 분할하였다. 3~4일 후, 세포는 약 4~5Х10e6개의 세포/ml의 밀도에 도달하였다. 20% CHO CD Efficient Feed B(Gibco A10240) + 6 mM GlutaMax(Gibco, 35050)를 첨가하여 발현을 개시하였다. 개시 후 4일차에, 10% CHO CD Efficient Feed B + 6 mM GlutaMAX를 추가로 첨가하였다. 개시 후 6일차에, 배양물을 수확하고 회전시켰다(200g, 5분). 상청액을 수집하고 15 mM HEPES(Gibco, 15630) 및 5 mM CaCl2(Sigma, 21115)를 첨가하였다. 상청액을 0.22 μm 병 상단 필터(Corning, CLS430049)를 사용하여 멸균 여과하였다.
cFVIIa-키메라의 발현 및 정제(22017-051)
cFVIIa-키메라는 전술한 바와 유사한 발현 시스템을 사용하여 생성하였다. 실시예 26에 기술된 바와 같이, 사내 항-FVII(a) 항체(F1A2)를 세파로오스 비드에 결합시켜 제조한 친화도 컬럼을 사용해 지모겐 cFVII-키메라를 배지로부터 정제하였다. 항-FVII(a) 항체 F1A2는 Ca++ 의존적 방식으로 FVII(a)의 Gla 도메인에 결합한다. 지모겐 cFVII-키메라를 인간 FIXa를 사용하여 활성화시키고, F1A2 친화도 정제를 사용하여 재정제하여 최종 cFVIIa-키메라를 수득하였다.
핫스팟 분석
25℃에서 표면 플라스몬 공명(Biacore T200)을 사용한 19개의 FVII(a) 변이체 집단에 대한 결합 연구에 의해, 1가 인간화 항체 mAb0842(OA)를 사용하여 핫-스팟 분석을 수행하였다. FVII(a) gla 도메인을 표적으로 하는 25 μg/ml의 항-FVII(a) 항체(NN 내부 Ab 4F6 (Nielsen AL 등의 문헌[PNAS 114 (47) 12454-12459, 2017]))를 표준 아민 결합 화학 키트(GE Healthcare가 공급함)를 사용하여 CM4 센서 칩(GE Healthcare가 공급함) 상에 고정시켰다. 표 19에 따라, (전술한 바와 같은) 세포 배양 상청액 중의 FVII(a) 변이체를 영동 완충액에서 희석하고, 1분 동안 10 μl/분의 유속으로 주입하여 5~55 RU의 포획 수준을 달성하였다. 각각의 FVII(a) 변이체는 고정된 항-FVII(a) gla Ab에 의해 포획되었다. 이어서, 540 nM(3x 희석물)의 mAb0842(OA)를 7분 동안 분당 30 μl의 유속으로 주입하여 포획된 FVII(a) 변이체에 결합될 수 있게 한 다음, 9분 동안 완충액을 주입하여 단일 아암 항-FVII(a) 항체를 해리시켰다. 영동 완충액은, 10xHBS-P 완충액(GE Healthcare가 공급함)을 10배 희석하고, 1 mg/ml BSA 및 5 mM CaCl2를 보충하여 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.4, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 수득함으로써 제조하였다. 영동 완충액은 항-FVII(a) 항체 및 FVII(a) 샘플의 희석에도 사용하였다. 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.05 v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.4를 사용해 칩을 재생하였다. 결합 데이터는 제조사(Biacore AB, Uppsala, Sweden)가 공급한 BiaEvaluation 4.1을 사용하여 1:1 동역학 모델에 정태 분석에 따라 분석하였다. 가능한 경우, 1:1 동역학 피팅 모델의 ka, kd 및 KD 값이 보고된다. 4개의 FVII(a) 변이체에 대해, 정태 피팅 모델을 사용한 KD 값을 보고하였다. 또한, 모든 FVII(a) 변이체에 대해 포획 신호가 보고된다. 알라닌으로 아미노산 잔기를 치환하여 야생형에 비해 10배 이상의 친화도가 감소하는 경우, 해당 아미노산 잔기는 핫-스팟 잔기로 간주된다. 표 19에 제시된 데이터에 기초하여, 아미노산 잔기 H115, T130, V131, 및 R392는 핫-스팟인 것으로 결론을 내렸다.
실시예 16에 따라, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 결정했을 때, 1가 인간화 항체 mAb0842(OA)와의 FVII(a) 변이체의 결합 상호작용.
FVII(a) 변이체 포획 (RU) K D (nM) 배수 차이 (변이체/WT)
야생형 19.2 0.31 1.0
R113A 17.7 0.29 1.0
H115A 19.3 8.16 26.8
G117A 9.5 0.31 1.0
Y118A 54.8 1.48 4.9
L120A 15.2 0.60 2.0
T130A 16.9 32.10 105.2
V131A 18 5.22 17.1
N184A 8.4 1.91 6.3
T185A 15.4 1.01 3.3
I186A 28.2 0.39 1.3
P251A 9 0.85 2.8
V252A 15.6 0.28 0.9
E265A 8.3 0.98 3.2
M391A 5.5 0.25 0.8
R392A 14.1 43.40 142.3
E394A 26.9 0.79 2.6
E116A 9.5 0.50 1.6
S119A 51.6 0.31 1.0
실시예 18: 시노몰구스 원숭이에서 인간화 11F2 항체와 공동 제형화된 재조합 FVIIa의 약동학
재조합 FVIIa(rFVIIa)를 단독으로 또는 1가 단일 아암 11F2 mAb0705(OA)와 1:3의 몰비로 IV 또는 SC 투여한 후, 시노몰구스 원숭이 연구에서 FVIIa 혈장 활성-시간 프로파일을 추정하였다. 제형을 5.4 nmol/kg의 FVIIa(공동 제형화를 위한 16.2 nmol/kg mAb0705(OA) 포함)의 단일 투여량으로 투여하고, 3주에 걸쳐 혈액 샘플을 채취하였다.
실험 동안, 동물을 현지 보건 당국의 표준 절차에 따라 유지하고 취급하였고, 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다. FVIIa 혈장 활성은 실시예 8에 기술된 바와 같이 FVIIa 활성 검정을 사용하여 측정하였다. 내인성 시노몰구스 FVIIa는 투여 전에 LLOQ(0.1 nM) 미만이었고, 결과적으로 무시하였다.
Phoenix WinNonlin 6.4를 사용하여 비구획 방법에 의해 FVIIa 혈장 활성-시간 프로파일의 약동학 분석을 수행하였다. 데이터로부터 다음 매개변수를 추정하였다: 제거율(CL), 평균 체류 시간(MRT), 및 SC 생체이용률(F). 파라미터는 표 20에 열거되어 있는데, 이는 항체 부재 시의 FVIIa와 비교하여, mAb0705(OA)와 공동 제형으로 IV 및 SC 투여한 경우 모두에서 FVIIa 활성이 실질적으로 연장되었음을 보여준다.
5.4 nmol/kg의 FVIIa를 단독으로 또는 mAb0705(OA)와 1:3 몰비의 공동 제형으로 IV 또는 SC 투여한 후, 시노몰구스 원숭이 연구에서 FVIIa의 혈장 활성의 제거율(CL), 평균 체류 시간(MRT) 및 SC 생체이용률(F). 값은 평균(SD)임 (n=3).
제형 CL (mL/h/kg) MRT (시간) F (%)
FVIIa 39 (5.2) 2.0 (0.2) 22
FVIIa 43.8 (2.2) 2.15 (0.08) 미결정
FVIIa:mAb0705(OA) 2.7 (0.07) 53.5 (15.3) 61.4
실시예 19: 쥣과 항-TLT-1 항체 mAb0012의 인간화 및 최적화
인간화
WO2012/117091에 개시된 쥣과 항-인간 TLT-1 항체 mAb0082를 인간화 과정의 시작점으로서 사용하였다. mAb0082는 2개의 점 돌연변이, 즉 C41A를 VL에 및 T61A를 VH에 혼입하여, VL의 FR1에서 페어링되지 않은 시스테인 및 VH의 CDR2에서의 N-글리코실화 부위를 각각 제거함으로써 mAb00122로부터 유래된다. 인간화 공정은 당업자에게 공지된 표준 분자 생물학 방법에 기초하였다.
요약하자면, IMGT 데이터베이스에 정의된 바와 같은 VH3_74/JH1 서열에 기초하여 mAb0082 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 서열을 인간 생식선 서열 상에 이식하였다. 또한, 이 CDR 서열을 추가로 인간화하기 위해 3개의 VH3_74/JH1 인간 아미노산 치환을 이식된 CDRH2 서열 내에 도입하였다: P62D, L64V 및 D66G. mAb0082의 결합 친화도와 유사한 결합 친화도를 얻기 위해, 3개의 복귀 돌연변이를 위치 S49G, D62P, 및 R98S에서 VL 서열에 도입하였다. VL의 인간화와 관련하여, mAb0082 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 서열을 IMGT 데이터베이스에 정의된 바와 같은 VKII_A23/JK2 서열에 기초하여 인간 생식선 서열 상에 이식하였다. VL 서열은 CDR1에서 잠재적 탈아미드화 핫-스팟(NG 모티프)을 함유한다. 이 위치에서 포화 돌연변이 유발을 사용하여, NG 모티프가 TLT-1에 대한 친화도를 손상시키지 않고 N33Q 치환에 의해 제거될 수 있음을 발견하였다.
mAb0082의 최종 인간화 및 최적화 변이체는 서열번호 934(VL) 및 938(VH)에 상응하는 mAb1076으로서 지칭된다.
인간화 TLT1 변이체의 SPR 분석
실시예 4의 biAb에 대한 sTLT1(C-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 첨가된 서열번호 3에 상응함)의 결합을 25℃에서 표면 플라스몬 공명(Biacore T200)에 의해 프로브하였다. 항-인간 IgG를 표준 아민 결합 화학을 사용하여 CM5 센서 칩(둘 다 GE Healthcare가 공급함) 상에 고정시켰다. 표 21에 따라 정제한 biAb(1 nM)를 1분 동안 10 μl/분의 유속으로 주입하였다. 이어서, 0 내지 60 μM의 sTLT1을 30 μl/분의 유속으로 3분 동안 주입하여 biAb에 결합시키고, 이어서 3분 동안 완충액을 주입하여 biAb로부터 해리시켰다. 영동 완충액은, 10xHBS-P 완충액(GE Healthcare가 공급함)을 10배 희석하고, 1 mg/ml BSA 및 5 mM CaCl2를 보충하여 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.4, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 수득함으로써 제조하였다. 영동 완충액은 biAb 및 sTLT1 샘플의 희석에도 사용하였다. 3M MgCl2(GE Healthcare가 공급함)로 구성된 권장 재생 완충액을 사용해 칩을 재생하였다. 결합 데이터는 제조사(Biacore AB, 스웨덴 웁살라)가 공급한 BiaEvaluation 4.1을 사용하여 1:1 모델에 따라 분석하였다. 분석에 의해 표 21에 보고된 결합 상수를 얻었는데, 이는 sTLT1이 2.9 nM 내지 320 nM 범위의 친화도로 biAb에 결합함을 입증하였다.
실시예 X에 따라 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 결정했을 때, sTLT1과 biAb의 상호작용에 대한 추정 결합 상수.

biAb 		부모
항-FVII(a) 		부모
항-TLT-1 		K D
(M)
biAb0001 mAb0865 mAb1076 2.9E-9
biAb0015 mAb0865 mAb1038 1.9E-8
biAb0090 mAb0865 mAb1049 3.2E-7
biAb0095 mAb0865 mAb1047 7.5E-8
실시예 20: Hz-TLT1 및 TLT-1 펩티드 복합 제제의 결정 구조
TLT-1 자루 펩티드와의 복합체에서 결정화에 사용된 Fab 단편은 mAb1076에 상응하는 VL 및 VH 도메인 서열(각각 서열번호 854 및 858), 인간 IgG4 CH1 도메인, 및 단일 점 돌연변이를 갖는 인간 카파 CL(G157C)을 포함하였다. G 대 C 치환은 Fab 단편의 불변 도메인 내에, 즉 항원 결합 부위로부터 멀리 있고, TLT-1에 대한 결합에 영향을 미치지 않는다. 서열번호 2의 잔기 111-147에 상응하는 37량체 자루 펩티드, EEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIP(서열번호 13)를 당업자에게 공지된 표준 펩티드 합성 방법에 의해 제조하였다. Fab 및 줄기 펩티드를 HEPES 완충액(20 mM Hepes(pH 7.3), 150 mM의 NaCl) 중에서 1:2의 몰비로 혼합하였다. 1:1의 Fab:펩티드 복합체를 HEPES 완충액으로 용리된 수퍼덱스 200 컬럼 상에서 겔 여과를 사용하여 단리하고, 이어서 약 11 mg/mL까지 농축시키고 결정화에 사용하였다.
결정화
겔 여과한 1:1 몰비의 Fab/펩티드 복합체의 결정을 좌적 증기 확산 기술을 사용해 18℃에서 성장시켰다. 20mM Hepes, pH 7.3 및 150mM NaCl 중 150 nl 10.8 mg/ml Fab:펩티드 복합체의 단백질 용액을 50 nl의 1M LiCl, 0.1 M NaCitrate-구연산, pH 4 및 침전제로서의 20% (w/v) PEG 6000과 혼합하고, 60 μl 침전제를 이용해 인큐베이션하였다.
회절 데이터 수집
액체 질소 중에서 급속 냉각하기 전에, 1 μl의 침전제가 첨가된 20%의 에틸렌 글리콜을 결정화 방울에 첨가함으로써 결정의 동결을 방지하였다. 회절 데이터는 Dectris의 Eiger 16M 하이브리드-픽셀 검출기를 사용하여 MAX IV 싱크로트론(Lund, Sweden)에서 BioMAX 빔라인에서 100K로 수집하였다. 데이터 자동 색인, 통합 및 스케일링은 XDS 패키지의 프로그램을 사용해 수행하였다(회절 데이터 통계는 표 22에 요약되어 있음).
구조 결정 및 정제
비대칭 유닛은 매튜 상관계수 분석(Matthews coefficient analysis)에서 판단된 바와 같이 2개의 Fab:펩티드 복합체를 함유한다. 구조는 분자 대체에 의해 결정하였다. 프로그램 패키지 페닉스(Phenix)에서 구현된 것과 같은 페이저(Phaser)를, 2개의 Fab를 국소화하는 검색 모델로서의 단백질 데이터 뱅크 엔트리 5KMV의 사슬 H와 L과 함께 사용하였다. 이들은 COOT을 사용하여 정확한 아미노산 서열로 구성한 뒤, 페닉스(Phenix) 정제를 사용하여 정제한 모델이었다. 펩티드의 아미노산 7 내지 21은 차이 전자 밀도 맵에서 명확하게 확인되었으며, COOT를 사용하여 수동으로 제작한 모델일 수 있다. 이 모델은 COOT에서 페닉스(Phenix) 정제 및 수동 재구성의 단계들을 사용하여 추가로 정제하였다. 정제 통계는 표 22에서 확인할 수 있다.
데이터 수집 및 정제 통계.
파장 (Å) 0.9799
해상도 범위 (Å) 29.42 - 1.49 (1.543 - 1.49)
공간군 P 1
단위 셀 (Å, 도) 53.23 65.38 67.15
91.88 91.72 92.89
총 반사 260187 (25653)
고유 반사 140071 (9127)
다중도 1.9 (1.9)
완성도(%) 91.03 (62.11)
평균 I/시그마(I) 9.03 (1.37)
Wilson B-인자 18.72
R-merge 0.05225 (0.593)
R-meas 0.07387 (0.8385)
R-pim 0.05222 (0.5928)
CC1/2 0.994 (0.0683)
CC* 0.999 (0.358)
정제에 사용된 반사 134361 (9125)
R-free에 사용된 반사 1784 (123)
R-work 0.1582 (0.2655)
R-free 0.1779 (0.2932)
CC(work) 0.966 (0.671)
CC(free) 0.962 (0.632)
비-수소 원자 수 8094
거대분자 7042
용매 1052
단백질 잔기 897
RMS(결합) 0.009
RMS(각도) 1.36
라마찬드란 선호도 (%) 97.06
라마찬드란 허용도 (%) 2.83
라마찬드란 이상치 (%) 0.11
회전 이성질체 이상치 (%) 1.35
클래시스코어(Clashscore) 4.17
평균 B-인자 (Å 2 ) 25.71
거대분자 24.26
용매 35.47
TLS 군의 수 1
가장 높은 해상도 셸에 대한 통계는 괄호 안에 도시되어 있다.
Fab/펩티드 복합체의 에피토프 및 파라토프
에피토프는, 비대칭 유닛의 복합체 둘 다에서, Fab 내의 중원자로부터 4.0 Å의 거리 이내에 중원자(즉, 비-수소 원자)를 갖는 것을 특징으로 하는 TLT-1 자루-펩티드 내의 잔기로서 정의된다. 유사하게, 파라토프는, 에피토프가 서열번호 13에 따른 37aa TLT-1 펩티드의 다음 잔기를 포함하는 것으로 확인된 비대칭 유닛 내의 복합체 둘 다에서, TLT-1 자루-펩티드 내의 중원자로부터 4.0 Å의 거리 이내에 중원자를 갖는 것을 특징으로 하는 Fab 단편 내의 잔기로서 정의된다:
K8
I9
G10
S11
L12
A13
N15
A16
F17
S18
D19
P20
A21
(서열번호 2 및 3의 K118, I119, G120, S121, L122, A123, N125, A126, F127, S128, D129, P130, 및 A131에 상응함).
파라토프는 중쇄 가변 도메인(서열번호 938)의 다음 잔기:
V2
F27
R31
Y32
W33
E50
T57
N59
S98
G99
V100
T102
S103
및 경쇄 가변 도메인(서열번호 934)의 다음 잔기를 포함한다:
H31
Y37
H39
Y54
F60
S61
S96
T97
V99
Y101
실시예 21: 항-FVII(a)/항-TLT-1 이중 특이적 항체 자극 활성에 친화도가 미치는 효과
이중 특이적 항체 활성에 친화도가 미치는 효과를 결정하기 위해, 11F2 mAb0005(실시예 14 참조) 및 mAb0012(실시예 19 참조)의 인간화에서 유래되고, FVIIa 및 TLT-1 각각에 대한 다양한 친화도를 갖는 다수의 항-FVII(a) 및 항-TLT-1 mAb를, WO2011/023785에 기술된 바와 같이 지질화된 TLT-1을 사용하는 FXa 생성 검정에서 이중 특이적 포맷으로 시험하였다.
제1 단계에서, FX 활성화는 10:90 포스파티딜 세린:포스파티딜 콜린 소포(WO2011023785), 2.5 nM FVIIa, 및 이중 특이적 항체(biAb)에 통합된 4 nM 재조합 TLT-1가 일련의 0 내지 300 nM의 농도로 존재하는 가운데 측정하였다. 실온에서 검정 완충액(50 mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, pH 7.3 + 1 mg/ml BSA 및 0.1% PEG8000)에서 10분 동안 사전 인큐베이션한 후, 150 nM 혈장 유래 FX(Haematologic Technologies)를 첨가하여 50 μl의 총 부피를 수득하고 20분 동안 활성화를 진행시켰다. 그런 다음, 25 μl 퀀칭 완충액(50 mM HEPES, 100mM NaCl, 80mM EDTA, pH 7.3)을 첨가하여 활성화를 종료시키고, 0.5 mM S-2765(Chromogenix) 발색성 기질(2 mM 모액으로서 25 μl 부피로 첨가함)을 가수분해하는 능력으로부터 정량화한 FXa를 생성하였고, 이어서 SPECTRAmax Plus384 플레이트 판독기에서 5분 동안 405 nm에서 추적하였다. 선형 흡광도 증가의 기울기에서, biAb 부재 시의 배경 활성을 차감하고, 검정에서의 FVIIa 농도로 나눔으로써, 100 nM 농도에서 각 biAb별로 정규화된 활성(AbiAb)을 계산하였다.
제2 단계에서, 동일한 검정을 수행하되, biAb는 검정 완충액으로 교체하고, FVIIa의 일련의 농도는 0 내지 80 nM로 변경하였다. 배경이 차감된 FXa 생성과 검정 중 FVIIa의 농도 간의 선형 관계의 기울기는 사용된 검정 조건 하에서 유리 FVIIa(AFVIIa)의 특이적 활성의 척도를 제공하였다.
측정된 활성에 기초하여, 100 nM에서 각 biAb의 자극 활성을 AbiAb/AFVIIa의 비율로서 계산하였다. 자극 활성은 100 nM biAb의 첨가 시 FVIIa에 의한 생성된 FXa의 배수 증가의 척도를 제공한다.
자극 활성은 표 23에 제공되어 있으며, 이는 FVIIa 및 TLT-1이 각각 결합되는 강도(해리 상수(KD) 값으로 표현됨)에 대한 biAb 자극의 의존성을 보여준다. 시험한 biAb 중에서, biAb0001은 가장 높은 자극 활성을 나타낸다.
실시예 21에 기술된 바와 같이, FX, FVIIa, 및 지질화된 TLT-1의 존재 시 이중 특이적 항체의 자극 활성. 각각의 이중 특이적 항체에 대해, 측정된 자극 활성이 FVIIa 및 TLT-1과의 상호작용에 대한 해리 상수와 함께 각각 열거된다(평균 ± SD, n = 2).
이중 특이적 항체 항-FVIIa 아암 항-TLT-1 아암 K D (FVIIa)
[nM] 		K D (TLT-1)
[nM] 		자극
(배수)
biAb0001 mAb0865 mAb1076 0.06 2.9 29.2 ± 1.7
biAb0015 mAb0865 mAb1038 0.06 19 18.7 ± 1.5
biAb0095 mAb0865 mAb1047 0.06 75 13.9 ± 1.1
biAb0090 mAb0865 mAb1049 0.06 320 11.1 ± 1
biAb0011 mAb0875 mAb1076 0.28 2.9 20.3 ± 1.3
biAb0016 mAb0875 mAb1038 0.28 19 17.3 ± 1.6
biAb0096 mAb0875 mAb1047 0.28 75 12.4 ± 1.1
biAb0091 mAb0875 mAb1049 0.28 320 11.3 ± 1.3
biAb0012 mAb0872 mAb1076 2.2 2.9 22.1 ± 0.4
biAb0017 mAb0872 mAb1038 2.2 19 13.6 ± 0.1
biAb0097 mAb0872 mAb1047 2.2 75 17.4 ± 0.1
biAb0092 mAb0872 mAb1049 2.2 320 11.2 ± 0.2
biAb0013 mAb0874 mAb1076 16.2 2.9 16 ± 0.1
biAb0018 mAb0874 mAb1038 16.2 19 12.8 ± 0.2
biAb0098 mAb0874 mAb1047 16.2 75 15.3 ± 0.1
biAb0093 mAb0874 mAb1049 16.2 320 9.6 ± 0.2
biAb0014 mAb0873 mAb1076 600 2.9 8 ± 0.2
biAb0019 mAb0873 mAb1038 600 19 9.4 ± 0.5
biAb0099 mAb0873 mAb1047 600 75 5.8 ± 0.5
biAb0094 mAb0873 mAb1049 600 320 5.4 ± 0.5
실시예 22: 항-FVII(a)/항-TLT-1 이중 특이적 항체 자극 활성에 에피토프의 위치가 미치는 효과
에피토프 위치가 이중 특이적 항체 활성에 미치는 효과를 결정하기 위해, TLT-1 및 FVIIa 상의 상이한 에피토프에 각각 결합하는 다수의 항-TLT-1 및 항-FVIIa mAb를, 실시예 21에서 수행된 바와 같이, FXa 생성 검정에서의 이중 특이적 포맷으로 시험하였다.
결과는 표 24에 제공되어 있으며, 이는 biAb 자극 활성이 에피토프 위치에 의존적임을 보여준다. 특히, 항-TLT-1 mAb인 mAb1076, mAb0023, mAb0051, 및 mAb0062는 항-FVIIa mAb인 mAb0865와 함께 유사한 자극 활성을 나타낸다.
[표 24]
실시예 23: 인간 IgG에 대한 항원 검정(LOCI)
시노몰구스 혈장에서 인간 IgG(hIgG)의 존재를 발광 산소 채널링 면역검정(Luminescent Oxygen Channelling Immunoassay, LOCI)에 의해 측정하였다. 간략하게, LOCI 시약은 2개의 라텍스 비드 시약(공여자 비드 및 수용자 비드) 및 hIgG에 대한 비오티닐화 단클론 항체를 포함하였다(Biosite, 카탈로그 번호 AFC4249). 감광성 염료를 함유하는 공여자 비드 시약을 스트렙타비딘으로 코팅하였다. 수용자 비드인 제2 비드 시약은 hIgG에 대한 사내 단클론 항체(0421)와 접합시켜, 샌드위치를 구성하였다. 검정 동안, 3개의 반응물을 혈장 내 hIgG와 조합하여 비드-응집체 면역 복합체를 형성하였다. 복합체의 여기는 공여자 비드로부터 단일항 산소 분자를 방출하였는데, 이를 수용자 비드 내로 채널링하여 화학발광 반응을 유발하였다. 그런 다음, EnVision 플레이트 판독기에서 이를 측정하였다. 초당 수(cps)로서 보고된, 생성된 광량은 hIgG의 농도에 비례하였다. 샘플을 검정 완충액 중에서 적어도 100x로 희석하고, 1% 시노몰구스 혈장에 첨가된 hIgG에 기초하여 검량선을 제작하였다.
실시예 24: FVII(a)에 대한 항원 검정(LOCI)
FVII 지모겐, FVIIa, 및 FVIIa:항트롬빈(FVIIa:AT) 복합체를 포함하는 FVII(a) 항원은, FVII(a)에 대한 검정이 사내 항-FVII(a) 항체(4F9) 및 사내 비오티닐화 항-FVII(a) 단클론 항체(4F7)로 코팅된 수용자 비드로 구성된 것을 제외하고는, 실시예 23에 기술된 것과 같이 LOCI 검정으로 측정하였다. 샘플을 검정 완충액 중에서 적어도 100x로 희석하고, 알려진 양의 인간 rFVIIa를 검정 완충액에 첨가하여 검량선을 제작하였다.
실시예 25: FVIIa:AT(항트롬빈)에 대한 항원 검정 (EIA)
Agersø H 등의 문헌[J Thromb Haemost 2011; 9: 333-8]에 기술된 바와 같은 효소 면역 검정(EIA)을 사용하여 FVIIa:AT (항트롬빈) 복합체를 측정하였다. N-말단 EGF-도메인에 결합하고 항트롬빈 결합을 차단하지 않는 단클론 항-FVIIa 항체(Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark, 제품 코드 O9572)를 FVIIa:AT 복합체의 포획에 사용하였다. 미리 형성된 인간 FVIIa 및 시노몰구스 항트롬빈 복합체(FVIIa:AT)를 10 μM 저분자량 헤파린(Enoxaparin)의 존재 하에 FVIIa를 2배 몰 과량의 항트롬빈과 함께 인큐베이션하여 제조하였다. 실온에서 밤새 인큐베이션한 후의 FVIIa의 잔류 아미도분해 활성(실시예 11 참조)은 초기 FVIIa 활성의 10% 미만인 것으로 확인되었다. 복합체를 사용하여 EIA 검량선을 구성하였다. 검출을 위해 다클론 항-인간 항-트롬빈 항체 퍼옥시다아제 접합체를 사용하였다(Siemens Healthcare Diagnostics ApS, Ballerup, Denmark, 제품 코드 OWMG15). TMB를 첨가하고, 충분한 색이 생길 때까지 발색시키고, H2SO4를 첨가하여 종료시키고, 650 nm을 기준으로 하여 450 nm에서의 흡광도를 흡광도 플레이트 판독기(BioTek) 상에서 측정하였다. 색 강도는 FVIIa:AT의 농도에 비례한다.
실시예 26: 인간 FVIIa, FVII(지모겐), 및 FVIIa:AT(항트롬빈) 복합체의 제조
인간 FVIIa(활성화된 FVII)의 제조
달리 언급되지 않는 한, 재조합 인간 활성화 FVII(FVIIa)는 Thim 등의 문헌[(1988) Biochemistry 27:7785-7793] 및 Persson 등의 문헌[(1996) FEBS Lett 385:241-243]에 기술된 바와 같이 제조하였다.
인간 FVII(지모겐 FVII)의 제조
CHO 세포에서 생산된 재조합 인간 FVII를 Thim 등의 문헌[(1988) Biochemistry 27:7785-7793]에 기술된 바와 같이 일단계 칼슘 의존성 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 후, 지모겐 FVII를 10 mM MES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 6.0 완충액에 투석하였다. 제조 시 활성화된 FVII(FVIIa)의 수준은 1 mM 발색성 기질 S-2288 및 200 nM sTF의 존재 하에 아미도분해 활성을 측정하여 결정하였다(실시예 11 참조). 이를 알려진 농도의 FVIIa로 제작한 표준 곡선과 관련시킴으로써, 측정된 활성을 지모겐 FVII 제제에서 FVIIa의 몰 농도로 변환할 수 있었다.
인간 FVIIa:AT (항트롬빈) 복합체의 제조
FVIIa:AT(항트롬빈) 복합체는 등몰 농도의 인간 재조합 FVIIa, 인간 혈장 유래 AT(Baxter), 및 저분자량 헤파린(Enoxaparin 나트륨)을 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 제조하였다. 오염을 유발하는 부형제를 제거하기 위해, 사용 전에 헤파린 세파로오스 6 패스트 플로우(GE heapharose) 컬럼 상에서 염화나트륨 구배를 적용하여 AT를 재정제하였다. 용리된 AT를 한외여과에 의해 상향 농축시켜 50% 글리세롤이 포함된 10 mM HEPES, 25mM NaCl, pH 7.3에서 최종 제제를 수득하였다. FVIIa:AT 복합체를 20 mM MES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 5.5 중에서 4℃에서 SEC 크로마토그래피에로 정제하여 복합체 안정성을 최대화하였다. 제조 시, FVIIa의 잔류 수준은 전술한 바와 같이 결정하였다. 복합체 파괴를 최소화하기 위해, 제제를 -80℃에서 분취물로 보관하고, 사용 직전에 해동하여 얼음 위에 두었다.
실시예 27: 시노몰구스 원숭이에서 항-FVII(a)/항-TLT-1 biAb의 단일 투여량 약동학
biAb0001, 및 3개의 추가 반감기 연장 치환(M252Y, S254T, 및 T256E)이 불변 중쇄 도메인에 도입된 상응하는 YTE-변이체인 biAb0352를 3.0, 9.49, 또는 30 nmol/kg으로 시노몰구스 원숭이에게 정맥 내(iv) 투여하거나, 9.49 nmol/kg으로 피하(sc) 투여하였다. 각 군은 2마리의 원숭이(수컷 1마리 및 암컷 1마리)로 구성되었다. 투여 전에 구연산나트륨으로 안정화된 1 mL의 혈액 샘플을 채취하였고, iv 투여군의 경우, 투여 후 0.5시간; 2.5시간; 6시간; 12시간; 24시간; 48시간; 72시간차; 및 8일차; 10일차; 및 15일차에 채취하였다. sc군의 경우, 투여 전 및 투여 후 0.5시간; 3시간; 6시간; 12시간; 16시간; 24시간; 30시간, 38시간; 48시간; 54시간; 72시간; 78시간; 96시간; 120시간차; 및 8일차, 10일차, 및 15일차에 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플을 2000 g로 10분 동안 원심분리하고, 혈장을 제거하고, 분취액으로 나누고, hIgG(실시예 23 참조), 총 FVII(a) 항원(실시예 24 참조), FVIIa 활성(실시예 8 참조), 및 FVIIa:AT 복합체(실시예 25)에 대한 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다. Phoenix WinNonlin 6.4를 사용하여 비구획 방법에 의해 hIgG의 농도-시간 프로파일의 약동학(PK) 분석을 수행하였다. 다음 PK 파라미터가 표 24에 나타나 있다: 반감기(t1/2), 제거율(Cl), 분포용적(Vz), 평균 체류 시간(MRT), 및 SC 생체이용률(F).
YTE 돌연변이가 있거나 없는 biAb의 PK 파라미터는 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플에 기초하여 분석하였다.*
화합물
 투여량
(nmol/kg)		 경로 t½
(시간)		 Cl 또는 Cl/F**
(mL/시간 ×kg)		 Vz
(mL/kg)		 MRT
(시간)		 AUC
(h×nM)
biAb 0001 3.0 iv 80 0.64 73.6 106 4084
100 0.47 67.7 132 5325
9.49 iv 127 0.43 78.3 177 16269
121 0.33 58.1 161 21647
30 iv 207 0.48 143.4 305 33046
207 0.36 106.9 277 49476
9.49 sc 127 0.70 - 193 9672
138 0.43 - 205 15059
biAb 0352 3.0 iv 98 0.27 37.9 133 8445
212 0.21 65.7 285 8040
9.49 iv 218 0.20 63.5 296 26397
201 0.26 75.0 267 21870
30 iv 206 0.26 78.2 282 65712
226 0.27 87.4 304 62075
9.49 sc 249 0.31 - 376 13966
218 0.33 - 342 13932
*) 각각의 선은 시노몰구스 원숭이 한 마리의 데이터를 나타내며, **) Cl은 iv 투여 군, Cl/F는 sc 투여 군에 대해 표시된다. F는 sc 생체이용률에 상응한다.
BiAb0001 또는 상응하는 YTE-변이체인 biAb0352을 투여한 원숭이에게서 내인성 FVII(a)의 축적이 관찰되었다. 표 25는 FVII(a) 항원, FVIIa 활성, 및 FVII:AT의 투여전 수준을 투여 후 72 내지 240시간에 측정된 평균 누적 수준과 함께 보여준다. FVII(a) 항원, FVIIa 활성, 및 FVIIa:AT의 항체 투여량 의존적 축적이 관찰되었다. FVII(a) 항원을 투여 전 수준에 비해 3배까지 증가시켰고, FVIIa 및 FVIIa:AT는 5배까지 증가시켰다. 데이터는 YTE 돌연변이가 있는 biAb0001 또는 biAb0352의 단일 투여량의 iv 또는 SC 투여가 생체 내에서 내인성 FVII(a) 항원, FVIIa 활성, 및 FVIIa:AT 복합체의 축적으로 이어진다는 것을 입증한다.
시노몰구스 원숭이에게 YTE 돌연변이가 있거나 없는 biAb를 1회 iv 또는 sc 투여한 후 FVII(a) 항원, FVIIa, 및 FVIIa:AT의 축적.
화합물 투여 경로 투여량 (nmol/kg) 투여 후 72시간 내지 240시간에 달성된 수준*
FVII(a) 항원 (nM) FVIIa 활성 (nM) FVIIa:AT
(nM)
biAb0001 iv 3 11.2 ± 2.7 0.21 ± 0.05 1.98 ± 0.44
biAb0001 iv 9.49 15.9 ± 2.4 0.59 ± 0.20 4.67 ± 1.15
biAb0001 iv 30 19.7 ± 4.8 0.91 ± 0.56 8.50 ± 0.62
biAb0001 sc 9.49 14.6 ± 3.4 0.43 ± 0.13 3.36 ± 0.68
biAb0352 iv 3 8.9 ± 2.6 0.37 ± 0.16 3.21 ± 1.42
biAb0352 iv 9.49 17.6 ± 4.5 0.66 ± 0.12 4.62 ± 0.64
biAb0352 iv 30 17.6 ± 4.5 2.04 ± 1.19 8.05 ± 1.15
biAb0352 sc 9.49 20.4 ± 3.0 0.81 ± 0.15 3.88 ± 0.27
투여 전 6.2 ± 1.4 0.16 ± 0.04 1.63 ± 0.37
*) 데이터는 군 당 n=2마리의 동물로부터의 측정치의 평균 및 SD이며, iv 군은 3개의 시점, sc 군은 6개의 시점에 측정한 것임. 투여-전 값은 16마리의 모든 동물에 대한 하나의 시점(투여-전)을 기준으로 한다.
실시예 28: 시노몰구스 원숭이에서 1가 11F2 항-FVII(a) 항체 mAb0705(OA)의 단일 및 다회 투여량의 약동학
시노몰구스 원숭이에게 1가 11F2 항-FVII(a) 항체 mAb0705(OA)를 투여하고, 이어서 혈장 샘플에서 FVII 항원, FVIIa 활성, 및 FVIIa:AT를 측정함으로써 FVII, FVIIa, 및 FVIIa:AT의 생체 내 축적을 분석하였다. 약 2.5 kg의 2마리의 수컷 시노몰구스 원숭이에게 40 nmol/kg의 mAb0705(OA)를 복재 정맥, 요골 피부 정맥, 또는 측방 미상 정맥에 iv 투여하고, 3마리의 수컷 시노몰구스 원숭이에게는 20 nmol/kg의 단일 아암 항-FVIIa 항체를 2주 동안 격일로 넓적다리에 피하(sc) 투여하였다(즉, 항체를 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15일차에 투여하였다). 투여 후 최대 21일의 시점에 요골 피부 정맥 또는 대퇴 정맥으로부터의 혈액을 3.8% 구연산 삼나트륨에 샘플링하였다.
혈액을 2300 g로 10분 동안 원심분리하고, 혈장을 분취액으로 나누고, hIgG(실시예 23 참조), 총 FVII(a) 항원(실시예 24 참조), FVIIa 활성(실시예 8 참조), 및 FVIIa:AT 복합체(실시예 25)에 대한 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다. Phoenix WinNonlin 6.4를 사용하여 비구획 방법에 의해 농도-시간 프로파일의 PK 분석을 수행하였다. iv 투여에 대한 PK 파라미터는 표 26에 나타나 있다. 단일 아암 항체의 반감기(t½)는 1회 iv 투여 후 평균 116시간(4.8일)이었다. sc 투여된 항체의 추정 반감기는 181 ± 20시간이었다(n=3에 대한 평균 및 SD). 2주의 투여 기간 동안 축적된 항체는 초기 투여 후 336 내지 366시간의 시점에 1179 ± 140 nM의 최대 수준에 도달하였다(n=3마리의 동물 및 3가지 시점 데이터의 평균 및 SD임).
시노몰구스 원숭이에게 40 nmol/kg으로 iv 투여된 mAb0705(OA)의 PK 파라미터.
동물 t½
(시간)		 Cl
(mL/시간×kg)		 Vz
(mL/kg)		 MRT
(시간)		 AUC
(h×nM)
#1 113 0.487 79.5 167 82207
#2 119 0.417 71.4 175 95894
mAb0705(OA)의 1회 iv 투여 또는 반복 sc 투여는 내인성 FVII(a)의 축적을 초래하였다. 40 nmol/kg을 1회 iv 투여한 후 총 FVII(a) 항원, FVIIa:AT, 및 FVIIa를 표 27에 나타냈다. 총 FVII 항원은 투여 전 7.0 nM에서 7~14일차에 35.0 ± 4.7 nM로 증가하였다. 마찬가지로, FVIIa는 검출 한계 미만(0.009 nM)에서 2.3 ± 0.7 nM로 증가하였고, FVIIa:AT는 1.0에서 7~14일차에 6.3 ± 0.8 nM로 증가하였다. 40 nmol/kh의 단일 아암 항체 투여 후의 지모겐 FVII 수준은 총 FVII(a) 항원으로부터 FVIIa 및 FVIIa:AT를 차감해서 계산했을 때 26.4 nM이었다.
40 nmol/kg의 mAb0705(OA)의 1회 iv 투여 7 내지 14일차에 측정한 FVII(a)의 수준.
FVII(a) 투여 전 수준 (nM) 정태 농도 (nM)
총 FVII(a) 항원 7.0 35.0 ± 4.7
FVIIa:AT 1.0 6.3 ± 0.8
FVIIa <0.009 2.3 ± 0.7
다회의 sc 투여 후 총 FVII(a), FVIIa, 및 FVIIa:AT의 정태 수준은 표 28에 나타나 있다. 총 FVII(a) 항원은 투여 전 6.5 ± 1.5 nM에서 12~21일차에 36.9 ± 9.8 nM으로 증가하였다. 마찬가지로, FVIIa는 검출 한계 미만(0.009 nM)에서 12~21일차에 3.9 ± 1.6 nM으로 증가하였고, FVIIa:AT는 1.0 ± 0.3 에서 12~21일차에 9.1 ± 0.6 nM으로 증가하였다. 총 FVII(a) 항원으로부터 FVIIa 및 FVIIa:AT를 차감해서 계산한 정태 지모겐 FVII 수준은 24 nM이었다.
데이터는 단일 아암 항-FVII(a) 항체 mAb0705(OA)의 투여가 생체 내에서 내인성 FVII(a), FVIIa, 및 FVIIa:AT의 축적을 초래하였음을 입증한다. 단일 아암 항-FVII(a) 항체의 제거(0.42~0.49 mL/kg x kg, 표 26)는 i.v. 투여 후 biAb0001의 제거(0.33~0.64 mL/kg x kg, 실시예 27, 표 24)와 비슷하였다. 따라서, 단일 아암 항-FVII(a) 항체의 반복 투여 후 측정된 FVII(a) 항원, FVIIa, 및 FVIIa:AT의 정태 수준은 동일한 FVII(a) 결합 아암으로 biAb를 반복 투여한 후 정태에서 달성될 수준을 나타낼 것으로 예상된다.
20 nmol/kg mAb0705(OA)의 반복 sc 투여 후 12 내지 21일차에 측정한 FVII(a)의 정태 수준.
FVII(a) 투여 전 수준 (nM) 정태 농도 (nM)
총 FVII(a) 항원 6.5 ± 1.5 36.9 ± 9.8
FVIIa:AT 1.0 ± 0.3 9.1 ± 0.6
FVIIa <0.009 3.9 ± 1.6
실시예 29: A형 혈우병 유사 조건에서, 항-FVII(a)/항-TLT-1 biAb0001 및 정태 수준의 지모겐 FVII, FVIIa, 및 FVIIa:AT가 첨가된 인간 전혈에서의 혈전탄성도.
이중 특이적 항-FVII(a)/항-TLT-1 항체 biAb0001(부모 항-FVII(a)는 mAb0865이고 부모 항-TLT-1 항체는 mAb1076임) 및 실시예 28에서 축적된 수준의 지모겐 FVII, FVIIa, 및 FVIIa:AT의 효과를 A형 혈우병 유사 상태의 인간 전혈에서의 혈전탄성도(thromboelastography)로 평가하고, 혈액에 첨가된 rFVIIa의 효과와 비교하였다. 혈전탄성도 분석은 원칙적으로 Viuff D 등의 문헌[Thromb Res 2010; 126: 144-9]에 기술된 바와 같이 TEG® 기기(Thrombelastograph Coagulation Analyzer, Haemoscope Corp.)를 사용해 수행하였다. 구연산으로 안정화된 건강한 공여자의 전혈을 0.1 mg/mL의 중화 항-FVIII 양 다클론 항체(Haematological Technologies Inc, 카달로그 번호 PAHFVIII-S-C) 및 5 μg/mL의 중화 항-TF 마우스 단클론 항체(1F44, 직접 제조함)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. HBS/BSA 완충액(20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,4, 2 % BSA) 중의 biAb0001(최종 혈장 농도 100 nM)을 rFVIIa(Novo Seven®, Novo Nordisk, 최종 혈장 농도 3.9 nM), 지모겐 FVII(실시예 26에서 제조한 것과 같음, 최종 혈장 농도 24 nM), 및 FVIIa:AT 복합체(실시예 26에서 제조한 것과 같음, 최종 혈장 농도 9 nM)와 혼합하고, 혈액 샘플에 첨가하였다. FVIIa:AT의 사전 희석물을 차가운 20 mM MES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 5.5 + 2% BSA에서 만들고, 검정 개시 직전에 나머지 단백질에 첨가하였다. FVII 지모겐 및 FVIIa:AT 제제는 미량의 FVIIa를 함유하였으므로, 상응하는 더 낮은 양의 FVIIa를 첨가하여 이를 보상하고, 공여자 혈액 중 FVIIa의 예상 혈장 농도(0.1 nM)를 보상하였다(Morissey JH 등의 문헌[Blood, 1993; 81: 734-44]). 마찬가지로, 일정량의 지모겐 FVII를 첨가하여 공여자 혈액 중 지모겐 FVIIa의 예상 혈장 농도 10 nM를 보상하였다. 별도의 샘플은 A형 혈우병을 가진 인간 대상체에게 90 μg/kg rFVIIa(NovoSeven®)의 투여 후 이론적인 최대 혈장 농도에 상응하는 25 nM rFVIIa를 함유하였다(Lindley CM 등의 문헌[Clin Pharmacol Ther 1994; 55: 638-48]). 대조군은 biAb 단독을 포함하거나 biAb가 없는 FVII/FVIIa/FVIIa:AT 혼합물을 포함하였다. 혈소판은 PAR1 작용제 펩티드 SFLLRN(Tocris Biosciences 카달로그 번호 3497)을 최종 농도 30 μM까지 첨가하고 GPVI 작용제 콘불륵신(convulxin)(5-Diagnostics, 카달로그 번호 5D-1192-50UG)을 최종 농도 10 ng/mL까지 첨가하여 최대로 활성화시켰다. 20 mM Hepes, pH 7.4 중의 20 μL 부피의 0.2 M CaCl2을 TEG 컵에 첨가하고, 이어서 340 μL의 혈액 샘플을 첨가하고, 즉시 분석을 개시하였다. TEG-트레이스의 2 mm 진폭까지의 시간으로 정의되는 응고 시간(R-시간)을 소프트웨어에 의해 계산하였다(TEG® Analytical Software, 버전 4.1.73). 4명의 공여자로부터의 데이터를 표 29에 나타냈다. 응고 시간은 정상 혈액에서의 290 ± 12초에서 중화 FVIII에 의해 A형 혈우병 유사 조건을 유도한 후 3506 ± 1561초로 지연되었다. 25 nM rFVIIa를 첨가한 결과, 모방한 A형 혈우병 혈액의 응고 시간이 694 ± 158초로 단축되었다. 혈액에 100 nM의 biAb를 첨가한 결과, 응고 시간이 2198 ± 712초로 약간 감소하였는데, 이는 혈액에서 내인성 FVIIa의 효과가 강화되었기 때문일 가능성이 높다. 정태 수준의 FVII/FVIIa/FVIIa:AT를 첨가한 후 응고 시간이 1440 ± 275초로 감소하였다. 100 nM biAb와 정태 수준의 FVII/FVIIa/FVIIa:AT를 조합하면 응고 시간이 495 ± 39초로, 즉 25 nM FVIIa를 첨가한 후 응고 시간과 비슷하거나 약간 더 낮은 수준으로 감소하였다. 데이터는, biAb가 누적된 수준의 FVII/FVIIa/FVIIa:AT의 효과를 강화하여, 치료적 유효 농도의 rFVIIa로 달성한 응고 시간 감소와 유사하거나 약간 더 양호하게 응고 시간을 감소시킨다는 것을 입증한다.
정태 수준의 FVII/FVIIa/FVIIa:AT가 있거나 없는 인간 전혈에서 biAb0001(100 nM)의 효과에 대한 혈전탄성영상 분석.
실험일 응고 시간 (R-시간, 초)
정상 A형 혈우병 (HA) HA + 25 nM FVIIa HA + BiAb HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT HA + biab + FVII/FVIIa/ FVIIa:AT
2018-03-14 295 3160 615 2460 1690 445
2018-03-15 280 1660 540 1145 1065 495
2018-03-22 280 3770 715 2720 1415 500
2018-03-21 305 5433 905 2465 1590 540
평균 290 3506 694 2198 1440 495
SD 12 1561 158 712 275 39
실시예 30: A형 혈우병 유사 상태에서, TLT-1 친화도가 다른 이중 특이적 항-FVII(a)/항-TLT-1 항체 및 정태 수준의 지모겐 FVII, FVIIa 및 FVIIa:AT가 첨가된 인간 전혈에서의 혈전탄성도
본 실시예에서, TLT-1에 대해 상이한 친화도를 갖는 다음의 이중 특이적 항-FVII(a)/항-TLT-1 항체를 시험하였다:
100 nM의 농도에서 이중 특이적 항체를 실시예 29에 기술된 바와 같은 혈전탄성도에 의해 평가하였다. 응고 시간(R-시간)은 표 30에 열거되어 있다. 항-FVIII 항체를 첨가하여 A형 혈우병(HA)를 유도할 때, 응고 시간은 340초에서 5433초로 지연되었다. TLT-1(biAb0001)에 대해 가장 높은 친화도를 갖는 biAb의 존재는 응고 시간을 2465초로 감소시켰으며, 3가지 다른 biAb 단독에 대해 관찰된 응고 시간 감소보다 더 많이 감소시켰다(biAb0015는 응고 시간을 3645초로 감소시켰고; -biAb0090는 4335초로 감소시켰고; biAb0095는 4110초로 감소시켰음). 마찬가지로, biAb와 정태 수준의 FVII, FVIIa, 및 FVII:AT의 조합은 biAb0001(540초로 감소)의 경우 다른 3개의 biAb보다 응고 시간을 현저히 감소시켰는데; 즉, biAb0015의 경우 1100초로 감소시켰고, biAb0090의 경우 1040초로 감소시켰고, biAb0095의 경우 815초로 감소시켰다. 데이터는 TLT-1에 대해 가장 높은 친화도(즉 가장 낮은 KD)를 갖는 biAb0001이 응고 시간 감소에 가장 효과적이었음을 입증한다.
정태 수준의 FVII/FVIIa/FVIIa:AT가 있거나 없는 인간 전혈에서 biAb0001, biAb0015, 또는 biAb0090(각각 100 nM)의 효과에 대한 혈전탄성영상 분석.
샘플 응고 시간 (R-시간, 초)
정상 340
A형 혈우병 (HA) 5433
A형 혈우병(HA) + 25 nM FVIIa 905
HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT 1590
HA + biAb0001 2465
HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT + biAb0001 540
HA + biAb0015 3645
HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT + biAb0015 1100
HA + biAb0090 4335
HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT + biAb0090 1040
HA + biAb0095 4110
HA + FVII/FVIIa/FVIIa:AT + biAb0095 815
실시예 31: FVIII-결핍 유전자 이식 인간 TLT-1 마우스의 꼬리 정맥 횡절단 모델에서 항-FVII(a)/항-TLT-1 이중 특이적 항체 biAb0001의 생체 내 효과
항-FVII(a)/항-TLT-1 이중 특이적 항체 biAb0001의 생체 내 효능은 유전자이식 FVIII 녹아웃(즉, A형 혈우병), 쥣과 TLT-1 녹아웃, 인간 녹인 마우스를 대상으로 한 꼬리 정맥 횡절단(TVT) 모델을 사용하여 결정하였다. 항-FVII(a)는 쥣과 FVII(a)를 인식하지 못하기 때문에, biAb를 인간 FVIIa, FVII, FVII:AT와 공동 투여함으로써 마우스에서 이들 성분의 목표 혈장 수준(각각 3.8, 26.2 및 9.0 nM)을 수득하여, 실시예 28에 따른 이들의 예상 임상적 정태 혈장 수준을 모방하였다. biAb의 농도는 40 또는 100 nM이었다. 요컨대, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 동물 체온을 37℃로 유지하도록 설정된 가열 패드 상에, 마우스들의 꼬리가 식염수(37℃에 침지된 상태로 놓았다. 절단 5분 전에 오른쪽 측면 꼬리 정맥에 투여를 수행하였다. 본 TVT 모델(Johansen 등의 문헌[Haemophilia, 2016, 625-31] 참조)에서는 측면 정맥을 횡절단하였다. 출혈이 10, 20 또는 30분에 멈추면, 꼬리를 식염수로부터 꺼내서, 식염수를 적신 거즈 면봉으로 상처를 부드럽게 닦아냈다. 총 실혈은 40분 후에 식염수 중 헤모글로빈의 양을 정량화하여 결정하였다. 투여 후 40분차에, 혈액 샘플을 안와총으로부터 3.8% 시트르산 삼나트륨에 수집하였다. 혈액을 4000 g로 5분 동안 원심분리하고, 혈장을 분취액으로 나누고, hIgG(실시예 23 참조), 총 FVII(a) 항원(실시예 24 참조), 및 FVIIa 활성(실시예 8 참조)에 대한 분석 시까지 -80℃에서 보관하였다.　
표 31에 나타낸 바와 같이, FVIIa 및 biAb의 모든 조합은 biAb 단독 투여 또는 biAb 없이 투여된 FVII(a)와 비교하여 실혈을 유의하게 감소시켰다. 모든 조합의 경우, 치료 후 45분에 측정된 혈소판 수는 비히클 군에 대해 관찰된 것과 비슷하였다.
결론적으로, 이들 데이터는 예상 정태 수준의 FVIIa, FVII, 및 FVII:AT의 존재 하에 biAb0001의 유의한 생체 내 지혈 효과를 입증한다.
biAb0001, FVIIa, FVII, 및 FVIIa:AT의 조합을 표시된 바와 같이 투여한 FVIII 녹아웃/쥣과 TLT-1 녹아웃/인간 TLT-1 녹인 마우스에서 꼬리 정맥 횡절단(TVT) 후의 실혈. 투여된 투여량, 예상 및 측정된 혈장 농도, 및 결정된 실혈은 평균 ± SEM(n = 10)으로 표시된다. 일원 ANOVA에 이어서 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 결과, 군 3~5의 실혈은 군 1 및 2와 유의하게 다른 것으로 밝혀졌다. 총 FVII(a) 항원 농도(실시예 23에 따라 측정됨)는 ‘FVII’로 표지된 행에 나열되어 있고, 값은 별표로 표시되어 있다.
군 공동 투여 화합물 투여량
(nmol/kg) 		예상 혈장
농도 (nM) 		측정된 혈장 농도(nM) 실혈
(nmol 혈액)
1 biAb0001 0.5 4 7.1 ± 0.4 3935 ± 711
FVIIa
FVII
FVIIa:AT
2 biAb0001 3225 ± 731
FVIIa 0.5 3.8 1.8 ± 0.2
FVII 3.45 26.2 37.2 ± 1.9*
FVIIa:AT 1.18 9.0
3 biAb0001 0.5 4 5.5 ± 0.6 820 ± 187
FVIIa 0.5 3.8 3.9 ± 0.1
FVII 3.8 ± 0.2*
FVIIa:AT
4 biAb0001 5.13 40 126.3 ± 11.1 381 ± 63
FVIIa 0.5 3.8 6.3 ± 0.5
FVII 3.45 26.2 72.4 ± 5.5*
FVIIa:AT 1.18 9.0
5 biAb0001 12.83 100 586.0 ± 115.9 598 ± 150
FVIIa 0.5 3.8 5.9 ± 0.4
FVII 3.45 26.2 124 ± 14.2*
FVIIa:AT 1.18 9.0
본 발명의 특정 특징들이 본원에 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 균등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 모든 이러한 수정 및 변경을 포함하도록 의도된 것임을 이해해야 한다.
실시예 32: 경쟁 ELISA에서 TLT-1에 결합하기 위해 항-TLT-1 mAb1076과 경쟁하는 항체의 식별
경쟁 실험에 사용될 Fab 단편(항-TLT-1 Fab)은 mAb1076에 상응하는 VL 및 VH 도메인 서열(각각 서열번호 938 및 934), 인간 IgG4 CH1 도메인, 및 단일 점 돌연변이를 갖는 인간 카파 CL(G157C)을 포함한다. G 대 C 치환은 Fab 단편의 불변 도메인 내에, 즉 항원 결합 부위로부터 멀리 있고, TLT-1에 대한 결합에 영향을 미치지 않는다(실시예 20 참조). 재조합물은 WO2011/023785에 기술된 바와 같이 TLT-1로서 생산된다. 항-TLT-1 Fab는 제조사의 지침에 따라 비오티닐화 키트(EZ-link, Thermo)의 적용을 포함하는 표준 방법을 사용하여 비오티닐화된다.
항-TLT-1 항체가 TLT-1에 결합하기 위해 항-TLT-1 Fab 및 이의 유래된 항체와 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 경쟁 연구를 수행하였다. 재조합 TLT-1을 희석 완충액(20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl, pH 7.2) 중에서 4℃에서 밤새 NUNC maxisorp 플레이트에 고정시킨다. 플레이트를 세척하고 세척 완충액(20 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mL/L Tween 20, pH 7.2)에서 15분 동안 차단한다. 경쟁 연구를 위해, 최종 고정 농도로 비오티닐화된 항-TLT-1 Fab를 항-TLT-1 항체의 연속 희석물과 조합하여 희석 완충액 중 0 내지 100 mg/ml 범위의 최종 농도를 수득한다. 혼합물을 플레이트의 웰에 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, 플레이트를 세척하고, HRP-표지된 스트렙타비딘-HRPO(희석 완충액 중 1:2000; Kirkegaard & Perry Labs)를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션한다. 마지막으로, 플레이트를 세척하고 TMB ONE(KMENTEC)으로 10분 동안 현상한다. H3PO4(4 M)를 첨가하여 반응을 중단시키고, 450 nm에서 FLUOStar Optima 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하고, 620 nm에서 측정된 배경 신호의 차감한다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 인큐베이션은 실온에서 수행되고, 플레이트는 세척 완충액을 사용하여 5회 세척된다.
경쟁 연구를 위해 경쟁 항체와 혼합할 비오티닐화 항-TLT-1 Fab의 고정 농도뿐만 아니라 NUNC maxisorp 플레이트에 고정할 재조합 TLT-1의 농도는, 경쟁 항체에 의한 경쟁(즉, 신호 감소)을 검출할 수 있는 충분한 신호를 제공하기 위한 목적으로 두 성분의 개별 적정에 의해 결정된다. 고정을 위한 TLT-1의 농도는 일반적으로 0~1 mg/ml의 범위, 예컨대 125 ng/ml이다. 비오티닐화 항-TLT-1 Fab의 농도는 일반적으로 0~1 mg/ml의 범위, 예컨대 10 ng/ml이다.
측정된 신호(OD 단위)로부터, 임의의 주어진 항체 농도에서의 경쟁은 다음과 같이 계산되며
억제율(%) = (1- (OD 단위 - 100% 억제)/(0% 억제 - 100% 억제))* 100
식 중 0% 억제는 임의의 경쟁 항-TLT-1 항체가 없는 웰에서의 신호로부터 결정되고, 100% 억제는 비오티닐화 항-TLT-1 Fab가 없는 웰로부터의 신호(즉, 검정 배경에 상응함)로서 결정된다. 항체의 농도를 최대 10000배 과량의 비오티닐화 항-TLT-1 Fab에서 시험할 때, 적어도 50%의 관찰된 억제(억제율(%))가 있는 경우, 항체는 TLT-1에 결합하기 위해 항-TLT-1 Fab와 경쟁하는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Bispecific antibodies <130> 190051WO01 <160> 943 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 1 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val 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Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 931 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 931 Arg Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 932 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 932 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 933 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 933 Gly Val Phe Thr Ser 1 5 <210> 934 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 934 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg 20 25 30 Gln Gly Asn Thr Tyr Phe His Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 935 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 935 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Gln Gly Asn Thr Tyr Phe His 1 5 10 15 <210> 936 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 936 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 937 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 937 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 938 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 938 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Val Phe Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 939 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 939 Arg Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 940 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 940 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 941 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 941 Gly Val Phe Thr Ser 1 5 <210> 942 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 942 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 943 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 943 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu Tyr Ser 275 280 285 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325

Claims (15)

  1. 이중 특이적 항체로서,
    (i) 인자 VII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및
    (ii) TREM-유사 전사체 1(TLT-1)에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하며,
    제1 항원 결합 부위는
    ● 서열번호 847로 표시되는 CDRL1,
    ● 서열번호 848로 표시되는 CDRL2,
    ● 서열번호 849로 표시되는 CDRL3,
    ● 서열번호 851로 표시되는 CDRH1,
    ● 서열번호 852로 표시되는 CDRH2, 및
    ● 서열번호 853으로 표시되는 CDRH3
    을 포함하고;
    제2 항원 결합 부위는
    ● 서열번호 855로 표시되는 CDRL1,
    ● 서열번호 856으로 표시되는 CDRL2,
    ● 서열번호 857로 표시되는 CDRL3,
    ● 서열번호 859로 표시되는 CDRH1,
    ● 서열번호 860으로 표시되는 CDRH2, 및
    ● 서열번호 861으로 표시되는 CDRH3
    을 포함하고,
    항체는 Fc 영역을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  2. 제1 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 항체.
  3. 제1 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 943 및 942에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 항체.
  4. 제1 항에 따른 이중 특이적 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 응고병증 치료에 사용하기 위한 약학적 제형.
  5. 제4 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 제형.
  6. 제4 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 943 및 942에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 약학적 제형.
  7. 유효량의 이중 특이적 항체를 포함하는, 응고병증의 치료에 사용하기 위한 약학적 제형으로서,
    이중 특이적 항체는
    (i) 인자 VII(a)에 결합할 수 있는 제1 항원 결합 부위, 및
    (ii) TREM-유사 전사체 1(TLT-1)에 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 포함하며,
    제1 항원 결합 부위는
    ● 서열번호 847로 표시되는 CDRL1,
    ● 서열번호 848로 표시되는 CDRL2,
    ● 서열번호 849로 표시되는 CDRL3,
    ● 서열번호 851로 표시되는 CDRH1,
    ● 서열번호 852로 표시되는 CDRH2, 및
    ● 서열번호 853으로 표시되는 CDRH3
    을 포함하고;
    제2 항원 결합 부위는
    ● 서열번호 855로 표시되는 CDRL1,
    ● 서열번호 856으로 표시되는 CDRL2,
    ● 서열번호 857로 표시되는 CDRL3,
    ● 서열번호 859로 표시되는 CDRH1,
    ● 서열번호 860으로 표시되는 CDRH2, 및
    ● 서열번호 861으로 표시되는 CDRH3
    을 포함하고,
    응고병증은 억제제가 있거나 없는 A형 혈우병; 억제제가 있거나 없는 B형 혈우병; FVII(a) 결핍증; 및 글란즈만 혈소판무력증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 제형.
  8. 제7 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 제형.
  9. 제7 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 서열번호 846에 의해 식별된 제1 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 850에 의해 식별된 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 부위는 서열번호 854에 의해 식별된 제2 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 858에 의해 식별된 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인에 부착된 중쇄 불변 도메인은 서열번호 943 및 942에 의해 각각 식별되고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인에 부착된 경쇄 불변 도메인은 모두 서열번호 12에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 약학적 제형.
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