JP2005530817A - 嚢胞性繊維症における好中球イメージング法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１種の抗顆粒球／好中球抗体またはそのフラグメントと診断薬とを種々のイメージング法を介して用いることにより、嚢胞性繊維症（ＣＦ）を有する被験体を検出およびモニタリングする改良された方法に関する。ただし、前記顆粒球抗体は、^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３抗体Ｆａｂ’フラグメントではない。ＣＦにおいて蓄積される顆粒球の改良されたイメージングのためのプレターゲッティング法も提供される。本発明はさらに、ＣＦ患者の気道下部への好中球の送達を評価することができる簡便、非侵襲的、かつ効果的な試験、および他の好中球により媒介される肺疾患を有する患者の気道下部への好中球の送達を評価することができる効果的な試験に関する。

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、少なくとも１種の抗顆粒球／好中球抗体またはそのフラグメントと診断薬を種々のイメージング法を介して用いることにより嚢胞性繊維症（ＣＦ）を有する被験体を検出およびモニタリングする改良法に関するものである。ただし、前記抗顆粒球抗体は、^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントではない。また、ＣＦにおいて蓄積した顆粒球の改良されたイメージングのためのプレターゲッティング法も提供される。本発明はさらに、ＣＦおよび好中球により媒介される他の肺疾患を有する患者の気道下部に対する好中球送達を評価することができる簡便、非侵襲的、かつ効果的な試験に関する。

背景技術
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカサス人種の間で最もよくみられる致死的な遺伝疾患である。米国では、およそ２，５００人の新生児がＣＦを持って生まれ、約３０，０００人の大人および子供がＣＦに罹患している。ＣＦは第７染色体上の異常な遺伝子によって引き起こされる常染色体劣性遺伝疾患である。この疾患は罹患者の外分泌腺に異常に厚い粘膜を作らせ、これが通路を遮断し、瘢痕および病変を作り出す。ＣＦは主として肺および消化系に影響を及ぼす。肺では、その作用はほとんどの場合破壊的であり、ますます重篤な呼吸器障害を引き起こす。消化管では、ＣＦにより食物からの栄養素の消化が極めて困難になる場合が多い。

現在認められているＣＦの肺疾患の病理スキームは、欠陥型のＣＦ遺伝子ではじまり、その結果、塩素イオンチャンネルの活性に関与する嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）と呼ばれる遺伝子のタンパク質産物の不在または欠陥を招く、というものである。この欠陥の主な病態生理学的作用は、異常な粘膜が気道閉塞を引き起こすといったような、気道環境の変化であると考えられている。これは緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)などのＣＦ気道に指向性を持つ生物に感染することにより進行する。ＣＦの病因における主要な決定因子としての粘稠な分泌物および慢性的なシュードモナス感染による気道閉塞の他、別の主要な原因として炎症が関連づけられている。Konstan, M. W. et al., Infection and Inflammation in the Lung in Cystic Fibrosis, in Cystic Fibrosis, Davis, P. B.(ed.), Marcel Dekker, Inc., NY (1993)を参照されたい。この感染に対する炎症応答は過大かつ持続性である。これは、最終的には肺の破壊をもたらす気道閉塞、感染および炎症の悪循環の段階をもたらす。Davis, P. B.et al. Am. J Respir. Crit. Care Med. 154:1229-1256 (1996)およびKonstan, M. W. et al., Pediatr. Pulmonol. 24:137-142 (1997)を参照されたい。

ＣＦＴＲは細胞内の他のタンパク質のプロセシングおよび化学的変更に影響を及ぼし得る。この発生のメカニズムはまだ明らかではない。しかし、研究者らは、ＣＦにおいて変更された膜タンパク質はシュードモナスの付着部位として働くことができ、おそらくはＣＦ患者の感染に対する高い感受性を説明する助けとなるといういくつかの証拠をつかんでいる。

ＣＦにおける異常な粘液分泌物を産生する組織としては、気道、肝臓の胆管、胃腸管（ＧＩＴ）、膵管、および男性の尿生殖管が挙げられる。正常な粘液はこれらの組織の内面を縁取る細胞を感染から保護する重要な役割を果たすゲル様のバリアを形成する。これらの組織を感染から保護する代わりに、ＣＦにおける異常な粘液は気道や管を閉塞させ、組織の損傷を来す。さらに、細菌が増殖する環境を与える。これに応じて感染と闘うため、白血球細胞または好中球（ＷＢＣ）が肺に補充される。しかし、これらの細胞は死滅し、それらの粘性のある遺伝物質（ＤＮＡ）を粘液中に放出する。次に、この粘性のあるＤＮＡは、すでに形成されている異常な粘液をさらに悪化させ、さらなる気道閉塞と感染を引き起こす。

ＣＦの炎症成分は好中球の持続的な浸潤を特徴とし、これには臨床的安定期が含まれる。Konstan, M. W. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:448-454 (1994)を参照されたい。これは、多くの患者ではしばしば生まれた最初の年、疾病の経過のごく初期に起こり、明確な感染がなくとも現れることがある。Konstan, M. W. et al., Pediatr. Pulmonol. 24:137-142 (1997)を参照されたい。実際、米国とオーストラリアで行われた気管支肺胞洗浄(bronchioalveolar lavage, BAL)研究では、症候的な肺疾患がない幼児であっても、炎症と多数の好中球を伴う著しい気管支内細菌感染を発症したことが分かっている。Khan, T. Z. et al., Am. J. Respir. Case Med. 151:1075-1082 (1995)およびArmstrong, D. S. et al., BMJ 310:571-1572 (1995)を参照されたい。さらに、これら２つの研究において、炎症は４週齢といった早期の何人かの乳児にも存在することが分かった。

また、ＢＡＬ研究では、臨床的には明らかに健康で、肺の増悪もない、軽度の肺疾患を有するＣＦ患者において、重篤な局部的炎症応答があることが明らかになった。これらの患者の気道には相当な量の細菌、特に緑膿菌が含まれており、炎症細胞および免疫グロブリン（Ｉｇ）の顕著な増加が見られた。また、おそらくは気道に過剰な数の好中球があるために、上皮内層流体において阻害されていない（活性型の）好中球エラスターゼの量が顕著に増加していた。活性型エラスターゼは肺に傷害を与えることが示されている。Bruce, M. C. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 132:529-535 (1985)を参照されたい。エラスターゼは好中球および緑膿菌からそれぞれ補体受容体およびオプソニン補体フラグメントを開裂させ、オプソニン食作用を無効にし、また、感染を延長させる。Berger, M. et al, J. Clin. Invest. 84:1302-1313 (1989)およびTosi, M. F. et al., J. Clin. Invest. 86:300-308 (1990)を参照されたい。

ＣＦ気道におけるエラスターゼおよびその他の炎症メディエーターの有害な作用に関し、炎症の軽減またはＣＦにおける炎症の傷害性産物の妨害を目的としたいくつかの治療的介入が検討されている。これらにはプレドニソンおよびイブプロフェンなどの抗炎症薬(Auerbach, H. S. et al., Lancet 2:686-688 (1985)およびKonstan, M.W., et al., J. Pediatr. 118:956-964(1991))；外的に投与されるα_１−ＰＩおよび分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤などの抗プロテアーゼ(McElvaney, N. G. et al., Lancet 337:392-394(1991)およびMcElvaney, N. G. et al., J. Clin. Invest. 90:1296-1301(1992))；および外的に投与されるデオキシリボヌクレアーゼ(Hubbard, R. C. et al., N. Eng. J. Med. 326:812-815 (1992))が含まれる。さらに、診断用の抗体系も検討されている。Gratz et al., Eur. J. Nucl. Med., 25(4):386-93 (1998)を参照されたい。

炎症プロセスがどのように開始され摂動するかにかかわらず、抗炎症治療は生まれた後早期に開始すべきであり、できる限りの最大の程度で感染を制御すべきであることが明らかになっている。しかし、この疾病のメカニズム研究は、その状態のモニタリング（現在のところ、気管支鏡から得られる気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液の分析によって行われている）の困難性により妨げられている。この手法のコストおよび侵襲性がその使用を制限しているだけでなく、この手法では肺の５％未満をサンプリングするに過ぎない。気道下部の粘膜への好中球送達に代わるマーカーとして口腔粘膜への好中球送達も使用できるが、このアッセイでは、患者は２週間にわたって９回定期的に口腔洗浄標本を提供する必要があるため、非常に患わしいものである。さらに、このアッセイがＣＦ患者の気道下部で起こっている現象の妥当な代用であるかどうかは分かっていない。

当技術分野では、ＣＦ患者において肺感染症をモニタリングする、また、その蔓延を遅らせるために、ＣＦの初期診断／検出試験を提供する必要性が引き続き存在する。ＣＦ患者の気道下部への好中球送達を評価することができる簡単で効果的な試験を開発する必要性が引き続き存在する。さらに、患者にとって最小限のリスクしか伴わず、患者からのインプットも最小限しか必要とせず、試験の有効性を損なわずに気管支肺胞洗浄を伴う気管支鏡よりも費用がかからない最適なＣＦアッセイが必要とされている。

この最適な試験への実行可能なルートは、放射性標識モノクローナル抗体、それらのフラグメントおよび関連の多価かつ／または多重特異性構築物を用いて特定の生体分子受容体をターゲッティングした後、イメージングにより同定するラジオイムノシントグラフィーを介するものであり得る(例えば、Hakki, S. et al., Clin. Orthopedics 335:275-285 (1997))。この方法は骨髄炎(Harwood, S. J. et al., Cell Biophysics. 24/25:99-107 (1994); Becker, W. et al., J. Nucl. Med. 35:1436-1443 (1994))、軟組織感染(Barron, B. et al., Surgery 125:288-295 (1999))、虫垂炎(Barron, B.,et al., 同上)、および血管炎(Jonker,ND. et al., J. Nucl. Med. 33:491-497 (1992))をはじめとするいくつかのヒトの疾病および症状に適用されている。これらの領域においてこれらのモノクローナル抗体が有意な診断能力を示すにもかかわらず、ＣＦ患者の肺の炎症症状の評価を目的としたこの技術の適用は採用されてこなかった。よって、ＣＦ患者の肺の炎症をモニタリングするために、核イメージングと組み合わせた放射性標識モノクローナル抗体を用いる必要がある。

発明の概要

よって、本発明の１つの目的は、嚢胞性繊維症（ＣＦ）、特に初期段階のＣＦを診断し、それにより細菌感染の蔓延を妨げ、同時に疾病の重篤度を最小限とする方法を提供することである。

また、ＣＦを有すると疑われる、またはＣＦに関して診断されるヒト被験体においてＣＦをアッセイし、その程度をモニタリングする安全かつ効果的な方法を提供することも本発明の１つの目的である。

さらに、ＣＦ患者の気道下部への好中球／顆粒球送達を評価し得る方法を開発することも本発明の１つの目的である。

これらの目的および他の目的を達成するため、本発明の一つの態様によれば、被験体において嚢胞性繊維症（ＣＦ）を診断する方法であって、診断に有効な量の少なくとも１種の抗顆粒球抗体またはそのフラグメント、および医薬上許容される担体を該被験体に投与することを含んでなる方法が提供され、該抗顆粒球抗体またはそのフラグメントは診断薬と結合して抗体複合体を形成する。ただし、前記抗顆粒球抗体は、^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメント以外のものとされる。しかし、キメラ、ヒト化、ヒトまたはマウス（ただし、このマウスはマウスＦａｂ’フラグメント以外のものである）のいずれかのような別の形態のＭＮ−３モノクローナル抗体は本発明で使用できる。さらに、マウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントも、^９９ｍＴｃ以外の放射性核種と結合される限り、本発明で使用できる。

本発明の別の態様によれば、好中球エピトープに結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。ただし、該抗顆粒球抗体またはフラグメントは、^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントではない。

別の実施態様では、診断薬は二重特異性または多重特異性抗体（この抗体の少なくとも１つの結合アームは抗顆粒球抗体またはそのフラグメントからなる）の少なくとも１つの結合アームにより認識される第二の部分に結合され、それにより、抗顆粒球抗体／二重特異性抗体がＣＦ含有顆粒球へターゲッティングされた後、二重特異性抗体の非顆粒球結合アームと結合する第二の薬剤（結合された診断薬を含む）を投与し、その抗顆粒球抗体アームにより顆粒球結合部位へ該診断薬を送達する。血液および身体からターゲッティングされなかった抗体を除去するために、この２回の注射の間に適当な時間をとる。

本発明では多様な抗顆粒球抗体を使用することができる。例えば、限定されるものではないが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、およびＭＡｂ４７が挙げられる。また、抗体は、抗ＣＤ１５および抗ＣＤ−３３のように、単一の顆粒球前駆体に存在する抗原に向けることもできる。Thakur et al., Nucl. Med., 37:1789-95 (1996); Ball et al., J. Immunol., 30:2937-41 (1983); PCT WO 02/12347（これらの全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）を参照されたい。ある実施態様では、抗顆粒球抗体は、ヒトより下等な霊長類（subhuman primate）に由来する抗体、マウスモノクローナル抗体、、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される。さらなる実施態様では、ターゲッティング剤はｓｃＦｖ構築物の再操作形態であってもよく、これにより多重特異性および多価構築物をはじめとする、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーなどが使用できる。例えば、多価単一特異性抗体は、好中球エピトープに対して親和性を有する２以上の抗原結合部位を含んでなる。別の例としては、好中球エピトープに対して親和性を有する１以上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する１以上のハプテン結合部位とを含んでなる多価多重特異性抗体がある。

本発明の別の態様によれば、好中球エピトープと結合する抗顆粒球ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなる好中球エピトープターゲッティング診断複合体が提供される。前記抗体成分は少なくとも１種の診断薬に結合されている。ただし、前記抗顆粒球Ｍａｂフラグメントは、^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３抗体Ｆａｂ’フラグメントではない。

本発明のさらに別の態様によれば、診断薬を標的へ送達する、またはＣＦを有する被験体を検出およびモニタリングする方法であって、上記の節で記載した抗体を被験体に投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および前記抗体の結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を該被験体に投与することを含んでなる方法が提供される。

本発明のさらに別の実施態様によれば、抗体複合体は放射性標識され、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２２１Ａｔ、^２１３Ｂｉ、^２２４Ａｃ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択される放射性核種を含んでなる。これらの放射性核種は単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いてイメージングされる。

さらなる実施態様によれば、診断薬は、常磁性イオン、ならびにＭＲＩ、Ｘ線およびＣＴ造影剤用のその他の薬剤、超音波増強剤および蛍光放射体からなる群から選択される。診断薬は、イメージングに用いられる１以上の放射線造影剤を含んでもよい。

本発明の他の目的、特徴および利点は以下の具体的説明から明らかになる。具体的説明および具体的な実施例は好ましい実施態様を示すものであるが、当業者には、この具体的説明から、本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変が明らかであるので、単に例として示すものである。さらに、これらの実施例は本発明の原理を示すものであり、先行技術において当業者にとって有用であることが自明である総ての感染例に対する本発明の適用を具体的に例示することが期待できるものではない。

発明の具体的説明

定義
以下の説明において、多数の用語が広く用いられている。本発明の理解を容易にするために以下の定義を示す。

特に断りのない限り、可算名詞("a"または"an")は１つ以上のものを意味する。

「嚢胞性繊維症」とは、膵臓不全、気道粘膜の脱水症、肺の慢性細菌感染、および腸閉塞をはじめとする広範囲の症候を特徴とする多臓器の外分泌上皮腺の致死的な遺伝疾患と定義される。

「抗顆粒球抗体」とは、好中球／顆粒球／骨髄球系の１以上の細胞種に存在する抗原を認識する抗体をいう。

「キメラ抗体」は、齧歯類抗体に由来する可変ドメインと相補性決定領域を含み、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。

「ヒト化抗体」は、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域がマウス免疫グロブリンの重および軽鎖可変鎖からヒト可変ドメインへと移された組換えタンパク質である。

「完全ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンの総ての軽および重鎖可変鎖、ならびにその他の総ての枠組み構造を有し、非ヒト成分またはドメインが存在しない。

「抗体成分」とは、完全な抗体と抗体フラグメントの双方を含む。

「抗体融合タンパク質」とは、１以上の抗体成分と診断薬を含んでなる組換え分子をいう。融合タンパク質は単一の抗体成分、異なる抗体成分の多価の組み合わせまたは同じ抗体成分の複数コピーを含んでもよい。

「構造遺伝子」は、後に特定のポリペプチドの特徴的なアミノ酸配列へと翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ分子である。

「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に近接した遺伝子の５’領域に位置する。プロモーターが誘導プロモーターであれば、転写速度は誘導因子に応答して上昇する。これに対し、プロモーターが構成プロモーターであれば、転写速度は誘導因子によっては調節されない。

「単離されたＤＮＡ分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていないＤＮＡの断片である。例えば、クローニングされた抗体遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡから分離されたＤＮＡ断片である。単離されたＤＮＡ分子の別の例としては、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学的に合成されたＤＮＡ分子がある。

「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または方向に関係なく転写効率を増強することができるＤＮＡ調節エレメントである。

「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖のＤＮＡ分子である。典型的には、逆転写の開始にはｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが用いられる。また、当業者は、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子をさす場合にも「ｃＤＮＡ」を用いる。

「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合、発現は構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。

「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどのＤＮＡ分子である。クローニングベクターは典型的には１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、この部位に外来ＤＮＡ配列が、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子とともに、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなく、確定できる様式で挿入され得る。マーカー遺伝子は典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。

「発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。

「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらかを含む任意の原核または真核細胞であってよい。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作された原核または真核細胞も含む。

「抗体フラグメント」とは、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂなどのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは、無傷の抗体により認識されるものと同じ抗原に結合する。例えば、抗ＮＣＡ−９０モノクローナル抗体フラグメントは、ＮＣＡ−９０のエピトープと結合する。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質をも含む。例えば、抗体フラグメントとしては、重鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子、および超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが挙げられる。

「抗体複合体」は、抗体成分と治療薬または診断薬との複合体である。この診断薬は、放射性または非放射性標識、放射線造影剤（磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法、Ｘ線または超音波診断法のための放射線造影剤など）を含んでなり、この放射性標識はγ−、β−、α−、オージェ電子、または陽電子を放射する同位元素であり得る。

説明
この最適な試験への実行可能なルートは、放射性標識モノクローナル抗体、それらのフラグメントおよび関連の多価かつ／または多重特異性構築物を用いて特定の生体分子受容体をターゲッティングした後、これをイメージングにより特徴づけるラジオイムノシンチグラフィーを介するものであり得る(例えば、Hakki, S. et al., Clin. Orthopedics 335:275-285 (1997))。この方法は骨髄炎(Harwood, S. J. et al., Cell Biophysics. 24/25:99-107 (1994); Becker, W. et al., J. Nucl. Med. 35:1436-1443 (1994))、軟組織感染(Barron, B. et al., Surgery 125:288-295 (1999))、虫垂炎(Barron, B.,et al., 同上)、および血管炎(Jonker,ND. et al., J. Nucl. Med. 33:491-497 (1992))をはじめとするいくつかのヒトの疾病および症状に適用されている。これらの領域においてこれらのモノクローナル抗体が顕著な診断能力を示すにもかかわらず、ＣＦ患者の肺の炎症症状の評価を目的としたこの技術の適用は採用されてこなかった。よって、ＣＦ患者の肺の炎症をモニタリングするために、核イメージングと組み合わせた放射性標識モノクローナル抗体を用いる必要性がある。

本発明によれば、嚢胞性繊維症をモニタリングおよび診断する改良された方法が提供される。本発明による方法は、好中球のエピトープに結合する、放射性標識された抗顆粒球特異的抗体を用い、これによるイメージングによってそれらの移動を追跡する。

本発明で用いる抗顆粒球抗体は、顆粒球／好中球の種々の細胞種に関連する抗原に対するものとされる。本発明では、これらの抗体として様々なものが使用できる。ある実施態様によれば、本発明による方法は抗ＮＣＡ−９０抗体を用いる。このような抗体の好ましい例としてはＭＮ−３がある。Hansen et al., Cancer 71:3478-3485 (1993); Becker et al., Semin. Nucl. Med. 24(2):142-53 (1994)を参照されたい。別の実施態様によれば、抗ＮＣＡ−９５抗体、抗ＣＤ−３３または抗ＣＤ−１５抗体が用いられる。Thakur et al., J. Nucl. Med., 37:1789-95 (1996); Ball et al., J. Immunol., 30:2937-41 (1983); 国際公開第０２／１２３４７号パンフレット（これらの全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）を参照されたい。さらにその他の実施態様によれば、クラスＩＩＡ抗ＣＥＡ抗体であるＭＮ−２およびＮＰ−２、ならびにクラスＩ抗ＣＥＡ抗体であるＭＮ−１５およびＮＰ−１が用いられる。Hansen et al., Cancer 71:3478-3485 (1993); Primus et al., Cancer Res. 43:686-692 (1983)を参照されたい。さらに、ＭＮ−３、ＢＷ２５０／１８３、およびＭＡｂ４７が用いられる。これらの抗体のヒト型およびキメラ型のものが好ましく、完全ヒト型およびヒト化型のものが最も好ましい。また、ヒトより下等な霊長類からの抗体およびマウスモノクローナル抗体を用いてもよい。多重特異性かつ／または多価のｓｃＦｖ構築物も本発明に好適である。

抗体の生産
顆粒球に特異的な齧歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。一般に、Kohler and Milstein, Nature 256:495（1975)、Coligan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY（John Wiley & Sons 1991）を参照されたい。要するに、マウスに、例えばＮＣＡ−９０を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗ＮＣＡ−９０抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、その抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによりモノクローナル抗体を得ることができる。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養液から種々の周知の技術により単離および精製することができる。このような単離技術としては、Ａタンパク質セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, 1991); Baines et al., pp.79-104, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (The Humana Press, Inc., 1992)を参照されたい。

適当量のＮＣＡ−９０（ＣＤ６６ｃとも呼ばれる）抗原は、当技術分野で周知の標準的な技術を用いて得ることができる。例えば、ＮＣＡ−９０タンパク質は、ＮＣＡ−９０を過剰産生するトランスフェクト培養細胞から得ることができる。ＮＣＡ−９０をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、公表されているＮＣＡ−９０ヌクレオチド配列を用いて構築することができる。Oikawa et al., Biochem. Bophys. Res. Commun. 146:464-460 (1987); Wilson et al., J. Exp. Med. 173:137 (1991); Wilson et al., J. Immunol. 150:5013 (1993)を参照されたい。同様に、ＮＣＡ−９５タンパク質を産生する発現ベクターは公表されているＮＣＡ−９５ヌクレオチド配列を用いて構築することができる。Berling et al., Cancer Res. 50:6534-6539 (1990)を参照されたい。

一例として、ＮＣＡ−９０をコードするＤＮＡ分子は成熟プライミング長鎖オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ分子を合成することにより得ることができる。Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., 1990); Wosnick et al., Gene 60:115 (1987); Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., 1995)を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術によれば、１．８キロベース長といった大きな遺伝子を合成することができる。Adang et al. Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993); White (ed.), METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, pp. 263-268 (Humana Press, Inc., 1993)を参照されたい。このアプローチのバリエーションでは、抗ＮＣＡ−９０モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の技術を用い、骨髄腫細胞を、ＮＣＡ−９０ｃＤＮＡで安定的にトランスフェクトされたマウスプレ−Ｂ細胞系で感作したマウスからの脾細胞と融合させることにより得られる。

本発明では種々の抗顆粒球抗体を用いることができる。例としては、限定されるものではないが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、およびＭＡｂ４７、ならびにＣＤ１５およびＣＤ３３に対する抗体が挙げられる。ある実施態様によれば、抗顆粒球抗体は、ヒトより下等な霊長類からの抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される。抗体はまた、抗ＣＤ−１５および抗ＣＤ−３３など、単一の顆粒球前駆体に存在する抗原に対するものとすることもできる。Thakur et al., J. Nucl. Med, 37:1789-95 (1996); Ball et al., J. Immunol., 30:2937-41 (1983); PCT WO 02/12347（これらの全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）を参照されたい。

好適なマウス抗ＮＣＡ−９０モノクローナル抗体の一例として、無傷のＭＮ−３モノクローナル抗体がある。このＭＮ−３抗体は、ＧＷ−３９ヒト結腸腺癌異種移植片由来の部分精製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するハイブリドーマから単離されたものである。Hansen et al., Cancer 71:3478-3485 (1993)を参照されたい。ＭＮ−３抗体は顆粒球、ならびに正常な結腸粘膜および結腸腺癌で発現される同型の接着分子ＮＣＡ−９０抗原に特異的である。Becker et al., Semin. Nucl. Med. 24(2):142-53 (1994); Watt et al., Blood 78:63-74 (1991)を参照されたい。^９９ｍＴｃに結合されたマウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントである抗ＮＣＡ−９０抗体は本発明では使用されない。しかし、キメラ、ヒト化、ヒトまたはマウスのいずれかのような別の形態のＭＮ−３モノクローナル抗体は本発明で使用できる。さらに、マウスＭＮ−３モノクローナル抗体Ｆａｂ’フラグメントも、^９９ｍＴｃ以外の放射性核種と結合されている限り、本発明で使用できる。

好適なマウス抗ＮＣＡ−９５抗体の一例としては、ＢＷ２５０／１８３抗体がある。Bosslet et al., Int. J. Cancer, 36:75-84 (1985); Meller et al., J. Nucl. Med. 39:1248-1253を参照されたい。もう一つ有用な抗ＮＣＡ−９５抗体としてＭａｂ４７がある。Audette et al., Mol. Immunol. 24:1177-1186 (1987)を参照されたい。

別の好適な抗体としてＭＮ−２モノクローナル抗体がある。ＭＮ−２抗体は、ＧＷ−３９ヒト結腸腺癌異種移植片由来の部分精製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するハイブリドーマから単離されたものである。Hansen et al., Cancer 71:3478-3485 (1993)を参照されたい。クラスＩＩＡ抗ＣＥＡ抗体としてのＭＮ−２は、当技術分野で周知の遮断アッセイを用いて容易に同定することができる。引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第４，８１８，７０９号明細書を参照されたい。

別の好適な抗体としてＭＮ−１５モノクローナル抗体がある。ＭＮ−１５抗体はＮＣＡ−９０とＮＣＡ−９５の間で交差反応性を示す。ＭＮ−１５は、ＧＷ−３９ヒト結腸腺癌異種移植片由来の部分精製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するハイブリドーマから単離されたものである。Hansen et al., Cancer 71:3478-3485 (1993)を参照されたい。クラスＩ抗ＣＥＡ抗体としてのＭＮ−１５は、当技術分野で周知の遮断アッセイを用いて容易に同定することができる。

さらに別の好適な抗体としてＮＰ−２モノクローナル抗体がある。ＮＰ−２はＭＮ−２の場合と同様の特異性を有する。ＮＰ−２は、Krupey et al. (Immunochem. 9:617 (1972))の手順をNewman et al. (Cancer Res. 34:2125 (1974))が改変したものに従って、ヒト結腸腺癌の肝臓転移物に由来の部分精製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するハイブリドーマから単離されたものである。Primus et al., Cancer Res. 43:686-92 (1983); 米国特許第４，８１８，７０９号明細書を参照されたい。

さらに別の好適な抗体としてＮＰ−１モノクローナル抗体がある。ＮＰ−１はＭＮ−１５の場合と同様の特異性を有する。ＮＰ−１は、Krupey et al. (Immunochem. 9:617 (1972))の手順をNewman et al. (Cancer Res. 34:2125 (1974))が改変したものに従って、ヒト結腸腺癌の肝臓転移物に由来の部分精製した癌胎児性抗原（ＣＥＡ）で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するハイブリドーマから単離されたものである。Primus et al., Cancer Res. 43:686-92 (1983); 米国特許第４，８１８，７０９号明細書を参照されたい。

さらなる実施態様によれば、本発明による抗体は、ヒト抗体の可変領域が、マウス抗体、例えば齧歯類抗ＮＣＡ−９０抗体の可変領域で置換されているキメラ抗体である。本明細書に記載のキメラ抗体は、ある種、好ましくは齧歯類抗体に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、一方で、その抗体分子の定常ドメインがヒト抗体に由来するものである組換えタンパク質である。キメラ抗体の利点としては、免疫原性の軽減とin vivo安定性の増強が挙げられる。キメラ抗体を構築する技術は当業者に周知である。Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)を参照されたい。

別の実施態様によれば、本発明による抗体は、ヒトより下等な霊長類からの抗体である。ヒヒにおいて治療上有用な抗体を惹起する一般的な技術は、例えばGoldenberg et al., 国際公開第９１／１１４６５号パンフレット (1991)（その全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる）、およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)に記載されている。

さらに別の実施態様によれば、本発明による抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体である。すなわち、マウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリン、例えば齧歯類抗ＮＣＡ−９０抗体の重および軽鎖可変鎖からヒト可変ドメインへ移され、その後、それらのマウス対応物の枠組み構造領域中のいくつかのヒト残基が置換されている。非ヒトモノクローナル抗体はヒト宿主により外来タンパク質として認識され、繰り返し注射すると有害な過敏感反応を招くことがあるので、マウス抗体配列をヒト化すれば、患者が受け得る有害な免疫応答を軽減することができる。マウスに基づくモノクローナル抗体では、これはしばしばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれる。ヒト化抗体またはそのフラグメントの枠組み構造領域のいくつかのヒト残基はそれらのマウス対応物で置換するのが好ましい。この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体に由来する。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般技術は、例えばOrlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を生産する技術は、例えばJones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)およびSinger et al., J. Immun. 150:2844 (1993)に記載されている。

マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般技術は、例えば、引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる、Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化ＭＡｂを生産する技術は、例えばCarter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1992), Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1 (1992)およびColigan 10.19.1-10.19.11（各々、引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。

一般に、抗体のＶ_Ｋ（可変軽鎖）およびＶ_Ｈ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング手順によって得ることができる。このＶ遺伝子配列に基づき、引用することにより本明細書の一部とされるLeung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995)が記載しているようにして、ヒト化抗体をデザインおよび構築することができる。ｃＤＮＡは、一般的な分子クローニング技術(Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd Ed (1989)により、マウスまたはキメラ抗体を産生するいずれの公知のハイブリドーマ系統またはトランスフェクト細胞系統から調製してもよい。

一般に、抗体は細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。キメラ抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用いて、細胞を回転瓶中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍｌ画分を、１０μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０(Amicon, Beverly, MA)を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。保存のためには、サンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。

別の実施態様によれば、本発明による抗体はヒトモノクローナル抗体とされる。このような抗体は、例えば、抗原投与に応答して特異的なヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在する重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッティング破壊を含む胚幹細胞に由来するマウス系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作出できる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は当技術分野で周知である。Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994); Lonberg et al., Nature 368:856 (1994); Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994); Bruggeman et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458 (1997)を参照されたい。また、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレー技術（総て当技術分野で公知である）によって完全ヒト抗体を構築することもできる。Aujame et al., Hum. Antibodies, 8:155-168 (1997)を参照されたい。例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体およびそのフラグメントをin vitro生産するにはMcCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を繊維状バクテリオファージの主要または二次的コートタンパク質のいずれかのフレーム内にクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとしてディスプレーさせる。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づいて選択すれば、その特性を示す抗体をコードする遺伝子も選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは様々な形式で行うことができ、それらの総説に関しては、例えばJohnson and Chiswell, Curre
nt Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)を参照されたい。

本発明による完全なヒト抗体、すなわちヒトＭＮ−２は、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするMendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 米国特許第５，６３３，４２５号明細書を参照されたい。例えば、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。このマウス体液性免疫系は、内在する免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑で、多数の離散セグメントを含み、それはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを保証するには、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系構造においてヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成に始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入配列はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。一つは重鎖遺伝子座、もう一つは軽鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞の融合を通じてマウスに個々に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラ雄動物を、生殖細胞系を通じてＹＡＣを伝達する能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスと交配させる。１種はヒト重鎖遺伝子座を含み、もう１種はヒト軽鎖遺伝子座を含む２種のトランスジェニック系統を繁殖させることにより、免疫感作に応答してヒト抗体を産生する子孫が作出される。

ＭＡｂは当業者に周知の種々の技術によって同定することができる。例えば、ＭＡｂの特定の抗原と結合する能力は間接的免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリーまたはウエスタン分析を用いて確認することができる。

抗体フラグメントの生産
本発明では、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ１５、および抗ＣＤ−３３抗体のフラグメントの使用が意図される。特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。他の抗体フラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製できるＦ（ａｂ）'_２フラグメント、およびＦ（ａｂ'）_２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できるＦａｂ'フラグメントが挙げられる。これらの方法は、例えばGoldenberg, 米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書ならびにそこに挙げられている参照文献（これらの特許は引用することによりその全開示内容が本明細書の一部とされる）に記載されている。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter,Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL.1, page 422 (Academic Press 1967)、およびColigan 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4も参照されたい。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするＦａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。

単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、Ｖ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインを含んでなる。このＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合されている。ｓｃＦｖ分子は、Ｖ_ＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、Ｖ_Ｌ−Ｌ−Ｖ_Ｈ、またはＶ_ＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、Ｖ_Ｈ−Ｌ−Ｖ_Ｌと表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号明細書、同第４，９４６，７７８号明細書、R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80（1995）およびR. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9:132-137(1991）を参照されたい。これらの参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。

本発明による組み合わせ療法で用いる免疫複合体は、抗体フラグメントを含むことができる。このような抗体フラグメントは、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）_２と表される５Ｓフラグメントを与えることにより作製することができる。このフラグメントはチオール還元剤、および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により２つの一価Ｆａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号明細書および同第４，３３１，６４７号明細書、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されている。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J. 73:119(1959)、Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY p. 422 (Academic Press 1967)、およびColigan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, 1991)も参照されたい。

重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような、抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り、用いてよい。例えば、ＦｖフラグメントはＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖の会合を含む。この会合はInbar et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)に記載のように非共有結合であり得る。あるいは、これらの可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって結合させることもできるし、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋することもできる。Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照されたい。

好ましくは、Ｆｖフラグメントはペプチドリンカーによって結合されたＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖を含んでなる。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦＶ）は、オリゴヌクレオチドにより結合されたＶ_ＨおよびＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる構造遺伝子を構築することにより調製される。この構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に、これを大腸菌(E. coli)のような宿主細胞に導入する。この組換え宿主細胞は２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する一本のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦＶを生産する方法は当技術分野で周知である。Whitlow et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991); Bird et al., Science, 242:423 (1988); 米国特許第４，９４６，７７８号明細書; Pack et al., Bio/Technolog 11:1271 (1993)、およびSandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照されたい。

別の形態の抗体フラグメントとして、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドがある。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は目的抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymoloy 2:106(1991); Ritter et al. (eds.), MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, p.166-179 (Cambridge University Press, 1995); Birch et al. (eds.), MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, p.137-185 (Wiley-Liss, Inc., 1995)を参照されたい。

本発明では、放射性同位元素またはその他のイメージング剤と結合するか、または診断薬を運ぶ分子と相互作用する抗体およびフラグメントが意図される。診断薬としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発行標識および常磁性標識を挙げることができる。放射性標識診断免疫複合体は、γ放出放射性同位元素、陽電子放出（β^＋）放射性同位元素、Ｘ線またはコンピューター断層撮影法増強造影剤、蛍光放出化合物、ＭＲＩ造影剤および／または超音波増強剤を含んでもよい。特に有用な診断用放射性同位元素としては、限定されるものではないが、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種が挙げられ、２０〜４，０００ｋｅＶの範囲の減衰エネルギーを有するものが好ましく、２５〜４，０００ｋｅＶの範囲であるのがより好ましく、４０〜１，０００ｋｅＶの範囲であるのがさらに好ましく、７０〜７００ｋｅＶの範囲であるのがさらに好ましい。有用な陽電子放出放射性同位元素の総減衰エネルギーは、好ましくは＜２，０００ｋｅＶであり、より好ましくは１，０００ｋｅＶより小さく、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。ガンマ線検出を用いる診断薬として有用なさらなる放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｙｂ−１６９、およびＨｇ−１９７が挙げられる。有用なガンマ線放出放射性核種の減衰エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。

本発明による方法に好適な放射性同位元素としては、ヨウ素−１２６、臭素−７７、インジウム−１１３ｍ、ルテニウム−９５、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０５、テルル−１２１ｍ、テルル−１２２ｍ、テルル−１２５ｍ、ツリウム−１６５、ツリウム−１６７、ツリウム−１６８、銀−１１１、白金−１９７、パラジウム−１０９、リン−３３、スカンジウム−４７、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、ロジウム−１０５、プラセオジム−１４２、プラセオジム−１４３、テルビウム−１６１、ホルミウム−１６６、金−１９９、コバルト−５８、およびクロム−５１が挙げられる。好ましくは放射性同位元素は１０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは５０〜１，５００ｋｅＶ、最も好ましくは５０〜５００ｋｅＶの範囲で放射する。

外部イメージングに好ましい同位元素としては、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、ガリウム−６７、ガリウム−６８、ルテニウム−９７、テクネチウム−９９ｍ、コバルト−５７、コバルト−５８、クロム−５１、鉄−５９、セレン−７５、タリウム−２０１、フッ素−１８、テクネチウム−９４ｍおよびイッテルビウム−１６９が挙げられる。

内部検出に最も好ましい同位元素としては、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、ガリウム−６８、フッ素−１８およびガリウム−６７、ならびにβエネルギー検出プローブとともに用いられる特定のβ放射同位元素が挙げられる。

本発明の方法は磁気共鳴（ＭＲＩ）イメージング剤を伴える。ＭＲＩイメージング剤としては放射性同位元素ではなく特定の磁気共鳴（ＭＲ）増強種を含む。ＭＲＩでは、生じたシグナルは、イメージングされる領域内の水分子の水素原子の核におけるプロトンの磁気モーメントの緩和時間に相関する。ＭＲＩ増強剤は緩和速度を増し、それによりイメージング剤が固着する領域の水分子と体内の他の場所の水分子の間のコントラストを増強することによって働く。しかしながら、この薬剤の作用はＴ_１およびＴ_２の双方を引き下げることであり、前者はコントラストを強め、後者はコントラストを弱めることになる。よって、この減少は濃度依存的であり、通常、最大効果のための常磁性種の至適濃度が存在する。この至適濃度は用いる薬剤、イメージングの部位、イメージングの様式、すなわち、スピンエコー法(spin-echo)、飽和回復法(saturation-recovery)、反転回復法(inversion-recovery)および／または他の種々の強いＴ_１依存またはＴ_２依存イメージング技術、ならびに薬剤を溶解または懸濁させる媒体の組成によって異なる。これらの因子およびそれらの相対的重要性は当技術分野で公知である。例えば、Pykett, Scientific Amencan 246:78 (1982); Runge et al., Am. J. Radiol. 141:1209 (1983)を参照されたい。ＭＲＩ増強剤は、適切に実行され、患者の安全性および装置のデザインに適合する磁場強度を用いて外部カメラで検出できるように十分な量で存在しなければならない。このような薬剤の必要条件は当技術分野では媒体中の水分子に対するそれらの作用を有する薬剤に関して周知であり、とりわけ、Pykett（前掲）、およびRunge et al.（前掲）に記載されている。ＭＲＩスキャンはコンピューターに保存し、画像処理を行う。

放射線造影剤は、身体に導入する場合、臓器、または臓器の表面、または臓器の管腔内の物質をイメージングで可視化する。通常、放射線造影剤は、それが輪郭を描く構造よりも高い撮影濃度である媒体を有するが、濃度の低いものが導入される場合もある。磁気共鳴イメージングに特に有用な放射線造影剤はガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタン、または鉄イオンを含んでなる。さらなる薬剤としては、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、またはネオジムが挙げられる。抗体およびそのフラグメントはまた、超音波造影／増強剤と結合させることもできる。例えば、超音波造影剤はヒト化Ａｂまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである。また、超音波造影剤はガス充填されたリポソームであるのが好ましい。以下に記載するように、種々の放射線不透過造影剤をＸ線およびコンピューター断層撮影スキャンとともに用いてもよい。

また、本発明による抗体、融合タンパク質およびフラグメントは、in vivo診断の目的で常磁性イオンで標識することもできる。本発明に好適な常磁性イオンとしては、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）が挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。

Ｘ線イメージングなどのその他の場合に有用なイオンとしては、限定されるものではないが、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）が挙げられる。蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインはイソチオシアネート中間体を介して結合させる場合が多い。

また、金属は磁気共鳴イメージング技術用のものなど、診断薬においても有用である。これらの金属としては、限定されるものではないが、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが挙げられる。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長い尾部を有する試薬と反応させる必要があろう。このような尾部は、ポリリシン、多糖、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム（polyoximes）、およびこの目的のために有用なことが公知の基といった、キレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖であり得る。キレート剤は標準的な化学法を用いてペプチド抗原に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋が最小となる分子との結合を形成しうる基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に結合させるその他の、もっと特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日出願の「Antibody Conjugates」と題されたHawthorneの米国特許第４，８２４，６５９号明細書に開示されており、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、一般エネルギー範囲２０〜２，０００ｋｅＶの診断用同位元素とともに用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯化した場合は、本発明の抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種とともに用いられる。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための^２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。

Ｘ線およびコンピューター断層撮影を増強するためには放射線不透性材料および放射線造影材料が用いられるが、これらにはヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。特定の化合物としては、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムが含まれる。

また、本発明による抗体およびそれらのフラグメントは、蛍光化により標識することもできる。蛍光標識ＭＡｂの存在は、抗原結合タンパク質を適当な波長の光に曝し、生じた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンが挙げられる。蛍光標識抗原結合タンパク質は特にフローサイトメトリー分析に有用である。

あるいは、本発明による抗体およびそれらのフラグメントは、抗原結合タンパク質と化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光タグ付きＭＡｂの存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。

同様に、生物発光化合物を用いて本発明による抗体およびそのフラグメントを標識することもできる。生物発光は触媒タンパク質が化学発光反応の効力を高める生体系で見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。

あるいは、本発明による抗体およびフラグメントは、抗体と酵素を連結することにより検出可能に標識することもできる。抗体−酵素複合体を適当な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度測定、蛍光測定または視覚的手段により検出可能な化学部分が生じる。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素の例としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。

当業者ならば、本発明に従って使用できる他の好適な標識が分かるであろう。マーカー部分の抗体への結合は、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて達成することができる。

キメラ、ヒト化およびヒト抗体融合タンパク質の生産
キメラ、ヒト化およびヒト抗顆粒球抗体融合タンパク質を生産する簡単な方法としては、グルタルアルデヒドの存在下で抗顆粒球抗体またはフラグメントを混合するものである。最初のシッフの塩基結合は、例えば第二級アミンへのホウ化水素還元により安定化させることができる。非位置特異的リンカーとして、グルタルアルデヒドの代わりに、ジイソチオシアネートまたはカルボジイミドを使用することもできる。また、本発明による抗顆粒球抗体およびそのフラグメントは、少なくとも２つのＭＡｂまたはフラグメントがＣＦに特異的な少なくとも２つの抗原と結合する２つのキメラ、ヒト化もしくはヒトＭＡｂまたはそのフラグメントを作出するためにも使用できる。例えば、これらのＭＡｂは、抗原特異的ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディー（これらは多価であるが、単一特異性である）を作出できる。抗体融合タンパク質は、この融合タンパク質が少なくとも２つの抗原に結合する部分を含んでいるので、ＭＡｂよりも結合特異性が大きいと期待される。よって、抗体融合タンパク質は、治療用のものとして好ましい形態の抗原結合タンパク質である。

２以上のｓｃＦｖ分子の非共有結合により、機能的ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーを形成することができる。単一特異性ダイアボディーは同じｓｃＦｖのホモダイマーであり、各ｓｃＦｖは同じ抗体のＶ_Ｌドメインに短いリンカーで接続された選択抗体由来のＶ_Ｈドメインを含む。ダイアボディーは２つのｓｃＦｖの非共有結合によって形成された二価のダイマーであり、２つのＦｖ結合部位を有している。トリアボディーは３つのｓｃＦｖの三価トリマーの形成から得られるものであり、３つの結合部位を有しており、また、テトラボディーは４つのｓｃＦｖの四価テトラマーであり、４つの結合部位を有している。いくつかの単一特異性ダイアボディーが、Ｖ_Ｈ１−リンカー−Ｖ_Ｌ１を含む組換え遺伝子構築物を含む発現ベクターを用いて作製されている。Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1302 (1996); Holliger et al., Nature Biotechnology 15:632-631 (1997); Helfrich et al., Int. J. Cancer 76:232-239 (1998); Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77:763-772 (1998); Holiger et al., Cancer Research 59:2909-2916 (1999))を参照されたい。ｓｃＦｖを構築する方法は米国特許第４，９４６，７７８号（１９９０）および同第５，１３２，４０５号（１９９２）に開示されている。ｓｃＦｖに基づく多価単一特異性結合タンパク質を作製する方法は米国特許第５，８３７，２４２号明細書（１９９８）、同第５，８４４，０９４号明細書（１９９８）および国際公開第９８／４４００１号パンフレット（１９９８）に開示されている。多価単一特異性抗体融合タンパク質は、同じ抗原または別個の抗原に位置し得る２以上の同種のエピトープと結合する。価数を高めると、さらなる相互作用、親和性の上昇および滞留時間の延長が見込める。これらの抗体融合タンパク質は、ダイレクトターゲッティング系（抗体
融合タンパク質を診断薬に結合させ、そのタンパク質をそれを必要とする患者に直接投与する）で使用できる。

二重特異性抗体は、例えばジスルフィド結合を切断し、全ＩｇＧまたは好ましくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントの混合物を再形成し、１を超えるハイブリドーマを融合して１を超える特異性を有する抗体を生産するなどの種々の従来法、また、遺伝子操作により作製することができる。二重特異性抗体融合タンパク質は、異なる抗体の還元的切断によって生じるＦａｂ’フラグメントの酸化的切断によって作製されてきた。これは、２つの異なる抗体のペプシン消化によって生じた２つの異なるＦ（ａｂ’）_２フラグメントを混合し、還元的切断によりＦａｂ’フラグメントの混合物を形成し、次いで、酸化的にジスルフィド結合を再形成して、元のエピトープの各々に特異的なＦａｂ’部分を含む二重特異性抗体融合タンパク質を含むＦ（ａｂ’）_２フラグメントの混合物を作製することにより行うのが有利である。抗体融合タンパク質の調製のための一般的技術は、例えばNisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961)、Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968)、および米国特許第４，３３１，６４７号明細書に記載されている。本発明では、少なくとも１つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明によるＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも１つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントが意図される。

より選択性の高い結合は、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることにより達成することができる。このエステルと抗体またはフラグメントとの反応により、抗体またはフラグメント上のアミン基が誘導体化され、次いで、この誘導体は、例えば遊離スルヒドリル基を有する抗体Ｆａｂフラグメント（あるいは、例えばトラウトの試薬によりスルヒドリル基が付加されたより大きなフラグメントまたは完全抗体）と反応させることができる。このようなリンカーは同じ抗体の基を架橋するとは考えにくいため、結合の選択性は向上する。

抗原結合部位から離れた部位で抗体またはフラグメントを連結するのが有利である。これは、例えば上記のように切断された鎖内スルヒドリル基に連結することによって達成することができる。あるいは、酸化された炭化水素部分を有する抗体を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する別の抗体と反応させることを含む。これにより最初のシッフ塩基（mime）結合が生じ、これは好ましくは、例えばホウ化水素還元により第二級アミンへ還元することにより安定化され、最終複合体が形成される。このような部位特異的結合が、小分子に関しては米国特許第４，６７１，９５８号明細書に、大きな付加物に関しては米国特許第４，６９９，７８４号明細書に開示されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。

多重特異性抗体融合タンパク質は、二重特異性キメラ、ヒト化またはヒト抗体融合タンパク質にＭＡｂ抗原結合部分を付加することにより得ることができる。例えば、二重特異性抗体融合タンパク質は、上記のビス−マレイミド活性化手順を用いて、二重特異性融合タンパク質を第三の抗原ＭＡｂまたはフラグメントと結合させる際に用いられる１以上のスルヒドリル基を導入するために、２−イミノチオランと反応させることができる。これらの抗体複合体の生産技術は当業者に周知である。例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第４，９２５，６４８号明細書を参照されたい。

１２アミノ酸残基長よりも長いリンカー（例えば１５または１８残基のリンカー）を有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶ_ＨとＶ_Ｌドメイン間の相互作用が可能であり、一般に単量体、二量体（ダイアボディーと呼ばれる）、および少量のより高次の多量体の混合物が生じる(Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157)。しかし、５以下のアミノ酸残基のリンカーを有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの分子内対合は妨げられ、異なる鎖上のＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの対合が促される。３〜１２残基の間のリンカーでは主として二量体が形成される(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)。０〜２残基の間のリンカーでは、ｓｃＦｖの三量体（トリアボディーと呼ばれる）、四量体（テトラボディーと呼ばれる）、またはより高次のオリゴマー構造が形成されるが、オリゴマー化の厳密なパターンは、リンカーの長さの他、Ｖドメインの組成ならびに方向に依存するようである。例えば、抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０のｓｃＦｖでは、０残基のリンカーを用いた場合、主として三量体（Ｖ_ＨからＶ_Ｌ方向）または四量体（Ｖ_ＬからＶ_Ｈ方向）が生じた(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。１および２酸基のリンカーを用いてＮＣ１０から構築されたｓｃＦｖでは、Ｖ_ＨからＶ_Ｌ方向で、主としてダイアボディーが形成されたが(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)、これに対して、Ｖ_ＬからＶ_Ｈ方向では四量体、三量体、二量体およびより高次の多量体が形成された(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。

本発明では、被験体においてＣＦを検出およびモニタリングする方法であって、該被験体に、抗顆粒球ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント（ここで、ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは少なくとも１種の診断薬に結合された後、医薬上好適な賦形剤中に調剤される）を含んでなる、有効量の診断複合体を投与することを含む方法が意図される。抗顆粒球抗体は、例えば抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、およびＭＡｂ４７を含み得る。抗体はまた、抗ＣＤ−１５および抗ＣＤ−３３抗体など、単一の顆粒球前駆体上に存在する抗原に対するものとすることができる。

被検体に送達されるキメラ、ヒト化、およびヒト抗体は、抗体単独、免疫複合体、融合タンパク質から構成されるか、または１以上の医薬上好適な賦形剤、１以上の付加的成分またはこれらの特定の組み合わせを含み得る。本発明による免疫複合体、裸の抗体、融合タンパク質、およびそのフラグメントは、医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤され、この免疫複合体または裸の抗体は混合物中で医薬上好適な賦形剤と結合する。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬上好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition （Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版を参照されたい。本発明による免疫複合体または裸の抗体は、例えばボーラス注射または点滴による静脈内投与のために調剤できる。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数回投与用容器で提供することができる。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は、使用前に、例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。

好ましい一つの実施態様によれば、抗体は一価の単一特異性抗体またはそのフラグメントである。また、好ましい一つの実施態様によれば、抗体は多価の単一特異性抗体またはそのフラグメントである。これらの好ましい抗体およびフラグメントは、ＣＦに関連する好中球のエピトープの直接ターゲッティングに用いられる。被験体においてＣＦを検出およびモニタリングするための好ましい方法は、一価の単一特異性抗体または多価の単一特異性抗体またはそのフラグメントと診断薬を含んでなる複合体を作製すること、その複合体をそれを必要とする被験体に投与すること、および、その後、診断薬を公知の技術で検出およびモニタリングすることを含んでなる。

好ましい一つの実施態様によれば、抗体は多価の多重特異性抗体またはそのフラグメントである。また、被験体においてＣＦを検出およびモニタリングする方法であって、ＣＦ抗原に対する１以上の抗原結合部位と１以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントを、それを必要とする被験体に投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および、その後、多価多重特異性抗体またはそのフラグメントの結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を被験体に投与することを含んでなる方法も好ましい。検出およびモニタリングは、結合したタンパク質を公知の技術で検出する工程をさらに必要とする。

キメラ、ヒト化、および完全ヒト抗体およびそのフラグメントは、診断法に用いるのに好適である。よって、本発明では、診断薬を標的に送達する方法であって、（ｉ）抗顆粒球抗体を含んでなる組成物を用意すること、および（ii）診断抗体複合体をそれを必要とする被験体に投与することを含んでなる方法が意図される。好ましくは、本発明によるキメラ、ヒト化および完全ヒト抗体およびフラグメントが、ＣＦを検出およびモニタリングするための方法に使用される。好ましい一つの実施態様によれば、これらの抗体はＣＦに関連する好中球のエピトープに結合するものとされる。

また、本発明によれば、ターゲッティングされた組織に対して反応性のある少なくとも１つのアームと、診断薬を運ぶためのターゲッティング可能な構築物に対して反応性のある少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体またはそのフラグメントが提供される。ターゲッティング可能な構築物は、キャリアー部分と、少なくとも２ユニットの認識可能なハプテンからなる。認識可能なハプテンの例としては、限定されるものではないが、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）およびフルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。ターゲッティング可能な構築物は、罹患組織の処置または同定に有用な種々の薬剤と結合させることができる。結合される薬剤の例は、上記の診断薬と同様である。

免疫原のハプテンは、免疫認識部分、例えば化学ハプテンを含む。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを用いると、抗体に対するリンカーの高い特異性が発揮される。これは、ＨＳＧハプテンに対して惹起された抗体が既知であり、適当な二重特異性抗体へと容易に組み込むことができるためである。よって、リンカーが、結合したハプテンと結合すれば、抗体またはそのフラグメントに対して高い特異性が得られる。

別の実施態様によれば、診断薬は、二重特異性または多重特異性抗体（この抗体の少なくとも１つの結合アームは抗顆粒球抗体またはそのフラグメントからなる）の少なくとも１つの結合アームにより認識される第二の部分に結合され、それにより、抗顆粒球抗体／二重特異性抗体がＣＦ含有顆粒球へターゲッティングされた後、二重特異性抗体の非顆粒球結合アームと結合する第二の薬剤（結合された診断薬を含む）を投与し、その抗顆粒球抗体アームにより顆粒球結合部位へ該診断薬を送達する。血液および身体からターゲッティングされなかった抗体を除去するために、この２回の注射の間に適当な時間をとる。

発現ベクターおよび宿主細胞
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は、構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする特定の調節エレメントの制御下におかれる。このような遺伝子は、調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。プロモーターは構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。構造遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列であり、次に、これは特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列へと翻訳される。典型的には、プロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に隣接して遺伝子の５’領域に配置される。プロモーターが誘導プロモーターであれば、誘導因子に応答して転写速度が高まる。これに対し、プロモーターが構成プロモーターであれば、転写速度は誘導因子による調節を受けない。エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または方向に関係なく、転写効率を高め得るＤＮＡ調節エレメントである。

単離されたＤＮＡ分子とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていないＤＮＡの断片である。単離されたＤＮＡ分子の例としては、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学合成されたＤＮＡ分子がある。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部に相補的な短い合成オリゴヌクレオチドが第一鎖ＤＮＡを作製するための逆転写の開始のためのプライマーとして用いられる。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子に対しても「ｃＤＮＡ」を用いる。

クローニングベクターは、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなど、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するＤＮＡ分子である。クローニングベクターは、典型的には一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、この部位に、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに定量可能な様式で外来ＤＮＡ配列、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子を挿入することができる。マーカー遺伝子は、典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。組換え宿主は、クローニングベクターか発現ベクターのいずれかを含むいずれの原核または真核細胞であってもよい。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作された原核または真核細胞も含まれる。発現とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、構造遺伝子の場合、発現とは、その構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。

好適な宿主細胞としては、微生物または哺乳類宿主細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、ＭＡｂの生産のために開発されたヒト細胞系統ＰＥＲ．Ｃ６およびその他の融合タンパク質がある。よって、本発明の好ましい実施態様は、抗顆粒球ＭＡｂ、複合体、融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含んでなる宿主細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（国際公開第９７／００３２６号パンフレット）は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂコード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９−３５１０）を含んだプラスミドを用い、ヒト一次胎児網膜細胞をトランスフェクトすることにより作出されたものである。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂは、それぞれアデノウイルス初期遺伝子活性化タンパク質１Ａおよび１Ｂである。これらの方法および組成物は、特に、翻訳後修飾（例えばグリコシル化）された目的のヒト組換えタンパク質の安定発現を作り出すために有用である。ＰＥＲ．Ｃ６は完全に特徴づけられたヒト細胞系統であり、また、実験室での実践に応じて開発されたものであるなど、いくつかの特徴によりＰＥＲ．Ｃ６は組換えタンパク質の生産のための宿主として特に有用なものとなる。さらに、ＰＥＲ．Ｃ６はいずれのヒト由来または動物由来タンパク質も含まない規定の血清フリー培地中の懸濁培養物として増殖させることができ、その増殖は倍加時間約３５時間の、回転瓶、シェーカーフラスコ、スピンフラスコおよびバイオリアクターに適合している。最後に、Ｅ１Ａが存在すると、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下にある遺伝子の発現がアップレギュレートされ、Ｅ１３が存在すると、おそらくは組換えトランスジーンの過剰発現によって増強されたｐ５３依存性のアポトーシスが妨げられる。ある実施態様では、この細胞は従来の哺乳類細胞系統よりも２００倍高い組換えタンパク質および／またはタンパク質性物質を産生することができる。

ＣＦの診断のためのキメラ、ヒト化およびヒト抗体の使用
本発明では、被験体においてＣＦを検出およびモニタリングする方法であって、抗顆粒球抗体ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメント（このＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは少なくとも１種の診断薬に結合され、その後、医薬上好適な賦形剤中に調剤される）を含んでなる有効量の診断複合体を被験体に投与することを含む方法が意図される。好ましい一つの実施態様によれば、前記抗体は、一価の単一特異性抗体またはそのフラグメントである。また、被験体においてＣＦを検出およびモニタリングする方法であって、ＣＦ抗原に対する１以上の抗原結合部位と１以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントをそれを必要とする被験体に投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および、その後、多価多重特異性抗体またはそのフラグメントの結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を被験体に投与することを含んでなる方法も好ましい。好ましい一つの実施態様によれば、前記抗体は、多価の単一特異性抗体またはそのフラグメントである。検出およびモニタリングは、結合したタンパク質を公知の技術で検出する工程をさらに必要とする。

キメラ、ヒト化、および完全ヒト抗体およびそのフラグメントは、診断法に用いるのに好適である。よって、本発明では、診断薬を標的に送達する方法であって、（ｉ）抗顆粒球抗体を含んでなる組成物を用意すること、および（ii）診断抗体複合体をそれを必要とする被験体に投与することを含んでなる方法が意図される。好ましくは、本発明によるキメラ、ヒト化および完全ヒト抗体およびフラグメントが、ＣＦを検出およびモニタリングするための方法に使用される。好ましい一つの実施態様によれば、これらの抗体はＣＦに関連する好中球のエピトープに結合するものとされる。

本発明によるいずれの抗体または抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを、１種以上の診断薬と結合させてもよい。一般に、１種の診断薬がそれぞれの抗体または抗体フラグメントに結合されるが、１を超える診断薬を同じ抗体または抗体フラグメントに結合させることもできる。Ｆｃ領域が存在しなければ（例えば、免疫複合体の抗体成分としても用いられる抗体が抗体フラグメントである場合）、全長抗体または抗体フラグメントのＬ鎖可変領域へ炭水化物部分を導入することができる。例えば、Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., 米国特許第５，４４３，９５３号明細書(1995), Leung et al., 米国特許第６，２５４，８６８号明細書を参照されたい（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。この操作された炭水化物部分は、治療薬または診断薬を結合させるのに用いられる。

抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドを結合させる方法は当業者に周知である。例えば、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990);およびShih et al., 米国特許第５，０５７，３１３号明細書を参照されたい（なお、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。一般的な方法としては、炭水化物部分が酸化された抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン基を有し、かつ、複数のペプチドが付加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへの還元により安定化され、最終的な複合体を形成し得る。

本発明による抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは、２種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を構成する各々の抗体または治療薬または診断薬を含むことができる。また、抗体融合タンパク質の１以上の抗体は、結合した１以上の診断薬を含むことができる。診断薬は、還元されたＳＨ基、および炭水化物側鎖に結合させることができる。

診断薬を伴う抗体は、医薬上許容される注射用ビヒクル、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、生理的ｐＨおよび濃度で、ヒトまたは哺乳類の診断用キットとして提供してもよい。この製品は、特にヒトでの使用を意図する場合には、無菌であることが好ましい。このようなキットの任意の成分としては、安定剤、緩衝剤、標識試薬、放射性同位元素、常磁性化合物、クリアランスを促進するための第二の抗体、および通常のシリンジ、カラム、バイアルなどが挙げられる。

抗体、抗体成分または融合タンパク質の患者への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内および髄腔内であり得る。注射により投与する場合には、投与は点滴、または単回もしくは複数回のボーラス注射によって行なうことができる。

一般に、投与される抗顆粒球抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、病状および以前の病歴といった因子によって異なる。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲（薬剤量／患者の体重）の用量の抗体をレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。この標識の選択も用量要求に影響を及ぼし得る。

本発明の実施態様を、本発明の態様を詳細に示す実施例によりさらに説明する。これらの実施例は本発明の具体的な要素を示すものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。

実施例１
１４歳の少年はＣＦ肺疾患の増悪を示し、高熱、倦怠感、および白血球増加により感染の証拠を示していた。担当医はプレターゲッティングを含む抗顆粒球イメージング法でこの患者を評価することにした。ＭＮ−３ Ｆａｂ’およびＭａｂ ７３２抗Ｉｎ−ＤＴＰＡ Ｆａｂ’からなる二重特異性抗体を５ｍｇの用量で注射した。４８時間後、１３１−Ｉ標識Ｉｎ−ＤＴＰＡペプチドを７ｍＣｉのＩ−１３１とともに投与し、この患者に４時間後と２４時間後に胸部のγイメージングを行った。スキャンは両肺、特に上部中央領域の広範な浸潤を示し、これは正常な場合の約５倍の活性であると見積もられた。スキャン定量の補助として側副ＣＴイメージを行ったところ、活性化された顆粒球が肺に広く含まれること、および激しい抗生物質療法の状況が示唆された。

実施例２
治療を行なったにもかかわらず進行を示す既知のＣＦ肺疾患を有する１０歳の少年に、ＤＯＴＡキレートにより５ｍｇのＩｎ−１１１を結合させた１ｍｇのタンパク質用量の、１１１−インジウム標識ヒト化ＭＮ−２モノクローナル抗体を静脈注射した。４８時間後、胸部の平面およびＳＰＥＣＴスキャンにおいて、肺浸出または浸潤と一致する著しく拡散した放射活性が見られた。その後、この患者に２週間、高用量の抗生物質の化学療法を施したところ、いくらかの緩解と肺機能の向上が見られた。化学療法後４週間の時点で、ラジオイムノシンチグラフィーを繰り返したところ、放射活性浸潤物が約５０％減少することによる肺の改善が見られた。

当業者には、本発明による物、組成物、方法およびプロセスに対して種々の改変および変更をなし得ることが明らかであろう。よって、本発明は、付属の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にある限り、このような改変および変更を包含するものとする。

上記で挙げられた総ての刊行物の開示は、明らかに、各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされる場合と同程度に、それらの全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。

Claims (111)

1. 被験体において嚢胞性繊維症（ＣＦ）を検出およびモニタリングする方法であって、
   診断に有効な量の少なくとも１種の抗顆粒球抗体もしくはそのフラグメントおよび医薬上許容される担体を前記被験体に投与することを含んでなり、
   前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントは診断薬と結合して抗体複合体を形成するが、該抗顆粒球抗体は^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３抗体Ｆａｂ’フラグメントではない、方法。
2. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗顆粒球抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトより下等な霊長類からの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
4. 前記診断薬が２０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性標識である、請求項１に記載の方法。
5. 前記放射性標識が、γ、βまたは陽電子を放射する同位元素である、請求項４に記載の方法。
6. 前記放射性標識が、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択されるものである、請求項５に記載の方法。
7. 前記放射性標識が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いてイメージングされる、請求項６に記載の方法。
8. 前記診断薬が放射線造影剤である、請求項１に記載の方法。
9. 前記放射線造影剤が常磁性イオンである、請求項８に記載の方法。
10. 前記常磁性イオンが、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）を含む金属である、請求項９に記載の方法。
11. 前記放射線造影剤が、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、ビスマス（III）、ニッケル、レニウム、およびユーロピウムからなる群から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
12. 前記診断薬が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性化合物である、請求項１に記載の方法。
13. 前記放射線不透過性化合物が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムからなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記放射線造影剤が超音波増強剤である、請求項８に記載の方法。
15. 前記超音波増強剤が、抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記抗顆粒球抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトより下等な霊長類からの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記リポソームがガス充填されている、請求項１５に記載の方法。
18. 好中球エピトープに結合する抗体またはそのフラグメント（この抗体フラグメントは^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３抗体Ｆａｂ’フラグメントではない）。
19. 抗顆粒球抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の抗体またはそのフラグメント。
20. 前記顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項１９に記載の抗体またはそのフラグメント。
21. キメラである、請求項２０に記載の抗体またはそのフラグメント。
22. ヒト化されている、請求項２０に記載の抗体またはそのフラグメント。
23. 完全にヒト型である、請求項２０に記載の抗体またはそのフラグメント。
24. 好中球エピトープに対して親和性を有する２以上の抗原結合部位を含んでなる、多価単一特異性抗体。
25. 前記抗原結合部位が抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるものである、請求項２４に記載の多価単一特異性抗体。
26. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項２５に記載の多価単一特異性抗体。
27. 前記抗体またはそのフラグメントがキメラである、請求項２５に記載の多価単一特異性抗体。
28. 前記抗体またはそのフラグメントがヒト化されている、請求項２５に記載の多価単一特異性抗体。
29. 前記抗体またはそのフラグメントが完全にヒト型である、請求項２５に記載の多価単一特異性抗体。
30. 好中球エピトープに対して親和性を有する１以上の抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する１以上のハプテン結合部位とを含んでなる、多価多重特異性抗体。
31. キメラ化されている、請求項３０に記載の抗体。
32. ヒト化されている、請求項３０に記載の抗体。
33. ヒト抗体である、請求項３０に記載の抗体。
34. 好中球エピトープに結合する請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の抗顆粒球ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含む抗体成分を含んでなる好中球エピトープターゲッティング診断複合体であって、
    前記抗体成分は少なくとも１種の診断薬に結合しているが、前記抗顆粒球Ｍａｂフラグメントは^９９ｍＴｃで放射性標識されたマウスＭＮ−３抗体Ｆａｂ’フラグメントではない、診断複合体。
35. 前記診断薬が２０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性標識である、請求項３４に記載の診断複合体。
36. 前記放射性標識が、γ、βまたは陽電子を放射する同位元素である、請求項３５に記載の診断複合体。
37. 前記放射性標識が、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択される、請求項３６に記載の診断複合体。
38. 前記診断薬が放射線造影剤である、請求項３４に記載の診断複合体。
39. 前記放射線造影剤が常磁性イオンである、請求項３８に記載の診断複合体。
40. 前記常磁性イオンが、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される金属である、請求項３９に記載の診断複合体。
41. 前記放射線造影剤が、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、ビスマス（III）、ニッケル、レニウム、およびユーロピウムからなる群から選択される金属である、請求項３８に記載の診断複合体。
42. 前記診断薬が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性化合物である、請求項３４に記載の診断複合体。
43. 前記放射線不透過性化合物が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムからなる群から選択されるものである、請求項４２に記載の診断複合体。
44. 前記放射線造影剤が超音波増強剤である、請求項３８に記載の診断複合体。
45. 前記超音波増強剤が、抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項４４に記載の診断複合体。
46. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項４５に記載の抗体またはそのフラグメント。
47. 前記リポソームがガス充填されている、請求項４４に記載の診断複合体。
48. 少なくとも２種の抗顆粒球ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントであって、該ＭＡｂまたはそのフラグメントが請求項１８〜４７のいずれか一項に記載の該ＭＡｂまたはそのフラグメントから選択されるものである、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
49. 請求項４８に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、発現ベクター。
50. 請求項４９に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、宿主細胞。
51. 診断薬を標的に送達する方法であって、
    請求項３０に記載の抗体を被験体に投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および前記抗体の結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を該被験体に投与することを含んでなる、方法。
52. 前記キャリアー分子が結合タンパク質の１を超える結合部位に結合する、請求項５１に記載の方法。
53. 前記診断薬が、放射性核種、放射線造影剤、および金属からなる群から選択されるものである、請求項５１に記載の方法。
54. ＣＦを有する被験体を検出およびモニタリングする方法であって、
    それを必要とする被験体に請求項３０に記載の抗体を投与すること、ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと、および前記抗体の結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を該被験体に投与することを含んでなる、方法。
55. 前記診断薬が、同位元素、金属、放射線造影剤、酵素および検出剤からなる群から選択されるものである、請求項５４に記載の方法。
56. 前記診断薬が同位元素である、請求項５５に記載の方法。
57. 前記同位元素が２０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有するものである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記同位元素が、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択されるものである、請求項５７に記載の方法。
59. 前記診断薬が金属である、請求項５５に記載の方法。
60. 前記金属がＭＲＩに用いられる常磁性イオンである、請求項５９に記載の方法。
61. 前記放射線造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択されるものである、請求項５５に記載の方法。
62. 前記金属が、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、ビスマス（III）、ニッケル、レニウム、およびユーロピウムからなる群から選択されるものである、請求項５５に記載の方法。
63. 前記診断薬が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性化合物である、請求項５４に記載の方法。
64. 前記放射線不透過性化合物が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムからなる群から選択されるものである、請求項６３に記載の方法。
65. 前記検出剤が、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物からなる群から選択されるものである、請求項５５に記載の方法。
66. 前記蛍光化合物が、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンからなる群から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
67. 前記化学発光化合物が、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
68. 前記生物発光化合物が、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンからなる群から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
69. 前記放射線造影剤が超音波造影剤である、請求項５５に記載の方法。
70. 前記超音波放射線造影剤が、抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項６９に記載の方法。
71. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項７０に記載の抗体またはそのフラグメント。
72. 前記リポソームがガス充填されている、請求項７０に記載の方法。
73. 診断薬を標的に送達する方法であって、（ｉ）抗顆粒球抗体を含んでなる組成物を用意すること、および（ii）請求項３４に記載の診断複合体を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法。
74. 前記診断薬が、同位元素、金属、放射線造影剤、酵素および検出剤からなる群から選択されるものである、請求項７３に記載の方法。
75. 前記診断薬が同位元素である、請求項７４に記載の方法。
76. 前記同位元素が２０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲を有するものである、請求項７５に記載の方法。
77. 前記同位元素が、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択されるものである、請求項７６に記載の方法。
78. 前記診断薬が金属である、請求項７４に記載の方法。
79. 前記金属がＭＲＩに用いられる常磁性イオンである、請求項７８に記載の方法。
80. 前記放射線造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択されるものである、請求項７４に記載の方法。
81. 前記金属が、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、ビスマス（III）、ニッケル、レニウム、およびユーロピウムからなる群から選択されるものである、請求項７４に記載の方法。
82. 前記診断薬が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性化合物である、請求項７３に記載の方法。
83. 前記放射線不透過性化合物が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムからなる群から選択されるものである、請求項８２に記載の方法。
84. 前記検出剤が、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物からなる群から選択されるものである、請求項７４に記載の方法。
85. 前記蛍光化合物が、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンからなる群から選択されるものである、請求項８４に記載の方法。
86. 前記化学発光化合物が、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択されるものである、請求項８４に記載の方法。
87. 前記生物発光化合物が、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンからなる群から選択されるものである、請求項８４に記載の方法。
88. 前記放射線造影剤が超音波造影剤である、請求項７４に記載の方法。
89. 前記超音波放射線造影剤が抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項８８に記載の方法。
90. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項８９に記載の抗体またはそのフラグメント。
91. 前記リポソームがガス充填されている、請求項８９に記載の方法。
92. ＣＦを有する被験体を検出およびモニタリングする方法であって、
    それを必要とする被験体に、顆粒球に対して親和性を有する少なくとも１つの結合アームと、非顆粒球結合タンパク質に対して親和性を有する少なくとも１つの結合アームとを含んでなる抗体を投与すること；ある量の非結合タンパク質が被験体の血流から除去されるのに十分な時間待つこと；および前記抗体の結合部位に結合する診断薬を含んでなるキャリアー分子を該被験体に投与することを含んでなる、方法。
93. 前記キャリアー分子が、ＨＳＧ、フルオレセインイソチオシアネート、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびその他のキレート剤からなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
94. 前記診断薬が、同位元素、金属、放射線造影剤、酵素および検出剤からなる群から選択されるものである、請求項９２に記載の方法。
95. 前記診断薬が同位元素である、請求項９４に記載の方法。
96. 前記同位元素が２０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲を有するものである、請求項９５に記載の方法。
97. 前記同位元素が、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、^１９８Ａｕ、^２０１Ｔｌ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子を放射する核種からなる群から選択されるものである、請求項９６に記載の方法。
98. 前記診断薬が金属である、請求項９３に記載の方法。
99. 前記金属がＭＲＩに用いられる常磁性イオンである、請求項９８に記載の方法。
100. 前記放射線造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択されるものである、請求項９４に記載の方法。
101. 前記金属が、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、ビスマス（III）、ニッケル、レニウム、およびユーロピウムからなる群から選択されるものである、請求項９４に記載の方法。
102. 前記診断薬が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性化合物である、請求項９２に記載の方法。
103. 前記放射線不透過性化合物が、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムからなる群から選択されるものである、請求項１０２に記載の方法。
104. 前記検出剤が、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物からなる群から選択されるものである、請求項９４に記載の方法。
105. 前記蛍光化合物が、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンからなる群から選択されるものである、請求項１０４に記載の方法。
106. 前記化学発光化合物が、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択されるものである、請求項１０４に記載の方法。
107. 前記生物発光化合物が、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンからなる群から選択されるものである、請求項１０４に記載の方法。
108. 前記放射線造影剤が超音波造影剤である、請求項９４に記載の方法。
109. 前記超音波放射線造影剤が、抗顆粒球抗体またはそのフラグメントを含んでなるリポソームである、請求項１０８に記載の方法。
110. 前記抗顆粒球抗体またはそのフラグメントが、抗ＮＣＡ−９０、抗ＮＣＡ−９５、ＭＮ−２、ＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＰ−１、ＮＰ−２、ＢＷ２５０／１８３、ＭＡｂ４７、抗ＣＤ−１５、および抗ＣＤ−３３抗体からなる群から選択されるものである、請求項１０９に記載の抗体またはそのフラグメント。
111. 前記リポソームがガス充填されている、請求項１０９に記載の方法。