KR20210027254A - Tim-3에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 TIM-3에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자를 더 제공하며 상기 항체를 발현하기 위한 발현 벡터, 그리고 숙주 세포 및 상기 항체의 생산 방법을 더 제공한다. 이외에, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약물 조성물 및 약물 제조에서의 이의 용도, 여러가지 질환(종양, 감염성 질환 및 자가면역질환을 포함)을 예방 및/또는 치료하는 용도를 더 제공한다.

Description

TIM-3에 대한 항체 및 그의 용도
본 발명은 치료성 단클론 항체 기술분야에 속하며, 더 구체적으로, 본 발명은 인간 TIM-3에 대한 항체 또는 그 항원 결합 단편에 관한 것이며, 항감염, 항종양 및 자가면역질환 등 방면에서의 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
T세포 면역 글로불린 및 뮤신 도메인-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3, TIM-3)은 근래에 발견된 중요한 면역 체크포인트 분자이다. TIM-3분자는 단일 막횡단 분자이며, 이 구조는 IgV 서브유닛, 뮤신 유사 도메인, 단일 막횡단 도메인 및 Tyr가 풍부한 세포내 단편(Lee J et al, GenesImmun, 2011, 12:595-604)을 포함한다. IgV 서브유닛은 세포의 외부에 위치하며, 이는 뮤신 유사 도메인과 함께 리간드 인식에 참여된다.
TIM-3은 IFN-γ를 분비하는 CD4+ 보조 T세포 1(Th1)와 CD8+ 세포독성 T세포(Tc1) 표면에서 높게 발현된다(Rodriguez-Manzanet R et al, Immunol Rev, 2009, 229(1):259-270). 갈렉틴-9(Galectin-9, Gal-9)는 TIM-3의 천연적인 리간드 중의 하나이며, Gal-9는 내인성 갈락토스 결합 렉틴 단백질 구성원에 속하며, 조직 중의 분포는 아주 광범위하여, 세포 응집, 접착, 분화, 사멸, 종양 전이 및 염증 반응의 조절 등 방면에서 중요한 역할을 발휘한다. Gal-9는 T세포 표면의 TIM-3과 결합함으로써, 세포내 신호 경로를 트리거링하고, T세포의 기능 고갈 또는 사멸을 유도하여, 면역 반응을 하향 조절함으로써, 상기 Gal-9는 자가면역질환, 알레르기성 질환 및 거부반응에서 중요한 조절 작용을 발휘한다. 따라서, TIM-3은 내거티브 면역 조절분자로 간주된다. 이 후에 발견한데 의하면 TIM-3도 천연적인 면역세포 표면에서 발현되는바, 조절 T세포(regulatory cell, Treg), 단핵세포, 대식세포, 수지상세포(dendritic cells, DCs), 자연살해세포(natural killer cell, NK) 등을 포함한다(Andemon AC 등, Science, 2007, 318(5853):1141-1143). 현재, 연구한 바에 의하면, TIM-3/Gal-9은 각종 세포의 면역응답을 조절할 수 있으며, 염증, 자가면역질환 및 종양의 발생 및 발전에 광범위하게 참여하는 것을 증명하였다(Anderson DE, Expert Opin Ther Targets, 2007, 11(8): 1005- 1009; Anderson AC, Curr Opin Immunol, 2006, 18(6): 665-669; Degauque N et al, Transplantation, 2007, 84: S12-16; Zhu C et al, Nat Immunol, 2005, 6: 1245-1252).
근래에 들어, 끊임없는 연구 발견에 의하면, 병원체 감염과정에서 TIM-3이 T세포에서 높게 발현되는 것은 T세포의 기능 고갈과 밀접히 연관되며, 이밖에 발견한 데 의하면 이의 대식세포 상의 발현도 상향 조절되었는바, TIM-3이 감염면역 과정에서도 중요한 작용를 발휘한다는 것을 암시한다. Wang 등이 발견한 데 의하면, 인간 결핵균 감염 환자 중, 말초혈 단핵세포는 마우스 항 인간 TIM-3항체를 통해 TIM-3 경로를 차단시킨 후, T세포에서의 IFN-γ 생성을 현저히 향상시킬 수 있음으로써, T세포의 고갈을 개선시키고 결핵균에 대한 신체의 저항력을 향상시킨다(Wang X et al, J Infect, 2011, 62(4): 292-300). Jayaraman 등이 발견한 데 의하면, C57BL/6J 마우스가 호흡기를 통해 결핵균에 감염된 후, TIM-3-IG 융합 단백질을 주사함으로써, 체내 결핵균의 제거를 향상시킨다(Jayaraman P et al, J Exp Med, 2010, 207(11): 2343-2354). Ma 등이 발견한 데 의하면, TIM-3 항체로 차단한 후, 정상적이거나 HCV에 감염된 인간 DC세포는 항원 흡수를 향상시키고, 성숙을 가속화시키며, IL-12의 분비를 증가시킬 수 있다(Ma CJ et al, PLoS One, 2014, 9(1): e87821). Nebbia 등이 발견한 데 의하면, 재조합 TIM3-Fc 융합 단백질로 TIM-3 경로를 차단함으로써, HBV 특이적 CD8+ T세포의 기능부전을 개선할 수 있다. 체외에서 TIM-3 경로를 차단함으로써, 일부 만성 HBV 환자의 말초혈 단핵세포에서 HBV 특이적 CD8+ T세포가 IFN-γ 및 TNF-α 발현을 복원할 수 있다(Nebbia G et al, PLoS One, 2012, 7(10): e47648). 상기 일련의 연구는 TIM-3 항체(길항제 항체) 또는 융합 단백질(TIM-3의 세포외 단편으로만 조성됨)을 통해 이의 신호 경로를 차단함으로써, 체내 및 체외에서 면역 세포 기능을 역전시킬 수 있어, 항 감염 기능을 향상시킨다. 따라서, TIM-3은 항 감염 면역치료에 사용되는 잠재적인 개입 표적이다.
TIM-3은 중요한 면역 조절 표적으로서, 다양한 면역 세포에서의 비정상적인 발현은 다양한 종양의 발생, 발전과 밀접히 연관된다. 현재 발견한 데 의하면, TIM-3은 비뇨기계 종양, 신세포암, 결장암, 유방암, 혈액 종양 등 다양한 악성 종양의 CD8+ T세포 표면에서의 발현이 상향 조절된다. TIM-3은 T세포 기능 고갈을 조절할 수 있으며 이의 면역 반응을 억제시키며, 차단 항체 또는 융합 단백질로 TIM-3 하류 신호를 억제시킴으로써, T세포가 분비하는 IFN-γ를 증가할 수 있다. 신투명세포암, 간암의 체외 실험에서, 단클론 항체를 이용하여 TIM-3/Gal-9 경로를 억제시킨 후, 종양은 현저하게 억제된다(Komohara Y et al, Cancer Immunol Res, 2015, 3(9): 999-1007; Yan W et al, Gut, 2015, 64(10): 1593-1604). 항 TIM-3 단클론 항체를 피하 주사함으로써 마우스 체내 EIA림프종의 생장을 억제할 수 있다(Fourcade J et al, Exp Med, 2010, 207(10): 2175-2186).
따라서, 임상에서는 고 특이성과 고 친화성, 더욱 낮은 독성 부작용 및 더욱 우수한 임상 약효를 구비하는 TIM-3 차단 항체가 절실히 필요하다. 이는 종양, 감염성 또는 자가면역질환 환자에게 더욱 많은 약물 선택을 제공할 것이다.
본 발명에서는 고 친화성 및 특이적으로 TIM-3과 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개시하였으며, 항체 분자를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 그리고 항체 분자를 제조하기 위한 방법을 더 제공하며, 항체 분자를 포함하는 이중 특이성 항체, 멀티 이중 특이성 항체 및 약물 조성물을 더 제공한다. 또한, 본 발명에서 개시된 항 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편(단독으로 또는 기타 활성제 또는 치료방식과의 조합)이 암, 감염성 질환, 크론병, 패혈증, 전신염증반응증후군(SIRS) 및 사구체신염 등 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의 응용을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다:
(a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR:
(i) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H1의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;
(ii) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H2의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H3의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3; 및/또는
하기 세 개의 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR:
(iv) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L1의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;
(v) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L2의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L3의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3;
또는,
(b) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR:
(i) 서열번호 7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H1의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;
(ii) 서열번호 7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H2의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H3의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3; 및/또는
하기 세 개의 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR:
(iv) 서열번호 8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L1의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;
(v) 서열번호 8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L2의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L3의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3.
일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환(conservative substitutions)이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 및/또는 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR:
상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11 중의 임의의 하나로 나타낸 VH;
및/또는
(b) 하기로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR:
상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12 중의 임의의 하나로 나타낸 VL.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및/또는 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은: 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR을 포함한다; 여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 IMGT 넘버링 시스템을 통해 확정된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
(i) 서열번호 18, 또는 서열번호 18에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H1;
(ii) 서열번호 19, 또는 서열번호 19에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 20, 또는 서열번호 20에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H3;
및/또는
(b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
(iv) 서열번호 27, 또는 서열번호 27에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L1;
(v) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L3;
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL) CDR은 IMGT 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 18로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 19로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 20으로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 27로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 25로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23으로 나타낸 CDR-L3을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은:
(a) 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR을 포함한다.
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Chothia 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
(i) 서열번호 16, 또는 서열번호 16에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H1;
(ii) 서열번호 17, 또는 서열번호 17에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H3;
및/또는
(b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
(iv) 서열번호 24, 또는 서열번호 24에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L1;
(v) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 26, 또는 서열번호 26에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L3;
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL) CDR은 Chothia 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 16로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 17로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 24로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 25로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 26로 나타낸 CDR-L3을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은:
(a) 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR; 또는,
(b) 서열번호 7로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는 서열번호 8로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR; 을 포함하며,
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR:
(i) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H1;
(ii) 서열번호 14, 또는 서열번호 14에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H3;
및/또는
(b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
(iv) 서열번호 21, 또는 서열번호 21에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L1;
(v) 서열번호 22, 또는 서열번호 22에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L3;
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL) CDR은 Kabat 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 13로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 14로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 21로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 22로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23로 나타낸 CDR-L3을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
(i) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H1;
(ii) 서열번호 28, 또는 서열번호 28에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H2; 및
(iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-H3;
및/또는
(b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
(iv) 서열번호 29, 또는 서열번호 29에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L1;
(v) 서열번호 30, 또는 서열번호 30에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L2; 및
(vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L3.
여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL) CDR은 Kabat 넘버링 시스템으로 정의된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 13로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 28로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 29로 나타낸 CDR-L, 서열번호 30으로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23으로 나타낸 CDR-L3을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 포유동물(예를 들면 뮤린 또는 인간)로부터 유래된 면역 글로불린의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편의 VH는 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 중쇄 가변 영역(VH) 프레임워크 영역(FR)을 포함하며, 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL은 마우스 면역 글로불린으로부터 유래된 경쇄 가변 영역(VL) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 및 그의 항원 결합 단편의 VH는 인간 면역 글로불린으로부터 유래된 중쇄 가변 영역(VH) 프레임워크 영역(FR)을 포함하며, 및/또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VL은 마우스 면역 글로불린으로부터 유래된 경쇄 가변 영역(VL) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역 FR 및/또는 경쇄 가변 영역 FR은 하나 이상의 비인간(예를 들면, 뮤린) 아미노산 잔기를 포함하는바, 예를 들면, 상기 중쇄 프레임워크 영역 FR 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 FR은 하나 이상의 아미노산 복귀돌연변이를 포함하되 이러한 복귀돌연변이에는 상응하는 뮤린 아미노산 잔기가 구비된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 인간 면역 글로불린의 중쇄 프레임워크 영역 또는 이의 변이체- 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 보존적 치환)된 아미노산을 구비함-; 및/또는
(b) 인간 면역 글로불린의 경쇄 프레임워크 영역 또는 이의 변이체- 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 보존적 치환)된 아미노산을 구비한다.
따라서, 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화된 것이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 인간화 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열;
(ii) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및/또는
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열;
(v) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 1로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 1로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 1로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 2로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 2로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 2로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 3으로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 3으로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 3으로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 4로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 4로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 4로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 5로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 5로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 5로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 6으로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 6으로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 6으로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 7로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 7로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 7로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 8로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 8로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 8로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 9로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 9로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 9로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 10으로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 10으로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 10으로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 11로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 11로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 11로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 서열번호 12로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 12로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 12로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(1) 서열번호 1로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 2로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
(2) 서열번호 3으로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 4로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
(3) 서열번호 5로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 6으로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
(4) 서열번호 7로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 8로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
(5) 서열번호 9로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 10으로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
(6) 서열번호 11로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 12로 나타낸 서열을 구비하는 VL.
일부 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가로 포유동물(예를 들면 뮤린 또는 인간)로부터 유래된 면역 글로불린의 불변 영역 서열 또는 그의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가를 구비한다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 하나 이상의 보존적 치환을 구비한다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 중쇄 불변 영역(Fc)을 구비하는바, 이는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며; 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 더욱 특히 IgG1 또는 IgG4(예를 들면, 인간 IgG1 또는 IgG4)의 중쇄 불변 영역으로부터 선택된다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 경쇄 불변 영역을 구비하는바, 이는 예를 들어, κ 또는 λ의 경쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 바람직하게는 κ 경쇄 불변 영역(예를 들면, 인간 κ 경쇄)으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 인간 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역(CH) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 많아서 20개, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 치환, 결실 또는 부가; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)를 구비하며; 및/또는,
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 인간 면역 글로불린의 경쇄 불변 영역(CL) 또는 이의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 치환)을 구비한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 뮤린 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역(CH) 또는 이의 변이체를 포함하며. 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환을 구비하며(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 치환); 및/또는
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 뮤린 면역 글로불린의 경쇄 불변 영역(CL) 또는 이의 변이체를 포함하며. 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 치환)을 구비한다.
일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자의 특성을 변형(예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글루코실화, 시스테인 잔기의 수, 효과기세포 기능 또는 보체 기능 중 하나 이상의 특성을 변경)하기 위해 불변 영역이 변경되는바, 예를 들면, 돌연변이 된다. 항체 불변 영역 중의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 부동한 잔기로 대체함으로써 기능 변경이 생성되는바, 예를 들면, 이펙터 리간드에 대한 항체의 친화도를 변경하여 이펙터 기능을 변경시킨다(예를 들면, 향상, 감소 또는 제거). 이의 이펙터 기능을 변경하기 위해 항체의 Fc 영역 중의 아미노산 잔기를 대체하는 것은 본 분야에 이미 공지된 것이다(예를 들어, EP388151A1, US5648260, US5624821을 참조). 항체의 Fc영역은 여러가지 중요한 이펙터 기능을 매개하는바, 예를 들면 ADCC, 식세포작용, CDC 등이다. 일부 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 치료적 항체에 대해 필요하지만, 다른 상황에서, 이러한 이펙터 기능은 불필요한 것일 수 있거나 심지어 해로울 수 있으며, 이는 의도된 목적에 따라 달라진다. 따라서, 일부 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 감소되거나 심지어 제거된 이펙터 기능(예를 들면, ADCC 및/또는 CDC 활성)을 구비한다. S228P(EU 명명법, Kabat 명명법에서는 S241P임)와 같이, 인간 IgG4에서 항체 구조를 안정화시키는 아미노산의 돌연변이도 고려하고 있다.
이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하는바, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환 중의 적어도 하나를 구비한다: Ser228Pro, Leu234Ala, Leu235Ala, Gly237Ala, Asp265Ala, Asn297Ala, Pro329Ala, Asp356Glu 및 Leu358Met이다(상기에서 언급된 아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치이다, Edelman GM 등, Proc Natl Acad USA, 63, 78-85 (1969). PMID : 5257969).
일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하는바, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Leu234Ala, Leu235Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 감소된 ADCC 및 CDC 활성을 구비한다.
일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하는바, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Asn297Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제거된 ADCC 활성을 구비한다.
일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하는바, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Asp265Ala, Pro329Ala(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제거된 ADCC 활성을 구비한다.
일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 변이체를 포함하는바, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 아래의 치환을 구비한다: Ser228Pro(EU 넘버링 시스템을 기반으로 하는 위치). 이러한 유형의 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 구조는 안정적이며, Fab-arm 교환을 감소시킬 수 있음으로써, 불완전 항체의 형성이 용이하지 않게 된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄는 인간 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역(CH)의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 기본적으로 변화가 없는 이펙터 기능을 구비한다. 이러한 유형의 실시 방안에서, 상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 아미노산 치환을 구비할 수 있다(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 보존적 치환).
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄:
(i) 서열번호 38로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 38로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 38로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄:
(iv) 서열번호 40으로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 40으로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 40으로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄:
(i) 서열번호 42로 나타내는 서열;
(ii) 서열번호 42로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(iii) 서열번호 42로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
및
(b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄:
(iv) 서열번호 44로 나타내는 서열;
(v) 서열번호 44로 나타내는 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열; 또는
(vi) 서열번호 44로 나타내는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열.
일부 바람직한 실시 방안에서, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환이다.
일부 예시적인 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음과 같은 것을 포함한다:
(1) 서열번호 38로 나타낸 서열을 구비하는 중쇄 및 서열번호 40으로 나타낸 서열을 구비하는 경쇄;
(2) 서열번호 42로 나타낸 서열을 구비하는 중쇄 및 서열번호 44로 나타낸 서열을 구비하는 경쇄이다.
본 문에서 개시된 항 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIM-3의 1종 이상의 활성을 억제, 감소 또는 중화시킬 수 있는바, 예를 들면, T세포 또는 NK세포에 대한 면역 체크포인트의 차단 또는 감소를 초래하거나 항원 제시 세포를 조절함으로써 면역 반응이 재활성화된다.
1종의 실시 방안에서, 항체 분자 또는 그의 항원 결합 단편은 아래의 특성 중의 1종 이상을 나타낼 수 있다:
a) 100nM이하, 바람직하게는 ≤10nM, ≤1nM, ≤100pM 또는 ≤1pM의 KD로 TIM-3에 결합되며;
b) 혼합 림프구 반응(MLR) 측정 중 T세포(예를 들면, CD4+ 또는 CD8+ T세포)의 증식을 증진시키며;
c) MLR 측정 중 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 증진시키며;
d) MLR 측정 중 인터루킨-2(IL-2) 분비를 증진시키며;
e) TIM-3을 발현하는 급성 골수성 백혈병 세포와 같은 TIM-3을 발현하는 세포에 대해 세포 독성(항체 의존성 세포 매개 세포 독성, ADCC)을 구비하며;
f) NK세포의 세포 독성 활성을 증가시키며;
g) 조절형 T세포(Treg) 또는 대식세포의 리프레서(repressor) 활성을 감소시키며; 또는
h) 대식세포 또는 수지상세포가 면역 반응을 자극하는 기능을 증가시킨다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 단클론 항체로부터 유래되거나 하기 단클론 항체이다:
하이브리도마 세포주#22에서 생성된 단클론 항체, 여기서, 하이브리도마 세포주#22는 중국 타입 컬쳐 콜렉션 센터(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)(주소: 중국. 우한. 우한대학)에 수탁되었으며, 수탁번호는 CCTCC NO.C2017181이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 단편, 디아바디(diabody), 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체로부터 선택된다.
본 발명의 제2 측면에서는, 본 발명의 상기 항 TIM-3 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 개시하였다. 일부 실시 방안에서, 상기 항 TIM-3 항체 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈이 최적화된 것이다. 예를 들면, 본 발명의 특징은 항 TIM-3 항체 분자의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 제1 및 제2 핵산을 각각 코딩하는 것이며, 해당 항체 분자는 하기로부터 선택되는 임의의 1종이다: Mab22, AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7; 또는 이와 실질적으로 동일한 서열. 예를 들면, 핵산은 표 4에 표시된 AB12S3, AB12S4 뉴클레오티드 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 더욱 유사한 서열 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환(예를 들면, 보존적 치환)을 구비하는 서열, 또는 표 4에 표시된 서열과는 3, 6, 15, 30 또는 45개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 서열)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제3 측면에서, 본 발명은 벡터(예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공하는바, 이는 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함한다. 일부 바람직한 실시 방안에서 본 발명의 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다. 일부 바람직한 실시 방안에서 상기 벡터는 대상체(예를 들어 포유동물, 예를 들면 인간) 체내에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있다.
본 발명의 제4 측면에서, 본 발명은 숙주세포를 제공하는바, 이는 본 발명의 분리된 핵산 분자 또는 본 발명의 벡터를 포함한다. 숙주 세포는 진핵 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포) 또는 원핵 세포(예를 들면, 대장균)일 수 있다. 적합한 진핵 세포는 NS0 세포, Vero 세포, Hela 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 숙주 세포는 포유동물 세포인바, 예를 들어 CHO(예를 들면, CHO-K1, CHO-S, CHO DXB11, CHO DG44)이다.
본 발명의 제5 측면에서는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하는바, 이는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 조건에서, 본 발명의 숙주세포를 배양하는 단계 및 배양된 숙주세포 배양물에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제6 측면에서 약물 조성물을 개시하였는바, 이는 약학적으로 허용가능한 벡터 및/또는 부형제 및/또는 안정제와 적어도 1종의 본 발명에 따른 항 TIM-3 항체 분자를 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 약물 조성물은 별도의 약학적 활성제를 더 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 항 종양 활성을 갖는 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 감염을 치료하기 위한 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 자가면역질환을 치료하기 위한 약물이다.
일부 실시 방안에서, 상기 약물 조성물에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상기 또 다른 약학적 활성제는 분리된 조성분 또는 동일한 조성물의 조성분으로서 제공된다. 따라서 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 별도의 약학적 활성제와 동시에 투여되거나, 개별적으로 투여 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 하기로부터 선택되는 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합되는 제2 항체 또는 상기 제2 항체를 코딩하는 핵산을 더 포함한다. 여기서, 상기 수용체 또는 리간드는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIGIT, VISTA, CTLA-4, OX40, BTLA, 4-1BB, CD96, CD27, CD28, CD40, LAIR1, CD160, 2B4, TGF-R , KIR, ICOS, GITR, CD3, CD30, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, SLAMF7, NKp80, B7-H3 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 특정된 실시 방안에서, 상기 제2 항체는 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물에 포함된 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, Nivolumab(니볼루맙 또는 Opdivo®) 또는 이의 항원 결합 단편 및 Pembrolizumab(펨브로리주맙 또는 Keytruda®) 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택된다.
일부 특정된 실시 방안에서, 상기 제2 항체는 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시 방안에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약물 제조에 사용되며, 상기 약물은 적어도 하기 임의의 하나에 사용된다: (1) 체외 또는 대상체(예를 들면, 인간) 체내에서 면역세포 활성을 향상시키는 것; (2) 대상체(예를 들면, 인간)에서 면역 반응을 증강시키는 것; (3) 대상체(예를 들면, 인간)에서 암을 치료하는 것; (4) 대상체(예를 들면, 인간)에서 감염성 질환을 치료하는 것; (5) 대상체(예를 들면, 인간)에서 자가면역질환을 치료하는 것; 및 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합이다.
본 발명의 제7 측면에서, 치료 대상 중 TIM-3 매개된 병증 또는 질환(예를 들면, 암, 감염성 질환, 자가면역질환)에 대한 약물을 제조함에 있어서의 용도를 제공하는바, 상기 종양은 고형 종양, 혈액 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들면 다발성 골수종) 및 전이성 병소로부터 선택되며; 암의 비한정적인 예시 암은 폐암(예를 들면, 폐선암 또는 비소세포폐암)(NSCLC)(예를 들면, 편평 및/또는 비편평 병력이 있는 NSCLC, 또는 NSCLC 선암), 흑색종(예를 들면, 진행성 흑색종), 신장암(예를 들면, 신세포암), 간암(예를 들면, 간세포암), 골수종(예를 들면, 다발성 골수종), 전립선암, 유방암(예를 들면, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중의 1종, 2종 또는 전부를 발현하지 않는 유방암; 예를 들면, 삼중음성유방암), 난소암, 결장직장암, 췌장암, 두경부암(예를 들면, 두경부편평세포암(HNSCC)), 항문암, 위-식도암(예를 들면, 식도편평세포암), 중피종, 비인두암, 갑상선암, 자궁경부암, 림프증식성질환(예를 들면, 이식후 림프증식성질환) 또는 혈액암(예를 들면, 미만성거대B세포림프종, T세포림프종, B세포림프종, 또는 비호지킨림프종), 또는 백혈병(예를 들면, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병)으로부터 선택된다.
하나의 실시 방안에서, 암종은 진행성 또는 전이성암, 흑색종 또는 ㅍ폐암으로부터 선택되는바, 예를 들면, 비소세포폐암이다.
하나의 실시 방안에서, 암종은 폐암인바, 예를 들면 폐선암, 비소세포폐암 또는 소세포폐암이다.
하나의 실시 방안에서, 암종은 흑색종인바, 예를 들면 진행성 흑색종이다. 하나의 실시 방안에서, 암은 다른 치료에 대해 반응하지 않는 진행성 또는 제거할 수 없는 흑색종이다. 다른 실시 방안에서, 암은 BRAF 돌연변이(예를 들면, BRAFV600돌연변이)를 갖는 흑색종이다.
다른 하나의 실시 방안에서, 암은 간암이며, 예를 들면, 바이러스 감염이 있거나 없는 진행성 간암인바, 예를 들면 만성 바이러스성 간염이다.
다른 하나의 실시 방안에서, 암은 전립선암이며, 예를 들면 진행성 전립선암이다.
또 다른 하나의 실시 방안에서, 암을 골수종이며, 예를 들면, 다발성 공수종이다.
또 다른 하나의 실시 방안에서, 암은 신장암이며, 예를 들면, 신세포암(RCC)(예를 들면, 전이성 RCC 또는 투명세포형 신세포암(CCRCC) 또는 유두상 신세포암)이다.
하나의 실시 방안에서, 종양미세환경은 상승된 수준의 PD-L1 발현을 구비한다. 대안적으로 또는 조합적으로, 종양미세환경은 상승된 IFN-γ 및/또는 CD8 발현을 구비한다.
일부 실시 방안에서, 대상체는 높은 PD-L1 수준 또는 높은 PD-L1 발현을 구비하는 1종 또는 다수 종의 종양을 갖는 것으로 이미 확인되었거나 이를 갖는 것으로 확인되며, 또는 종양 침윤 림프구(TIL)+, 또는 상기 서술된 2종의 상황으로 확인된다.
일부 실시 방안에서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및 기생충 감염으로부터 선택되는바, 예를 들면, 감염성 질환의 비한정적인 예시는 HIV, (A형, B형 또는 C형)간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 패혈증 등을 포함한다.
일부 실시 방안에서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 용혈성빈혈, 자가면역성 혈소판감소성자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 그레이브스병, 중증근무력증, 자가면역성 간염 및 다발성 경화증으로부터 선택된다.
본 발명의 제8 측면에서, 대상체에서 면역 반응을 조정(예를 들어 자극 또는 억제)하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 단독적으로 또는 1종 이상의 활성제 또는 1종 이상의 수술을 조합(예를 들면, 다른 면역조절제와 조합함)함으로써 본 문에서 개시된 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 대상체에 투여하여 대상체 중의 면역 반응이 조정되도록 하는 것을 포함한다. 일부 실시 방안에서, 항체 분자는 대상체 중의 면역 반응을 증강, 자극 또는 증가시킨다. 일부 실시 방안에서, 항체 분자는 대상체 중의 면역 반응을 억제, 감소 또는 중화시킨다. 대상체는 포유동물일 수 있는바, 예를 들면 원숭이, 영장류이며, 바람직하게는 고등영장류이며, 예를 들면, 인간(예를 들면 본 발명에서 설명된 병증을 앓고 있거나 상기 병증의 위험에 처해있는 환자)이다.
본 발명의 제9 측면에서, 대상체의 암 또는 종양을 치료(예를 들어, 억제 및/또는 진행 지연)하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 본 문에 따른 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 단독적으로 또는 1종 또는 다수 종의 활성제 또는 절차와 조합하여 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 특정된 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 공동 자극 분자의 조절제(예를 들면, 공동 자극 분자의 작용제) 또는 억제 분자의 조절제(예를 들면, 면역 체크포인트 분자의 억제제)와 조합하여 투여되는바, 예를 들면 본 발명에 서술된 바와 같다.
본 발명의 제10 측면에서, 대상체 중 암 또는 종양 세포 성장(예를 들어, 암 치료)을 감소시키거나 억제시키는 방법을 제공한다. 해당 방법은, 단독적으로 또는 제2 활성제와 조합함으로써, 본 문에서 설명된 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면, 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제 11 측면에서, 진단 또는 치료 키트를 제공하는바, 이는 본 발명에서 설명된 항 TIM-3 항체 분자 및 사용 명세서를 포함한다.
본 발명에서 제조된 항 TIM-3 인간화 항체는 TIM-3과의 결합 친화도가 높으며, 아주 강한 특이성을 구비한다. 체내 항 종양 연구 데이터에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제공한 인간화 항체는 마우스 이식 종양의 성장을 현저히 억제키는바, 심지어, 일부분 마우스의 종양이 완전히 사라진다. 이외에, 본 발명에 따른 상기 항체는 CHO 세포로 발현되며, 생산량이 높고 활성이 높으며, 정제 공정이 간단하고 생산 단가가 낮은 우세가 있다.
발명의 상세한 설명
약어 및 정의
TIM-3: T세포 면역 글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3;
CDR: Kabat 넘버링 시스템으로 정의된 면역 글로불린 가변 영역 중의 상보성 결정 영역;
EC50: 50% 기능 효과를 나타내거나 결합되는 농도;
ELISA: 효소결합면역흡착측정(enzyme-linked immunosorbent assay);
FR: 항체프레임워크영역: CDR 영역을 제외한 면역글로불린 가변 영역;
HRP: 겨자무과산화효소;
IL-2: 인터루킨-2;
IFN: 인터페론;
IC50: 50%의 억제효과를 나타내는 농도;
IgG: 면역 글로불린 G;
Kabat: Elvin A Kabat가 주장한 면역 글로불린 비교 및 넘버링 시스템;
mAb: 단클론 항체;
PCR: 중합효소 연쇄 반응;
V 영역: 서로 다른 항체 사이에서 서열이 가변되는 IgG 체인 세그먼트이다. 이는 경쇄의 109 위치 Kabat 잔기 및 중쇄의 제 113 위치 잔기까지 연장된다.
VH: 면역 글로불린 중쇄 가변 영역;
VL: 면역 글로불린 경쇄 가변 영역;
VK: 면역 글로불린 κ경쇄 가변 영역;
KD: 평형해리상수(Equilibrium dissociation constant);
Ka: 결합속도상수(Association rate constant);
Kd: 해리속도상수.
본 발명에서 사용된 용어 "TIM-3"은 이소타입, 포유동물(예를 들면, 인간)의 TIM-3, 인간 TIM-3의 종간 상동체 및 TIM-3과 하나 이상의 공통 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. TIM-3(예를 들면, 인간 TIM-3)의 아미노산 서열은 본 분야에서 공지된 것이다(예를 들면, Sabatos et al., Nat Immunol, 2003, 4 (11):1102). 일부 실시 방안에서, 본 발명에서 제공된 항체 분자는 포유동물(예를 들면 인간 또는 게먹이 원숭이)의 TIM-3 상의 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체 형태 에피토프)에 특이적으로 결합된다. 일부 실시 방안에서, 결합 에피토프는 적어도 인간 또는 게먹이 원숭이 TIM-3의 IgV 도메인의 일부분이다. 인간 TIM-3의 뉴클레오티드와 단백질 서열은 Genbank 수탁번호 AF251707.1 및 Uniprot 수탁번호 Q8TDQ0에서 찾아볼 수 있다.
용어 "항체"는 전장 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 포함), 이의 여러가지 기능성 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv or scFv 단편과 같은 항원 결합 부분만 포함할 수 있음) 및 변형된 항체(예를 들면, 인간화, 글리코실화 등임)를 포함한다. 본 발명은 글리코실화 변형된 항 TIM-3 항체를 더 포함한다. 일부 응용에서는, 변형을 진행함으로써, 바람직하지 못한 글리코실화 부위를 제거하는바, 예를 들면, 올리고당 사슬에서 항체 의존성 세포 매개 독성(ADCC) 기능이 증가되도록 푸코스를 제거하는 변형을 진행한다. 일부 응용에서, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경하기 위해 갈락토실화 변형을 진행한다. 본 발명에서 항 TIM-3 항체 분자는 인간화, 키메라, 낙타(camelid), 상어 또는 체외에 생성된 항체 분자일 수 있다. 항체 및 항체 단편은 임의의 항체 종류로부터 선택되는바, IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 상기 항체 및 항체 단편은 임의의 항체 아형으로부터 유래될 수 있다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체, CDR 이식 항체 또는 체외에서 생성된 항체일 수도 있다. 항체는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 구비할 수 있다. 항체는 예를 들어 κ 또는 λ로부터 선택되는 경쇄를 더 구비할 수 있다.
용어 "단클론 항체 또는 mAb"는 단일 클론 세포주로부터 얻은 항체를 의미하며, 상기 세포주는 진핵, 원핵 또는 파지의 클론 세포주에 한정되지 않는다. 단클론 항체 또는 항원 결합 단편은 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 전시 기술, 합성 기술(예를 들면 CDR-grafting), 또는 다른 기존 기술로 재조합하여 얻을 수 있다.
"항체 단편" 및 "항원 결합 단편"은 항체의 항원 결합 단편 및 항체 유사체를 지칭하며, 이는 일반적으로 적어도 일부분의 모체 항체(parental antibody)의 항원 결합 영역 또는 가변 영역(예를 들면, 하나 이상의 CDR)을 포함한다. 항체 단편은 모체 항체의 적어도 일부 결합 특이성을 보유한다. 바람직하게, 항체 단편은 표적에 대한 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 더 많은 모체 항체의 결합 친화도를 보유한다. 항체 단편의 예시는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(linear antibody); 단일 사슬 항체 분자(예를 들면, ScFv, 단일 항체, 나노 항체, 단일 도메인 항체); 및 항체 단편으로 형성된 다중 특이성 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 조작된 항체(Engineered antibody) 변이체는 Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136에 종합적으로 설명되어 있다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1과 CH2 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 포함한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 이상의 디설파이드결합에 의해 CH3 도메인의 소수성 작용을 통해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역 부분을 포함하며, 이로써, F(ab')2 분자를 형성하도록 두 개의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄 사이에 사슬 간 디설파이드결합을 형성한다.
"F(ab')2 단편"은 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄의 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역 부분을 포함하며, 두 개의 중쇄 사이에 사슬 간 디설파이드결합을 형성한다. 따라서, F(ab')2 단편은 두 개의 중쇄 사이의 디설파이드결합을 통해 함께 유지되는 두 개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 양자의 가변 영역으로부터 유래되나, 불변 영역이 결핍하다.
"단일 쇄 Fv 항체"(또는 "scFv 항체")는 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 말하는바, 여기서, 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. scFv에 대하여, Pluckthun (1994), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(단클론 항체 약리학), 제 113권, Rosenburg 및 Moore 주필, Springer-Verlag, New York, 제 269-315페이지를 참조할 수 있다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO88/01649 및 미국 특허 4946778와 526020를 더 참조할 수 있다.
"항원 결합 단편"은 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 사슬만 포함하는 면역학 기능을 구비하는 면역 글로불린 단편이다. 항원 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL와 CH1 도메인을 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합으로 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH와 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 FV 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 디아바디 항체(dAb) 단편; (vi) 낙타(또는 낙타화된 가변 도메인); (vii) 단일 쇄 Fv(scFv); (viii) 단일 도메인 항체를 포함한다. 본 분야의 당업자에게 공지된 몇 가지 통상적인 기술을 포함하는 임의의 적당한 방법을 사용하면 이러한 항체 단편을 얻을 수 있으며, 온전한 항체와 동일한 방식에 따라 상기 단편의 용도를 스크리닝할 수 있다.
본 문에서 사용된 용어 "초가변영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "상보성 결정 영격"은 항원 결합을 책임지는 항체 아미노산 잔기를 의미한다. CDR 영역 서열은 IMGT, Kabat, Chothia 및 AbM 방법으로 정의되거나 본 분야에서 익숙히 알고 있는 임의의 CDR 영역 서열 확정 방법에 의해 확인되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기일 수 있다. 항체 CDR은 최초 Kabat 등이 정의한 높은 가변 영역으로 확인될 수 있는바, 예를 들면, 경쇄 가변 도메인의 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 위치 잔기와 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 위치 잔기이며(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest(면역학적 관심사의 단백질 서열), 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md를 참조), CDR의 위치는 최초 Chothia 등이 설명한 "초가변루프"(HVL) 구조로 정의된 것으로 확인될 수 있는바, 예를 들면, 경쇄 가변 도메인의 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 위치 잔기와 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-102 (H3) 위치 잔기이다(예를 들면, Chothia et al., J Mol Biol, 1992, 227: 799-817; Tomlinson et al., J Mol Biol, 1992, 227: 776-798을 참조). IMGT(ImMunoGeneTics)도 CDR의 면역 글로불린 가변 영역의 넘버링 시스템을 제공하였으며, IMGT 넘버링에 따라 CDR 영역이 정의되는바, 예를 들면, 경쇄 가변 도메인의 27-32 (L1), 50-52 (L2) 및 89-97 (L3) 위치 잔기와 중쇄 가변 도메인의 26-35 (H1), 51-57 (H2) 및 93-102 (H3) 위치 잔기이다(Lefranc, M.P. et al., Dev Comp Immunol, 2003, 27: 55-77, 이는 본 문에 참조로 포함됨). CDR 확인을 위한 다른 방법은, Kabat 및 Chothia 사이의 절충이고 Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어를 사용하여 얻는 "AbM 정의"; 또는 관찰된 항원 접촉에 기반하며, MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745에서 설명된 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. CDR의 "구성 정의(configuration definition)" 방법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대해 엔탈피 기여를 하는 잔기로 확인된다(예를 들면, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166을 참조). 본 발명에서 사용된 방법은 Kabat 정의, IMGT 정의, Chothia 정의, AbM 정의, 접촉 정의 및/또는 구성 정의를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 중의 하나를 사용하거나 이들 중 하나에 따라 정의될 수 있다.
일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 적어도 하나, 두 개 또는 세 개의 본 발명에서 서술된 항체의 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 해당 항체는 예를 들어 하기 임의의 항체로부터 선택된다: Mab22, AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7; 또는 표 1에서 서술된 것; 또는 표 4 중의 뉴클레오티드 서열로 코딩된 것; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 실질적으로 동일(예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 유사하거나 하나 또는 다수 개의 아미노산 치환을 구비(예를 들면 보존적 치환))한 서열. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 적어도 하나, 두 개 또는 세 개의 본 발명에서 서술된 항체의 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 해당 항체는 예를 들어 하기 임의의 항체로부터 선택된다: Mab22, AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7; 또는 표 1에서 서술된 것; 또는 표 4 중의 뉴클레오티드 서열로 코딩된 것; 또는 상기 서열 중의 임의의 서열과 실질적으로 동일(예를 들면, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더욱 유사하거나 하나 또는 다수 개의 아미노산 치환을 구비(예를 들면 보존적 치환))한 서열다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 적어도 1개, 2개 또는 3개, 4개, 5개 또는 6개의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 CDR을 포함하며, 해당 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 표 1에서 나타낸 것; 또는 표 4에서 나타낸 뉴클레오티드 서열로 코딩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 방안에서, 표 1에서 나타낸 것, 또는 표 4에서 나타낸 뉴클레오티드 서열로 코딩된 CDR에 비해, 하나 이상의 CDR(또는 전부 CDR)에는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 더욱 많은 변형을 구비하는바, 예를 들면, 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 구비한다.
용어 "프레임워크 영역", "가변 프레임워크 영역", "FR 영역"은 본 발명에서 정의된 초가변영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자의 경쇄 가변 프레임워크 영역 또는 중쇄 가변 프레임워크 영역은 하기로부터 선택될 수 있다: (a) 인간 경쇄 또는 중쇄 가변 프레임워크 영역으로부터 유래된 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 바람직하게는 100%의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 또는 중쇄 가변 프레임워크 영역; (b) 비인간 프레임워크 영역(예를 들면, 설치동물 프레임워크); 또는 (c) 변형된(예를 들면, 항원 결정 인자 또는 세포독성 결정 인자를 제거하도록 변형되는 것) 비이간 프레임워크 영역, 예를 들면, 탈면역화 또는 부분적인 인간화 프레임워크이다. 일부 바람직한 방안에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 프레임워크 영역은 인간 생식세포 유전자의 VL 또는 VH 단편의 프레임워크 영역과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일하거나 동일한 경쇄 또는 중쇄 가변 프레임워크 영역 서열을 포함한다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는, 예를 들어 완전한 가변 영역(예를 들면 표 1에서 나타낸 것) 중 FR 영역의 아미노산 서열로부터 유래된, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 10개, 15개, 20개 또는 더욱 많은 변형(예를 들면, 아미노산 치환, 삽입 또는 결실)을 구비하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는, 예를 들어, 완전한 가변 영역 중, FR 영역의 아미노산 서열로부터 유래된, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 10개, 15개, 20개 또는 더욱 많은 변형(예를 들면, 아미노산 치환, 삽입 또는 결실)을 구비하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
용어 "키메라 항체(Chimeric antibody)"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합시켜 형성한 항체이며, 뮤린 항체에 의해 유도된 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 키메라 항체는 임의의 적합한 재조합 DNA 기술에 의해 생성 될 수 있다. 일부는 본 분야에서 공지된 것이다(PCT/US86/02269; EP184,187; EP171496; EP173494; WO86/01533; US4816567; EP125023; Better et al., Science, 1988, 240: 1041-1043); Liu et al., PNAS, 1987, 84: 3439-3443; Liu et al., J Immunol, 1987, 139: 3521-3526; Sun et al., PNAS, 1987, 84: 214-218; Nishimura et al., Canc Res, 1987, 47: 999-1005; Wood et al., Nature, 1985, 314: 446-449; 및 Shaw et al., J Natl Cancer Inst, 1988, 80: 1553-1559를 참조). 본 발명의 바람직한 일 실시 방안에서, 상기 TIM-3 키메라 항체의 항체 경쇄 가변 영역은 추가로 뮤린 κ쇄, λ쇄 또는 변이체의 경쇄 FR 영역을 포함한다. TIM-3 키메라 항체의 중쇄 가변 영역은 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 FR 영역을 추가로 포함한다. 인간 항체의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다.
용어 "다중 특이성 항체"는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 유사체와 커플링시킴으로써 형성되며, 여기서 각 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체 유사체는 원 결합 특이성을 유지하는바, 예를 들면, 다중 특이성 항체는 삼중 특이성 항체 또는 사중 특이성 항체이다. 용어 "이중 특이성 항체"는 본 발명의 항 TIM-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어 종양 관련 항원, 사이토카인 및 세포 표면 수용체)에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합되는 이중 특이성 분자를 생성할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 이중 특이성 항체을 생성하기 위해, 본 발명의 항체를 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결되어(예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 기타 방식을 통함) 이중 특이성 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, "이중 특이성 항체"는 얻은 항체가 2종의 상이한 항원을 식별하도록 2개의 가변 도메인 또는 ScFv 단위를 포함하는 것을 의미한다.
본 문에서 사용된 용어 "면역 결합" 및 "면역 결합 성질"은 면역 글로불린 분자와 항원(해당 항원에 대해 면역 글로불린은 특이적임) 사이에 발생하는 비공유 상호 작용을 의미한다. 면역 결합 상호 작용의 강도 또는 친화도는 상호 작용하는 평형해리상수(KD)로 표시할 수 있는바, 여기서, KD 값이 작을수록 친화도가 높다는 것을 표시한다. 선택된 폴리 펩티드의 면역 결합 성질은 본 분야에서 공지된 방법으로 정량화될 수 있다. 한 가지 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체가 형성 및 해리되는 속도를 측정하는 것이다. "결합속도상수"(ka 또는 kon)와 "해리속도상수"(kd 또는 koff) 양자는 모두 농도 및 결합과 해리의 실제 속도를 통해 계산하여 얻을 수 있다(Malmqvist M, Nature, 1993, 361: 186-187을 참조). kd/ka 비율은 해리상수 KD와 같다(일반적으로 Davies et al., Annual Rev Biochem, 1990, 59: 439-473을 참조). 임의의 효과적인 방법으로 KD, ka 및 kd 값을 측정할 수 있다. 바람직한 실시 바안에서, 생물 발광 간섭 측정법(예를 들어, 실시예 5.2에 따른 ForteBio Octet법)으로 해리상수를 측정한다. 다른 바람직한 실시 방안에서, 표면 플라즈몬 공명 기술(예를 들어, Biacore) 또는 Kinexa로 해리상수를 측정할 수 있다. 평형결합상수(KD)가 ≤10nM, 바람직하게는 ≤ 100nM, 더 바람직하게는 ≤ 10nM, 가장 바람직하게 ≤ 100pM 내지 약 1pM일 경우, 본 발명의 항체는 특이적으로 TIM-3 에피토프에 결합되는 것으로 예상한다.
동종항체
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체가 포함하는 중쇄와 경쇄 가변 영역에 포함되는 아미노산 서열은 본 문에 따른 바람직한 항체의 아미노산 서열과 상동성을 가지며, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항 TIM-3 항체의 원하는 기능 특성을 보류하였다.
예를 들면, 본 발명에서는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는, TIM-3에 결합되는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하였다. 여기서: (a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; 더 바람직하게, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; (b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12의 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함하며; 더 바람직하게, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12의 아미노산 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
보존적 변형을 구비하는 항체
용어 "보존적 변형"은 아미노산 변형이 해당 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특징에 현저한 영향을 주지 않거나 변경하지 않음을 의도적으로 의미한다. 이러한 유형의 보존적 변형은 아미노산의 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 본 분야에 공지된 표준적인 기술, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유도 및 PCR 매개된 장점을 본 발명의 항체에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 구비하는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 대체하는 것을 의미한다. 본 분야에는 유사한 측쇄를 구비하는 아미노산 잔기 패밀리가 살세히 설명되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 구비하는 아미노산을 포함한다. 따라서, 동일한 측쇄 패밀리로부터 유래된 다른 아미노산 잔기로 본 발명의 항체 CDR 영역 중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체할 수 있다.
항 TIM-3 항체의 용도
본 문에 개시된 항 TIM-3 항체 분자는 TIM-3의 하나 이상의 활성을 억제, 감소 또는 중화시킬 수 있는바, 예를 들어, T세포 또는 NK세포 상의 면역 체크포인트를 차단하거나 항원 제시 세포를 조절함으로써, 면역 반응을 재활성화시키는 것이다. 일 실시 방안에서, 항체 분자는 하기와 같은 1종 이상의 활성을 구비한다: T세포 중 IFN-γ 및/또는 TNFα 분비를 향상시키며; T세포(예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T세포)의 증식을 향상시키며; NK세포의 세포 독성 작용을 증가시키거나; 또는 조절형 T세포(Treg) 또는 대식세포의 리프레서 활성을 감소시키거나; 대식 세포 또는 수지상세포가 면역 반응을 자극하는 기능을 증가하는 것이다. 따라서, 이러한 항체 분자를 사용함으로써 대상체 중 면역 반응을 증강하려고 하는 병증, 예를 들면, 암, 감염성 질환 및 자가 면역 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.
암
일부 실시 방안에서, TIM-3 항체 분자를 사용하여 TIM-3을 발현하는 암을 치료한다. TIM-3을 발현하는 암은 자궁경부암(Cao et al., PLOS One, 2013, 8 (1): e53834), 폐암(Zhuang et al., Am J Clin Pathol, 2012, 137 (6): 978-985)(예를 들면, 비소세포폐암), 급성 골수성 백혈병(Kikushige et al., Cell Stem Cell, 2010, 7 (6): 708-17), 미만성 대B세포 림프종, 흑색종(Fourcade et al., JEM, 2010, 207 (10): 2175), 신장암(예를 들면, 신세포암(RCC), 예를 들어 신투명세포암, 유두상 신세포암 또는 전이성 신세포암), 편평세포암, 식도 편평세포암, 비인두암, 결장직장암, 유방암(예를 들면, 에스트로겐 수용체 단백질, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중의 1종, 2종 또는 전부를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어 삼중음성 유방암), 중피종, 간세포암 및 난소암을 포함한다. TIM-3을 발현하는 암은 전이성 암일 수 있다. 일 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자를 사용하여 1종 이상의 하기 대식세포의 세포 마커를 특징으로 하는 암을 치료한다: LILRB4 (대식세포 억제성 수용체), CD14, CD16, CD68, MSR1, SIGLEC1, TREM2, CD163, ITGAX, ITGAM, CD11b 또는 CD11c이다. 이러한 암의 예시는 미만성 대B세포 림프종, 다형성 교모세포종, 신장 신투명세포암, 췌장선암, 육종, 간장 간세포암, 폐선암, 신장 유두상 신세포암, 피부의 피부 흑색종, 대뇌 저등급 신경교종, 폐편평상피세포암, 난소 장액성낭포선암, 두경부 편평세포암, 침윤성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 자궁경부 편평상피세포암, 자궁경부 상피내 선암, 자궁암, 결장직장암, 자궁체부 자궁내막암, 갑상선암, 방광요로상피세포암, 부신피질암, 신장 발색성 세포 및 전립선선암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 방안에서, 본 발명에서는 대상체에서 면역 반응을 조정(예를 들어 자극 또는 억제)하는 방법을 제공한다. 방법은 단독적으로 또는 1종 이상의 활성제 또는 1종 이상의 수술을 조합(예를 들면, 다른 면역조절제와 조합함)함으로써 본 문에서 개시된 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 대상체에 투여하여 대상체 중의 면역 반응이 조정되도록 하는 것을 포함한다. 일부 실시 방안에서, 항체 분자는 대상체 중의 면역 반응을 증강, 자극 또는 증가시킨다. 일부 실시 방안에서, 항체 분자는 대상체 중의 면역 반응을 억제, 감소 또는 중화시킨다.
대상체는 포유동물일 수 있는바, 예를 들면 원숭이, 영장류이며, 바람직하게는 고등영장류이며, 예를 들면, 인간(예를 들면 본 발명에서 설명된 병증을 앓고 있거나 상기 병증의 위험에 처해있는 환자)이다. 일부 실시 방안에서, 대상체의 면역 반응을 증강해야 하며, 일부 실시 방안에서, 대상체의 면역 반응을 억제시켜야 된다. 일부 실시 방안에서, 대상체는 본 문에서 서술된 병증을 앓고 있거나, 또는 본 문에 따른 상기 병증의 발병 위험에 처해 있는바, 예를 들면, 본 문에 따른 상기 암 및 감염성 병증을 앓고 있다. 특정된 실시 방안에서, 대상체는 면역 손상되었거나 면역 손상의 위험에 처해 있다. 예를 들면, 대상체는 화학 치료 및/또는 방사선 치료를 받고 있거나 이미 받았다. 대안적으로 또는 조합적으로, 대상체는 감염으로 인해 면역 손상되거나 면역 손상의 위험에 처해 있다.
한 측면에서, 대상체의 암 또는 종양을 치료(예를 들어, 억제 및/또는 진행 지연)하는 방법을 제공하였다. 해당 방법은 본 문에 따른 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 단독적으로 또는 1종 또는 다수 종의 활성제 또는 절차와 조합하여 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 특정된 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 공동 자극 분자의 조절제(예를 들면, 공동 자극 분자의 작용제) 또는 억제 분자의 조절제(예를 들면, 면역 체크포인트 분자의 억제제)와 조합하여 투여되는바, 예를 들면 본 발명에 서술된 바와 같다.
본 문에서는 대상체 중 암 또는 종양 세포 성장(예를 들어, 암 치료)을 감소시키거나 억제시키는 방법을 제공한다. 해당 방법은 단독적으로 또는 제2 활성제와 조합함으로써, 본 문에서 설명된 항 TIM-3 항체 분자(예를 들면, 치료학적 유효량의 항 TIM-3 항체 분자)를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자(단독적으로 또는 1종 이상의 면역조절제와 조합함)로 치료하는 암은 고형 종양, 혈액학적 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들어 다발성 골수종) 및 전이성 병소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일 실시 방안에서, 암은 고형 종양이다. 고형 종양의 예시는 악성 종양을 포함하는바, 예를 들어, 육종과 암, 예를 들어 폐, 유방, 난소, 림프, 위장(예를 들어 결장), 항문, 생식기 및 비뇨생식로(예를 들어, 신장, 요도, 방광세포, 전립선), 인후, CNS(예를 들어, 뇌, 신경 또는 교질 세포), 두경부, 피부(예를 들어 흑색종)와 췌장 그런 것과 같은 각종 기관 계통의 선암을 포함하며, 결장암, 신장암, 신세포암, 간암, 비소세포폐암, 소장의 암종 및 식도의 암종과 같은 악성 종양의 선암을 포함한다.
일 실시 방안에서, 암은 폐암(예를 들어, 폐선암 또는 비소세포폐암)(NSCLC)(예를 들어 편평 및/또는 비편평 병력이 있는 NSCLC, 또는 NSCLC 선암), 흑색종(예를 들어, 진행성 흑색종), 신장암(예를 들어 신세포암), 간암(예를 들어 간세포암), 골수종(예를 들어 다발성 골수종), 전립선암, 유방암(예를 들어 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중의 1종, 2종 또는 전부를 발현하지 않는 유방암; 예를 들면, 삼중음성유방암), 난소암, 결장직장암, 췌장암, 두경부암(예를 들면, 두경부편평세포암(HNSCC)), 항문암, 위-식도암(예를 들면, 식도편평세포암), 중피종, 비인두암, 갑상선암, 자궁경부암, 림프증식성질환(예를 들면, 이식후 림프증식성질환) 또는 혈액암(예를 들면, 미만성거대B세포림프종, T세포림프종, B세포림프종, 또는 비호지킨림프종), 또는 백혈병(예를 들면, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병)으로부터 선택된다.
다른 하나의 실시 방안에서, 암종은 암(예를 들어 진행성 또는 전이성 암), 흑색종 또는 폐암(예를 들어 비소세포폐암)으로부터 선택된다.
일 실시 방안에서, 암종은 폐암이며, 예를 들어, 폐선암, 비소세포폐암 또는 소세포폐암이다.
일 실시 방안에서, 암종은 흑색종이며, 예를 들어 진행성 흑색종이다. 일 실시 방안에서, 암종은 다른 치료에 반응하지 않는 진행성 또는 제거할 수 없는 흑색종이다. 다른 실시 방안에서, 암종은 BRAF 돌연변이(예를 들어 BRAFV600돌연변이)를 갖는 흑색종이다.
다른 하나의 실시 방안에서, 암종은 간암이며, 예를 들어, 바이러스 감염이 있거나 없는 진행성 간암, 예를 들어 만성 바이러스성 간염이다.
다른 하나의 실시 방안에서, 암종은 전립선암이며, 예를 들어, 진행성 전립선암이다.
또 다른 하나의 실시 방안에서, 암종은 골수종이며, 예를 들어 다발성 골수종이다.
또 다른 하나의 실시 방안에서, 암종은 신장암이며, 예를 들어, 신세포암(RCC)(예를 들어, 전이성 RCC 또는 투명세포성 신세포암(CCRCC) 또는 유두상 신세포암)이다.
한 실시 방안에서, 암 미세환경은 상승된 수준의 PD-L1 발현을 구비한다. 대안적으로 또는 조합적으로, 암 미세환경은 상승된 IFN-γ 및/또는 CD8 발현을 구비할 수 있다.
일부 실시 방안에서, 대상체는 높은 PD-L1 발현을 구비하는 종양을 앓고 있는 것으로 이미 확인되었거나 확인되며, 또는 종양 침윤 림프구(TIL)+(예를 들어, 증가된 수의 TIL을 구비함), 또는 상기 서술된 2종의 상황으로 확인된다. 일부 실시 방안에서, 대상체는 높은 PD-L1 발현 및 TIL+의 종양이 있거나 있는 것으로 확인된다. 일부 실시 방안에서, 본 문에 따른 상기 방법은 높은 PD-L1 발현 및 TIL+의 종양이 있거나 있는 것으로 확인되는 것을 기초로 대상체를 확인하는 것을 더 포함한다. 일부 실시방안에서, TIL+의 종양은 CD8 양성 및 IFN-γ 양성이다. 일부 실시 방안에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFN-γ 중 하나, 둘 또는 그 이상에 대해 양성인 고백분율의 세포를 구비하거나 구비하는 것으로 확인된다. 일부 실시 방안에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFN-γ에 대해 모두 양성인 고백분율의 세포를 구비하는 것으로 확인된다. 일부 실시 방안에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFN-γ 중 하나, 둘 또는 그 이상을 구비하거나 구비하는 것으로 확인되며, 하기 1종 이상의 암종이 있거나 있는 것을 확인된다: 폐암(예를 들어 편평세포폐암 또는 폐선암), 두경부암, 편평세포 자궁경부암, 위암, 식도암, 갑상선암, 흑색종 및/또는 비인두암(NPC)이다. 일부 실시 방안에서, 본 문에 서술된 방법은 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFN-γ 중 하나, 둘 이상을 구비하거나 구비하는 것으로 확인되는 것을 더 설명하였는바, 예를 들면, 편평세포 폐암 또는 페선암, 두경부암, 편평세포 자궁경부암, 위암, 갑상선암, 흑색종 및/또는 비인두암 중의 1종 이상이다.
일부 실시방안에서, 대상체는 종양이 있거나 있는 것으로 확인되며, 이는 하기 1종, 2종 또는 그 이상의 특징을 구비한다: 종양에서 높은 PD-1 발현, 높은 TIM-3 발현 및/또는 조절 T세포의 종양에서의 고수준 침윤. 일부 실시 방안에서, 대상체는 종양이 있거나 있는 것으로 확인되며, 이는 높은 PD-1 및 TIM-3 수준을 구비하며, 종양에서 조절 T세포 수준은 향상된다. 일부 실시 방안에서, 본 문에 설명된 방법은 대상체가 하기 중의 1종, 2종 또는 그 이상을 기초로 하는 특징을 구비하거나 구비하는 것으로 확인되는 것을 더 포함한다: 고백분율의 PD-1+ 세포, 고백분율의 TIM-3+ 세포 및/또는 조절 T세포의 종양에서의 고수준 침윤(예를 들어, 증가된 수 또는 백분율의 TIL이 종양에 존재함). 일부 실시 방안에서, 본 문에 설명된 방법은 대상체가 하기의 1종, 2종 또는 그 이상을 앓고 있는 것으로 확인되는 것을 더 포함한다: 고백분율의 PD-1+ 세포, 고백분율의 TIM-3+ 세포 및/또는 조절 T세포의 종양에서의 고수준 침윤, 그리고 폐암(예를 들어 비소세포폐암(NSCLC)); 간세포성암(예를 들어 간세포암); 또는 난소암(예를 들어 난소암종) 중의 1종 또는 그 이상을 앓고 있는다.
감염성질환
관련된 감염성 생물체 또는 물질의 타입에 기반하여, 감염을 광범위하게 세균성, 바이러스성, 진균성 또는 기생충 감염으로 분류한다. 다른 흔하지 않는 감염은 예를 들어 리케차, 마이코프라스마 및 물질에 관련된 감염성 질환을 포함하며, 상기 물질에 의한 스크래피, 소해면상뇌병증(BSE) 및 프리온병(예를 들어 쿠루병 및 크로이츠펠트-야콥병)의 감염을 일으킨다. 감염을 일으키는 세균, 바이러스, 진균 및 기생충의 예시는 본 분야에서 공지된 것이다. 감염은 급성, 아급성, 만성 또는 잠복성일 수 있으며 이는 국부적이거나 전신적일 수 있다. 여러가지 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 단독적이거나 보조제의 형태로 백신과 조합하여 사용됨으로써, 예를 들어 병원체 또는 독소에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 이러한 치료 방법이 특별히 유용할 수 있는 병원체의 예시는 현재 특별히 이에 대해 효과적인 백신이 없는 병원체 또는 일반적인 백신이 이에 대해 완전히 효과적이지 않는 병원체를 포함하는바, 이들은 HIV, (A형, B형 및 C형)간염, 인플루엔자, 헤르페스, 지알디아 편모충(Giardia), 말라리아, 리슈마니아(Leishmania), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
TIM-3 항체로 치료할 수 있는 감염된 병원성 바이러스의 일부 예로는 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV, 및 EpsteinBarr 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키바이러스, 코로나바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 이하선염바이러스, 로타바이러스, 홍역바이러스, 풍진바이러스, 파보바이러스, 백시니아바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기바이러스, 유두종바이러스, 연속종바이러스, 폴리오바이러스, 광견병바이러스, JC 바이러스, 절지동물매개뇌염 바이러스, 에볼라바이러스(예를 들어 BDBV, EBOV, RESTV, SUDV, 및 TAFV)를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 예방, 치료 또는 관리하는 염증성 질환의 예시는 천식(asthma), 뇌염(encephalitis), 염증성장질환(inflammatory bowel disease), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease(COPD)), 알레르기 질환(allergic disorders), 패혈증(septic shock), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 미분화척추관절병증(undifferentiated spondy loarthropathy), 미분화관절질환(undifferentiated arthropathy), 관절염(arthritis), 염증성 골용해(inflammatory osteolysis), 및 만성 바이러스 또는 세균 감염으로 인한 만성염증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 염증성 및 자가면역질환의 치료 과정에서 실용성을 구비한다.
자가면역질환
면역 시스템의 하향 조절은 염증성 및 자가면역질환 및 이식편대숙주 질환(GvHD)의 치료에서 바람직한 것이다. 본 발명의 항체를 투여하여 치료할 수 있는 자가면역질환의 예시는 원형 탈모증(alopecia greata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항인지질항체 증후군(antiphospholipid syndrome), 자가면역성 에디슨병(auto-immune Addison's disease), 부신자가면역질환, 자가면역성용혈성빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성간염(autoimmune hepatitis), 자가면역성난소염 및 고환염(autoimmune oophoritis and orchitis), 자가면역성 혈소판 감소증(autoimmune thrombocytopenia), 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유사천포창(bullous pemphigoid), 심근증(cardiomyopathy), 셀리악 스프루 피부염(celiacsprue-dermatitis), 만성 피로 면역 부전 증후군(chronic fatigue immune dysfunction syndrome(CFIDS)), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경근염(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유사천포창(cicatrical pemphigoid), 크레스트증후군(CREST syndrome), 한랭응집소증(cold agglutinin disease), 크론병(Crohn's disease), 원판성 루푸스(discoidlupus), 특발성 혼합 한랭글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근육통-섬유근염(fibromyalgia-fibromyositis), 사구체신염(glomerulonephritis), 그레이브스 병(Graves' disease), 길랑바레 증후군(Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)), IgA 신경병증(IgA neuropathy), 아동관절염(juvenile arthritis), 편평태선(lichen planus), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 메니에르병(Meniere's disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica (NMO)), 제1형 또는 면역 매개된 당뇨병(type 1 or immune mediated diabetes mellitus), 중증근무력증(myasthenia gravis), 보통천포창(pemphigus vulgaris), 악성빈혈(pernicious anemia), 결정성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 다연골염(polychrondritis), 다선성 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatic), 다발근염(polymyositis)과 피부근염(dermatomyositis), 원발성 무 감마글로불린혈증(primary agamma globulinemia), 원발성 담즙성 경변증(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 래이노 증후군(Raynauld's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 사르코이드증(sarcoidosis), 피부경화증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 강직인간증후군(stiff-mansyndrome), 전신홍반루푸스(systemic lupusery thematosus), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 타카야수동맥염(takayasu arteritis), 측두동맥염/거세포동맥염(temporal arteristis/giant cell arteritis), 횡단척수염(transverse myelitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 포도막염(uveitis), 혈관염(vasculitides)(예를 들면 포진성 피부염 및 혈관염), 백반증(vitiligo), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
검출 방법 및 키트
일부 측면에서, 본 발명에서는 샘플(예를 들어 생물 샘플, 예를 들면 혈액, 혈청, 정액 또는 소변 또는 조직생검 샘플(예를 들며 과증식성 또는 암성 병소))에서 TIM-3의 존재 또는 수준을 (예를 들어 체내 또는 체외에서)검출하는 방법을 제공하였다. 해당 방법은 (예를 들어, 대상체에서 본 발명에 따른 질환(예를 들면 면역 질환, 암 또는 감염성 질환)의 치료 또는 진전, 이의 진단 및/또는 병기화)를 평가하는데 사용할 수 있다. 해당 방법은 (i) 상호 작용의 발생을 허용하는 조건에서, 샘플을 본 발명에 따른 항 TIM 항체 분자와 접촉시키거나 상기 항 TIM-3 항체 분자를 대상체에 투여하는 것, 및 (ii) 항체 분자와 샘플 간의 복합체 형성의 존재 여부를 검출하는 것을 포함한다. 복합체의 형성은 TIM-3이 존재함을 표시하며, 본 문에 서술된 치료의 적합성 또는 수요를 나타낼 수 있다. 해당 방법은 예를 들어 면역 조직 화학, 면역 세포 화학, 유세포 분석, 항체 분자 복합된 마그네틱 비드, 효소 면역 측정법(ELISA assay), PCR 기술(예를 들어, RT-PCR)을 포함한다. 일반적으로, 체내 및 체외 진단 방법에서 사용되는 항 TIM-3 항체 분자는 검출 신호을 출력하도록 검출 가능한 물질로 직접적 또는 간접적으로 표지된다. 적합한 검출 가능한 물질은 각종 생물 활성 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다.
다른 한 측면에서, 본 발명에서는 키트를 제공하는바, 이는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능한 표지를 보유한다. 바람직한 실시 방안에서, 상기 키트는 특이적으로 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 식별하는 제2 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 제2 항체는 검출 가능한 표지를 더 포함한다.
본 발명에서, 상기 검출 가능한 표지는 형광, 분광학, 광화학, 생물 화학, 면역학, 전기학, 광학 또는 화학 수단을 통해 검출될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 특히 바람직하게는, 이러한 유형의 표지는 면역학 검출(예를 들어 효소면역측정법, 방사면역측정법, 형광면역측정법, 화학발광면역측정법)에 적용될 수 있다. 이러한 표지는 본 분야에 공지된 것이며, 효소(예를 들어 겨자무과산화효소, 알칼리인산분해효소, β-갈락토시다아제, 우레아제, 글루코스산화효소 등), 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 형광염료(예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 홍조소(PE), 텍사스레드, 로다민, 양자점 또는 시아닌 유도체 염료(dye derivatives)(예를 들어 Cy7, Alexa 750)), 아크리딘 에스테르 화합물, 마그네틱 비드(예를 들어 Dynabeads®), 열량 측정 표지(콜로이드 골드 또는 유색 유리 또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 락테스 등)비드), 및 상기 표지에 의해 변형된 아비딘(예를 들어, 스트렙트아비딘)에 결합하기 위한 비오틴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 표지의 사용을 가르치는 특허에는 미국 특허 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 및 4366241(전부 본 문에 참조로 포함됨)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 포함된 표지는 본 분야의 공지된 방법으로 검출한다. 예를 들면, 방사성 표지는 사진 필름 또는 신틸레이션 계산기를 사용하여 검출할 수 있으며, 형광 표지는 광학 검출기를 사용하여 검출할 수 있음으로써 방출된 빛을 검출하도록 한다. 효소 표지는, 일반적으로 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 작용으로 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되며, 열량 측정 표지는 착색 표지를 단순 시각화함으로써 검출된다. 일부 실시 방안에서, 잠재적인 입체 장해(steric hindrance)를 감소시키도록, 상이한 길이의 링커를 통해 상기와 같은 검출 가능한 표지를 본 발명의 재조합 단백질에 연결시킬 수 있다.
다른 한 측면에서, 본 발명의 키트를 제조하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하였으며, 상기 키트는 샘플에서의 TIM-3의 존재 또는 수준을 검출하는데 사용된다.
약물 조성물 및 병용 요법
본 발명에서 제공한 항체는 단독적으로 사용할 수 있거나 다른 치료제 또는 치료 방법과 병용하여 사용된다. TIM-3 항체는 표준적인 암 치료와 병용할 수도 있다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 약물 조성물은 별도의 약학적 활성제를 더 포함 할 수 있다. 일부 바람직한 실시 방안에서 상기 별도의 약학적 활성제는 항 종양 활성을 구비하는 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 감염을 치료하기 위한 약물이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 별도의 약학적 활성제는 자가면역질환을 치료하기 위한 약물이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 약물 조성물에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상기 별도의 약학적 활성제는 분리된 조성분 또는 동일한 조성물의 조성분으로서 제공된다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 별도의 약학적 활성제와 동시에 투여되거나, 개별적으로 투여 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 하기로부터 선택되는 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합되는 제2 항체 또는 상기 제2 항체를 코딩하는 핵산을 더 포함한다. 여기서, 상기 수용체 또는 리간드는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIGIT, VISTA, CTLA-4, OX40, BTLA, 4-1BB, CD96, CD27, CD28, CD40, LAIR1, CD160, 2B4, TGF-R, KIR, ICOS, GITR, CD3, CD30, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, SLAMF7, NKp80, B7-H3 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 특정된 실시 방안에서, 상기 제2 항체는 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물에 포함된 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, Nivolumab(니볼루맙 또는 Opdivo®) 또는 이의 항원 결합 단편 및 Pembrolizumab(펨브로리주맙 또는 Keytruda®) 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택된다.
일부 특정된 실시 방안에서, 상기 제2 항체는 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 바람직한 실시 방안에서, 본 발명의 약물 조성물은 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시 방안에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약물 제조에 사용되며, 상기 약물은 적어도 하기 임의의 하나에 사용된다: (1) 체외 또는 대상체(예를 들면, 인간) 체내에서 면역세포 활성을 향상시키는 것; (2) 대상체(예를 들면, 인간)에서 면역 반응을 증강시키는 것; (3) 대상체(예를 들면, 인간)에서 암을 치료하는 것; (4) 대상체(예를 들면, 인간)에서 감염성 질환을 치료하는 것; (5) 대상체(예를 들면, 인간)에서 자가면역질환을 치료하는 것; 및 (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합이다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 암은 고형 종양, 혈액 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들어 다발성 골수종) 및 전이성 병소로부터 선택되는바, 예를 들면, 폐암, 편평세포폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, IM-TN 유방암, 결장직장암, 백혈병 또는 암의 전이성 병소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및 기생충 감염으로부터 선택되는바, HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 패혈증으로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시 방안에서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 용혈성빈혈, 자가면역성 혈소판감소성자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 그레이브스 병, 중증근무력증, 자가면역성 간염 및 다발성 경화증으로부터 선택된다.
유도체화된 항체(Derivatized antibody)
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유도체화시킬 수 있는바, 예를 들면, 다른 하나의 분자(예를 들어 다른 하나의 폴리펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유도체화(예를 들어 표지(labeling))는 TIM-3(특별히 인간 TIM-3)에 대한 결합에 불리한 영향을 주지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이러한 유도체화된 형태를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 하나 이상의 다른 분자 그룹, 예를 들어 다른 하나의 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체를 형성), 검출 시약, 약용 시약, 및/또는 항체 또는 항원 결합 단편이 다른 하나의 분자에 결합되도록 매개할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 아비딘 또는 폴리히스티딘 태그)에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 기타 방식을 통함)시킬 수 있다.
한 가지 유형의 유도체화 항체(예를 들면 이중 특이성 항체)는 2개 이상의 항체(동일한 유형 또는 상이한 유형에 속함)를 교차 연결함으로써 생성된다. 이중 특이성 항체를 획득하는 방법은 본 분야에서 공지된 것이며, 이의 예시는 화학적 가교법, 세포 공학 방법(하이브리도마 방법) 또는 유전 공학 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 한 가지 유형의 유도체화 항체는 치료적인 부분과 연결되는 항체이다. 본 발명에 서술된 치료적인 부분은 세포 독소, 세포 독성 약물 또는 방사성 독소일 수 있으며, 이의 예시는 택솔(taxol), 시토칼라신 B(cytochalasin B), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 빈크리스틴(vincristine) 또는 다른 항대사 물질, 알킬화제, 항생제 또는 항 유사분열 약물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
다른 한 가지 유형의 유도체화 항체는 표지된 항체이다. 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 검출 가능한 표지에 연결시키는 것이다. 본 발명에 따른 검출 가능한 표지는 형광, 분광학, 광화학, 생물 화학, 면역학, 전기학, 광학 또는 화학 수단을 통해 검출될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이런 유형의 표지는 본 분야에서 공지된 것이며, 이의 예시는 효소(예를 들어 겨자무과산화효소, 알칼리인산분해효소, β-갈락토시다아제, 우레아제, 글루코스산화효소 등), 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 형광염료(예를 들어 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 홍조소(PE), 텍사스레드, 로다민, 양자점 또는 시아닌 유도체 염료(예를 들어 Cy7, Alexa 750)), 아크리딘 에스테르 화합물, 마그네틱 비드(예를 들어 Dynabeads®), 열량 측정 표지(콜로이드 골드 또는 유색 유리 또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 락테스 등)비드), 및 상기 표지에 의해 변형된 아비딘(예를 들어, 스트렙트아비딘)에 결합하기 위한 비오틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 표지의 사용을 가르치는 특허에는 미국 특허 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 및 4366241(전부 본 문에 참조로 포함됨)이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 포함된 표지는 본 분야의 공지된 방법으로 검출한다. 예를 들면, 방사성 표지는 사진 필름 또는 신틸레이션 계산기를 사용하여 검출할 수 있으며, 형광 표지는 광학 검출기를 사용하여 검출할 수 있음으로써 방출된 빛을 검출하도록 한다. 효소 표지는, 일반적으로 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 작용으로 생성된 반응 생성물을 통해 검출함으로써 검출되며, 열량 측정 표지는 착색 표지를 단순 시각화함으로써 검출된다. 일부 실시 방안에서, 이러한 표지는 면역학적 검출(예를 들어 효소면역측정법, 방사면역측정법, 형광면역측정법, 화학발광면역측정법)에 적용될 수 있다. 일부 실시 방안에서, 잠재적인 입체 장해(steric hindrance)를 감소시키도록, 상이한 길이의 링커(linker)를 통해 상기와 같은 검출 가능한 표지를 본 발명의 재조합 단백질에 연결시킬 수 있다.
이외에, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학 그룹(예를 들면, 폴리 에틸렌 글리콜(PEG), 메틸기 또는 에틸기, 또는 글리코실기)으로 유도체화시킬 수 있다. 이러한 그룹은 항체의 생물학적 특성을 촉진시키는데 사용할 수 있는바, 예를 들면, 혈청의 반감기를 증가시키는 것이다.
단클론항체 제조
본 발명의 단클론항체(mAb)는 여러가지 기술을 통해 제조될 수 있는바, 일반적인 단클론항체 방법론, 예를 들어 Kohler 및 Milstein, Nature, 1975; 256: 495에 서술된 표준 체세포 혼성화 기술을 통해 제조될 수 있다. 비록 체세포 혼성화 절차가 바람직하지만, 원칙 상 단클론항체를 제조하는 다른 방법, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질 전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 제조하는 것은 아주 완전한 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장 세포을 분리시키는 면역 방안과 기술은 본 분야에서 공지된 것이다. 융합파트너(예를 들어, 마우스 골수종 세포) 및 융합 절차도 이미 공지된 것이다.
항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 PCR 증폭 또는 표적 항체를 발현하는 하이브리도마의 cDNA 클론)을 통해 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있으며, DNA를 발현 벡터에 삽입하여 표적 유전자가 전사 및 번역 제어 서열과 작동 가능하게 연결되도록 하고, 숙주세포로 형질 감염됨으로써 발현하도록 한다. 발현 숙주는 바람직하게 진핵 발현 벡터며, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이며, 예를 들어 CHO 및 이의 유도체 세포계이다.
항체는 단백질 A 또는 단백질 G의 친화성 크로마토그래피와 같은 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다. 후속적으로 또는 대안적으로, 특정 항원 또는 이의 에피토프를 컬럼에 고정시켜 면역 친화성 크로마토그래피를 통해 면역 특이성 항체를 정제할 수 있다. 면역 글로불린의 정제는 예를 들어 D.Wilkinson에 의해 논술되어 있다(The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), 25-28페이지에 개시됨).
본 발명의 키메라 항체 또는 인간화 항체는 상기 제조된 마우스 단클론항체의 서열에 따라 제조된다. 경쇄 및 중쇄 면역 글로불린을 코딩하는 DNA는 표적 마우스 하이브리도마로부터 획득할 수 있으며, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(예를 들어, 인간) 면역 글로불린 서열이 포함되도록 조작한다. 예를 들면, 키메라 항체를 생성하기 위해, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킨다(예를 들어, Cabilly et al, U.S. Patent No. 4816567을 참조). VH를 코딩하는 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 하나의 DNA 분자에 조작가능하게 연결시켜 VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 본 분야에서 공지된 것이며(예를 들어, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242를 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 획득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다.
인간화 항체를 생성하기 위해, 본 분야에 공지된 방법으로 뮤린 CDR 영역을 인간화 프레임 서열에 삽입한다(Winter, US Patent No. 5225539 및 Queen et al, US Patent Nos. 5530101, 5585089, 5693762 및 6180370을 참조). 또한, 유전자 이식 동물(예를 들면, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역 글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역 글로불린 유전자 미니로시를 포함하는 HuMAb 마우스(Medarex, Inc.) 그리고 내인성 μ 및 κ 사슬 유전자좌를 비활성화하는 표적 돌연변이(예를 들어 Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859를 참조); 또는 인간 중쇄 유전자 이식 및 인간 경쇄 전이 염색체를 운반하는 "KM 마우스 TM"(특허 WO02/43478 참조))을 이용하여 항체 인간화 변형을 진행한다. 다른 항체 인간화 변형의 방법은 파이지 디스플레이 기술을 포함한다.
하기 실시예를 통해 본 발명을 추가로 설명하며, 상기 실시예는 추가적인 한정으로 해석되어서는 안된다. 이러한 전체 출원에 인용된 모든 첨부도면, 전부 참고문헌, 특허 및 이미 개시된 특허 출원의 내용은 참고하는 것으로 본 문에 명확하게 수납된다.
도 1은 뮤린 항체 및 인간 TIM-3 항원의 결합 기능의 측정을 예시한 도면이다.
도 2는 5개의 항 인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7을 뮤린 항체 Mab22의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 간의 병렬 비교를 예시한 도면이다.
도 3은 5개의 항 인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7을 뮤린 항체 Mab22의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 간의 병렬 비교를 예시한 도면이다.
도 4는 인간화 항체와 인간 TIM-3 항원의 결합 기능의 측정을 예시한 도면이다.
도 5는 인간화 항체 Tm 값의 측정을 예시한 도면이다.
도 6은 ELISA로 항체 AB12S3과 상이한 종으로부터 유래되는 TIM-3 항원의 친화도의 측정을 예시한 도면이다.
도 7은 ELISA로 TIM-3 항원에 대한 항체 AB12S3의 특이적 결합의 검출을 예시한 도면이다.
도 8은 HTRF로 TIM-3/Galectin-9의 결합을 차단하는 AB12S1 및 AB12S3의 능력을 검출한 도면이다.
도 9는 경쟁적 ELISA로 TIM-3/PS의 결합을 차단하는 AB12S1 및 AB12S3의 능력을 검출한 도면이다.
도 10은 CD8+ T세포 표면에서 CD69의 발현에 대한 AB12S1, AB12S3 및 AB12S4의 영향을 예시한 도면이다.
도 11은 항 TIM-3 인간화 항체 AB12S3가 체외에서 T세포를 증강하여 종양 세포를 사멸하는 기능을 예시한 도면이다.
도 12는 유전자 이식 마우스에서 항체 AB12S3 및 대조군 항체 AB12S1의 생체 내 약물 효능 측정을 예시한 도면이다.
도 13은 IFN-γ를 분비하도록 공여체 A로부터 유래된 PBMC를 자극하는 SEB에 대한 항-인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3 및 양성 대조군 항체 AB12S1의 촉진 작용을 예시한 도면이다.
도 14는 IFN-γ를 분비하도록 공여체 B로부터 유래된 PBMC를 자극하는 SEB에 대한 항-인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3 및 양성 대조군 항체 AB12S1의 촉진 작용을 예시한 도면이다.
도 15는 공여체(donor) A로부터 유래된 MLR에서 IFN-γ의 분비에 대한, 항-인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3 및 이와 OPDIVO®를 병용의 자극 작용을 예시한 도면이다.
도 16은 공여체 B로부터 유래된 MLR에서 IFN-γ의 분비에 대한, 항-인간 TIM-3 인간화 항체 AB12S3 및 이와 OPDIVO®를 병용의 자극 작용을 예시한 도면이다.
실시예 1: 항 인간 TIM-3 뮤린 단클론항체의 제조
인간 TIM-3 항원(Ampsource Biopharma Shanghai Inc. 에서 기존 방법으로 발현시킨 His 태그가 지정된 TIM-3 세포 외 도메인, 단백질 서열: Uniport entry No. Q8TDQ) 50μg을 완전프로인트보조제로 충분히 유화시킨 후, 멀티 사이트 면역 방식을 적용하여 수컷 Balb/C 마우스에 대해 면역화시키되, 면역 주기는 3주에 한 번이다. 제 3차 면역 후 10일 째, 미정맥을 통해 채혈하고, ELISA로 혈장 항 인간 TIM-3 항체 역가(titer)를 측정하여 마우스 면역 반응 정도를 모니터링한다. 그리고 융합 3일 전, 생성된 항 인간 TIM-3 항체 역가가 가장 높은 마우스에 대하여 면역을 한 번 보강시킨다. 3일 후, 마우스를 희생시키고 해당 마우스의 비장을 마우스 골수종 Sp2/0 세포주와 융합시킨다. 2×108개의 Sp2/0 세포와 2×108개 비장 세포를 50%의 폴리 에틸렌 글리콜(분자량이 1450임)과 5%의 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액에 혼합하여 융합시킨다. Iscove 배지(10%의 우태아혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신, 0.1mM의 히포크산틴, 0.4μM의 아미노프테린, 16μg의 티미딘을 포함)로 비장 세포 수를 5×105/mL로 조정하고, 0.3mL를 96웰 플레이트 홀 내에 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에 배치한다. 10일 동안 배양 후, 고 처리량의 ELISA법을 사용하여 상등액 중 항체가 고친화도로 TIM3-His에 결합된 클론을 개별적으로 검출한다. 그리고 상기 단클론항체의 홀 내 융합 세포를 서브클로닝한다. TIM-3에 결합되는 인간 Galectin-9와 경쟁하는 양성 웰을 HTRF 방법으로 스크리닝하여(실시예 5.6에서 항 TIM-3 인간화 항체가 TIM-3/Galectin-9의 결합을 차단하는 테스트를 참조) 하이브리도마 세포주#22을 획득한다.
특이성 항체를 생성한 클론을 10% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양한다. 세포 밀도가 약 5×105개 세포/mL일 경우, 무혈청 배지로 해당 배지를 대체한다. 2일 내지 4일 후, 배양 후의 배지를 원심 분리하여 배양물 상등액을 수집한다. 단백질 G 칼럼은 항체 정제에 사용된다. 150mM NaCl로 단클론항체 용출액을 투석한다. 0.2μm의 필터로 투석된 용액을 여과하여 멸균함으로써, 테스트될 정제된 단클론항체 Mab22를 획득한다.
실시예 2 ELISA 방법으로 뮤린 항체와 인간 TIM-3 항원의 결합 기능을 측정
마이크로타이터 플레이트를 인간 TIM-3(Ampsource Biopharma Shanghai Inc에서 기존 방법으로 발현시킨 His 태그가 지정된 TIM-3 세포 외 도메인, 단백질 서열: Uniport entry No. Q8TDQ)으로 코팅한 후 실온에서 밤새 놔둔다. 코팅 용액을 버리고 인산완충식염수(PBS)에 용해된 탈지유로 각 웰을 0.5시간 동안 블로킹하고, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 함유된 PBS로 웰을 세척한다. 그리고, 각 웰에 50μL의 정제된 항 인간 TIM-3 뮤린 항체 Mab22를 각각 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 함유된 PBS로 웰을 세척한 다음, 각 웰에 HRP로 표지된 염소 항 마우스 IgG 폴리클론항체(Jackson Laboratory로부터 구매함) 50μL를 첨가하는 바, 이를 검출 항체로 한다.
결과는 도 1에 나타낸 바와 같이, 뮤린 항체 Mab22와 인간 TIM-3은 비교적 높은 친화도를 구비하는바, EC50은 6.30ng/mL이다.
실시예 3, 항 TIM-3 뮤린 단클론항체의 아형 식별 및 가변 영역의 증폭
항체 아형 식별: 하이브리도마 세포를 취하여 상등액을 배양하고, IsoStripTM 뮤린 단클론항체 아형 식별 키트(Santa Cruz Biotechnology, 카탈로그 번호 sc-24958)를 사용하여 항체 아형을 식별한다. 뮤린 단클론항체 Mab22 아형은 IgG1 (Kappa)형으로 식별되었다.
항체 가변 영역의 증폭: 후보 하이브리도마 세포 #22를 총 107개 세포로 배양하고, 1000rpm인 조건에서 10분 동안 원심 분리하여 세포를 수집하고, Trizol 키트(Invitrogen)로 전체 RNA를 추출하며, 역전사 키트 SMARTer RACE로 제1 쇄 cDNA를 합성하고, 제1 쇄 cDNA가 추후 템플릿으로서 하이브리도마 세포에 대응되는 항체 가변 영역 DNA 서열을 증폭시킨다. 아형 식별 결과에 따라, 해당 항체 아형의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열을 획득하고, 특이적인 네스티드 PCR 프라이머를 디자인하되, 해당 증폭 반응에 사용된 프라이머 서열은 항체 가변 영역 제1 프레임워크 영역 및 불변 영역과 상보된다. 일반적인 PCR 방밥을 사용하여 표적 유전자를 증폭시키고, 증폭된 생성물에 대해 서열을 측정한 후, 하이브리도마 클론 #22에 의해 분비되는 항체 Mab22의 중쇄 가변 영역 서열인 서열번호 1과 경쇄 가변 영역 서열인 서열번호 2를 얻는다. 하이브리도마 세포주 #22는 2017 년 10 월 25 일에 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 수탁되었다 (수탁번호 CCTCC NO. C2017181)
실시예 4, 항 TIM-3 뮤린 단클론항체의 인간화
상기 획득한 Mab22 뮤린 항체 가변 영역 서열에 따라, 항체 3차원 모델링 및 구조 분석의 보조하에 컴퓨터를 이용하여 항체 인간화 변형을 진행한다. CDR 이식(CDR-Grafting)은 흔히 보는 항체 인간화 방법이며, 인간화 항체의 FR로 뮤린 항체의 FR을 대체함으로써, 활성 유지 및 면역원성 감소의 목적에 도달한다. Discovery Studio 분석 도구를 결합하여 CDR 이식으로 항체 인간화 변형을 진행하는 방법은 아래와 같은 단계를 포함한다: (1) 항체 3차원 구조 모델링; (2) 핵심잔기의 분석; 분자 도킹을 이용하여 가변 영역 및 이의 주변 프레임워크 아미노산 서열을 분석하고 이의 공간 입체 결합 방식을 조사하여 CDR 영역 구조를 유지하는데 있어서 아주 중요한 핵심 잔기를 확정하는바, 다음과 같은 3개 유형을 구비한다: 1. VL와 VH 결합 계면 상에 위치하는 잔기, 이는 2개의 도메인의 폴딩에 대해 관건적인 역할을 하며; 2. CDR 영역에 가까우며 단백질 내부에 내장된 잔기; 3. CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기, 여기서 상호 작용은 소수성 상호 작용/수소 결합/염다리(salt bridge)를 포함하며; (3) 인간화 템플릿 선택; 하기 두 개의 조건을 동시에 충족시켜야 된다: 우선, 각 하이브리도마 세포에서 분비된 항체의 아미노산 서열을 인간 생식세포계열 항체의 아미노산 서열과 비교하여 상동성이 높은 서열을 찾으며; 다음으로, 그 중에서 MHC II(HLA-DR)와 친화도가 낮은 인간 생식세포계열(germline) 항체 프레임워크 서열을 선택하여 그의 면연원성을 감소시키며; (4) 핵심 잔기 분석의 역 이식에 기반하여 인간화 항체 서열을 획득한다.
모두 5개의 인간화 항체를 획득하는바, 이는 각각 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7이다. 5개의 인간화 항체 및 이의 모뮤린 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1 뮤린항체 Mab22 및 이로부터 유도체화된 인간화 항체 가변 영역의 아미노산 서열
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Figure pct00002
도 2는 5개 인간화 항체와 뮤린 항체 Mab22의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 간의 병렬 비교를 예시한다. 도 3은 5개 인간화 항체와 뮤린 항체 Mab22의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 간의 병렬 비교를 예시한다. 가변 영역에는, 상보성 결정 영역(CDRs) 및 프레임워크(FRs)가 표시되며, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR은 IMGT법으로 정의된다.
본 발명에서 제조한 뮤린 단클론항체 Mab22 및 이로부터 유래된 5개의 인간화 항체 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7의 가변 영역에 포함되는 CDR 영역의 아미노산 서열은 표 2에 나타낸 바와 같으며, 각각 Kabat, Chothia 및 IMGT 방법으로 정의된다.
표 2 예시적인 항 TIM-3 항체 Mab22 및 이로부터 유래된 인간화 항체의 CDR 영역 서열
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두 개의 중쇄 및 경쇄로 구성된 전장 항체 서열을 획득하기 위해, 일반적인 기술을 사용하여 표 1에 나타낸 바와 같은 VH와 VL 서열을 항체 중쇄 불변 영역(바람직하게 인간 IgG1 또는 IgG4로부터 선택됨) 및 경쇄 불변 영역(바람직하게 인간 κ 경쇄로부터 선택됨)과 스플라이싱 또는 조립된다. 예를 들면, 일 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 표 3에 나타낸 바와 같은 야생형 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역과 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또는 변형된 인간 IgG4 불변 영역 서열을 사용하는바, 예를 들면, 일 실시 방안에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 항 TIM-3 항체 분자는 EU 넘버링에 따른 제 228 위치에서 돌연변이(예를 들어 S가 P로 변이됨)된 인간 IgG4를 포함한다. 다른 한 실시 방안에서, 항 TIM-3 항체 분자는 야생형 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역과 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또는 변형된 인간 IgG1 불변 영역 서열을 사용하는바, 예를 들면, 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따른 제 297 위치에서 치환(예를 들어 Asn가 Ala로 치환됨)을 포함된다. 다른 한 실시 방안에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따른 제 265 위치에서 치환을 포함하며, EU 넘버링에 따른 제 329 위치에서 치환을 포함하거나 이런 2종의 치환(예를 들어 제 265 위치에서 Asp가 Ala를 치환되고, 및/또는 제 329 위치에서 Pro가 Ala로 치환됨)을 포함한다. 또 하나의 실시 방안에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1은 EU 넘버링에 따른 제 234 위치에서 치환을 포함, EU 넘버링에 따른 제 235 위치에서 치환을 포함하거나 이러한 2종의 치환(예를 들어 제 234 위치에서 Leu가 Ala로 치환되고, 및/또는 제 235 위치에서 Leu가 Ala로 치환됨)을 포함한다.
표 3 인간 IgG 중쇄 및 인간 κ 경쇄 불변 영역 아미노산 서열
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표 4에 나타낸 바와 같이, 인간화 항체 AB12S3 및 AB12S4는 EU 넘버링에 따른 제 228 위치에서 돌연변이된 인간 IgG4와 인간 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 항 TIM-3가 항체의 기능 발휘를 차단함에 있어 ADCC 및 CDC 효과가 필요하지 않기 때문에, AB12S3 및 AB12S4의 불변 영역은 바람직하게 인간 IgG4를 선택하지만, IgG4는 불완전항체를 쉽게 형성하므로, S228P 변형은 Fab-arm의 교환을 감소시킬 수 있다.
표 4 인간화 항체 AB12S3과 AB12S4의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 대응되는 뉴클레오티드 서열
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실시예 5, 항 TIM-3 인간화 항체의 정성(Qualities)
5.1 항 TIM-3 인간화항체 및 인간 TIM-3의 결합 기능의 측정
일반 ELISA 방법을 사용하여 인간화 항체 AB12S3 및 AB12S4가 인간 TIM-3(Ampsource Biopharma Shanghai Inc에서 기존 방법으로 발현시킨 His 태그가 지정된 TIM-3 세포 외 도메인, 단백질 서열: Uniport entry No. Q8TDQ) 항원에 결합되는 기능을 측정하며, 구체적인 방법은 실시예 2와 같다. 결과는 도 4를 참조하면 된다. 인간화 항체 AB12S3 및 AB12S4는 대조 항체 AB12S1(AB12S1 가변 영역 서열은 미국 특허 9605070 중의 항 TIM-3 항체 ABTIM3으로부터 유래되며, 본 발명 중 이의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 46이고 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 47임)과 동일하게 모두 특이적으로 인간 TIM-3 항원에 결합될 수 있지만, 음성 대조인 다른 1종의 인간화된 IgG와 관련되지 않는 항체는 인간 TIM-3에 결합되지 못한다.
5.2 항 TIM-3 인간화 항체 친화도 분석 테스트
생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 정제된 인간화 항체 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7과 항원의 결합 친화도 상수에 대한 측정을 진행한다(ForteBio Octet RED&QK 시스템, PALL회사). 항 인간 IgG Fc의 폴리클론항체는 아미노 커플링 방법을 통해 CM5 칩 표면에 고정되며, 인간화 항체는 흘러 폴리클론항체와 작용하여 칩 표면에 포획되고 이동상인 항원 단백질이 항체 표면으로 흘러 이와 상호 작용한다다. 처리하여 얻은 데이터는 Biacore T200의 분석 소프트웨어 1:1로 결합된 모델로 실험 데이터를 피팅하며, 피팅 데이터 및 실험 데이터는 기본적으로 겹치게 되어 결합 및 해리 속도 상수 ka와 kd를 얻으며, kd로 ka를 나누어 평형 해리 상수 K D 를 얻는다(표 5를 참조). 결과로부터 볼 수 있다시피, 획득한 인간화 항체 친화도는 명확한 손실이 없으며, 후보 항체 AB12S3, AB12S4, AB12S5, AB12S6 및 AB12S7과 인간 TIM-3의 결합 친화도는 뮤린 항체 Mab22의 친화도와 상당하며, KD값은 모두 pM급에 도달되어 모뮤린 단클론항체의 친화도를 비교적 양호하게 유지시킴으로써 그의 면역 원성을 크게 감소시킨다.
표 5 항체의 친화도 측정 결과
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5.3 항 TIM-3 인간화 항체 Tm값 측정
DSF(시차 주사 형광측정법) 방법을 사용하여 항 TIM-3 항체의 Tm값을 측정한다. 구체적인 단계는 다음과 같은바, AB12S1, AB12S3 및 AB12S4를 PBS로 1mg/mL까지 희석시키며, 12.5μL를 취하여 40×SYPRO Orange dye(Life Technologies회사, 카탈로그 번호는 4306737) 5μL 및 7.5μL ddH2O를 첨가한다. 그리고 상기 샘플을 Q-PCR 시스템(Applied Biosystems ABI 7500)에 넣고 반응시키며, Q-PCR 파라미터 설정은 다음과 같다: Target (ROX), 프로그램(25 ℃, 3 min; 1% 속도, 95 ℃; 95 ℃, 2 min)이다.
결과는 도 5에 나타낸 바와 같고 후보 항체 AB12S3의 Tm값(67.89℃)과 후보 항체 AB12S4의 Tm값(66.61℃)은 대조 항체 AB12S1(58.54℃)에 비해 적어도 8℃ 높음으로써, 본 발명에서 제조된 인간화 항체 AB12S3 및 AB12S4는 더욱 우수한 열 안정성을 구비하는 것을 명확하게 할 수 있다.
5.4 항 TIM-3 인간화 항체 종간교차반응 측정
일반적인 ELISA 방법을 사용하여 항 TIM-3 인간화 항체 AB12S3 및 상이한 종간의 TIM-3 항원의 교차 반응성을 측정한다.
구체적인 실험 단계는 다음과 같다: 마이크로타이터 플레이트를 인간 TIM-3 (Ampsource Biopharma Shanghai Inc에서 기존 방법으로 발현시킨 His 태그가 지정된 TIM-3 세포 외 도메인, 단백질 서열: Uniport entry No. Q8TDQ), 원숭이 TIM-3(Sino Biological Inc. 카탈로그 번호는 90312-C02H), 마우스 TIM-3 단백질(Sino Biological Inc. 카탈로그 번호는 51152-M08H) 1 μg/mL, 100 μL로 코팅한 후 실온에서 밤새 놔둔다다. 코팅 용액을 버리고 인산완충식염수(PBS)에 용해된 탈지유로 각 웰을 0.5시간 동안 블로킹하고, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 함유된 PBS로 웰을 세척한다. 그리고, 각 웰에 50μL의 정제된 HRP로 표기된 AB12S3를 각각 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하고, 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 함유된 PBS로 웰을 5회 세척한 다음, 100μL의 TMB를 대응되는 웰에 첨가하고 실온에서 5분 동안 발색시키며; 50μL의 2N H2SO4를 첨가하여 종료하고, 마이크로플레이트리더기로 450nm에서 판독한다. 결과를 Graph Prism에 도입시키고 EC50값을 계산한다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 결과는 AB12S3이 인간 TIM-3과 원숭이 TIM-3 항원에 결합될 수 있지만 마우스 TIM-3 항원에 결합되지 않는 것으로 나타난다.
5.5 항 TIM-3 인간화 항체 특이성 측정
인간의 TIM-3 상동 패밀리는 TIM-1 및 TIM-4 단백질을 더 구비하며, 항 TIM-3 인간화 항체 AB12S3이 인간 TIM-3 단백질에 특이적으로 결합되는지 여부를 ELISA 방법을 통해 검증한다.
구체적인 단계는 다음과 같다: pH가 9.6인 탄산 완충액으로 인간 TIM-1(Sino Biological Inc. 카탈로그 번호는 11051-H08H1), 인간 TIM-3(Sino Biological Inc. 카탈로그 번호는 10390-H08H), 인간 TIM-4(Sino Biological Inc. 카탈로그 번호는 1 12161-H08H) 항원을 1μg/mL로 희석하고, 4℃에서 100μL/well로 마이크로타이터 플레이트를 코팅하며 4℃에서 밤새 놔두며; 300μL PBST로 1회 세척하고; 2% BSA를 포함하는 200μL의 PBS를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 블로킹하며; 2% BSA를 포함하는 PBST 용액으로 AB12S3을 희석시키고, 10μg/mL를 시작 농도로 하고 4배로 희석시키되, 총 11개의 농도 구배를 얻으며, 각 웰에 100μL로 대응되는 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하며; 300μL의 PBST로 3회 세척하고 2% BSA가 포함된 PBS 용액으로 1:10000으로 HRP-표기된 염소 항 인간 IgG(Jackson Immuno Research)를 희석시키고 각 웰에 100μL로 대응되는 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하며; 300μL의 PBST로 5회 세척하고; 각 웰에 100μL의 TMB 발색액을 대응되는 웰에 첨가하고 실온에서 5분 동안 발색시키고; 추후 50μL의 1M H2SO4 용액을 첨가하여 발색을 종료시키고, 마이크로플레이트리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하며 결과를 Graph Prism에 도입시키고 EC50값을 계산한다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 결과는 AB12S3이 인간 TIM-3 단백질에 특이적으로 결합되지만 인간 TIM-1 및 인간 TIM-4 단백질에 결합되지 않는 것으로 나타난다.
5.6 항 TIM-3 인간화 항체는 TIM-3/Galectin-9 결합을 차단하는 것을 검출
HTRF 방법, 즉 동차 시간-방출 형광 기술의 약칭이다. 해당 기술은 파장 검측을 이용하여 분자의 결합 작용을 분석한다. 생체 분자가 상호 작용할 경우, 620nm 및 665nm인 두 개의 여기광을 구비하며; 상호 작용이 존재하지 않을 경우, 단지 620nm인 하나의 여기광만 구비한다.
TIM-3/Gal9 결합 측정 키트(Cibio, 카탈로그 번호 63ADK000CTLPEF)를 사용하여 TIM-3/Galectin-9에 대한 항 TIM-3 인간화 항체의 결합을 차단하는 작용을 측정하며 설명서에 따른 방법에 따라 조작된다. 구체적인 실험 단계는 다음과 같다: AB12S1 및 AB12S3 항체를 PBS로 각각 10000ng/mL, 1000ng/mL 100ng/mL, 10ng/mL 및 1ng/mL로 희석한다. 384웰 형광 플레이트를 취하여 각 웰에 4μL의 5nM TIM3-Euk 용액을 첨가하고 다시 2μL의 희석된 항체를 첨가하며, 이어서 각 웰에 4μL의 40nM Tag-Gal9를 첨가하여 실온에서 5분 동안 배양시킨다. 마지막으로, 각 웰에 4μL의 Anti-Tag-XL665를 첨가하고 실링 필름으로 384웰 플레이트를 실링하여 실온에서 1시간 동안 배양시킨다. 다기능 마이크로플레이트리더를 사용하여 665nm 및 620nm에서의 형광값을 판독하며 결과를 Graph Prism에 도입시키고 EC50값을 계산한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 결과는 AB12S3 항체(IC50=202.4ng/mL)가 TIM-3/Galectin-9 결합을 차단하는 기능은 AB12S1 항체(IC50= 258.7 ng/mL)보다 강하다.
5.7 항 TIM-3 인간화 항체에 의한 TIM-3/PtdSer 결합의 차단을 측정
경쟁적 ELISA의 방법을 사용하여 TIM-3 인간화 항체에 의한 TIM-3/PtdSer 결합의 차단을 검측한다.
구체적인 실험 단계는 다음과 같다: pH가 9.6인 탄산 완충액으로 PtdSer(Sigma회사로부터 구매되며, 카탈로그 번호는 P6641)을 1.3μM로 희석하고, 100μL/웰로 마이크로타이터 플레이트에 첨가하여 4℃에서 밤새 놔두며; 300μL의 PBST를 1회 세척하고 2% BSA를 포함하는 100μL의 PBS 용액을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 블로킹하며; 2% BSA를 포함하는 PBST 용액으로 AB12S1 및 AB12S3(시작 농도는 800μg/mL이고, 3배 구배로 희석하여 총 7개 농도 구배를 얻음)과 TIM-3(최종 농도는 6μg/mL)을 각각 희석하고, 1:1로 혼합한 후, 각 웰에 100μL를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하며; 300μL PBST로 3회 세척하고 2% BSA를 포함하는 PBST 용액으로 HRP-표지된 anti-6×His tag mAb를 1:4000으로 희석하며, 각 웰에 100μL를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하며; 300μL의 PBST로 5회 세척하며 100μL의 TMB 용액을 대응되는 웰에 첨가하고 실온에서 20분 동안 발색하며, 50μL의 1M H2SO4 용액을 첨가하여 발색을 종료시키며, 마이크로플레이트리더기로 450nm에서 흡광도를 측정하며 결과를 Graph Prism에 도입시키고 EC50값을 계산한다.
도 9에 도시된 바와 같이, 결과는 AB12S3(IC50=1.33μg/mL)이 TIM-3/PtdSer의 결합을 차단하는 기능은 AB12S1(IC50=3.20μg/mL)보다 강하다.
5.8 항 TIM-3 인간화 항체에 의한 CD8+ T세포의 활성화를 향상
정지 상태의 T세포가 활성화된 후, 세포막 표면에서 CD69가 발현되며, 항 TIM-3 항체가 존재하는 상황에서, 초항원 SEB로 CD8+ T세포를 자극한 후, FACS를 통해 CD69의 발현을 측정함으로써, T림프구 기능에 대한 항 TIM-3 항체의 향상 작용를 평가한다. 밀도 기울기 원심분리법(LymphoprepTM,인간 림프구 분리 용액, STEMCELL)을 사용하여 인간 말초 혈액으로부터 신선한 단핵 세포(인간 PBMC)를 획득하고, T세포 분리 시약(STEMCELL, #19053)을 사용하여 높은 순도의 CD8+ T세포를 획득한다. 획득한 CD8+ T세포는 1ng/mL의 포도알균 장독소 B가 함유된 배양액을 재현탁시키며, 세포 밀도를 5.6×105/mL로 조정하고, 180μL/웰(105세포/웰)이 되도록 96웰 세포 배양 플레이트에 접종한다. 항 AB12S3 및 AB12S4를 10배 구배로 희석시킨 후, 각 웰에 각각 20μL를 첨가하고, 또한, AB12S1을 양성 대조군으로 하되 각 샘플은 3개의 농도 100μg/mL, 10μg/mL 및 1μg/mL를 가진다. 각종 항체 각 농도는 3개의 복제 웰에 대응된다. 48시간 후, 세포를 수집하고, FACS로 CD8+ T세포 표면에서 CD69의 발현을 검출하는바, 방법은 다음과 같다: 세포 300g을 5분 동안 원심분리시킨 후, 상등액은 버리고, 2% BSA를 포함하는 PBS 200μL/웰로 세척하고, 원심분리시킨 후, 100μL/웰로 재현탁하고, CD69 항체(BD회사, #555531)를 2.5μL/웰로 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하고 원심분리하며, 100μL의 2% BSA를 포함하는 PBS로 재현탁시킨 후, 기계에 배치하여 CD69 발현을 검출한다.
도 10에 도시된 바와 같이, AB12S1 및 AB12S4에 비해, AB12S3의 처리 상황에서 CD8+ T세포 표면에서 CD69의 발현은 명확히 상향 조절된다.
5.9 항 TIM-3 인간화 항체가 생체외에서 T세포를 자극하여 종양 세포를 살상하는 기능
인간 비소세포 폐암 세포주의 HCC827세포(Cell Bank of Chinese Academy of Sciences)와 유방 관내상피암 세포주 HCC1954세포(Cell Bank of Chinese Academy of Sciences)를 96웰 세포 배양 플레이트에 접종시키고, 농도가 5μg/mL인 인간화 TIM-3 항체 AB12S3을 첨가하고, 건강한 자원봉사자의 분리된 혈청 IgG를 음성 대조군으로 하고, 4:1의 이펙터-타겟 비율에 따라 항 CD3 항체(OKT3) 및 인터루킨-2(Sino Biological Inc., 11848-HNAY1)로 활성화된 T세포를 첨가하여, 24시간 동안 배양하고, 세포 증식 시약 CCK-8(동인 화학, Dojindo Laboratories)을 사용하여 세포의 생존 상황을 측정하되, T세포가 첨가되지 않은 배양웰(즉 표적세포군)의 생존율을 100%로 하여 세포의 생존 상황를 측정하는바, 아래와 같은 식으로 살상률(%)을 계산한다: 살상률% = (1-테스트군 OD값/표적세포군 OD군)×100%이며, SPSS를 사용하여 AB12S3군 및 인간 IgG군의 3개의 복제웰의 차이를 통계하고 p값을 계산한다.
결과는 도 11에 나타낸 바와 같이, AB12S3군 및 HuIgG군을 비교하면, 표적세포에 대한 HCC827의 살상률은 59.2%에서 75.8%로 상승되며, 살상률은 27.9%로 상향 조절되며, p<0.01이며; 표적세포에 대한 HCC1954의 살상률은 42.4%에서 60.8%로 상승되며, 살상률은 43.3%로 상향 조절되며, p<0.01이다. 실험에서는 항 TIM-3 인간화 항체 AB12S3은 T세포가 종양세포를 살상하는 기능을 증강시킬 수 있음을 나타낸다.
5.10 hTIM3 유전자 변형 마우스의 체내에서의 항 TIM-3 인간화 항체의 약효를 검출
마우스 피하 종양보유 모델(mouse subcutaneous tumor-bearing model)을 사용하여 AB12S3 항체의 약효를 검증하며, 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 평가한다. 6-7 주령인 인간 TIM-3을 보유한 수컷 유전자 변형 마우스(Biocytogen)에 각각 0.1mL (5×105개) MC38세포를 피하 주사하고, 종양 부피가 100mm3에 도달되면, 무작위로 그룹화하되, 각 군마다 5마리씩, 무작위로 다음과 같은 3개의 군으로 그룹화한다: 음성 대조군(생리식염수), 10mg/kg의 AB12S1 항체군, 10mg/kg AB12S3 항체군이다. 투여 방식은 다음과 같다: 3일에 한 번씩, 총 6번 복강 투여하여 종양 부피를 측정한다.
결과는 도 12에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군과 비교하면, AB12S3 항체는 종양 성장의 기능을 명확히 억제시키지만, 대조 항체 AB12S1은 명확한 항 종양 효과가 없다.
5.11 IFN-γ를 분비하도록 PBMC를 자극하는 SEB에 대한 항-인간 TIM-3 인간화 항체의 촉진 작용
TIM-3은 CD8+ T세포, CD4+ T세포 및 Th1세포 등 활성화된 T세포에서 발현될 수 있다. 항 TIM-3 항체는 TIM-3에 결합됨으로써, TIM-3의 활성을 억제시키며, 최종적으로 IFN-γ 분비를 촉진시킨다. 본 실시예에서는 SEB를 사용하여 PBMC(T림프구 등을 포함)를 자극하고, IFN-γ를 분비하는 것을 검출 지표로 하여 TIM-3 항체의 활성을 검출한다. 인간(공여체 A와 공여체 B) 말초혈로부터 신선한 단핵세포(PBMC세포)를 획득한 후, PBMC를 96웰 플레이트에 접종하고, 1ng/ml SEB 용액 및 상이한 농도의 AB12S3과 대조 항체 AB12S1을 37℃, 5%의 CO2 배양기에 첨가하여 72시간 동안 배양한다. 작용이 끝난 후, 상등액을 흡입하고, IFN-γ 검출 키트로 상등액 중의 IFN-γ의 함량을 검출한다. 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, AB12S3은 PBMC를 자극하여 IFN-γ를 분비하도록 하는 SEB의 활성을 현저히 촉진시키며, 대조군 항체 AB12S1보다 강하다.
5.12 혼합 림프구 반응(MLR) 중 사이토카인 분비에 대한 항 TIM-3 인간화 항체의 영향
CD14 마그네틱 비드 분리 키트로 공여체 A와 공여체 B의 PBMC에서 CD14+단핵세포를 분리시킨 후, GM-CSF 및 rhIL-4로 7일 동안 유도하여 이를 성숙된 수지상 세포(DC)로 분화시키며; CD4+ T세포 마그네틱 비드 분리 키트로 PBMC로부터 CD4+ T세포를 분리시킨 후, CD4+ T세포와 성숙된 DC세포를 혼합하고, 상이한 농도의 AB12S3을 단독적으로 또는 OPDIVO®와 병합된 군(OPDIVO®의 농도는 각각 0.02μg/ml임)으로 첨가하여 37℃의 배양기에서 5일 동안 작용한다. 작용이 끝난 후, 상등액을 흡입하고, IFN-γ 검출 키트로 상등액 중의 IFN-γ의 함량을 검출한다. MLR에서 IFN-γ의 분비에 대한 AB12S3, PD-1 항체 OPDIVO®, 및 AB12S3과 PD-1 항체 OPDIVO®의 병용의 작용을 검출하는바, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이 AB12S3과 OPDIVO®의 병용은 MLR에서 IFN-γ의 분비에 대해 시너지 촉진 작용이 있다.
본 발명에 언급된 모든 문헌은 본 출원에 참고로서 인용되며, 한 편의 문헌마다 참고로서 단독적으로 인용되는 것과 같다. 이외에, 본 발명의 상기 설명한 내용을 읽은 후, 본 분야의 당업자는 본 발명에 대해 각종 변형 또는 수정할 수 있는바, 이러한 등가 형태는 본 출원에 첨부된 청구항에 한정된 범위내에 있다.
Figure pct00016
중국 타입 컬쳐 콜렉션 센터 C2017181 20171025
<110> AMPSOURCE BIOPHARMA SHANGHAI INC. SICHUAN KELUN-BIOTECH BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIBODY AGAINST TIM-3 AND APPLICATION THEREOF <130> PCT190361PPC <160> 47 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus domesticus <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Leu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Met Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Ile 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Asp Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus domesticus <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asn Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the constant region of IgG1 (L234A,L235A) mutant <400> 35 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 37 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the constant region of IgG4(S228P) mutant <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 38 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S3-HC <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Ile 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Asp Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 39 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S3-HC <400> 39 gaggtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc cgtgaaggtg 60 agctgcaagg cctctggcta tacattcacc aactacgtga tgcactggat gagacaggct 120 ccaggacagc gcctggagtg gatcggctat atcgaccctg ataacgacgg catcaagtac 180 aatgagaaga tcaagggcaa ggccacactg acctccgata agtccagctc taccgcttac 240 atggagctgt ccagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc tcgcgatttt 300 ggctatgtgg actggttccc ctactggggc cagggcacca cagtgaccgt gtcttccgcc 360 tctaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccatgtt cccgcagcac ctctgagtcc 420 acagccgctc tgggctgcct ggtgaaggac tatttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggcg ctctgacctc cggagtgcac acatttcccg ccgtgctgca gtcttccggc 540 ctgtacagcc tgagctctgt ggtgaccgtg ccatccagct ctctgggcac caagacatat 600 acctgtaacg tggatcataa gccctccaat acaaaggtgg acaagcgcgt ggagagcaag 660 tacggaccac catgtcctcc atgcccagct cccgagtttc tgggcggccc tagcgtgttc 720 ctgtttcccc ctaagccaaa ggataccctg atgatcagca ggacccctga ggtgacatgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca ggaggaccca gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcct cgggaggagc agtttaattc cacctacaga 900 gtggtgagcg tgctgacagt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtataagtgt 960 aaggtgtcca ataagggcct gccatccagc atcgagaaga ccatcagcaa ggctaagggc 1020 cagcccaggg agcctcaggt gtacacactg ccaccctctc aggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacatgcct ggtgaagggc ttctatcctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg gccagccaga gaacaattac aagaccacac ctccagtgct ggattctgac 1200 ggctccttct ttctgtattc ccggctgacc gtggacaaga gcagatggca ggagggcaac 1260 gtgtttagct gttctgtgat gcatgaggct ctgcacaatc attacacaca gaagtccctg 1320 agcctgtctc tgggcaag 1338 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S3-LC <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S3-LC <400> 41 gacatcgtga tgacacagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgaca 60 atcacctgta aggcttctca ggacgtgacc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctattcc gctagcaata gatacatcgg cgtgcctgat 180 cgctttaccg gctctggctc cggcacagac tttacattca ccatctccag cctgcagcca 240 gaggacatcg ccacctacta ttgccagcag cattatagca tcccccctac cttcggcggc 300 ggcacaaagg tggagatcaa gaggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat ctttccccct 360 tccgatgagc agctgaagtc cggcacagcc agcgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420 cctagagagg ctaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caattctcag 480 gagtccgtga ccgagcagga tagcaaggac tctacatatt ccctgtccag cacactgacc 540 ctgagcaagg ctgattacga gaagcacaag gtgtatgcct gtgaggtgac ccatcagggc 600 ctgtcttccc ctgtgacaaa gtctttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 42 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S4-HC <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Leu Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Met Arg Gln Lys Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Asp Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Ile 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Asp Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S4-HC <400> 43 gaggtgcagc tggtgctgtc cggagctgag gtggtgaagc caggagcttc cgtgaagatg 60 agctgcaagg cctctggcta tacattcacc aactacgtga tgcactggat gagacagaag 120 ccaggacagc gcctggagtg gatcggctat atcgaccctg ataacgacgg catcaagtac 180 aatgagaaga tcaagggcaa ggccacactg acctccgata agtccagctc taccgcttac 240 atggagctgt ccagcctgag aagcgaggac agcgccgtgt actattgcgc tcgcgatttt 300 ggctatgtgg actggttccc ctactggggc cagggcacca cagtgaccgt gtcttccgcc 360 tctaccaagg gcccttccgt gttccctctg gccccatgtt cccgcagcac ctctgagtcc 420 acagccgctc tgggctgcct ggtgaaggac tatttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggcg ctctgacctc cggagtgcac acatttcccg ccgtgctgca gtcttccggc 540 ctgtacagcc tgagctctgt ggtgaccgtg ccatccagct ctctgggcac caagacatat 600 acctgtaacg tggatcataa gccctccaat acaaaggtgg acaagcgcgt ggagagcaag 660 tacggaccac catgtcctcc atgcccagct cccgagtttc tgggcggccc tagcgtgttc 720 ctgtttcccc ctaagccaaa ggataccctg atgatcagca ggacccctga ggtgacatgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca ggaggaccca gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcct cgggaggagc agtttaattc cacctacaga 900 gtggtgagcg tgctgacagt gctgcatcag gactggctga acggcaagga gtataagtgt 960 aaggtgtcca ataagggcct gccatccagc atcgagaaga ccatcagcaa ggctaagggc 1020 cagcccaggg agcctcaggt gtacacactg ccaccctctc aggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacatgcct ggtgaagggc ttctatcctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaatg gccagccaga gaacaattac aagaccacac ctccagtgct ggattctgac 1200 ggctccttct ttctgtattc ccggctgacc gtggacaaga gcagatggca ggagggcaac 1260 gtgtttagct gttctgtgat gcatgaggct ctgcacaatc attacacaca gaagtccctg 1320 agcctgtctc tgggcaag 1338 <210> 44 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S4-LC <400> 44 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 45 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AB12S4-LC <400> 45 gacatcgtga tgacacagag ccctagctct atgagcacct ctgtgggcga tagagtgaca 60 atcacctgta aggcttctca ggacgtgacc acagccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggcaagagcc ctaagctgct gatctattcc gctagcaata gatacatcgg cgtgcctgat 180 cgctttaccg gctctggctc cggcacagac tttacattca ccatctccag cgtgcagcca 240 gaggacatcg ccgtgtacta ttgccagcag cattatagca tcccccctac cttcggcggc 300 ggcacaaatc tggagatcaa gaggaccgtg gctgccccct ccgtgttcat ctttccccct 360 tccgatgagc agctgaagtc cggcacagcc agcgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420 cctagagagg ctaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caattctcag 480 gagtccgtga ccgagcagga tagcaaggac tctacatatt ccctgtccag cacactgacc 540 ctgagcaagg ctgattacga gaagcacaag gtgtatgcct gtgaggtgac ccatcagggc 600 ctgtcttccc ctgtgacaaa gtctttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 46 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VH of AB12S1 <400> 46 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Gly Ala Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 47 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL of AB12S1 <400> 47 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Asp Pro Ser Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (27)

  1. 하기 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR:
    (i) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H1의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;
    (ii) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H2의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호 1로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H3의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개가 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3; 및/또는
    하기 세 개의 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR:
    (iv) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L1의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;
    (v) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L2의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호 2로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L3의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3;
    또는,
    (b) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR:
    (i) 서열번호7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H1의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H1;
    (ii) 서열번호7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H2의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호7로 나타낸 VH에 함유된 CDR-H3의 서열을 구비하거나 상기 VH에 함유된 CDR-H3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-H3; 및/또는
    하기 세 개의 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR
    (iv) 서열번호8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L1의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L1의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L1;
    (v) 서열번호 8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L2의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L2의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호8로 나타낸 VL에 함유된 CDR-L3의 서열을 구비하거나 상기 VL에 함유된 CDR-L3의 서열에 비해 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열을 구비하는 CDR-L3; 을 포함하며,
    바람직하게, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이며;
    바람직하게, 상기 중쇄 거변 영역(VH)에 함유된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 및/또는 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템으로 정의된다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) 하기로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR:
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11 중의 임의의 하나로 나타낸 VH임;
    및/또는
    (b) 하기로부터 선택되는 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR:
    상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12 중의 임의의 하나로 나타낸 VL임; 을 포함하며,
    바람직하게, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및/또는 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템으로 정의되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은,
    (1) 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는, 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR;
    여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 IMGT 넘버링 시스템을 통해 정의되며;
    (2) (a) 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는, 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR, 또는 (b) 서열번호 7로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는, 서열번호 8로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR;
    여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템을 통해 정의되며; 또는
    (3) 서열번호 1로 나타낸 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR; 및/또는 서열번호 2로 나타낸 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR; 을 포함하며,
    여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH)에 함유된 세 개의 CDR 및 상기 경쇄 가변 영역(VL)에 함유된 세 개의 CDR은 Chothia 넘버링 시스템을 통해 정의되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서,
    아래와 같은 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (1) IMGT 넘버링 시스템으로 정의된 CDR:
    (a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
    (i) 서열번호 18, 또는 서열번호 18에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H1;
    (ii) 서열번호 19, 또는 서열번호 19에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호 20, 또는 서열번호 20에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H3;
    및/또는
    (b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
    (iv) 서열번호 27, 또는 서열번호 27에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 아미노산을 구비하는 서열로 조성된 CDR-L1;
    (v) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)된 서열로 구성된 CDR-L3;
    또는
    (2) Chothia 넘버링 시스템으로 정의되는 CDR:
    (a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
    (i) 서열번호 16, 또는 서열번호 16에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H1;
    (ii) 서열번호 17, 또는 서열번호 17에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H3;
    및/또는
    (b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
    (iv) 서열번호 24, 또는 서열번호 24에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L1;
    (v) 서열번호 25, 또는 서열번호 25에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호 26, 또는 서열번호 26에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L3;
    또는,
    (3) Kabat 넘버링 시스템으로 정의된 CDR:
    (a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
    (i) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H1;
    (ii) 서열번호 14, 또는 서열번호 14에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H3;
    및/또는
    (b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR:
    (iv) 서열번호 21, 또는 서열번호 21에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L1;
    (v) 서열번호 22, 또는 서열번호 22에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L3;
    또는
    (4) Kabat 넘버링 시스템으로 정의된 CDR
    a) 하기 세 개의 중쇄 가변 영역(VH) CDR:
    (i) 서열번호 13, 또는 서열번호 13에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H1;
    (ii) 서열번호 28, 또는 서열번호 28에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H2; 및
    (iii) 서열번호 15, 또는 서열번호 15에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-H3;
    및/또는
    (b) 하기 세 개 경쇄 가변 영역(VL) CDR
    (iv) 서열번호 29, 또는 서열번호 29에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L1;
    (v) 서열번호 30, 또는 서열번호 30에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L2; 및
    (vi) 서열번호 23, 또는 서열번호 23에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 세 개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열로 구성된 CDR-L3; 을 포함하며,
    바람직하게, (i)-(vi) 중 임의의 하나에 따른 치환은 보존적 치환이다.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 18로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 19로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 20으로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, VL은 서열번호 27로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 25로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23으로 나타낸 CDR-L3을 포함하며;
    여기서, 상기 각 CDR은 IMGT 넘버링 시스템으로 정의되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 16로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 17로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, VL은 서열번호 24로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 25로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 26로 나타낸 CDR-L3을 포함하며;
    여기서, 상기 각 CDR은 Chothia 넘버링 시스템으로 정의되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제 4 항에 있어서,
    (a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 13로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 14로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 21로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 22로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23로 나타낸 CDR-L3을 포함하며; 또는
    (b) 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VH는 서열번호 13로 나타낸 CDR-H1, 서열번호 28로 나타낸 CDR-H2 및 서열번호 15로 나타낸 CDR-H3을 포함하며, 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VL은 서열번호 29로 나타낸 CDR-L1, 서열번호 30으로 나타낸 CDR-L2 및 서열번호 23으로 나타낸 CDR-L3을 포함하며;
    여기서, 상기 각 CDR은 Kabat 넘버링 시스템으로 정의되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항의 임의의 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은,
    (a) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
    (i) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열;
    (ii) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열; 또는
    (iii) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 중 임의의 하나로 나타낸 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열;
    및/또는
    (b) 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
    (iv) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열;
    (v) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열에 비해 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환, 결실 또는 부가)가 있는 서열; 또는
    (vi) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 중 임의의 하나로 나타낸 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92% 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 구비하는 서열; 을 포함하며,
    바람직하게, (ii) 또는 (v) 중 상기의 치환은 보존적 치환인 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서,
    (1) 서열번호 1로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 2로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
    (2) 서열번호 3으로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 4로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
    (3) 서열번호 5로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 6으로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
    (4) 서열번호 7로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 8로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
    (5) 서열번호 9로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 10으로 나타낸 서열을 구비하는 VL;
    (6) 서열번호 11로 나타낸 서열을 구비하는 VH 및 서열번호 12로 나타낸 서열을 구비하는 VL; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 인간 면역 글로불린의 중쇄 불변 영역(CH) 또는 이의 변이체- 여기서, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 보존적 치환)을 구비함-; 및
    (b) 인간 면역 글로불린의 경쇄 불변 영역(CL) 또는 이의 변이체- 여기서, 상기 변이체는 이가 유래된 서열에 비해 많아서 20개의 보존적 치환(예를 들면, 많아서 15개, 많아서 10개, 또는 많아서 5개의 보존적 치환; 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 보존적 치환)을 구비함; 를 더 포함하며,
    바람직하게, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG 중쇄 불변 영역이며 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이며;
    바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (1) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역;
    (2) 인간 IgG4 중쇄 불변 영역;
    (3) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체-상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 Leu234Ala, Leu235Ala 치환을 구비함-;
    (4) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체-상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 Asn297Ala 치환을 구비함-;
    (5) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체-상기 변이체는 이가 유래된 야생형 서열에 비해 Asp265Ala, Pro329Ala 치환을 구비함-;
    (6) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 변이체-상기 변이체는 이가 유래되는 야생형 서열에 비해 Ser228Pro 치환을 구비함-; 를 포함하며,
    여기서, 상기에서 언급된 아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따른 위치이며,
    바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 32 내지 서열번호 37 중 임의의 하나로 나타낸 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하며;
    바람직하게, 상기 경쇄 불변 영역은 κ경쇄 불변 영역이며;
    바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 31로 나타낸 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 scFv, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 단편, 디아바디(diabody), 이중 특이성 항체, 다중 특이성 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 100×10-12M이하인 KD로 TIM-3(예를 들면 인간 TIM-3)에 결합되며;
    바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 1×10-12M이하인 KD로 TIM-3(예를 들면 인간 TIM-3)에 결합되는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 임의의 한 항에 따른 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  15. 제 14 항에 따른 핵산 분자를 포함하며, 바람직하게, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제 14 항에 따른 핵산 분자 또는 제 15 항에 따른 베터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 임의의 한 항에 따른 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 조건에서, 청구항 16에 따른 숙주세포를 배양하는 단계 및 배양된 숙주세포 배양물에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 TIM-3에 특이적으로 결합될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  18. 중국 타입 컬쳐 콜렉션 센터(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)에 수탁되었으며, 수탁번호는 CCTCC NO.C2017181인 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주#22.
  19. 제 18 항에 따른 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 벡터 및/또는 부형제 및/또는 안정제를 포함하며,
    바람직하게, 또 다른 약학적 활성제를 더 포함하며,
    바람직하게, 상기 또 다른 약학적 활성제는 항 종양 활성을 갖는 약물이며,
    바람직하게, 상기 또 다른 약학적 활성제는 감염을 치료하기 위한 약물이며,
    바람직하게, 상기 또 다른 약학적 활성제는 자가면역질환을 치료하기 위한 약물이며,
    바람직하게, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상기 또 다른 약학적 활성제는 분리된 조성분 또는 동일한 조성물의 조성분으로서 제공되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIGIT, VISTA, CTLA-4, OX40, BTLA, 4-1BB, CD96, CD27, CD28, CD40, LAIR1, CD160, 2B4, TGF-R, KIR, ICOS, GITR, CD3, CD30, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, SLAMF7, NKp80, B7-H3 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합되는 제2 항체 또는 상기 제2 항체를 코딩하는 핵산을 더 포함하며,
    바람직하게, 상기 제2 항체는 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며; 더욱 바람직하게, 상기 인간 PD-1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Nivoluma 또는 이의 항원 결합 단편 및 Pembrolizumab 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되며,
    바람직하게, 상기 제2 항체는 인간 PD-L1에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  22. 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물 제조 과정에서의 용도에 있어서,
    상기 약물은 적어도 하기 임의의 하나에 사용되며:
    (1) 체외 또는 대상체(예를 들면, 인간) 체내에서 면역세포 활성을 향상시키는 것;
    (2) 대상체(예를 들면, 인간)에서 면역 반응을 증강시키는 것;
    (3) 대상체(예를 들면, 인간)에서 암을 치료하는 것;
    (4) 대상체(예를 들면, 인간)에서 감염성 질환을 치료하는 것;
    (5) 대상체(예를 들면, 인간)에서 자가면역질환을 치료하는 것; 및
    (6) (1) 내지 (5)의 임의의 조합,
    바람직하게, 상기 암은 고형 종양, 혈액 종양(예를 들면, 백혈병; 림프종; 골수종, 예를 들어 다발성 골수종) 및 전이성 병소로부터 선택되는바, 예를 들면, 폐암, 편평세포폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, IM-TN 유방암, 결장직장암, 백혈병 또는 암의 전이성 병소를 포함하지만 이에 한정되지 않으며,
    바람직하게, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및 기생충 감염으로부터 선택되며 HIV,간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 패혈증을 포함하지만 이에 한정되지 않으며,
    바람직하게, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 건선, 전신홍반루푸스, 원발성 담즙성 간경변증, 자가면역성 용혈성빈혈, 자가면역성 혈소판감소성자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 그레이브스 병, 중증근무력증, 자가면역성 간염 및 다발성 경변증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 12 항 중의 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물 제조 과정에서의 용도.
  23. 제 1 항 내지 제 12 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 혹은 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 약물 조성물을 면역 반응을 자극하는데 효과적인 양으로 이가 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 12 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 혹은 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 약물 조성물을 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 편평세포폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, IM-TN 유방암, 결장직장암, 백혈병 또는 암의 전이성 병소로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 12 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 혹은 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 약물 조성물을 효과적인 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체(예를 들어 인간)에서 자가면역질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 12 항 중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 명세서를 포함하는 진단 또는 치료 키트.
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