KR101891750B1

KR101891750B1 - 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR101891750B1
Application number: KR1020170050514A
Authority: KR
Inventors: 최지하; 심소연; 최윤희
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2018-09-28

Abstract

일 양상에 따른 태아의 조산 가능성을 예측하기 위한 조성물, 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물, 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SHP-2 변이를 검출하는 방법, 및 이와 관련된 바아오마커를 제공한다. 이에 따르면, 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 민감도 및 특이도가 높게 예측하는데 필요한 정보를 제공할 수 있다.

Description

태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물, 및 이를 이용한 방법{Composition for predicting preterm birth of fetus or neurodevelopment of preterm infant, and method using the same}

태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물, 및 이를 이용하여 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 예측하는 방법에 관한 것이다.

조산(preterm birth)은 임신 기간을 기준으로 하여 임신 20 주를 지나 임신 37 주 이전의 분만을 말한다. 최근 조산아의 생존율이 증가하고 있지만, 조산아의 신경학적 장애가 여전히 문제된다. 조산은 매우 다양한 요인들이 관련되어 있는데, 염증, 감염, 활성 산소종, 유전적 요인, 조기 진통, 조기 양막 파수, 출혈, 자궁의 기형 등 수많은 요인들이 조산과 관련이 있다고 알려져 있다. 조산아의 경우 폐가 미성숙하여 호흡을 잘하지 못하고, 뇌출혈, 뇌성마비, 감염 등의 발생 빈도가 높다. 또한, 조산아의 뇌는 미성숙하여 신경발달 지연이 나타날 수 있다.

Src 호모로지 2 도메인-함유 단백질 티로신 포스파타제(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2: SHP-2)는 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 11(Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11: PTPN11로도 알려져 있는 단백질로, 단백질 티로신 포스파타제(protein tyrosine phosphatase: PTP) 패밀리에 속한다. SHP-2 유전자의 변이는 누난 증후군(Noonan syndrome)의 원인으로 알려져 있다(Tartaglia M. et al., Nat Genet 2001; 29(4): 465-8). SHP-2는 조혈 세포와 중추 신경계에서 높은 수준으로 광범위하게 발현되고, 허혈성 뇌 손상에 대한 뇌신경 보호에 관련되어 있다.

따라서, 조산의 위험성 또는 조산아의 신경발달을 수준을 민감도 및 특이도가 높게 예측할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 진단 방법을 개발할 필요가 있다.

태아의 조산 가능성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

조산 또는 조산아의 신경발달 예측용 바이오마커를 제공한다.

일 양상은 Src 호모로지 2 도메인-함유 단백질 티로신 포스파타제(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2: SHP-2) 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 317번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드;

SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및

SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산의 변이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 태아의 조산 가능성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 SHP-2는 티로신-단백질 포스파타제 비-수용체 유형 11(Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11: PTPN11), BPTP3, CFC, JMML, METCDS, NS1, PTP-1D, PTP2C, SH-PTP2, 또는 SH-PTP3로도 달려져 있다. 상기 SHP-2는 단백질 티로신 포스파타제(protein tyrosine phosphatase: PTP) 패밀리에 속하는 단백질일 수 있다. 상기 SHP-2의 구조는 2개의 SH2 도메인과 그의 N-말단에 PTP 도메인을 포함할 수 있다. 상기 SHP-2는 인간의 경우 GenBank Accession No. NM_002834, NM_080601, 또는 NM_001330437의 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 상기 SHP-2는 GenBank Accession No. NM_002834.3의 핵산 서열(서열번호 1)에 의해 암호화될 수 있다. 상기 SHP-2는 마우스의 경우 GenBank Accession No. NM_001109992, 또는 NM_011202의 핵산 서열에 의해 암호화되는 단백질일 수 있다. 상기 SHP-2는 인간의 경우 GenBank Accession No. NP_001317366, NP_002825, 또는 NP_542168의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 SHP-2는 마우스의 경우 GenBank Accession No. NP_001103462.1, NP_035332.1, NP_001103462, 또는 NP_035332의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

용어 "유전자(gene)"는 유전 정보의 단위로서, 조절 영역 및 열린 해독틀(open reading frame: ORF)을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer) 영역, 비번역 영역(untranslated region: UTR), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 ORF는 엑손(exon) 또는 인트론(intron)을 포함할 수 있다.

상기 전사 개시점은 전령 RNA(messenger RNA: mRNA)에서 리보좀에 의해 번역되는 첫번째 코돈에서 5' 말단의 핵산을 말한다.

상기 다형성 부위(polymorphism site)는 게놈에서 다형성이 나타난 위치를 말한다. 상기 다형성은 게놈에서 특정 위치에 나타나는 하나 이상의 뉴클레오티드의 변이(variation)를 말한다. 단일 뉴클레오티드의 변이는 단일 뉴클레오티드 다형성(single-nucleotide polymorphism: SNP)으로도 불린다.

상기 조성물은 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 317번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드 포함할 수 있다.

상기 조성물은 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.

상기 조성물은 SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산의 변이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편할 수 있다.

용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항-SHP-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

용어 "태아(fetus)"는 임신 초기부터 출생 시까지의 임신된 개체를 의미한다. 수정 후 2주 후부터 8주(임신 10주)까지는 배아(embryo), 수정 8주(임신 10주) 이후부터 출생 때까지를 태아(fetus)로 구별할 수 있다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.

용어 "조산(preterm birth)"는 임신 기간을 기준으로 임신 20주 이후부터 임신 37주 이전의 분만을 말한다. 상기 조산은 예를 들어 임신 20주 이후부터 35주 이하의 분만일 수 있다.

다른 양상은 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 317번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드;

SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산의 변이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 SHP-2, 유전자, 전사 개시점, 다형성 부위, 폴리뉴클레오티드, 항체, 및 항원 결합 단편은 전술한 바와 같다.

용어 "조산아(preterm infant)"는 임신 기간 37주 미만 또는 최종 월경일로부터 259일 미만에 태어난 아기를 말하고 미숙아로도 불린다.

상기 신경발달(neurodevelopment)은 뇌 또는 중추신경계의 성장 또는 발달일 수 있다. 상기 신경발달은 운동기능 발달, 인지기능 발달, 언어기능 발달, 사회성 발달, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 신경발달은 조산아 뇌의 수초화(myelination) 수준일 수 있다. 수초화는 신경축삭 주위에 수초가 생기는 과정을 말하고, 뇌 성숙의 척도일 수 있다.

다른 양상은 개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료 또는 단백질 시료를 수득하는 단계; 및

수득된 시료로부터 SHP-2의 변이를 검출하는 단계로서,

상기 SHP-2의 변이는

SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 317번째 뉴클레오티드의 다형성, SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성, 및 SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산의 변이로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단계를 포함하는,

태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SHP-2 변이를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 개체, SHP-2, 유전자, 전사 개시점, 다형성, 태아, 및 조산은 전술한 바와 같다.

상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득될 수 있다, 상기 생물학적 시료는 예를 들어 모체 또는 태아로부터 수득될 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 핵산 시료 또는 단백질 시료는 모체 또는 태아로부터 수득될 수 있다.

상기 변이(variation)는 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 변경 또는 변화를 말한다. 상기 변이는 핵산 서열 중 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 중복, 역위, 및 결실을 포함한다. 상기 변이는 아미노산 서열 중 아미노산의 치환, 삽입, 및 결실을 포함한다. 상기 변이는 예를 들어 뉴클레오티드의 치환일 수 있다. 상기 변이는 아미노산의 치환일 수 있다. 상기 변이는 점 돌연변이일 수 있다.

상기 SHP-2 변이는 상기 317번째 뉴클레오티드의 다형성에서 유전자형이 C/T 또는 T/T이거나, 상기 273번째 뉴클레오티드의 다형성에서 유전자형이 G/A 또는 A/A이거나, 상기 559번째 아미노산이 세린이거나, 또는 이들의 조합을 포함한다.

상기 검출하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블로팅(Northern blotting), 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR 또는 역전사 PCR일 수 있다.

상기 방법은 상기 317번째 뉴클레오티드의 다형성에서 유전자형이 C/T 또는 T/T인 것을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 273번째 뉴클레오티드의 다형성에서 유전자형이 G/A 또는 A/A인 것을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 559번째 아미노산이 세린(serine)인 것을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 태아는 조산될 가능성이 높다고 예측할 수 있다.

상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 조산아의 신경발달이 지연될 가능성이 높다고 예측할 수 있다. 상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 조산아 뇌가 미성숙하거나, 조산아 뇌의 수초화 수준이 낮을 것으로 예측할 수 있다. 상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 조산아의 운동기능 발달, 인지기능 발달, 언어기능 발달, 사회성 발달, 또는 이들의 조합이 지연되거나 지연될 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 조산아의 운동기능이 지연되거나 지연될 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다. 상기 개체가 상기 SHP-2 변이를 가질 경우, 상기 개체에 대해 정밀 평가를 진행하도록 정보를 제공할 수 있다.

다른 양상은 SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산이 세린인 돌연변이 SHP-2 단백질인, 조산 또는 조산아의 신경발달 예측용 바이오마커를 제공한다.

용어 "바이오마커(biomarker)"는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미한다.

상기 SHP-2 단백질의 N-말단으로부터 559번째 아미노산이 세린인 돌연변이 SHP-2 단백질은 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측할 수 있는 바이오마커일 수 있다.

일 양상에 따른 태아의 조산 가능성을 예측하기 위한 조성물, 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물, 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SHP-2 변이를 검출하는 방법, 및 이와 관련된 바이오마커에 따르면, 태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달을 민감도 및 특이도가 높게 예측할 수 있다.

도 1은 조산아에서 SHP-2 변이의 효과를 확인하기 위해 모집된 유아의 특징을 나타내는 그림이다.
도 2는 SHP-2 프로모터 변이를 함유한 리포터 벡터의 루시퍼라제 활성을 나타내는 그래프이다(***: 야생형에 대한 P < 0.001).
도 3a는 g.-317T SHP-2 프로모터 변이와 전사인자 NF-κB 간의 결합을 확인하는 EMSA 이미지이고((V): 변이), 도 3b는 g.-273A SHP-2 프로모터 변이와 전사인자 GABPα 간의 결합을 확인하는 EMSA 이미지이고((WT): 야생형, (V): 변이, Ref: 참조 올리고뉴클레오티드, Mut: 돌연변이 올리고뉴클레오티드), 도 3c는 GABPα 항체를 이용한 초이동 검사법의 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4a는 SHP-2 발현에서 P559S 변이의 효과를 나타내는 면역블로팅 이미지이고, 도 4b는 야생형 SHP-2 밴드 강도에 대한 P559S 변이 SHP-2 밴드 강도의 배수 차이를 나타내는 그래프이다.
도 5는 18 내지 22개월의 SHP-2 변이를 갖는 조산아와 만삭아의 확산 텐서 영상(DTI)을 트랙-기반 공간 통계(TBSS)로 분석한 결과를 나타내는 이미지이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 조산아의 신경 발달 정도 스크리닝

1. 연구 집단의 준비

본 시험은 이화여자대학교 의과대학 임상시험 심사위원회의 승인을 받았다.

SHP-2의 유전적 분석을 위해 72명의 조산아(재태 기간 ≤35 주)와 58명의 만삭아(재태 기간 ≥37 주)를 모집하였다. 모집된 유아에 대하여, 입원 기간 동안의 신생아기 또는 외래 병동에 내원한 유아기의 유아로부터 혈액 시료를 수득하였다.

연구에 참여한 유아들의 인구통계학적 데이터를 표 1에 나타내었다.

변수	조산아의 수 (명(%))	만삭아의 수 (명(%))	조산아 평균±표준 편차	만삭아 평균±표준 편차	P-값
총 수 (명)	72	58
재태 기간 (주)			28⁺⁵± 3⁺²	38⁺⁵± 1⁺¹	< 0.001
출생시 체중 (g)			1174 ± 492	3067 ± 610	< 0.001
남아	36 (50.0)	30 (51.7)			0.845
제왕절개	44 (61.1)	22 (37.9)			0.009
기관지폐 이형성증	31 (43.1)	0			< 0.001
뇌실내 출혈	46 (63.9)	3 (5.2)			< 0.001
뇌실주위 백질연화증	9 (12.5)	0			0.005
패혈증	6 (8.3)	0			0.024
사망	9 (12.5)	0			0.005

표 1에 나타난 바와 같이 72 명의 조산아들 중 9명이 입원 기간 중 사망하였고, 17명은 추적 중 데이터를 소실하였다. 나머지 46명의 조산아는 18 내지 22 개월의 연령에 다시 내원하여 신경학적 발달을 평가하였다.

2. 조산아 및 만삭아에서 SHP -2의 유전자 변이의 검출

조산의 감수성에 대한 SHP-2 변이의 효과를 조사하기 위해, 직접 핵산 서열 분석 및 유전자형 분석을 통해 총 130명의 조산아 또는 만삭아의 유전적 변이를 분석하였다.

SHP-2의 유전적 변이를 검출하기 위해, 조산아(72명)와 만삭아(58명)의 혈액 시료로부터 DNA 시료를 수득하고, 사용하여 SHP-2 유전자의 프로모터 영역(GenBank accession number NM_002834.3(서열번호 1)의 번역 개시 위치로부터 -2,168 bp까지) 또는 코딩 영역(모든 엑손 및 엑손-인트론 구역)을 직접 핵산 서열 분석하거나 유전자형을 분석하였다. 시험을 시작하기 전에 모든 시험 참여자의 법적 대리인으로부터 서면 동의를 받았다.

조산아와 만삭아 간의 SHP-2 유전적 변이의 빈도를 비교하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

변이	대립형질	조산아의 수(%)	만삭아의 수(%)	P-값^a
g.-317C>T	+/+	71 (98.6)	58 (100.0)	1.000
	+/-	1 (1.4)	0
	-/-	0	0
g.-273G>A	+/+	33 (45.8)	38 (65.5)	0.025
	+/-	36 (50.0)	17 (29.3)
	-/-	3 (4.2)	3 (5.2)
IVS1+21C>G	+/+	68 (94.4)	57 (98.3)	0.380
	+/-	4 ((5.6)	1 (1.7)
	-/-	0	0
IVS2+143G>A	+/+	72 (100.0)	57 (98.3)	0.446
	+/-	0	1 (1.7)
	-/-	0	0
IVS4-19T>C	+/+	71 (98.6)	58 (100.0)	1.000
	+/-	1 (1.4)	0
	-/-	0	0
IVS10-63G>A	+/+	71 (98.6)	58 (100.0)	1.000
	+/-	1 (1.4)	0
	-/-	0	0
IVS11+20C>T	+/+	71 (98.6)	57 (98.3)	1.000
	+/-	1 (1.4)	1 (1.7)
	-/-	0	0
IVS11-75C>T	+/+	71 (98.6)	58 (100.0)	1.000
	+/-	1 (1.4)	0
	-/-	0	0
IVS13-95C>T	+/+	52 (72.2)	37 (63.8)	0.304
	+/-	19 (26.4)	18 (31.0)
	-/-	1 (1.4)	3 (5.2)
P559S	+/+	71 (98.6)	58 (100.0)	1.000
	+/-	1 (1.4)	0
	-/-	0	0
IVS14-46G>A^b	+/+	20 (28.2)	23 (39.6)	0.169
	+/-	41 (57.7)	24 (41.4)
	-/-	10 (14.1)	11 (19.0)
1960T>C^b	+/+	68 (95.8)	57 (98.3)	0.627
	+/-	3 (4.2)	1 (1.7)
	-/-	0	0

+: 메이저(major) 대립형질, -: 마이너(minor) 대립형질

^a: P-값은 우위 모델(dominant model)(+/+ 대 +/- 또는 -/-)를 이용하여 산출함.

^b: 유전자형 데이터는 핵산 서열 분석을 실패하여 조산아에서 수득하지 못함.

표 2에 나타난 바와 같이, SHP-2 유전자에서 12종의 유전적 변이가 확인되었다. 중요한 변이로 확인된 것은 프로모터 영역에 있는 2개의 변이(g.-317C>T 및 g.-273G>A)와 1개의 비동의(nonsynonymous) 변이(P559S)였다. 프로모터 변이 중 하나인 g.-273G>A의 빈도는 만삭아 군보다 조산아 군에서 유의하게 높았다(P = 0.025). 다른 변이들의 빈도는 조산아와 만삭아 군 간에 유사하였다.

3. SHP -2 프로모터 활성에 대한 SHP -2 프로모터 변이의 효과

(1) 변이 SHP -2 프로모터의 활성

SHP-2 프로모터에서 유전적 변이의 기능적 특징을 확인하기 위해, 야생형 또는 변이 SHP-2 프로모터를 함유한 리포터 벡터의 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

구체적으로, 야생형 핵산 서열을 갖는 개체로부터 게놈 DNA 시료를 수득하고, 수득된 게놈 DNA 시료와 하기 프라이머 세트를 사용하여 SHP-2 프로모터의 -361bp 부터 +87 bp까지 (전체 448 bp) 영역을 PCR로 증폭하였다.

정방향 프라이머: 5'-ATGCCTCGAGGAAGCAAGGATGCTTTGGAC-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머: 5'-AATGCTAGCCTTCCGGACGGGGCTAAC-3'(서열번호 4)

서열번호 3 및 4에서 진한 글씨는 제한효소 인식 부위를 나타낸다.

PCR 증폭 산물을 pGL4.11 [luc2P] 벡터(Promega)에 삽입하여 야생형 SHP-2 프로모터 함유 리포터 벡터를 준비하였다.

프로모터에 유전적 변이를 함유하는 돌연변이 벡터는 QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)를 사용하고, 하기 프라이머를 이용하여 제작하였다.

g.-317C>T 돌연변이 제작용 프라이머: 5'-CCTCCGCGGAGTCCCCGCGCTGC-3' (서열번호 5)

g.-273G>A 돌연변이 제작용 프라이머: 5'-GGTCCTCCGCTGACAGGAAGCAGGAAGTG-3' (서열번호 6)

서열번호 5 및 6에서 진한 글씨는 SNP 부위를 나타낸다. 모든 벡터의 콘스트럭트는 핵산 서열 분석을 통해 확인하였다.

SHP-2 유전자의 프로모터 활성에 대한 SHP-2 프로모터 변이의 효과를 확인하기 위해, 준비된 리포터 벡터를 HCT-116 세포에 형질감염시킨 후 48 시간에, Dual-luciferase® 리포터 검사 시스템(Promega) 및 Glomax 96-웰 플레이트 루미노미터(Promega)를 사용하여 프로모터의 활성을 측정하였다. 측정된 루시퍼라제 활성을 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다(***: 야생형에 대한 P < 0.001).

도 2에 나타난 바와 같이, g.-317C>T 및 g.-273G>A의 두 변이가 각각 야생형의 리포터와 비교하여 SHP-2 프로모터 활성을 각각 36.7% 및 34.0% 증가시켰다. 따라서, g.-317C>T 및 g.-273G>A의 변이는 SHP-2의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

(2) SHP -2 프로모터의 전사 조절 메커니즘

SHP-2 프로모터의 전사 조절에 대한 메커니즘을 조사하기 위해, MatInspector(Genomatrix Software GmbH, 독일)를 이용하여 상기 두 변이에 인접한 SHP-2 프로모터에 전사 인자들이 결합할 수 있는지를 예측하였다. NF-κB와 GABPα의 두 전사 인자들이 각각 g.-317C>T 및 g.-273G>A 변이에 결합하는 것으로 예측되었고, 야생형과 변이 서열 간에 결합 친화도가 큰 차이가 있었다.

이러한 예측을 검증하기 위해, 전기적 이동성 변동 검사법(Electrophoretic Mobility Shift Assay: EMSA)를 수행하였다.

EMSA에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다.

야생형(g.-317C): 5'-GCCTCCGCGGAGCCCCCGCGCTGCC-3' (서열번호 7)

변이(g.-317T): 5'-GCCTCCGCGGAGTCCCCGCGCTGCC-3' (서열번호 8)

NF-κB 컨센서스: 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' (서열번호 9)

야생형(g.-273G): 5'-TCCTCCGCTGACGGGAAGCAGGAAG-3' (서열번호 10)

변이(g.-273A): 5'-TCCTCCGCTGACAGGAAGCAGGAAG-3' (서열번호 11)

GABPα 컨센서스: 5'-AGAGGATTGTGGGACCGGAAGCGGAAGAGAAGC-3' (서열번호 12)

돌연변이 GABPα 컨센서스: 5'-AGAGGATTGTGGGACTACAAGTACAAGAGAAGC-3' (서열번호 13)

서열번호 7, 8, 10, 및 11에서 진한 글씨는 SNP 부위를 나타내고, 서열번호 9 및 12에서 진한 글씨는 전사 인자의 컨센서스 서열을 나타내고, 및 서열번호 13에서 진한 글씨는 컨센서스 서열에서 변경된 서열을 나타낸다.

결합 반응을 위해, ³²P-표지된 올리고뉴클레오티드(1x10⁵ 카운트/분)를 HCT-116 세포에서 수득된 핵 단백질 추출물 10 ㎍ 내지 20 ㎍과 혼합하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. NF-κB 콘센서스(consensus) 올리고뉴클레오티드와 핵 추출물로 이루어진 DNA-단백질 복합체의 위치를 경쟁 검사법(competition assay) 및 초이동 검사법(supershift assay)을 통해 확인하였다. 경쟁 검사법을 위해, 표지되지 않은 NF-κB 컨센서스 또는 GABPα 컨센서스 또는 변이 올리고뉴클레오티드를 결합 반응 전에 100배 과량의 몰 비율로 가하였다. 초이동 검사법은 항-NF-κB p50 항체(sc-7178X, Santa Cruz Biotechnology), 항-NF-κB p60 항체(sc-372X, Santa Cruz Biotechnology), 항-GABPα 항체(sc-22810X, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 수행하였다. 각 시료를 전기 영동 후 건조시키고, CP-BU 필름(Agfa, 벨기에)에 약 16 시간 동안 약 -80℃에서 노출시켜 신호를 검출하였다. 각 밴드의 강도를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정하고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다 (화살표: DNA-단백질 복합체). 도 3a에 나타난 바와 같이, 핵 단백질 추출물과 야생형 (g.-317C) 또는 변이 (g.-317T) 올리고뉴클레오오티드의 결합 반응을 통해, NF-κB가 SHP-2 프로모터 인근 g.-317C>T에 결합할 수 있고, 야생형에 비해 변이에 더욱 강하게 결합하였다(레인 5: 야생형 프로모터, 레인 6 내지 8: 변이 프로모터).

다음으로, GABPα 콘센서스 올리고뉴클레오티드와 핵 추출물로 이루어진 DNA-단백질 복합체의 위치를 경쟁 검사법을 통해 확인하고, 그 결과를 도 3b에 나타내었다(화살표: DNA-단백질 복합체). 도 3b에 나타난 바와 같이, GABPα는 SHP-2 프로모터 인근 g.-273G>A에 결합할 수 있고, SHP-2 프로모터에 대한 결합 친화도는 변이 g.-273A의 존재에서 훨씬 강하였다(레인 4 및 7). GABPα 항체를 사용하여 수행된 초이동 검사법의 결과를 도 3c에 나타내었다(화살표: DNA-단백질 복합체). 항체의 존재에서 초이동을 통해, GABPα가 DNA-단백질 복합체에 존재한다는 것을 확인하였다(레인 2, 4, 및 6).

4. SHP -2 발현에 대한 SHP -2 비동의 변이의 효과

일반적으로, 비동의(nonsynonymous) 변이는 아미노산에 변화를 야기하여, 단백질의 발현 또는 기능에 영향을 미칠 수 있다. 실시예 1.2의 표 2에 나타난 바와 같이, 비동의 변이 P559S가 건강한 조산아에서 확인되었다.

SHP-2의 발현에 대한 P559S 변이의 효과를 조사하기 위해, 면역블로팅을 수행하였다. 야생형 SHP-2 코딩 영역을 함유하는 벡터는 pCMV-SHP-2 야생형 벡터 (Addgene, plasmid #8381)에서 수득하였다. 코딩 영역에 유전적 변이를 함유하는 돌연변이 벡터는 QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)를 사용하고, 하기 프라이머를 이용하여 제작하였다.

P559S 변이 제작용 프라이머: 5'-GTGGAGATCAGAGCTCTCTCCCGCCTTGT-3' (서열번호 14)

서열번호 14에서 진한 글씨는 P559S 변이를 위해 변경된 서열을 나타낸다. 모든 벡터의 콘스트럭트는 핵산 서열 분석을 통해 확인하였다.

야생형 SHP-2 또는 SHP-2 변이 함유 벡터를 HCT-116 세포에 형질감염시킨 후 48 시간에, 세포를 수득하고 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 마우스 항-SHP-2 항체(BD Biosciences) 또는 염소 항-β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 수행하고, 각 밴드의 강도는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 면역블로팅 이미지 및 분석 결과를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, SHP-2 발현은 P559S의 존재에서 약 20.7%까지 증가하였다(P = 0.765).

5. 조산아에서 수초화에 대한 프로모터 변이 g.-273G>A의 효과

조산아에서 수초화(myelination)에 대한 SHP-2 프로모터 변이의 효과를 확인하기 위해, 46명의 조산아를 변이군(n = 23) 및 대조군(n = 23)으로 나누었다. 변이군은 g.-273G>A에 대해 이형접합(heterozygous) 또는 동형접합(homozygous)인 개체로 이루어지고, 대조군은 변이군에 속하지 않는 조산아로 이루어진다.

확산 텐서 영상(Diffusion tensor imaging: DTI)은 18 내지 22개월의 연령에서 3-테슬라 MRI(Phillips)를 사용하여 수득하였다. DTI 수행 이전에, 3D MPRAGE 이미지와 고해상도 T1- 및 T2-강조 영상(weighted image)을 수득하였다. DTI 시퀀스 파라미터는 b = 0 및 800 s/mm² 및 TR/TE = 10,100/76 ms로 대용하였다.

SHP-2 프로모터 변이군(g.-273A)과 대조군(g.-273G) 간의 수초화 정도를 비교하기 위해, DTI 결과에 대해 트랙-기반 공간 통계(tract-based spatial statistics: TBSS) 분석을 수행하고, 그 결과를 도 5 및 표 3에 나타내었다. 도 5에서 평균 분획 이방성(fractional anisotropy: FA) 골격은 녹색으로 나타나고, 두 군 간에 유의한 차이가 있는 영역은 적황색으로 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 뇌들보(corpus callosum), 내포 뒷다리(posterior limb of internal capsule: PLIC), 및 시각 방사(optic radiation)에서 분획 이방성(fractional anisotropy) 값은 대조군 (g.-273G) 보다 변이군(g.-273A)에서 유의하게 더 낮았다(P < 0.05).

MNI 좌표			해부학적 위치
x	y	z	해부학적 위치
-42	-65	51	위 마루 소엽(Superior parietal lobule)
-40	-62	45	아래 마루 소엽(Inferior parietal lobule)
-38	-66	31	모이랑(Angular gyrus)
21	-37	31	내측 전두 이랑(Medial frontal gyrus)
20	-36	31	대상회(Cingulate gyrus)
-54	-52	27	모서리위 이랑(Supramarginal gyrus)
-32	-33	12	가로 측두 이랑(Transverse temporal gyrus)
-43	-21	9	뇌섬엽(Insula)
-49	-20	4	위 측두 이랑(Superior temporal gyrus)
-29	-63	-2	혀 이랑(Lingual gyrus)
36	-15	-5	전장(Claustrum)
-48	-11	-14	가운데 측두 이랑(Middle temporal gyrus)
19	-68	43	설전부(Precuneus)

MNI: 몬트리올 신경질환 연구소(Montreal neurological institute)

표 3에 나타난 바와 같이, 변이군의 미성숙 수초화는 두정부, 전두부, 및 측두부 주위에 퍼져있었다.

따라서, 변이군에서 뇌의 수초화가 적어 뇌가 미성숙하고, 뇌의 발달이 지연된 것을 확인하였다.

6. 조산아의 신경발달에 대한 프로모터 변이 g.-273G>A의 효과

조산아의 신경발달에 대한 SHP-2 프로모터의 변이의 효과를 조사하였다. 46명의 조산아에서 18 내지 22 개월의 연령에 운동, 인지, 언어 및 사회성 발달을 평가하여 베일리(Bayley) III 점수를 산출하였다. 신경발달을 나타내는 베일리 III 점수와 g.-273G>A 변이와의 관련성을 분석하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

신경발달 점수	변이군 (n = 23)	대조군 (n = 23)	P-값
평가 당시 보정된 연령 (개월)	19.1 ± 3.3	18.7 ± 2.3	0.653
운동 복합 점수	89.1 ± 16.1	100.4 ± 17.2	0.027
인지 복합 점수	92.4 ± 16.9	93.7 ± 13.6	0.767
언어 복합 점수	84.4 ± 14.5	90.8 ± 11.9	0.112
사회성 복합 점수	94.6 ± 16.4	96.5 ± 19.4	0.733

표 4에서 수치는 평균±표준 편차로 나타내었다.

표 4에 나타난 바와 같이, 변이군의 조산아는 대조군에 비해 현저하게 낮은 점수를 나타내었다. 특히, 운동 복합 점수(motor composite score)는 SHP-2 프로모터 변이를 갖는 조산아에서 현저하게 낮았다(P = 0.027).

모든 하위 점수를 위해, < 85 (정규화된 평균 미만 1 표준 편차) 및 < 70 (정규화된 평균 미만 2 표준 편차)의 컷오프 값을 이용하여 각각 경증 지연, 중등도 지연 및 중증 지연을 확인하였다. 지연 발달은 경증 내지 중등도 지연 및 중증 지연을 포함한다.

각 발달 하위 점수에서 발달이 지연된 비율을 표 5에 나타내었다.

발달 지연	변이군 (n = 23) n (%)	대조군 (n = 23) n (%)	P-값
운동 복합	9 (39.1)	1 (4.3)	0.004
인지 복합	6 (26.1)	2 (8.7)	0.120
언어 복합	12 (52.2)	6 (26.1)	0.070
사회성 복합	4 (17.4)	4 (17.4)	1.000

표 5에 나타난 바와 같이, 운동 발달 지연은 변이군에서 약 40%에 달하고, 대조군과 비교하여 유의하게 상이하였다(P = 0.004).

따라서, g.-273G>A 변이는 조산아의 신경발달 지연, 특히 운동 발달 지연에 대해 유의한 바이오마커임을 확인하였다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation EWHA WOMANS UNIVERSITY <120> Composition for predicting preterm birth of fetus or neurodevelopment of preterm infant, and method using the same <130> PN117386KR <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SHP-2, transcript variant 1, mRNA <400> 1 cggccgcggt ttccaggagg aagcaaggat gctttggaca ctgtgcgtgg cgcctccgcg 60 gagcccccgc gctgccattc ccggccgtcg ctcggtcctc cgctgacggg aagcaggaag 120 tggcggcggg cgtcgcgagc ggtgacatca cgggggcgac ggcggcgaag ggcgggggcg 180 gaggaggagc gagccgggcc ggggggcagc tgcacagtct ccgggatccc caggcctgga 240 ggggggtctg tgcgcggccg gctggctctg ccccgcgtcc ggtcccgagc gggcctccct 300 cgggccagcc cgatgtgacc gagcccagcg gagcctgagc aaggagcggg tccgtcgcgg 360 agccggaggg cgggaggaac atgacatcgc ggagatggtt tcacccaaat atcactggtg 420 tggaggcaga aaacctactg ttgacaagag gagttgatgg cagttttttg gcaaggccta 480 gtaaaagtaa ccctggagac ttcacacttt ccgttagaag aaatggagct gtcacccaca 540 tcaagattca gaacactggt gattactatg acctgtatgg aggggagaaa tttgccactt 600 tggctgagtt ggtccagtat tacatggaac atcacgggca attaaaagag aagaatggag 660 atgtcattga gcttaaatat cctctgaact gtgcagatcc tacctctgaa aggtggtttc 720 atggacatct ctctgggaaa gaagcagaga aattattaac tgaaaaagga aaacatggta 780 gttttcttgt acgagagagc cagagccacc ctggagattt tgttctttct gtgcgcactg 840 gtgatgacaa aggggagagc aatgacggca agtctaaagt gacccatgtt atgattcgct 900 gtcaggaact gaaatacgac gttggtggag gagaacggtt tgattctttg acagatcttg 960 tggaacatta taagaagaat cctatggtgg aaacattggg tacagtacta caactcaagc 1020 agccccttaa cacgactcgt ataaatgctg ctgaaataga aagcagagtt cgagaactaa 1080 gcaaattagc tgagaccaca gataaagtca aacaaggctt ttgggaagaa tttgagacac 1140 tacaacaaca ggagtgcaaa cttctctaca gccgaaaaga gggtcaaagg caagaaaaca 1200 aaaacaaaaa tagatataaa aacatcctgc cctttgatca taccagggtt gtcctacacg 1260 atggtgatcc caatgagcct gtttcagatt acatcaatgc aaatatcatc atgcctgaat 1320 ttgaaaccaa gtgcaacaat tcaaagccca aaaagagtta cattgccaca caaggctgcc 1380 tgcaaaacac ggtgaatgac ttttggcgga tggtgttcca agaaaactcc cgagtgattg 1440 tcatgacaac gaaagaagtg gagagaggaa agagtaaatg tgtcaaatac tggcctgatg 1500 agtatgctct aaaagaatat ggcgtcatgc gtgttaggaa cgtcaaagaa agcgccgctc 1560 atgactatac gctaagagaa cttaaacttt caaaggttgg acaagggaat acggagagaa 1620 cggtctggca ataccacttt cggacctggc cggaccacgg cgtgcccagc gaccctgggg 1680 gcgtgctgga cttcctggag gaggtgcacc ataagcagga gagcatcatg gatgcagggc 1740 cggtcgtggt gcactgcagt gctggaattg gccggacagg gacgttcatt gtgattgata 1800 ttcttattga catcatcaga gagaaaggtg ttgactgcga tattgacgtt cccaaaacca 1860 tccagatggt gcggtctcag aggtcaggga tggtccagac agaagcacag taccgattta 1920 tctatatggc ggtccagcat tatattgaaa cactacagcg caggattgaa gaagagcaga 1980 aaagcaagag gaaagggcac gaatatacaa atattaagta ttctctagcg gaccagacga 2040 gtggagatca gagccctctc ccgccttgta ctccaacgcc accctgtgca gaaatgagag 2100 aagacagtgc tagagtctat gaaaacgtgg gcctgatgca acagcagaaa agtttcagat 2160 gagaaaacct gccaaaactt cagcacagaa atagatgtgg actttcaccc tctccctaaa 2220 aagatcaaga acagacgcaa gaaagtttat gtgaagacag aatttggatt tggaaggctt 2280 gcaatgtggt tgactacctt ttgataagca aaatttgaaa ccatttaaag accactgtat 2340 tttaactcaa caatacctgc ttcccaatta ctcatttcct cagataagaa gaaatcatct 2400 ctacaatgta gacaacatta tattttatag aatttgtttg aaattgagga agcagttaaa 2460 ttgtgcgctg tattttgcag attatgggga ttcaaattct agtaataggc ttttttattt 2520 ttatttttat acccttaacc agtttaattt tttttttcct cattgttggg gatgatgaga 2580 agaaatgatt tgggaaaatt aagtaacaac gacctagaaa agtgagaaca atctcattta 2640 ccatcatgta tccagtagtg gataattcat tttgatggct tctatttttg gccaaatgag 2700 aattaagcca gtgcctgaga ctgtcagaag ttgacctttg cactggcatt aaagagtcat 2760 agaaaaagaa tcatggatat ttatgaatta aggtaagagg tgtggctttt ttttttttct 2820 tttttccagc cgttgaccaa ttatagttcg gctgttgact gagaagtttg tggtgggaaa 2880 acgtttgcca tattttcttt gcatttgaat aattgtcttg tacttagaaa aaaggcgtct 2940 atgaatgacc agtgtttttg gtcgccaaat gttgctgaca aacttatccc aaaactttag 3000 tggcttaaaa aaacctgccc ccaactgtta gtcaatctga gctgggctca gctgggctgt 3060 tcttctgcca gcctgcaggt ggccactcat gtggtcagca ggtcggcgga gagactggga 3120 tggctgggct tctctctctg cctgcagtcc tgagtctctc cttcttcgtg tagtctcttt 3180 cagtggcctg gctggcaggg tagctagacc tctcacatgc agctcagagc tcccaagagc 3240 tcaaaagcag aaatggccag gccttctgaa aacttaagtc cagaattgtc acagtgtccc 3300 ttctacttcc ctctattgat gatgatgatg atgatgatga tgatgatgat gatgatgatg 3360 atggtttttt ctaatcagaa gaaagctggg gtatgccctc tacttactaa acaagtcaca 3420 agcccagctc agattcaaga aaagggtgtg aagtagaggt gcagttaagt ggggggccac 3480 tagtctaaca gacggtcaca accagtgcca tggaaaacca aggatattag caaaagcaga 3540 agttgctagt gaccttggga agccgaagct gcttacagta gctgggacaa gctgaaagtc 3600 agactaagaa ataaagagag ggccttcaag aagcttcctg aatgatttct gctagccctg 3660 agcctatttt tggaaccagc acttggggaa actgatcttg tgaggatgga tgtgtttagg 3720 gacacagggc ttttgagagc agcaccaccc cactggggca tccccagact tgggaaacgt 3780 gactctttct taatgccact gggttttagt caggccacag tgagaaggaa cagccctaac 3840 aggcctccag ccaggttgaa tgagctcatt tttgttgtag ccaaccagta agatttgcta 3900 atgttctaca ttaagtgcct tctccaaaga catccctctt tgcctcatat gttgaatcat 3960 ccagtgcgga tatttcaatg aaaatatcat tggttgactt ttgtgatggt aataatgcta 4020 tggcatcttt gccatgaagt tgtggcctcc ttggattctt ctgactttgg cttctgaaag 4080 gaaggcctag atccagccct ggtggtagtt cctttctgag gtctctcagt cccttgagac 4140 tttggggtag tttggctgcc attctcactg acaaaatgta tatcagcccc cacctccacc 4200 ccccaatatt ccttgaactt tgaattgctt cagaacacag gtgtggcctg aaggtattcc 4260 cttattaggg aagtgtcact gctgtcttct agtcaaactt gtaaagaaaa agattccagt 4320 tcagtatttg cagcaagaag cttgaatgct gttcttttta tcgcattgtt acatcgactc 4380 attctccatt ttgctttggt tttgtcttga cttgacttga ctttgggggt aaagtctttc 4440 accagcacac aagagtttga ttgtacaaat atatcttctg cattaacatc tctgcctgtt 4500 gcttaagatc agttgctttt atactcagaa tggaaatacc tgatcttggc tagttttgtt 4560 ataagatatt gatttcattt agatttccct ccacgaggtc agcaaactat catgttctta 4620 tgtaaactta ggccaaggcc agagttatca tagtccctag gttgctacgg cttatcatgt 4680 gcttggtaaa aggtgatcgc aggttctcag acgagtttac tttacatgag atggaatcag 4740 gcagagaggc tgggatgatg gagaaagctc gaggtgaagt tttaaaaaaa aagttgtgga 4800 aaggaaagtt ccaaagaggt ggtttctgag gaagtcagag cgcccagggc cagagcagtc 4860 agtaatgggt gaatgaggtt gtttggaaag tcggtgtgac agacacatgg atgccatcta 4920 cttctaggtt gctggtgggt attaaatatg cacaatattc catagctcac tgaggatttt 4980 aaaattataa gcataggatt ttatattttg gggtgaaaga attatctggc acattaggta 5040 ttggagttta aaaaaaaagc caaatttcac agtcttaata acttttttta aaaaaaacta 5100 aaaggcgctt catgtccagt gtgtggccct tctgaaactt atggtcatct ctcccactga 5160 aaccaaggtc ttttcaaatg tggctaaatg gggatgagga gacacgggta ggactttctt 5220 ggtgtgtgtg cattctttaa agagccaagt tgcttcgggg aaacagccag gaaaatggtc 5280 aagattattt ttagaggtta ttttattggg gattttaaga actaataaca tcttgagtta 5340 tttttaattc agggggatgt ggaaaggttt gcaattgtca agtgttttgt tgtagcttag 5400 tatccataag ggaaacttag actatagaca taactacaaa gccagtgcag cttttgtttt 5460 ctgtatgttg ttgggggatc aactttcaca catagcaagc acatggcctc cctgatgtca 5520 ggatgccttt gttaggatct gtatttgccc ttaattttgt tgaaatcttt tttccttctt 5580 cctcttgaaa agttccaaaa tatagtttat tgtatctttc atcactaaaa atttgttcct 5640 ttttcactat gggcagttca cacaaggcaa aaactattga acagttggtt ttagtgtgtt 5700 gtataacttt gctgtatatc aaactaattt tgacaagttt tcatcctaag cctcaaatca 5760 tgtaattaat aatttgcctg tttatttatg acctaattgt gattctttta ttaataaaag 5820 ctaatgggaa aaggatccct gattaagctg atgactagac ctacaattaa ttttcctgca 5880 gtatatgaag tattgtacca gagtattaaa agatatgtaa tattttattg ataaatctat 5940 cctttaaaag gaatacgttt taggatgtca tcattttgat gtgaatcatg taaatgttga 6000 taatatgctg tttattatac atttagtgtt tcaagagatt cacttaattg cctttttgcc 6060 cacgtatatt atgtagtcta tttgcaactg ttcttaaaaa aatgacatta aaagaatagt 6120 ttatgtagag aaacattagt ggatgttaat tgtctcccca cctatattta tgggtgttag 6180 cgcaactgct ttgctagttg caaagctgta ttatcagagt aaaagtgtat ttgtaaactg 6240 tatgggaact aaaaattagg aataaaacca ttttcttata tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6300 6300 <210> 2 <211> 593 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SHP-2 polypeptide <400> 2 Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala 1 5 10 15 Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn 35 40 45 Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr 65 70 75 80 Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile 85 90 95 Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp 100 105 110 Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu 115 120 125 Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro 130 135 140 Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser 145 150 155 160 Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu 165 170 175 Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp 180 185 190 Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly Thr 195 200 205 Val Leu Gln Leu Lys Gln Pro Leu Asn Thr Thr Arg Ile Asn Ala Ala 210 215 220 Glu Ile Glu Ser Arg Val Arg Glu Leu Ser Lys Leu Ala Glu Thr Thr 225 230 235 240 Asp Lys Val Lys Gln Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Thr Leu Gln Gln 245 250 255 Gln Glu Cys Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Lys Glu Gly Gln Arg Gln Glu 260 265 270 Asn Lys Asn Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Thr 275 280 285 Arg Val Val Leu His Asp Gly Asp Pro Asn Glu Pro Val Ser Asp Tyr 290 295 300 Ile Asn Ala Asn Ile Ile Met Pro Glu Phe Glu Thr Lys Cys Asn Asn 305 310 315 320 Ser Lys Pro Lys Lys Ser Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Cys Leu Gln Asn 325 330 335 Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Val Phe Gln Glu Asn Ser Arg Val 340 345 350 Ile Val Met Thr Thr Lys Glu Val Glu Arg Gly Lys Ser Lys Cys Val 355 360 365 Lys Tyr Trp Pro Asp Glu Tyr Ala Leu Lys Glu Tyr Gly Val Met Arg 370 375 380 Val Arg Asn Val Lys Glu Ser Ala Ala His Asp Tyr Thr Leu Arg Glu 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ser Lys Val Gly Gln Gly Asn Thr Glu Arg Thr Val Trp 405 410 415 Gln Tyr His Phe Arg Thr Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Asp Pro 420 425 430 Gly Gly Val Leu Asp Phe Leu Glu Glu Val His His Lys Gln Glu Ser 435 440 445 Ile Met Asp Ala Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Thr Phe Ile Val Ile Asp Ile Leu Ile Asp Ile Ile Arg 465 470 475 480 Glu Lys Gly Val Asp Cys Asp Ile Asp Val Pro Lys Thr Ile Gln Met 485 490 495 Val Arg Ser Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Arg 500 505 510 Phe Ile Tyr Met Ala Val Gln His Tyr Ile Glu Thr Leu Gln Arg Arg 515 520 525 Ile Glu Glu Glu Gln Lys Ser Lys Arg Lys Gly His Glu Tyr Thr Asn 530 535 540 Ile Lys Tyr Ser Leu Ala Asp Gln Thr Ser Gly Asp Gln Ser Pro Leu 545 550 555 560 Pro Pro Cys Thr Pro Thr Pro Pro Cys Ala Glu Met Arg Glu Asp Ser 565 570 575 Ala Arg Val Tyr Glu Asn Val Gly Leu Met Gln Gln Gln Lys Ser Phe 580 585 590 Arg <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SHP-2 promoter cloning <400> 3 atgcctcgag gaagcaagga tgctttggac 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SHP-2 promoter cloning <400> 4 aatgctagcc ttccggacgg ggctaac 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for SHP-2 g.-317C>T mutagenesis PCR <400> 5 cctccgcgga gtccccgcgc tgc 23 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for SHP-2 g.-273G>A mutagenesis PCR <400> 6 ggtcctccgc tgacaggaag caggaagtg 29 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild-type (g.-317C) oligonucleotide for EMSA <400> 7 gcctccgcgg agcccccgcg ctgcc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant (g.-317T) oligonucleotide for EMSA <400> 8 gcctccgcgg agtccccgcg ctgcc 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus NF-kappa B oligonucleotides for EMSA <400> 9 agttgagggg actttcccag gc 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild-type (g.-273G) oligonucleotide for EMSA <400> 10 tcctccgctg acgggaagca ggaag 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant (g.-273A) oligonucleotide for EMSA <400> 11 tcctccgctg acaggaagca ggaag 25 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus GABP alpha oligonucleotides for EMSA <400> 12 agaggattgt gggaccggaa gcggaagaga agc 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant consensus GABP alpha oligonucleotides for EMSA <400> 13 agaggattgt gggactacaa gtacaagaga agc 33 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for SHP-2 P559S mutagenesis PCR <400> 14 gtggagatca gagctctctc ccgccttgt 29

Claims

서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 태아의 조산 가능성을 예측하기 위한 조성물로서, 상기 다형성 부위에서 유전자형은 G/A 또는 A/A인 것인 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브인 것인 조성물.
서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성 부위를 포함하는 3개 내지 100개의 연속 핵산 서열과 동일하거나 또는 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조산아의 신경발달을 예측하기 위한 조성물로서,
상기 다형성 부위에서 유전자형은 G/A 또는 A/A인 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 신경발달은 운동기능 발달, 인지기능 발달, 언어기능 발달, 사회성 발달, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 신경발달은 조산아 뇌의 수초화(myelination) 수준인 것인 조성물.
개체의 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; 및
수득된 시료로부터 SHP-2의 변이를 검출하는 단계로서,
상기 SHP-2의 변이는 서열번호 1의 핵산 서열로 이루어진 SHP-2 유전자의 전사 개시점으로부터 5' 방향으로 273번째 뉴클레오티드의 다형성에서 유전자형이 G/A 또는 A/A인 것인 단계를 포함하는,
태아의 조산 가능성 또는 조산아의 신경발달의 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 SHP-2 변이를 검출하는 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
삭제
삭제