KR20050085855A - 성장 호르몬 수용체에 작용하는 약제에 대한 치료 반응의예측 방법 - Google Patents

성장 호르몬 수용체에 작용하는 약제에 대한 치료 반응의예측 방법 Download PDF

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Abstract

환자에서 성장 호르몬 수용체 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 이 때 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 것을 포함하여 이루어지는, (GHR) 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법.

Description

성장 호르몬 수용체에 작용하는 약제에 대한 치료 반응의 예측 방법{METHODS FOR PREDICTING THERAPEUTIC RESPONSE TO AGENTS ACTING ON THE GROWTH HORMONE RECEPTOR}
본 발명은 성장 호르몬 수용체에 작용하는 약제에 대한 환자의 치료 반응 강도를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 측면은 단신인 인간 환자의 신장 증가 방법과, 비만 및 말단 비대증의 치료 방법을 포함한다.
심각하게 단신인 대부분의 아동들은 유발성 자극에 대한 성장 호르몬 (GH) 반응에 의하여 통상적으로 정의되는 성장 호르몬 결핍증 (GHD)을 갖지 않는다. 일단 단신의 공지된 원인을 배제시키면, 이들 환자는, 가족성 단신, 체질성 성장 지연, "특발성(idiopathic)" 단신 (ISS) 등의 다양한 증상으로 분류된다. 정상 신장의 부모에 비하여 작게 태어난 아동의 경우를 "자궁내 성장 지연(intra uterine growth retardation)" (IUGR)이라 부른다. 자신들의 태령에 비하여 작게 태어난 아동들을 "부당 경량아(small for gestational age)" (SGA)라 부른다. 대규모의 장기간적인 연구 결과가 보고되어 있지는 않지만, 이들 아동 중 일부, 아마도 상당수가 유전적 잠재적 신장에 도달할 수 없을 것이다. 정상적 성장 및 발달에 영향을 미치는 인자가 매우 많이 있기 때문에, 정의된 바와 같은 ISS, IUGR, SGA 증상을 갖는 환자들은 이들의 단신의 병인과 관련하여 이질적인 것으로 보인다. GH 결핍증으로 분류되지 않더라도, ISS 증상을 갖는 대부분의 아동들은, 완전히 동등한 정도로 충분하지는 않더라도, GH를 사용하는 치료에 반응한다.
많은 연구자들이 이러한 부류의 환자에 있어서의 자발적 GH 분비의 장애를 연구하여 왔다. 하나의 가설은, 이들 환자 중 일부는, 생리적 조건 하에서는 내부 GH가 부족하게 분비되지만, 통상적인 GH 자극 테스트에서와 같이, 약물 자극에 반응하여서는 GH의 증가를 나타낼 수 있다고 제안한다. 이러한 장애는 "GH 신경 분비 이상"이라 불리우고, 그 진단은 지속 혈청 샘플링 상에서의 비정상적 순환 GH 패턴의 입증에 기초한다. 많은 연구자들이 이러한 연구 결과를 보고하고 있으며, 이러한 비정상이 단지 가끔 나타난다는 것을 발견하였다. 다른 연구자들은 이들 환자들이 "생물학적 불활성 GH"를 갖는다고 주장하고 있지만, 아직 결정적으로 입증되지는 않았다.
GH 수용체 (GHR)의 클로닝시, 혈액 내에서의 주요 GH 결합 활성이 GHR과 동일한 유전자로부터 유래하고 전장 GHR의 세포외 도메인에 해당하는 단백질에서 기인하는 것으로 나타났다. 성장 호르몬 불감성 [또는 라론(Laron)] 증후군 (GHIS)을 갖는 거의 모든 환자들에서 성장 호르몬 수용체 결합 활성이 결여되어 있고, 혈액 내에서의 GH 결합 단백질 (GHBP)의 활성이 없어나 매우 낮다. 이러한 환자들은 약 -5 내지 -6의 평균 신장 표준 편차 스코어(SDS)를 갖고, GH 치료에 대하여 내성이 있으며, 증가된 혈청 GH 농도 및 낮은 혈청 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-I) 농도를 갖는다. 이들은 IGF-I를 사용하는 치료에 반응한다. GHR의 세포외 도메인에 결함을 갖는 환자에 있어서, 순환에서의 기능적 GHBP의 부족은 GH 불감성에 대한 표지로서 작용할 수 있다.
외인 GH로 치료받은 ISS 환자들은 치료에 대하여 상이한 정도의 반응을 나타내었다. 특히, 많은 아동들이 GH 치료에 대하여 어느정도 반응하지만, 완전하게 반응하지는 않는다. 이들 환자들은 완전하게 반응하는 아동들의 단지 약 절반 수준의 성장률의 증가는 갖는다. 따라서, 이들 아동들의 치료 과정 후의 증가된 총 신장은, 치료 기간에 따라서, 완전하게 반응하는 아동들의 신장과 비교하여 감소한다. 완전하게 반응하지 않는 환자의 치료를 개선시키는 한 가지 방법은 GH 투여량을 증가시켜 성장률과 총 신장이 어느정도 향상되는 결과를 얻는 것이다. 그러나, GH 투여량의 증가는 잠재적인 부작용 때문에 모든 환자에게 있어서 바람직하지 못하다. GH 투여량의 증가는 또한 비용의 증가를 수반한다. 불행하게도, 오랜 치료 및 관찰 기간 전에, 반응성이 적은 것으로 보이는 환자를 동정하는 방법이 현재로서는 없다.
따라서, 이 기술 분야에 있어서, GH를 사용하는 치료에 대하여 감소된 반응률을 나타내는 환자의 아집단을 동정하는데 사용될 수 있는 방법이 요구된다. 또한, 외인성 GH에 대하여 감소된 반응성을 보이는 환자의 치료를 위한 개선된 약물의 개발을 가능하게 하는 방법이 요구된다. 또한, 이 기술 분야에 있어서, GH에 대하여 증가된 반응률을 나타내는 환자의 아집단을 동정하는데 사용될 수 있는 방법 및 GH에 대하여 증가된 반응성을 보이는 환자를 치료하기 위한 개선된 약물의 개발을 가능하게 하는 방법이 요구된다.
이러한 환자들에는, 예컨대, 단신인 개체, 또는 비만, 감염 또는 당뇨; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용와 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증 증상; 나트륨 및 수분 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압을 앓고 있는 개체 등이 있다.
발명의 요약
본 발명은, 엑손 3 결실을 갖는 성장 호르몬 수용체 (GHR) 대립 유전자 (GHRd3)를 갖는 인간 환자가, GHRd3 대립 유전자를 갖지 않는 환자와 비교하여, GHR 경로를 통하여 작용하는 약제를 사용하는 치료에 대하여 보다 큰 양성 반응을 나타낸다는 발견에 기초한 것이다. 특히, GHRd3 대립 유전자를 갖는 환자는 재조합 성장 호르몬 (GH)를 사용하는 치료에 대하여, 상기 GHRd3 대립 유전자를 갖지 않는 환자와 비교하여, 큰 양성 반응을 나타내었다. 재조합 GH를 사용하는 치료 과정을 거쳐서, ISS, IUGR 또는 SGA 증상을 갖고 GHRd3를 갖는 환자들은, GHRfl 대립 유전자에 대하여 동종 접합성인 ISS 환자와 비교하여, 성장률에 있어서 약 2 배의 증가를 나타내었다. 이들의 총 신장 변화는 이러한 효과에 비례하여 증가한다.
GH 활성은, 상기한 바와 같이, GH 수용체 (GHR)에 의하여 매개된다. GHR 두 분자가 GH 한 분자와 상호 작용하는 것으로 나타났다 [Cunningham 등,(1991) Science 254: 821-825; de Vos 등, (1992) Science 255: 306-312; Sundstrom 등, (1996) J. Biol. Chem. 271: 32197-32203; 및 Clackson 등, (1998) J. Mol. Biol. 277: 1111-1128]. 결합은 두 개의 수용체의 세포외 도메인 상의 공통된 결합 주머니와 GH 상의 두 개의 고유한 GHR 결합 부위에서 일어난다. GH 분자 상의 부위 1은 부위 2 보다 높은 친화도를 가지며, 수용체 이합체화는 하나의 수용체가 GH 상의 부위 1에 결합한 후 이어서 두 번째 수용체가 부위 2에 결합하여 일어나는 것으로 생각된다. Cunningham 등 (1991, 상기한 바와 같음)은 수용체 이합체화는 신호 활성화를 이끄는 중요한 단계이며 이합체화는 GH 결합에 의하여 유도된다고 제안하였다 [Ross 등, J. Clin. Endocrinol. & Metabolism (2001) 86 (4): 1716-171723]. 리간드의 결합시, GHRs는 신속하게 내재화되며 (Maamra 등, (1999) J. Biol. Chem 274: 14791-14798; 및 Harding 등, (1996) J. Biol. Chem. 271: 6708-6712), 그 중 일부는 세포 표면으로 재순환된다 (Roupas 등, (1987) Endocrinol. 121: 15211530).
보다 최근에, GHRd3이라고 불리는 GHR 이소형이 엑손 3의 결실을 갖는다는 것이 발견되었다 (Urbanek M 등, Mol Endocrinol 1992 Feb; 6 (2): 279-87; Godowski et al (1989) PNAS USA 86: 8083-8087). 이러한 결실은, 전장 GHRf1 이소형 또는 엑손 3 결실 GHRd3 이소형에 해당하는, 엑손 3의 체류 또는 배제를 일으키는 교대 스플라이싱(alternative splicing)의 결과인 것으로 생각된다. GHRd3 이소형의 동정에 의하여 몇 가지 모순된 결과를 얻었다. 몇 몇 연구는 GHRd3 이소형이 조직 특이적 스플라이싱을 거치고, 발현 패턴은 발생적으로 조절된다고 보고하였고, 다른 연구들은 GHRd3 이소형이 개인에 따라 특이적이라고 보고하였다. 또 다른 연구는 스플라이싱이 멘델의 특질로서 전달되고 스플라이싱을 변경시키는 유전학적 다형성에서 기인한다고 제안하였다 [Stallings-Mann 등, (1996) P. N. A. S U. S. A. 94: 12394-12399]. 마침내, Pantel 등 [(2000), J. Biol. Chem.275 (25): 18664-18669), GHR 위치의 분석 중에, 인간에 있어서 GHRd3 이소형은 엑손 3에 걸쳐 2.7 kb 게놈 결실을 갖는 GHR 대립 유전자의 전사된 형태임을 입증하였다. Pantel은 또한 GHRfl만을 발현하는 개체로부터 얻은 게놈 DNA 샘플에서는 인접한 두 개의 역작용 요소(retrorlement)를 확인한 반면, GHRd3을 발현하는 개체의 DNA에서는 단지 하나의 역작용 요소만을 확인하였으며, 이는 엑손 3 결실이 동일한 GHRfl 대립 유전자 상에 위치하는 두 개의 역작용 요소 사이에서의 상동 재조합의 결과임을 나타내는 것이다.
hGHRd3 단백질은 수용체의 세포외 도메인 내의 22 아미노산이 결실되었다는 점에서 전장 hGHR (GHRfl)과 차이를 갖는다. GHRd3 이소형은 안정하고 기능적인 GHR 단백질을 코딩한다 [Urbanek 등, (1993) J. Biol. Chem. 268 (25): 19025-19032]. Urbanek 등 (1993)은 GHRd3 이소형이 세포막 내로 안정적으로 통합되고, hGHR과 같이 효율적으로 리간드에 결합하고 내재화시키며, GHRfl 이소형과 기능적 차이점이 확인되지 않았다고 보고하였다.
본 발명은 외인성 GH에 대한 양성 반응에 있어서의 차이점에 영향을 미치는 중요한 인자로서의 GHR 대립 유전자와 이소형의 동정과 관련된 것이다. 따라서, 본 발명은 GHR 경로를 통하여 작용하는 화합물, 또는 바람직하게는, GH 조성물과 같은 GHR에 결합하는 화합물을 사용하는 치료에 대한 양성 반응 정도를 예측하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 환자들을 연역적으로, 예컨대, 고반응군 또는 저반응군으로 분류할 수 있게 한다. 특정 환자에 적합화된 치료를 가능하게 함으로써, (예컨대, 적절한 분량의 GH 조성물의 사용 또는 환자들이 감소된 GHR 반응을 보이지 않는 화합물의 사용에 의하여), 경제적 이익 및/또는 감소된 부작용의 결과를 얻는다.
본 발명은 또한 GHRd3 및 GHRfl 대립 유전자에 대하여 이형 접합성(heterozygous)인 환자는, GHRfl 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 환자와 비교하여, GH를 사용하는 치료에 반응하는 성장 속도와 신장 변화가 크다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명은 GHRfl 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 개체에서의 GHR 반응 또는 GHR 활성의 감소를 검출 및 진단하는 방법을 제공한다. GHR 활성의 감소는 예컨대, 감소된 GHR 농도, 발현 또는 단백질 활성의 결과일 수 있다. 또한, 본 발명은 GHRd3 대립 유전자에 대하여 동형 접합성 또는 이형 접합성인 개체에서의 GHR 반응 또는 GHR 활성의 증가를 검출 및 진단하는 방법을 제공한다. GHR 활성의 증가 또는 감소의 검출은 GHR 경로를 통하여 작용하는 치료제를 사용하여 치료 가능한 다양한 장애의 치료에 유용할 것으로 예측된다. 그 예로서 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS, IUGR 또는 SGA), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압의 치료 등이 있다. 바람직한 예로서, GHR 작용제 또는 길항제로서 작용하는 재조합 GH 조성물과 같은 GHR 단백질과 결합하는 약제 등이 있다.
따라서, 본 발명은 GHR 매개 활성의 측정 또는 예측 방법을 제공하며, 이들 방법에는 치료에 대한 GHR 반응을 예측하는 방법, 및 감소된 GHR 활성과 관련된 증상을 진단하거나 이러한 위험이 있는 환자를 동정하는 방법등이 포함된다. 바람직하게는, 본 발명은 GHR 폴리펩타이드와 상호 작용 (예컨대, GHR 폴리펩타이드에 결합)할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법에 대하여 기재하고 있으며, 상기 방법은 환자에서 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 이 때 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS, IUGR 또는 SGA), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증, 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상의 치료를 위한 약제에 대한 환자의 반응을 예측하고, 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에 있어서, 본 발명은 환자의 신장을 증가시키기 위한 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자에서 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 엑손 3에서 하나 이상의 핵산이 결실, 삽입 또는 치환된, 또는 가장 바람직하게는, 실질적으로 전체 엑손 3이 결실된, GHR 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상에 대한 증가 또는 감소된 치료 가능성을 갖는 환자를 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) GHR 유전자의 대립 유전자의 존재를 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응과 상호 관련시키고, b) 환자에서 단계 a)의 대립 유전자를 검출하여, 상기 약제를 사용하는 치료에 대한 반응 가능성이 증가 또는 감소된 환자를 동정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상의 치료 가능성의 증가 또는 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 동정하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재를 측정하고, b) 단계 a)의 대립 유전자의 존재를 GHR 단백질과 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상의 치료 가능성의 증가 또는 감소와 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대한 증가 또는 감소된 반응 가능성과 관련된 대립 유전자를 동정하는 것을 포함한다.
상기 질환 또는 증상은 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS, IUGR 또는 SGA), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것을 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상일 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 방법은 GHR 유전자의 엑손 3에서의 환자의 유전자형을 측정하는 것을 포함하며, 이 때, 엑손 3의 존재는 상기 환자가 GHR 반응의 감소와 관련된 증상을 앓고 있거나 이러한 증상에 대하여 증가된 위험성을 갖는다는 것을 나타내며, 또는 엑손 3에서의 결실은 상기 환자가 GHR 반응의 감소와 관련된 증상에 대하여 감소된 위험성을 갖는다는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법은 치료 방법에 있어서 특히 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자형은 상기 치료법의 치료적 이점 또는 효능을 보여주는 것이다. 일례에 있어서, 본 발명의 방법은 환자에게 투여될 약물의 양을 결정하기 위하여 사용된다. 또 다른 예에 있어서, 본 방법은 임상 시험에 있어서의 환자의 치료 반응을 평가하거나, 임상 시험에 포함시킬 환자를 선별하기 위하여 사용된다. 예컨대, 본 발명의 방법은 GHR 유전자의 엑손 3에서의 환자의 유전자형을 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 상기 유전자형에 의하여 상기 환자가 임상 시험의 소집단 또는 임상 시험에 포함되기 위한 소집단에 분류된다.
본 발명은 또한 환자의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 이 때, 상기 대립 유전자를 GHR 경로를 통하여 작용하거나 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고, (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선별 또는 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법 중 어느 하나에 있어서, GHR 경로를 통하여 작용하거나 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상의 치료에 유효한 약제인 것이 바람직하다: 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS, IUGR 또는 SGA), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압.
특히, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 환자의 치료 방법을 제공한다:
(a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하는 단계로서, 이 때, 상기 대립 유전자를 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상을 치료할 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고: 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS, IUGR 또는 SGA), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압,
(b) 상기 환자에게 투요될 상기 약제의 유효량을 선별 또는 결정하는 단계.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 환자의 성장을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 상기 대립 유전자를 환자의 성장을 증가시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성고 상호 관련시키고, (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선별 또는 결정하는 단계를 포함한다.
바람직한 측면에 있어서, 본 발명은 인간 환자의 성장률을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 환자가 해당 연령 및 성별대의 정상 신장보다 작고, 그 표준 편차가 1 이상인지, 보다 바람직하게는 표준 편차가 2 이상인지 여부를 측정하고, (b) 환자의 DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는지 여부를 측정하고, (c) 환자의 성장률을 증가시키는 유효량의 GH를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 환자는 라론 증후군(Laron's syndrome)을 앓는 환자가 아닌 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기의 인간 환자 치료 방법은 환자에게 GHRfl 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인 환잔에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하며, 상기 유효량은 DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하고 다른 점에서는 동일한 환자에게 투여되는 유효량보다 많은 양이다.
바람직한 측면에 있어서, 상기 약제는 GH 분자이다. 환자에게 투여될 GH의 유효량은 약 0.001 mg/kglday 내지 약 0.2 mg/kg/day인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는, GH의 유효량은 약 0.01 mglkg/day 내지 약 0.1mg/kg/day이다.
다른 측면에 있어서, 환자에게 투여될 GH의 유효랑은 약 0.2 mg/kg/week 이상이다. 또 다른 측면에 있어서, GH의 유효량은 약 0.25 mg/kg/week 이상이다. 또 다른 측면에 있어서, GH의 유효량은 약 0.3mg/kg/week 이상이다. 바람직하게는, GH를 하루에 한번 투여한다. GH를 피하 주사로 주입하는 것이 바람직하다. 성장 호르몬을 pH 약 7.4 내지 7.8에서 제제화하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 다음의 단계를 포함하는 약물을 사용하는 방법과 관련된 것이다: 환자로부터 DNA 샘플을 얻고, 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 증가와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함하는지 여부 및/또는 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함포함하는지 여부를 측정하고, 상기 DNA 샘플이 약물에 대한 양성 반응의 증가와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함하는 경우 및/또는 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 결여하고 있는 경우 상기 환자에게 상기 약물의 유효량을 투여하는 단계.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 외인성 GH에 대한 반응 감소를 앓고 있는 환자의 치료를 포함한다. 이러한 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물의 사용 방법을 제공한다: 환자로부터 DNA 샘플을 얻고, 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 증가와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함하는지 여부 및/또는 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함하는지 여부를 측정하고, 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함하고 있는 경우 및/또는 상기 DNA 샘플이 상기 약물에 대한 양성 반응의 증가와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 결여하고 있는 경우, 상기 환자에게 상기 약물의 유효량을 투여하는 단계.
전술한 바와 같이, 상기 방법은 엑손 3 내의 하나 이상의 핵산이 결실, 삽입 또는 치환되거나, 가장 바람직하게는 실질적으로 전체 엑손 3이 결실되어 있는 GHR 대립 유전자의 환자 내 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함한다. 상기 약물에 대한 양성 반응의 증가와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자는 엑손 3이 결여된 GHR 대립 유전자이고, 바람직하게는 GHRd3 대립 유전자이다. 상기 약물에 대한 양성 반응의 감소와 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자는 엑손 3을 포함하는 GHR 대립 유전자 (GHRfl)인 것이 바람직하다 (환자가 상기 대리 유전자에 대하여 동형 접합성인 경우).
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물의 임상적 검사 방법에 관한 것다:
- 개체군에 약물을 투여하고.
- 상기 개체군으로부터, DNA가 GHRd3 폴리펩타이드 이소형을 코딩하는 개체들의 제1 부분 개체군 및 DNA가 GHRd3 폴리펩타이드 이소형을 코딩하지 않는 개체들의 제2 부분 개체군을 동정하는 단계.
상기 방법은 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다: (a) 상기 제1 부분 개체군에서의 상기 약물에 대한 반응의 평가; 및/또는 (b) 상기 제2 부분 개체군에서의 상기 약물에 대한 반응의 평가. 상기 약물에 대한 반응을 상기 제1 부분 개체군과 상기 제2 부분 개체군 모두에서 평가하는 것이 바람직하다. 상기 반응은 상기 제1 부분 개체군과 제2 부분 개체군에서 개별적으로 평가하는 것이 바람직하가다. 상기 약물에 대한 반응의 평가는 환자의 신장 변화를 측정하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 약물의 임상적 검사 방법에 관한 것이다:
- DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 개체의 제1 개체군과 DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하지 않는 개체의 제2 개체군을 동정하고,
- 상기 제1 개체군 및/또는 상기 제2 개체군의 개체에 약물을 투여하는 단계. 한 구체예에 있어서, 상기 약물을 상기 제1 개체군의 개체에는 투여하고, 상기 제2 개체군의 개체에게는 투여하지 않는다. 한 구체예에 있어서, 상기 약물을 제2 개체군의 개체에게는 투여하고, 상기 제1 개체군의 개체에게는 투여하지 않는다. 다른 구체예에 있어서, 상기 약물을 상기 제1 개체군과 상기 제2 개체군 모두의 개체에게 투여한다.
전술한 방법에 있어서, 약물은 다음의 증상을 치료하기 위한 약물인 것이 바람직하다: 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압.
본 발명의 바람직한 측면은 약물의 임상적 검사 방법과 관련된 것으로, 상기 약물은 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있는 약물인 것이 바람직하다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
- 약물, 바람직하게는, 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있는 약물을 개체군에 투여하고,
- 상기 개체군으로부터, DNA가 GHRd3 폴리펩타이드 이소형을 코딩하는 개체의 제1 부분 개체군 및 DNA가 GHRd3 폴리펩타이드 이소형을 코딩하지 않는 개체의 제2 부분 개체군을 동정하는 단계.
다른 바람직한 측면은 약물의 임상적 검사 방법과 관련된 것으로, 상기 약물은 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있거나, ISS, IUGR 또는 SGA를 개선시킬 수 있는 약물인 것이 바람직하다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
- DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 개체의 제1 개체군과, DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하지 않는 개체의 제2 개체군을 동정하고,
- 약물, 바람직하게는 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있거나 ISS, IUGR 또는 SGA를 개선시킬 수 있는 약물을 상기 제1 개체군 및/또는 상기 제2 개체군의 개체에 투여하는 단계. 한 구체예에 있어서, 약물을 상기 제1 개체군의 개체에게는 투여하고, 상기 제2 개체군의 개체에게는 투여하지 않는다. 한 구체예에 있어서, 약물을 제2 개체군의 개체에게 투여하고, 제1 개체군의 개체에게는 투여하지 않는다. 다른 구체예에 있어서, 약물을 제1 개체군과 제2 개체군 모두에게 투여한다.
인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있거나 또는 ISS, IUGR 또는 SGA를 개선시킬 수 있는 약물에 대한 반응의 평가는 개체의 신장의 변화를 평가하는 것을 포함한다. 인간 환자의 성장률을 증가시키는 것은 상기 환자가 적어도 GH를 사용하여 치료 받은 GH 결핍 환자 (즉, GHD를 사용하여 진단된 환자)와 동일한 최종 신장에 도달하는 상황을 포함할 뿐 아니라, 환자가 GH를 사용하여 치료 받은 GH 결핍 환자와 동일한 성장률로 신장 면에서 도달하거나, 목적 신장 범위 내의 성인 신장, 즉, 중간 부모 목적 신장에 의하여 결정된 바와 같은 유전적 잠재성에 부합하는 최종 신장에 도달하는 상황을 의미한다.
본 발명의 방법 중 어느 한 측면에 있어서, 환자의 DNA가 특정 GHR 폴리펩타이드 이소형을 코딩하는지 여부를 측정하는 단계는 GHR 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 사용하여 수행할 수 있다. 다른 측면에 있어서, 환자의 DNA가 GHR 폴리펩타이드 이소형을 코딩하는지 여부를 측정하는 단계를 GHR 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 사용하여 수행한다. 본 발명의 방법은 개체의 DNA가 GHRd3 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 이는 개체의 게놈 DNA가 GHRd3 대립 유전자를 포함하는지 여부, 개체로부터 얻어진 mRNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는지 여부, 또는 환자가 GHRd3 폴리펩타이드를 발현하는지 여부를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 구체예 중 어느 하나에 있어서, 개체의 DNA가 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는지 여부의 결정은 다음의 단계를 포함한다:
a) 생물학적 샘플을 준비하고,
b) 상기 생물학적 시료를 ii) 엄격한 조건 하에서 GHR 핵산, 바람직하게는 GHRd3 핵산과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 iii) GHR 폴리펩타이드, 바람직하게는 GHRd3 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 검출 가능한 폴리펩타이드와 접촉시키고,
c) 상기 폴리뉴클레오타이드와 상기 샘플 내의 RNA 종류 간의 혼성화의 존부 또는 상기 검출 가능한 폴리펩타이드의 상기 샘플 내의 폴리펩타이드와의 결합의 존부를 측정하는 단계.
생물학적 샘플을 엄격한 조건 하에서 GHRd3 핵산과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 GHRd3 폴리펩타이드와 선택적으로 결합하는 검출 가능한 폴리펩타이드와 접촉시키는 것이 바람직하며, 이 때, 상기 혼성화 또는 상기 결합의 검출은 상기 GHRd3이 상기 샘플 내에서 발현되었음을 나타내는 것이다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 프라미머이고, 상기 혼성화는 상기 프라이머 서열을 포함하는 증폭 산물의 존재를 검출함으로써 검출하는 것이 바람직하다. 상기 검출 가능한 폴리펩타이드는 항체인 것이 바람직하다. GHRd3와 GHRfl 폴리펩타이드 또는 핵산의 검출은 모든 적절한 방법에 의하여 수행할 수 있다. 예컨대, GHRd3 또는 GHRfl의 세포외 도메인의 혈청 농도를 평가할 수 있다 (예컨대, 고친화성 GH 결합 단백질을 평가할 수 있다). GHRd3 게놈 또는 cDNA 서열과 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머 및 상기 프라이머와 프로브를 사용하는 DNA 증폭 및 검출 방법 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 GHRd3 폴리펩타이드의 후보 조절자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, 예컨대, GHRd3 대립 유전자에 대하여 동형 접합성 또는 이형 접합성인 개체에서 효과적인 GHR 작용제 또는 억제제의 동정 방법으로서 구체화될 수 있다. 상기 방법은, 예컨대, GENOTROPINTM, PROTROPINTM, NUTROPINTM, SOMAVERTTM (pegvisomant) 등과 같이 공지된 GH 조성물로부터 화합물을 동정하여, 치료에 가장 효과적인 화합물을 동정하는데 사용할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있고, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압을 개선시킬 수 있는 약물을 동정하는데 유용할 수 있다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 GHRd3 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
a) GHRd3 폴리펩타이드를 준비하고,
b) 상기 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고,
b) 상기 화합물이 상기 GHRd3 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
이 때, 상기 화합물이 상기 폴리펩타이드와 선택적으로 결합하는 것이 검출되면, 상기 화합물이 상기 GHRd3 폴리펩타이드의 후보 조절자임을 나타내는 것이다. 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 이의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHRd3 폴리펩타이드의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 GHRd3 폴리펩타이드는 막 내로 통합된다.
본 발명은 또한 GHRd3 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a) GHRd3 폴리펩타이드를 준비하고,
b) 상기 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고
c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
이 때, 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는 것이 검출되면, 상기 화합물이 GHRd3 폴리펩타이드 활성의 후보 조절자임을 나타내는 것이다. 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 그의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHRd3 폴리펩타이드의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 상기 시험 화합물이 GHR 활성을 촉진하는 것으로 검축되면, 상기 시험 화합물은 후보 작용제이다. 상기 시험 화합물이 GHR 활성을 억제하면, 상기 시험 화합물은 후보 억제제이다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 GHRd3 폴리펩타이드는 막 내로 통합된다.
본 발명은 또한 GHRd3 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a) GHRd3 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 준비하고,
b) 상기 세포를 시험 화합물과 접촉시키고,
c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
이 때, 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는 것으로 검출되면, 상기 화합물은 GHRd3 폴리펩타이드 활성의 후보 조절자이다. 상기 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 이의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHRd3 폴리펩타이드의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 상기 시험 화합물이 GHR 활성을 촉진시키는 것으로 검출되면, 상기 시험 화합물은 후보 작용제이다. 상기 시험 화합물이 GHR 활성을 억제하는 것으로 검출되면, 상기 시험 화합물은 후보 억제제이다. 상기 세포는 인간 293 세포인 것이 바람직하다. 상기 방법의 다른 측면에 있어서, 상기 세포는 Xenopus laevis의 난모세포이고, 단계 a)는 상기 세포에 GHRd3 cRNA를 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 GHR이 GHRd3 및 GHRfl 헤테로다이머 폴리펩타이드로서 존재할 수 있음을 제시한다. 따라서, 다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 GHR 헤테로다이머 (GHRd3/fl) 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법과 관련있다. 이러한 방법은, 예컨대, GHR 작용제 또는 억제제를 동정하는 방법으로서 구체화될 수 있다. 이러한 방법은 또한 인간 환자의 성장률을 증가시킬 수 있고, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압을 개선시킬 수 있는 약물을 동정하는 방법으로서 구체화될 수 있다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 GHR 헤테로다이머 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법과 관련된 것으로, 상기 방법은,
c) GHRfl 폴리펩타이드와 GHRd3 폴리펩타이들 혼합하고,
d) 상기 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고,
b) 상기 화합물이 GHRfl 또는 GHRd3 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
이 때, 상기 화합물이 상기 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 것으로 검출되면, 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머 폴리펩타이드의 후보 조절자이다. 상기 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 이의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 GHRfl 및 GHRd3 폴리펩타이드는 막 내로 통합된다.
본 발명은 또한 GHR 헤테로다이머 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법을 제공하며, 상기 방법은,
c) GHRfl 폴리펩타이드와 GHRd3 폴리펩타이드를 혼합하고,
d) 상기 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고,
c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
이 때, 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는 것으로 검출되면, 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머 활성의 후보 조절자이다. 상기 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 그의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 상기 시험 화합물이 GHR 활성을 촉진하는 것을 검출되면, 사익 시험 화합물은 후보 작용제이다. 시험 화합물이 GHR 활성을 억제하는 것으로 검출되면, 상기 시험 화합물은 후보 억제제이다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 GHRfl 및 GHRd3 폴리펩타이드는 막 내로 통합된다.
본 발명은 또한 GHR 헤테로다이머 폴리펩타이드의 후보 조절자의 동정 방법을 제공하며, 상기 방법은,
c) GHRfl 폴리펩타이드와 GHRd3 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 준비하고,
d) 상기 세포를 시험 화합물과 접촉시키고,
c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 조절하는 것으로 검출되면 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머 활성의 후보 조절자이다. 시험 화합물은 GH 폴리펩타이드 또는 그의 일부분 또는 변이체인 것이 바람직하다. 상기 화합물은 GHR 헤테로다이머의 작용제 또는 억제제일 수 있다. 시험 화합물이 GHR 활성을 촉진하는 것으로 검출되면, 상기 시험 화합물은 후보 작용제이다. 시험 화합물이 GHR 활성을 억제하는 것으로 검출되면, 상기 시험 화합물은 후보 억제제이다. 상기 세포는 인간 293 세포인 것이 바람직하다. 상기 방법의 다른 측면에 있어서, 상기 세포는 Xenopus laevis 난모세포이고, 단계 a)는 상기 세포에 GHRd3 cRNA를 도입시키는 것을 포함한다.
상기 세포는 GHRfl 폴리펩타이드와 GHRd3 폴리펩타이드를 발현하는 세포인 것이 바람직하다. 바람직한 측면에 있어서, 단계 a)는 상기 세포에 GHRd3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산과 GHRfl 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 도입시키는 것을 포함한다. 다른 측면에 있어서, 단계 a)는 GHRfl 핵산을 발현하는 세포에 GHRd3 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 도입시키는 것을 포함한다. 또 다른 측면에 있어서, 단계 a)는 GHRd3 핵산을 발현하는 세포에 GHRfl 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 GHRd3 폴리뉴클레오타이드와 GHRfl 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 GHRd3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 재조합 벡터와 GHRfl 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 재조합 벡터를 포함하는, 두 가지 이상의 재조합 벡터 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 제1 재조합 벡터와 상기 제2 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 이는 상기 재조합 벡터들을 포함하는 비인간 숙주 동물 또는 포유류를 포함한다.
본 발명은 또한 GHRd3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 녹 아웃 벡터에 의한 상동 재조합에 의하여 파손된 GHR 유전자를 포함하는 포유류 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 GHFd3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 녹 아웃 벡터에 의한 상동 재조합에 의하여 파손된 GHR 유전자를 포함하는 비인간 숙주 포유류를 제공한다.
전술한 바와 같이, 상기 분석 수행 방법, GHR 헤테로다이머의 조절자의 동정 방법, 재조합 벡터, 숙주 세포 및 비인간 숙주 포유류는 실질적으로 전체 엑손 3이 결실되어 있는 GHRd3 대립 유전자를 사용거나, 이 대신에, 모든 적절한 GHR 대립 유전자 또는 엑손 3 내의 하나 이상의 핵산이 결실, 삽입 또는 치환되어 있는 GHR 핵산에 의하여 코딩되는 모든 적절한 이소형을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
발명의 상세한 설명
재조합 GH를 사용하는 치료 시험에 포함된 특발성 단신 (ISS)을 앓고 있는 97명의 아동에 대하여, 공통적 GHR 엑손 3 변이체의 관련 및 GH를 사용하는 치료에 대한 성장 속도의 반응을 조사하였다. GHRd3 대립 유전자는 47명의 환자에 존재하였으며, 이들 중 3명에서는 GHRd3/d3 동형 접합체로 존재하고, 44명에서는 GHRd3/fl 이형 접합체로 존재하였다. 연령, 성별 및 rGH 투여량을 조정한 후, GHRd3 변이체를 갖는 아동이 rGH로 치료시 우수한 속도로 성장하는 것으로 나타났다. 성장 속도는, GHRd3/fl 또는 GHRd3/d3 유전자형을 갖는 아동에 있어서는, 치료 첫 해에 9.0 +/- 0.3 cm/yr, 두 번째 해에 7.8 +/- 0.2 cm/yr이었으며, GHRfl/fl 유전자형을 갖는 아동에서의 첫 번째와 두 번째 해에서의 각각 7.4 +/-0.2 cm/yr 및 6.5 +/- 0.2 cm/yr의 성장 속도와 비교하였다 (P < 0.0001). 유전자형 군을 다른 의학적 및 치료적 특성에 대하여 비교하였다. 따라서, GHR 서열의 게놈 변이체는 rGH 효과에 있어서의 현저한 차이와 관련있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 진단 분석, 예후 분석 및 모니터링 임상 시험을 예후 판단 (예측) 목적으로 사용하여 개체를 치료하는 예방 의약 및 제약 분야에 포함된다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플 (예컨대, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서의 GHR 단백질 및/또는 핵산 발현을 측정하여, 개체의 GHR 반응의 본질을 측정하는, 특히, 외인성 GH 조성물을 사용하여 치료하는, 진단 분석과 관련된 것이다. 이는 또한 개체가 감소된 GHR 반응 또는 활성과 관련된 질병 또는 장애로 고통받는지 여부를 측정하는데 유용할 수 있다. GHR 활성을 수반하는 질환 또는 증상에는 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압 등이 있다. 본 발명은 또한 개체가 GHR 단백질 활성과 관련된 질환의 발생 위험성을 갖는지 여부를 측정하는 예후 판단 (예측) 분석을 제공한다. 예컨대, GHRd3 이소형 및 GHRfl 이소형을 생물학적 샘플에서 분석할 수 있다. 이러한 분석은, 예컨대 환자가 자신의 유전적 잠재력에 부합하는 최종 신장에 도달할 수 있도록 하기 위하여 유효량의 GH를 투여함으로써, 감소된 GHR 반응의 특징을 갖거나 이와 관련된 질환의 발병 전에 개체를 예방적으로 치료하는 예후 판단 또는 예측 목적을 위하여 사용될 수 있다. 다른 측면에 있어서, 본 발명은 GHRd3/GHRfl 헤테로다이머 활성을 조절하는 약제의 검출 방법을 제공한다. 이러한 약제는 GHR 활성을 수반하는 상기의 증상 또는 질환의 치료에 유용할 수 있다.
정의
본 명에서에 있어서 "약제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질, 또는 세균, 식문, 진균류 또는 동물 (특히, 포유류) 세포 또는 조직과 같은 생물학적 재료로부터 얻어진 추출물을 의미한다.
본 발명과 관련하여, 약물 또는 약제에 대한 "양성 반응" 또는 "양성 치료적 반응"이라 함은 질병 또는 질환과 관련된 증상의 감소를 포함하는 것으로 정의될 수 있다. 예컨대, 양성 반응은 약제의 투여시의 신장 또는 성장률에 있어서의 증가일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 약물에 대한 "음성 반응"은 약물에 대한 양성 반응의 결여, 또는 약물의 투여 후에 관찰되는 부작용의 유발을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 중합체의 길이와 관계 없이 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질이 폴리펩타이드의 정의 내에 포함된다. 또한, 상기 용어는 폴리펩타이드의 발현 후 변형을 한정하거나 배재시키지 않으며, 예컨대, 글라이코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등의 공유적 부착을 포함하는 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드에 명백하게 포함된다. 하나 이상의 아미노산 유사체 (예컨대, 비천연 아미노산, 비관련 생물계에서 천연적으로만 생성되는 아미노산, 포유류계로부터 변형된 아미노산 등을 포함)을 포함하는 폴리펩타이드, 치환적 결합 및 이 기술 분야에 알려진 다른 변형을 갖는 천연 및 비천연 모두인 폴리펩타이드도 역시 상기 정의 내에 포함된다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 상기 단백질이 유래된 세포 또는 조직 근원의 세포내 물질 또는 다른 불순물 단백질을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질을 갖지 않는 것을 의미한다. "세포내 물질을 실질적으로 갖지 않는"이란 표현은 GH 또는 GHR 단백질이 자신이 분리 또는 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분과 분리되어 있는 GH 또는 GHR 단백질 제제를 포함한다. 한 구체예에 있어서, "세포내 물질을 실질적으로 갖지 않는"이란 표현은 비GH 단백질 또는 비GHR 단백질 함량이 약 30% (건조 중량 기준) 이하, 바람직하게는 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 5% 이하인 GH 또는 GHR 단백질 제제를 포함한다. GH 또는 GHR 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 실질적으로 배양 배지를 갖지 않는 것이 또한 바람직하며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 약 5% 이하로 함유되는 것이 바람직하다.
"화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는"이라는 표현은 GH 또는 GHR 단백질이 자신의 합성에 수반된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있는 GH 또는 GHR 단백질 제제를 포함하는 것이다. 한 구체예에 있어서, "화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는"이란 표현은 화학적 전구체 또는 비GH 화학물질 또는 비GHR 화학물질의 함량이 약 30% (건조 중량 기준) 이하, 바람직하게는 약 20% 이하, 보다 바람직하게는 약 10% 이하, 가장 바람직하게는 약 5% 이하인 GH 또는 GHR 단백질 제제를 포함하는 것이다.
본 명세서에 있어서, "재조합 폴리펩타이드"는 인공적으로 설계되고 자신의 초기 천연 환경에서 인접 폴리펩타이드 서열로서 나타나지 않는 두 가지 이상의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하거나, 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 폴리펩타이드를 의미하는 것이다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적 관련성이 있도록 위치하는 경우, "조작 가능하게 연결 (operably linked)"되었다고 한다. 예컨대, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열과 조작 가능하게 연결되었다고 한다. 전사 조절 서열과 관련하여, "조작 가능하게 연결됨"은 결합된 DNA 서열이 인접하여 있고, 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결시킬 필요가 있는 경우에는, 인접하여 해독틀 내에 위치하는 것이다.
"프라이머"는 표적 뉴클레오타이드 서열에 상보적이고 상기 표적 뉴클레오타이드 서열과의 혼성화에 사용되는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이다. 프라이머는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소 또는 역전사 효소에 의하여 촉매되는 뉴클레오타이드 중합의 개시점으로서의 역할을 한다.
"프로브"는 샘플 내에 존재하는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열을 동정하는데 사용될 수 있는 정의된 핵산 단편 (또는 뉴클레오타이드 유사체 단편, 예컨대, 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드)를 의미하며, 상기 핵산 단편은 동정된 특정 폴리뉴클레오타이드 서열과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바로서, "시험 샘플"은 당해 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 의미한다. 예컨대, 시험 샘플을 체액 (예컨대, 혈청), 세포 샘플 또는 조직일 수 있다.
"형질(trait)" 및 "표현형"은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 예컨대, 질병의 증상 또는 질병에 대한 민감성 등과 같이, 생물체의 모든 임상적으로 구별 가능하거나, 검출 가능하거나 또는 다른 측정 가능한 특성을 의미하는 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 "형질" 또는 "표현형"은 GHR 상에 작용하는 약제에 대한 개체의 반응을 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 바로서, "유전자형"은 개체 또는 샘플에 존재하는 대립 유전자의 동일성을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 유전자형은 개체 또는 샘플에 존재하는 대립 유전자의 설명을 의미하는 것이 바람직하다. 대립 유전자에 대하여 샘플 또는 개체를 "유전자형화(genotyping)" 하는 것은 개체에 의하여 갖는 특정 대립 유전자를 결정하는 것을 수반한다.
본 명세서에 있어서, "대립 유전자"는 뉴클레오타이드 서열의 변이체를 의미한다. 예컨대, GHR 뉴클레오타이드 서열의 대립 유전자는 GHRd3와 GHRfl를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "이소형 (isoform)" 및 "GHR 이소형"은 GHR 유전자의 하나 이상의 엑손에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드를 의미한다. GHR 이소형의 예에는 GHRd3 및 GHRfl 폴리펩타이드가 있다.
본 명세서에 있어서, "다형성 (polymorphism)"은 상이한 게놈 또는 개체 간의 두 가지 이상의 대체적 게놈 서열 또는 대립 유전자의 발생을 의미하는 것이다. "다형적(polymorphic)"은 특정 게놈 서열의 두 가지 이상의 변이체가 한 개체군 내에서 발견되는 상태를 의미한다. "다형성 부위 (polymorphic site)"는 변이가 일어나는 위치를 의미한다. 다형성은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 단일 뉴클레오타이드 다형성은 단일 염기쌍의 변화를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "엑손"은 성숙한 RNA 산물에 존재하는 단속 유전자(interrupted gene)의 모든 단편을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "인트론"은 성숙한 RNA 산물에 존재하지 않는 단속 유전자의 단편을 의미한다. 인트론은 일차 핵 전사의 부분이지만, 스플라이싱에 의하여 제거되어, 세포질로 운반될 mRNA를 생산하지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바로서, "성장 호르몬" 또는 "GH"는 천연 서열 또는 변이체 형태의 성장 호르몬을 의미하는 것으로, 모든 근원으로부터 얻을 수 있으며, 천연, 합성 또는 재조합일 수 있다. 그 예로서, 인간 천연 서열을 갖는 천연 또는 재조합 GH인 인간 성장 호르몬 (hGH) (예컨대, GENOTROPINTM, 소마토트로핀 또는 소마트로핀), 및 소마트렘(somatrem), 소마토트로핀, 스마트로핀 및 페그비소만트(pegvisomant)를 포함하여, 재조합 DNA 기술에 의하여 생산된 모든 GH 또는 GH 변이체를 의미하는 재조합 성장 호르몬 (rGH) 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. GH 분자는 GHR에서의 작용제 또는 길항제일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, "성장 호르몬 수용체" 또는 "GHR"는 천연 서열 또는 변이체 형태의 성장 호르몬 수용체를 의미하는 것으로 모든 근원으로부터 얻을 수 있으며, 천연, 합성 또는 재조합일 수 있다. "GHR"는 GHRfl 이소형과 GHRd3 이소형을 모두 포함한다. 예로서, 인간 천연 서열을 갖는 천연 또는 재조합 GHR인 인간 성장 호르몬 수용체 (hGHR) 등이 있다. 본 명세서에 사용된 바로서, "GHRd3"는 GHR의 엑손 3 결실 이소형을 의미한다. "GHRfl"는 엑손 3 포함 이소형을 의미한다. GHRd3는 본 명세서에 참조로서 포함되는 Urbanek M 등의 "Mol Endocrinol 1992 Feb; 6 (2): 279-87"에 기재된 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. GHRfl는 본 명세서에 참조로서 포함되는 Leung 등의 "Nature, 330: 537-543 (1987)"에 기재된 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바로서, "GHR 유전자"는 게놈 DNA의 비번역 조절 영역을 포함하는, 모든 GHR 단백질을 코딩하는 게놈 서열, mRNA 서열 및 cDNA 서열을 포함한다. "GHR 유전자"는 또한 GHRd3 대립 유전자 및 GHRfl 대립 유전자와 같은 GHR 유전자의 대립 유전자를 포함한다.
인간 GHR 유전자 및 단백질
인간 GHR 유전자는 5p13-12 염색체 영역의 90 kb에 걸쳐 있는 단일 복사본 유전자이다. 이것은 9 개의 코딩 엑손 (번호: 2 내지 10)과 수 개의 비번역 엑손을 포함하며, 엑손 2는 신호 펩타이드를 코딩하고, 엑손 3 내지 7은 세포외 도메인을 코딩하고, 엑손 8은 막통과 도메인을 코딩하고, 엑손 9 및 10은 세포질 도메인을 코딩한다. 전술한 바와 같이, hGHRd3 단백질은 수용체의 세포외 도메인 내의 22개 아미노산이 결실되었다는 점에서 간 hGHR과 상이하다 [Godowski 등 (1989)]. 그 서열이 본 명세서에 참조로서 포함되는 Genbank accession number: AF155912의 기재는 GHR 유전자 (즉, GHRfl 대립 유전자)의 엑손 3 주위의 게놈 DNA 영역의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 엑손 3 및 인트론 2와 3 부분을 포함하는 이 6.8 bp 단편은 또한 두 개의 251 bp의 반복 요소(repeat elements)를 포함한다. 이들 반복 요소는 엑손 3 측면에 위치하며, 엑손의 577 bp 상류 및 1821 bp 하류에 위치하는 5' 및 3' 반복 요소를 갖는다. 상기 요소들은 HERV-P 계통에 속하는 인간 내인 레트로바이러스에서 유래하는 171 bp 긴 말단 반복 서열 (long terminal repeat, LTR) 단편으로 구성된다 [Boeke, J. D., and Stoye, J. P. (1997) in Retroviruses (Coffin, J. M., Hughes, S. H., and Varmus, H. E., eds), pp. 343-435, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]. 중간 반복 빈도 MER4형 서열로부터 80 bp가 LTR 다음에 위치한다 [Smit, A. F. (1996) Curr. Opin.Genet. Dev. 6, 743-748]. 5' 및 3' 반복 서열로 칭해지는 두 개의 251 bp 길이의 복사본 서열은 99% 상동이며, 반복 서열의 14, 245 및 146 위치의 3 개의 뉴클레오타이드만 상이하다. 특히, Pantel 등 (2000)에 보고된 바와 같이, 엑손 3에서 상류에 위치하는 요소는 위치 14에서는 시토신을, 위치 245 및 246에서는 티민을 갖는 반면, 엑손 3의 하류에 위치하는 요소는 이들 위치에서 구아닌, 시토신 및 아데닌을 갖는다. 또한, 바이러스 기원의 다른 서열이 엑손 3에 인접하여 관찰된다.
GHRd3 대립 유전자는 엑손 3과 인트론 2 및 3의 주변 부분의 결실을 포함한다. GHRfl 대립 유전자와 달리, GHRd3 대립 유전자는 GHRfl 대립 유전자 상에서 동정되는 3' 복사본의 LTR과 서열면에서 동일한 단독 251 bp LTR을 포함한다. 결실된 엑손 영역의 3 GHRd3 대립 유전자의 게놈 DNA 서열은 Genbank accession number: AF210633에 나타나 있으며, 그 서열의 기재는 본 명세서에 참조로서 포함된다. GHRd3 및 GHRfl 서열에 기초하여, GHR 핵산 또는 폴리펩타이드를 검출하는 공지된 방법을 사용하여 개체가 GHRd3 대립 유전자를 갖는지 여부를 측정할 수 있다.
엑손 3 결실을 갖는 GHRd3 단백질은 수용체의 세포외 도메인 내 22 개 아미노산이 결실되었다는 점에서 전장 hGHR (GHRfl)과 다르다. 따라서, 모든 공지된 방법을 사용하여 GHRd3 또는 GHRfl 단백질의 존재 여부를 측정할 수 있다. GHRd3와 GHRfl는 또한, 몇 몇 종에서 GHBP로서 작용하고 혈액 내를 순환하는 GHR의 세포외 도메인을 의미하는, "고친화성 성장 호르몬 결합 단백질", "고친화성 GHBP" 또는 "GHBP"로서, 비절단 형태 또는 절단 형태로 검출할 수 있다 [Ymer and Herington,(1985) Mol. Cell. Endocrinol. 41: 153; Smith and Talamantes, (1988) Endocrinology, 123: 1489-1494; Emtner and Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 (1990), including mar.Baumann 등, J. Clin. Endocrinol. Metab., 62: 134-141 (1986); EP 366,710 ; Herington 등, J. Crin. Invest., 77:1817-1823 (1986); Leung 등, Nature, 330: 537-543 (1987)]. 혈청 내 기능적 GHBP를 측정하기 위한 다양한 방법이 있고, 사용 가능하고, 바람직한 방법은 미국 특허 제5,210,017호 및 본 명세서에 기재된 리간드 매개 면역 기능적 분석법 (ligand-mediated immunofunctional assay, LIFA)이다.
진단, 치료 및 약리 유전학에 있어서의 GHRd3
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 환자가 치료에 대한 반응의 증가 또는 감소, 또는 GHR 활성의 증가 또는 감소와 관련된 GHR 대립 유전자를 발현하는지 여부를 측정하는 것을 수반한다. 환자가 GHR 대립 유전자를 발현하는지 여부의 측정은 GHR 단백질 또는 핵산을 검출함으로써 수행할 수 있다.
환자를 치료, 진단 또는 평가하는 방법은 환자가 GHRd3 대립 유전자 및/또는GHRfl 대립 유전자를 발현하는지 여부를 평가 또는 측정하는 것, 예컨대, 환자가 GHRfl 대립 유전자에 대하여 동형 접합성 (GHRfl/fl), GHRd3 대립 유전자에 대하여 동형 접합성 (GHRd3/d3) 또는 이형 접합성 (GHRd3/fl)인지 여부를 측정하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하여 GHRd3이 생물학적 샘플 내에서 발현되는지 여부를 측정하는 것을 수반하는 것이 바람직하다: a) 상기 생물학적 시료를 i) 엄격한 조건 하에서 GHRd3 핵산과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 ii) GHRd3 폴리펩타이드와 선택적으로 결합하는 검출 가능한 폴리펩타이드와 접촉시키고, b) 상기 폴리뉴클레오타이드와 상기 샘플 내의 RNA 종과의 혼성화 여부 또는 상기 검출 가능한 폴리펩타이드와 상기 샘플 내의 폴리펩타이드와의 결합의 존재 여부를 검출하는 단계. 상기 혼성화 또는 상기 결합의 검출은 상기 GHRd3 대립 유전자 또는 이소형이 상기 샘플 내에서 발현됨을 나타내는 것이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 프라이머이고, 상기 혼성화는 상기 프라이머 서열을 포함하는 증폭 산물의 존재 여부를 측정함에 의하여 측정하고, 또는 상기 검출 가능한 폴리펩타이드는 항체이다.
또한, 포유류, 바람직하게는 인간이 증가 또는 감소된 수준의 GHRd3 발현을 나타내는지 여부를 측정하는 방법이 계획되며, 상기 방법은, a) 상기 포유류로부터 생물학적 샘플을 준비하고, b) 상기 생물학적 샘플 내의 GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 GHRd3 RNA 종 또는 GHRd3 폴리펩타이드의 양을 대조군 샘플로부터 예상되거나 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 상기 대조군 샘플에서 예상되거나 검출된 수준과 비교시의 상기 생물학적 샘플 내의 상기 GHRd3 RNA 종 또는 상기 GHRd3 폴리펩타이드의 증가량은 상기 포유류의 GHRd3 발현 수준이 증가되었음을 나타내며, 상기 대조군 샘플에서 예상되거나 검출된 수준과 비교시의 상기 생물학적 샘플 내의 상기 GHRd3 RNA 종 또는 상기 GHRd3 폴리펩타이드의 감소량은 상기 포유류의 GHRd3 발현 수준이 감소하였음을 나타내는 것이다.
생물학적 샘플에서의 GHRd3 단백질 또는 핵산의 존재 여부의 측정 방법은 시험 환자로부터 생물학적 샘플을 얻고, 상기 생물학적 샘플을 GHRd3 단백질 또는 GHRd3 단백질을 코딩하는 핵산 (예컨대, mRNA, 게놈 DNA)을 검출할 수 있는 약제 또는 화합물과 접촉시켜, 상기 생물학적 시료 내의 GHRd3 단백질 또는 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있도록 하는 것을 포함한다. GHRd3 mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하기 위한 약제는 GHRd3 mRNA 또는 게놈 DNA에 혼성화 가능한 표지된 핵산 프로브인 것이바람직하다. 핵산 프로브는, 예컨대, 길이 면에서 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오타이드 이상이고, 엄격한 조건 하에서 GHRd3 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 혼성화하기에 충분한 올리고뉴클레오타이드와 같은, 인간 핵산 또는 그의 일부분일 수 있다. 본 발명의 진단 분석에 사용하기 위한 다른 적절한 프로브를 본 명세서에 기재하였다.
GHRd3 단백질을 검출하기 위한 약제는 GHRd3 단백질에 결합 가능한 항체인 것이 바람직하며, 검출 가능하게 표지된 항체가 더욱 바람직하다. 항체는 폴리클로날 항체일 수 있고, 또는 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 완전한(무손상) 항체 또는 그의 단편 [예컨대, Fat 또는 F(ab')2]를 사용할 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 "표지된"이란 용어는 검출 가능한 물질을 프로브 또는 항체에 결합 (예컨대, 물리적 결합)시킴으로써 프로브 또는 항체를 직접적으로 표지하는 것 뿐 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약의 반응성에 의하여 프로브 또는 항체를 간접적으로 표지하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 간접적 표지의 예로서 형광 표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘을 검출할 수 있도록 바이오틴을 사용하는 DNA 프로브의 말단 표지 등이 있다.
"생물학적 샘플"이란 용어는 환자 뿐 아니라 환자에 존재하는 조직, 세포 및 체액으로부터 분리된 조직, 세포 및 체액을 포함하도록 의도된다. 즉, 본 발명의 검출 방법은 생체외 및 생체내적으로 생물학적 샘플에서 후보 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA을 검출하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 후보 mRNA를 검출하는 생체외 (in vitro) 기술에는 노던(Northern) 혼성화 및 제자리 혼성화 (in situ hybridization) 등이 있다. 후보 단백질을 검출하기 위한 생체외 기술에는 효소 면역 측정법 (enzyme linked immunosorbent assays, ELISAs), 웨스턴(Western) 블라트, 면역 침강법 및 면역 형광법 등이 있다. 후보 게놈 DNA를 검출하기 위한 생체외 기술에는 서던(Southern) 혼성화 등이 있다. 또한, GHRd3 단백질을 검출하기 위한 생체내 (in vivo) 기술은 환자에게 표지된 항항체(anti-antibody)를 도입시키는 것을 포함한다. 예컨대, 항체는 환자에서의 그 존재 및 위치가 표준 영상 기술에 의하여 검출 가능한 방사성 마커로 표지할 수 있다.
한 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 시험체로부터 유래하는 단백질 분자를 포함하는 것이다. 또는, 생물학적 샘플은 시험체로부터 유래하는 mRNA 분자 또는 시험체부터 유래하는 게놈 DNA 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 생물학적 샘플은 환자로부터 통상적인 수단으로 분리된 혈청 샘플인다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 대조군 환자로부터 대조군 생물학적 샘플을 얻고, 상기 대조군 샘플을 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 검출할 수 있는 약제 또는 화합물과 접촉시켜, 상기 생물학적 샘플 내의 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 존재 여부를 측정하고, 대조군 샘플에서의 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부를 시험 샘플 내의 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부와 비교하는 것을 추가로 수반한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플 내의 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예컨대, 상기 키트는 생물학적 시료에서 GHRd3 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 약제; 상기 시료 내의 GHRd3 단백질 또는 mRNA의 양을 검출하기 위한 수단; 및 시료내의 GHRd3 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 양을 표준 샘플과 비교하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 상기 화합물 또는 약제는 적절한 용기에 포장되어 있을 수 있다. 상기 키트는 GHRd3 단백질 또는 핵산을 검출하기 위한 키트의 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, 전술한 진단 분석법 또는 후술하는 분석법과 같은, 본 명세서에 기재된 분석법은 GHR 반응이 감소된 환자 또는 GHR 반응 감소의 발생 위험이 있는 환자를 동정하는데 사용할 수 있다. 특히, GHRfl 동형 접합성 환자는 GHR 반응이 감소되어 있거나 GHR 반응 감소의 위험이 있는 것으로 확인된다. 다른 측면에 있어서, 본 명세서에 기재된 진단 방법은, 이상 증상, 특히 GHR 수준, 발현 또는 활성의 감소와 관련된 질병, 장애 또는 형질을 갖거나 이러한 위험이 있는 환자를 동정하기 위하여 사용할 수 있다. 예컨대, 전술한 진단 분석법 또는 후술하는 분석법과 같은, 본 명세서에 기재된 분석법은 GHR 수준, 발현 또는 활성의 감소와 관련된 형질을 갖거나, 이러한 형질의 발생 위험이 있는 환자를 동정하는데 사용할 수 있다. 다른 예에 있어서, 본 명세서에 기재된 분석법은 GHR 수준, 발현 또는 활성의 감소와 관련된 형질을 갖거나 이러한 형질의 발생 위험이 있는 환자를 동정하는데 사용할 수 있다. 논의된 바와 같이, GHRfl 이형 접합체는 GHRfl/fl 동형 접합체와 비교하여 증가된 GHR 반응 또는 GHR 활성을 가질 것으로 예상된다.
본 명세서에 기재된 예후 분석법은 환자에게 GHR 경로를 통하여 작용하여 질병 또는 장애를 치료하는 약제를 투여할 것인지 여부 및/또는 어떠한 투여 요법에 따를 것인지를 결정하기 위하여 사용할 수 있다. 따라서, 본발명은 환자가 GHR 경로를 통하여 작용하는 약제에 의하여 효과적으로 치료될 수 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 시험 샘플을 얻고 GHRd3 단백질 또는 핵산 발현 또는 활성을 검출하는 것을 포함한다. 논의된 바와 같이, GHRd3 단백질 또는 핵산이 검출되는 환자는 GHRd3 단백질 또는 핵산이 검출되지 않은 환자와 비교하여 상기 약제에 대하여 증가된 양성 반응을 보일 것으로 예상된다.
대부분에 있어서, GHR 매개 경로를 통하여 작용하는 약제의 투여를 상기 약제에 대하여 높거나 낮은 반응성을 갖는 환자에 적용할 수 있기 때문에, 개체에서의 감소된 GHR 활성에 대한 감수성 측정이 매우 중요하다. 상기 약제는 반드시 직접적으로 GHR 단백질에 작용할 필요가 없지만, 예컨대, 궁극적으로 GHR 단백질과 상호작용하는 다른 분자에 작용하는 등과 같이, GHR 단백질의 상류에 작용할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 약제는 GHR 단백질에 직접 작용하는 약제이다. 보다 바람직하게는, 상기 약제는 작용제 또는 길항제로 작용하고 GHR 단백질에 결합하는 약제이다. 가장 바람직하게는, 상기 약제는 GHR 단백질을 활성화시킬 수 있는 GH 단백질이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 약제는 GHR 단백질에 결합하지만 활성화시키지 않는 GH 단백질이다.
GHR을 수반하는 질환에는, 예컨대, 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압 등이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 이들 질환 중 어느 하나에 대한 약제에 의한 치료에 대한 환자의 반응을 예측하기 위하여 사용할 수 있다.
논의한 바와 같이, 본 발명은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상을 앓고 있는 환자의 치료 방법을 개시하며: 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압,
상기 방법은,
(a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재 또는 부재를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
(b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선별 또는 결정하는 단계.
따라서, 본 발명은 또한 포유류, 바람직하게는 인간의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
- 임의적으로, 개체의 DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하는지 여부를 측정하고,
- DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하지 않는 개체를 선별하고,
- 상기 개체의 감소된 GHR 반응과 관련된 증상의 양상 (및 임의적으로 경과)을 추적하고
- 적절한 단계에서 상기 개체에게 감소된 GHR 반응 또는 그의 증상에 대하여 작용하는 유효량의 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 포유류, 바람직하게는 인간의 치료 방법을 포함하며, 상기 방법은,
- 임의적으로, 개체의 DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하는지 여부를 측정하고,
- DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하지 않는 개체를 선별하고,
- 상기 개체에게 감소된 GHR 반응에 대여 예방적 치료를 수행하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 포유류, 바람직하게는 인간의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
- 임의적으로, 개체의 DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하는지 여부를 측정하고,
- DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하지 않는 개체를 선별하고,
- 상기 개체에게 감소된 GHR 반응에 대하여 예방적 치료를 수행하고,
- 상기 개체의 감소된 GHR 반응과 관련된 증상의 양상 및 경과를 추적하고,
- 임의적으로 적절한 단계에서 상기 개체에게 감소된 GHR 반응 또는 그의 증상에 작용하는 치료를 수행하는 단계를 포함한다.
개체의 치료 방향을 결정하는데 사용하기 위하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 치료 방법과 관련있다:
- DNA가 감소된 GHR 반응, 활성 또는 발현 또는 그와 관련된 증상과 관련된 단백질을 코딩하는 개체를 선별하고,
- 상기 개체에게 감소된 GHR 반응 또는 그의 증상에 효과적인 치료를 수행하는 단계. 바람직한 구체예에 있어서, 감소된 GHR 반응 또는 그의 증상과 관련된 상기 단백질은 GHR 단백질이며, 보다 바람직하게는 GHRfl 단백질이다. 가장 바람직하게는, 상기 개체는 GHRfl/fl 이소형에 대하여 동형 접합성일 것이다.
본 발명의 방법에 따른 개체는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상에 민감하거나 이러한 증상을 앓고 있는 개체일 수 있다: 단신 (예컨대, 바람직하게는, ISS), 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압.
감소된 GHR 반응은 GHR 경로를 통하여 작용할 수 있는, 보다 바람직하게는, GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 치료에 대한 반응의 감소인 것이 바람직하다. 바람직한 약제의 예로서 다음과 같은 증상의 치료를 위한 약제 등이 있다: 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압.
감소된 GHR 반응 또는 그의 증상에 효과적인 치료는 모든 적절한 면에서 GHR 반응이 감소되지 않은 개체에 수행하는 치료와 차이가 있을 수 있다. 한 측면에 있어서, 상기 치료는 투여될 약제의 양에 있어서 상이하다. 다른 측면에 있어서, 상기 치료는 포뮬레이션에 있어서 상이하다. 다른 측면에 있어서, 조성물의 투여 방법의 기간이 상이하다. 또 다른 측면에 있어서, 감소된 GHR 반응 또는 그의 증상에 효과적인 치료에 상용되는 약제가 구조면에서 기초 증상 (예컨대, 단신, 비만)을 치료하는데 사용되는 약제와 상이하다. 바람직한 측면에 있어서, GH 단백질, 그의 변이체 또는 단편을 함유하는 조성물을, DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하는 개체에 투여되는 양보다 많은 양으로, GHRfl에 대하여 동형 접합성인 개체에게 투여한다.
바람직하게는, 상기 약제는 GH 폴리펩타이드 또는 그의 단편이고, 보다 바람직하게는 재조합 GH 폴리펩타이드 또는 그의 단편이며, 그 예들이 본 명세서에 추가로 논의된다. 재조합 GH 폴리펩타이드는 GHR 작용제 (예컨대, 성장 증가 또는 비만 치료용) 또는 GHR 길항제 (예컨대, 말단 비대증 또는 거인증 치료용)일 수 있다. 추가로 논의될 바와 같이, 반응은, 신장 또는 성장률 변화, 비만 [예컨대, 신체 비만 지수 (body mass index, BMI)], 감염 또는 당뇨 증상의 개선, 말단 비대증 또는 거인증 증상의 개선, 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상, 대사 증후군, 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압 증상의 개선 등일 수 있다.
한 측면에 있어서, 개체는 이미 질환을 앓고 있거나 질환에 민감하여, 이미 치료를 받거나 치료를 받는 중이거나, 추가적 치료의 후보자일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개체는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 증상을 앓거나 이러한 증상에 민감할 수 있다: 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압. 따라서, 바람직한 측면에 있어서, 본 발명은 상기 질환 중 한 가지 이상을 갖는 개체를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 특정 치료 방법에 따라서 상기에 정의된 같이 GHR 반응이 감소된 환자를 치료하는 것을 목적으로 할 수 있도록 한다.
시험할 개체로부터 DNA 샘플을 취하여, DNA가 GHRd3 단백질을 코딩하는지 여부를 측정한다. DNA 샘플을 분석하여, GHRd3 서열을 포함하는지 또는 개체가 GHRfl 이소형에 대하여 동형 접합성인지 여부를 측정한다. GHRd3 단백질을 코딩하는 DNA는 약물을 사용하는 치료에 대한 큰 양성 반응과 관련된 것이며, GHRd3 대립 유전자를 코딩하는 DNA의 결여는 GHRd3 개체와 비교하여 감소된 양성 반응과 관련있다.
본 발명의 방법은 또한 약물의 임상 시험을 평가하고 수행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 방법은 상기 약물에 양성적으로 반응하는 개체의 제1 개체군 및 상기 약물에 음성적으로 반응하거나 상기 제1 개체군과 비교하여 상기 약제에 대한 양성 반응이 감소된 개체의 제2 개체군을 동정하는 것을 포함한다. 한 구체예에 있어서, DNA 샘플이 약물을 사용하는 치료에 대한 양성 반응과 관련된 하나 이상의 대립 유전자의 대립 유전자를 포함하는 경우 및/또는 DNA 샘플이 약물을 사용하는 치료에 대한 음성 반응 또는 감소된 양성 반응과 관련된 하나 이상의 대립 유전자의 대립 유전자를 포함하는 경우, 임상 실험 중의 환자에게 약물을 투여할 수 있다. 다른 측면에 있어서, DNA 샘플이 약물을 사용하는 치료에 대한 음성 반응 또는 감소된 양성 반응과 관련된 하나 이상의 대립 유전자의 대립 유전자를 포함하는 경우 및/또는 DNA 샘플이 약물을 사용하는 치료에 대한 양성 반응 또는 증가된 양성 반응과 관련된 하나 이상의 대립 유전자의 대립 유전자를 결여하고 있는 경우, 임상 시험 중의 환자에게 약물을 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법을 사용하여, 약물 시험 객체 간의 GHR 반응의 차이를 고려하여 약물 효능을 평가할 수 있다. 소망하는 경우, 실질적으로 약물에 유리하게 반응할 것으로 보이는 개체들을 포함하는 개체군, 또는 실질적으로 다른 개체군보다 약물에 대하여 덜 유리하게 반응할 것으로 보이는 개체들을 포함하는 개체군에서 약물 효능 평가 시험을 수행할 수 있다. 예컨대, GH 단백질 함유 조성물을 GHRd3 개체들의 개체군 또는 GHRfl/fl 개체들의 개체군에서 평가할 수 있다. 다른 측면에 있어서, GH 반응의 감소를 앓고 있는 개체를 치료하기 위하여 의도된 약물을 GHRfl/fl 개체들의 개체군에서 평가하는 것이 유리하다.
GHRd3 및 GHRfl의 검출
특정 핵산에서의 뉴클레오타이드 변형을 검출하여, 본 발명에 따라서, GHR 유전자의 다른 변이를 동정할 수 있을 것으로 의도된다 (미국 특허 제4,988,617호, 본 명세서에 참조로서 포함됨). 이와 관련하여, 다양한 서로 다른 분석법이 고려되며, 상기 분석법은 형광 제자리 혼성화 (fluorescent in situ hybridization, FISH; 미국 특허 제5,633,365호 및 미국 특허 제5,665,549호, 이은 각각 본 명세서에 참조로서 포함됨), 직접 DNA 시퀀싱, PFGE 분석법, 서던 또는 노던 블라팅, 단일 가닥 형태 분석법 (single-stranded conformation analysis, SSCA), RNAse 보호 분석법, 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 (ASO, 예컨대, 미국 특허 제5,639,611호), 도트 블라트 분석 변성 구배 젤 전기 영동 (예컨대, 미국 특허 제5,190,856호, 본 명세서에 참조로서 포함됨). RFLP (예컨대, 미국 특허 제5,324,631호, 본 명세서에 참조로서 포함됨) 및 PCR-SSCP를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예컨대 체액에서의, 유전자 서열의 검출 및 정량화가 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제5,496,699호에 기재되어 있다.
프라이머 및 프로브
상기에 정의된 바와 같이, 프라이머는 신생 핵산의 주형 의존적(template-dependent process) 합성을 프라이밍할 수 있는 모든 핵산을 포함하도록 의도된다. 통상적으로, 프라이머는 10 내지 20 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오타이드이며, 이보다 긴 서열도 사용 가능하다. 프라이머는 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로 제공될 수 있으며, 단일 가닥 형태가 바람직하다. 프로브는, 프라이머로서 작용할 수도 있지만, 다르게 정의된다. 프로브는, 아마도 프라이밍 가능하면서, 표적 DNA 또는 RNA에 결합하도록 설계되고, 증폭 과정에 사용될 것을 필요로 하지 않는다.
도 3과 4는 각각 GHR 유전자 내의 엑손 3 결실 부위 또는 엑손 3 주위의 게놈 DNA 서열을 보여준다. GHRfl cDNA 서열은 서열 번호 1로 나타내었다. 개체에서 특정 GHR 대립 유전자를 검출하고 구별하기 위하여, GHRd3 대립 유전자 및 GHRfl 대립 유전자 간의 뉴클레오타이드 서열에 있어서의 모든 차이를 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. GHRfl 게놈 DNA 또는 cDNA 분자를 동정하기 위하여, 엑손 3 핵산에 혼성화하도록 프라이머를 설계할 수 있다. GHRd3 게놈 DNA를 동정하기 위하여, 프라이머 또는 프로브를 GHRd3 대립 유전자의 게놈 DNA 서열에서 발견되는 바와 같은 GHR 유전자의 인트론 2 및 3의 접합부에 걸쳐 있도록 설계하여, 엑손 3을 포함하는 GHRfl 대립 유전자과 엑손 3을 포함하지 않는 GHRd3 대립 유전자 간의 구별이 가능하게 할 수 있다. 다른 예에 있어서, 프라이머 또는 프로브를 엑손 2 및 4 접합부에 걸쳐 있도록 설계하여 엑손 3을 포함하는 GHTRfl cDNA 분자와 엑손 3을 포함하지 않는 GHRd3 cDNA 분자 간의 구별이 가능하도록 함으로써 GHRd3 cDNA 분자를 동정할 수 있다. GHRd3 검출을 위한 적절한 프라이머의 다른 예들이 Pantel 등 (상기)와 후술하는 실시예 1에 열거되어 있다.
본 발명은 본 발명의 방법에 프라이머 및 프로브로서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 제시된 모든 서열로부터 유래하는 서열의 뉴클레오타이드의 인접 범위 (contiguous span) 뿐 아니라 이에 상보적인 서열(상보체)로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들을 포함하는 것일 수 있다. "인접 범위"는 길이가 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 또는 1000 뉴클레오타이드 이상일 수 있으며, 이들 길이의 인접 범위가 특정 서열 ID의 길이와 부합되는 정도이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 서열 목록에 열거되어 있는, 당해 표적 서열 주위의 정확한 인접 (flanking) 서열을 가질 것으로 제한되지 않음을 유의하여야 한다. 오히려, 마커로부터 보다 떨어져 있는 본 발명의 프라이머 또는 프로브 중 어느 하나 또는 다형태 주위의 인접 서열은 모든 이들의 의도된 용도와 부합하는 정도로 연장 또는 단축될 수 있는 것으로 인식되며, 본 발명은 이러한 서열을 구체적으로 예측한다. 본 명세서에 인용된 폴리뉴클레오타이드는 이들의 의도된 용도에 부합하는 모든 길이를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 인접 범위 외부의 인접 부위는 사실상 인간에 존재하는 천연 인접 서열과 상동일 필요는 없다. 뉴클레오타이드의 의도된 용도에 부합하는 모든 뉴클레오타이드 서열의 첨가를 구체적으로 의도한다. 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1, 4 또는 6 서열 뿐 아니라 이에 상보적인 서열의 뉴클레오타이드의 인접 범위로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 또는 이들을 포함한다. "인접 범위"는 길이가 8, 10, 12, 15, 50, 70, 80, 100, 250, 500 또는 1000 뉴클레오타이드 이상일 수 있다.
본 발명의 프로브는 이 기술 분야에 공지된 모든 방법, 특히 본 명세서에 기재된 특정 서열 또는 마커의 존재 여부를 시험할 수 있도록 하는 방법을 위하여 기재된 서열로부터 설계할 수 있다. 바람직한 프로브 세트는, 이 기술 분야에 공지된 모든 수단으로, 본 발명의 혼성화 분석법에 사용하기 위하여, 이들이 어떠한 특정 세트의 분석 조건 하에서도 다형태 중 하나의 대립 유전자에 선택적으로 결합하고 다른 것에는 결합하지 않도록 설계할 수 있다.
본 발명의 모든 폴리뉴클레오타이드는, 소망하는 경우, 분광 분석 수단, 광화학적 수단, 생화학적 수단, 면역 화학적 수단 또는 화학적 수단에 의하여 검출 가능한 표지를 결합시킴으로써 표지할 수 있다. 예컨대, 유용한 표지로서, 방사성 물질, 형광 염료 또는 바이오틴 등이 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드의 3' 및 5' 말단을 표지한다. 표지는 또한 프라이머를 포획하기 위하여 사용되어, 고체 지지체 상에서의 증폭된 DNA 등의 프라이머 확장 산물 또는 프라이머의 고정을 용이하게 할 수 있다. 포획 표지는 프라이머 또는 프로브에 부착되고, 고체상 시약의 특이적 결합 물질과 결합쌍을 형성하는 특이적 결합 물질 (예컨대, 바이오틴과 스트렙타비딘)일 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드 또는 프로브에 의하여 운반되는 표지의 유형에 따라서, 이를 표적 DNA를 포획하거나 검출하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오타이드, 프라이머 또는 프로브는 그 자체로 포획 표지로서 작용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예컨대, 고체상 시약의 결합 물질이 핵산 서열인 경우, 이는 프라이머 또는 프로브의 상보적 부분에 결합하여 프라이머 또는 프로브를 고체상에 고정시키도록 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 프로브가 그 자체로 결합 물질로서 작용하는 경우, 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 프로브가 표적과 상보적이지 않은 서열 또는 "꼬리(tail)"를 포함할 것이라는 것을 인식할 수 있을 것이다. 폴리뉴클레오타이드 자체가 포획 표지로서 작용하는 경우, 프라이머의 적어도 일부분은 고체상 상에서 뉴클레오타이드와 자유롭게 혼성화할 것이다. DNA 표지 기술은 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 모든 폴리뉴클레오타이드, 프라이머 및 프로브는 고체 지지체 상에 편리하게 고정시킬 수 있다. 고체 지지체는 이 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 반응 트레이의 웰의 벽, 시험관, 폴리스티렌 비드, 자성 비드, 니트로셀룰로오스 스트라이프, 멤브레인, 라텍스 입자 등의 미세 입자, 양 (또는 다른 동물) 적혈구 세포, 듀라사이트(duracyte) 등을 포함한다. 고체 지지체는 중요하지 않으며, 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진자라면 선택할 수 있는 것이다. 따라서, 라텍스 입자, 미세 입자, 자성 또는 비자성 비드, 멤브레인, 플라스틱 관, 마이크로타이터 웰의 벽, 유리 또는 실리콘 칩, 양 (또는 다른 적절한 동물) 적혈구 세포 및 듀라사이트 등은 모두 적절한 예이다. 고체상에 핵산을 고정시키는 적절한 방법에는, 이온 상호 작용, 소수 상호 작용, 공유적 상호 작용 등이 있다. 본 명세서에 사용된 바로서, 고체 지지체는 불용성인 또는 후속 반응에 의하여 불용성으로 될 수 있는 모든 물질을 의미한다. 고체 지지체는 그 고유 능력에 있어서 포획 시약을 끌어 당기고 고정화시킬 수 있는 것으로 선택할 수 있다. 또는, 고체상은 포획 시약을 끌어 당기고 고정화시키는 능력을 갖는 추가적인 수용체를 갖는 것일 수 있다. 추가적인 수용체는 포획 시약에 접합된 하전 물질 또는 포획 시약 자체에 대하여 반대 전기로 하전된 하전 물질을 포함할 수 있다. 또 다른 대안으로서, 수용체 분자는 고체 지지체 상에 고정되거나 부착되고, 특이적 결합 작용을 통하여 포획 시약을 고정시키는 능력을 갖는 모든 특이적 결합 물질일 수 있다. 수용체 분자는 분석의 수행 전 또는 분석의 수행 동안, 고체 지지체 물질에 포획 시약을 간접적으로 결합시킬 수 있다. 따라서 고체상은 플라스틱, 유도체화 플라스틱 (derivatized plastic), 자성 또는 비자성 금속, 시험관의 유리 또는 실리콘 표면, 마이크로타이터 웰, 쉬트, 비드, 미세 입자, 칩, 양 (또는 다른 적절한 동물) 적혈구 세포, 듀라사이트 및 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지된 다른 형상일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 개별적으로 하나의 고체 지지체 상에 부착 또는 고정시키거나, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 또는 25개 이상의 상이한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 군으로 하나의 고체 지지체 상에 부착 또는 고정시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 이외의 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 동일한 고체 지지체에 부착시킬 수 있다.
본 명세서에 제시된 모든 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체 상의 중복된 영역 또는 임의 위치에 부착될 수 있다. 또는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 각각의 폴리뉴클레오타이드가 고체 지지체 상의 다른 폴리뉴클레오타이드의 부착 부위와 중복하지 않는 별개의 영역에 부착되어 있는 정렬 어레이에 부착되어 있을 수 있다. 바람직하게는, 이러한 폴리뉴클레오타이드 정렬 어레이는, 구별된 별개의 위치가 기록되고 분석 과정의 일부로서 접근될 수 있는, "어드레서블(addressable)"하게 설계할 수 있다. 어드레서블 폴리뉴클레오타이드 어레이는 통상적으로 공지된 상이한 자리에서 기판의 표면에 결합하는 다수의 상이한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함한다. 각각의 폴리뉴클레오타이드의 정확한 위치 정보는 이들 "어드레서블" 어레이를 혼성화 분석에 특히 유용하게 한다. 이 기술 분야에 알려진 모든 어드레서블 어레이 기술을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 함께 사용할 수 있다. 이들 폴리뉴클레오타이드 어레이의 한 구체예는 유전자칩(Genechip)으로 알려진 것으로, 미국 특허 제5,143,854호, PCT 공개 공보 제90/15070호 및 92/10092호에 일반적으로 개시된 바 있다. 이들 어레이는 일반적으로 기계적 합성법 또는 광 유도 합성법을 사용하여 생산할 수 있으며, 이들은 포토리쏘그래피법와 고상 올리고뉴클레오타이드 합성법과의 조합을 포함할 수 있다 (Fodor 등, Science, 251: 767-777, 1991). 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 어레이 고정은, 통상 프로브를 칩의 고체 표면 상의 고밀도 어레이에 고정시키는, 일반적으로 "대규모 고정 폴리머 합성법 (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis)" (VLSIPS)라고 정의된 기술의 개발에 의하여 가능해졌다. VLSIPS 기술의 예가 미국 특허 제5,143,854호, 제5,412,087호 및 PCT 공개 공보 WO 90/15070, WO 92/10092 및 WO 95/11995에 기재되어 있으며, 이들은 광 유도 합성법 등의 기술을 통하여 올리고뉴클레오타이드 어레이를 형성하는 방법을 개시하고 있다. 고체 지지체 상에 고정된 뉴클레오타이드 어레이를 제공하기 위한 전략의 계획에 있어서, 혼성화 패턴 및 서열 정보를 최대화하기 위한 의도로 칩 상의 뉴클레오타이드 어레이를 배열하고 디스플레이하기 위한 추가적 프리젠테이션 전략이 개발되었다. 이러한 프리젠테이션 전략은 PCT 공개 공보 WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 및 WO 97/31256에 기재되어 있다.
주형 의존 증폭법 (Template Dependent Amplification Methods)
많은 주형 의존 방법을 사용하여 주어진 주형 샘플에 존재하는 마커 서열을 증폭시킬 수 있다. 잘 알려진 증폭법 중 하나는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)이며, 이는 미국 특허 제4,683,195호, 4,683,202호, 제4,800,159호 및 "Innis 등, PCR Protocols, Academic Press, Inc. San Diego Calif., 1990." 등에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 완전히 참조로서 본 명에서에 포함된다.
간단히 말해서, PCR에 있어서, 마커 서열의 반대편 상보적 가닥 상의 영역과 상보적인 두 개의 프라이머 서열을 제조한다. 예컨대, 택 중합효소 (Taq polymerase)와 같은 DNA 중합효소와 함께 반응 혼합물에 과량의 데옥시뉴크레오사이드 트리포스페이트를 첨가한다. 샘플에 마커 서열이 존재하는 경우, 프라이머들은 상기 마커에 결합하고, 중합 효소는 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 마커 서열을 따라서 프라이머를 연장시킬 것이다. 반응 혼합물의 온도를 승온 및 감온시킴으로써, 연장된 프라이머를 마커로부터 분리하여 반응 산물을 형성하고, 여분의 프라이머는 마커와 반응 산물에 결합하고, 반응 과정은 반복될 것이다.
증폭된 mRNA의 양을 정량하기 위하여 역전사 효소 PCR 증폭 과정을 수행할 수 있다. RNA를 cDNA로 역전사하는 방법은 잘 알려져 있으며, Sambrook 등의 "In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989"에 개시되어 있다. 또 다른 역전사 방법은 열안정적인 RNA 의존 DNA 중합효소를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 WO 90/07641에 기재되어 있다. 중합 효소 연쇄 반응 방법은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
다른 증폭 방법은 리가아제 연쇄 반응법 [ligase chain reaction (LCR), 미국 특허 제5,494,810호, 제5,484,699호, 유럽 특허 제320 308호, 이들은 각각 본 명세서에 참조로서 포함됨)이다. LCR에 있어서, 두 개의 상보적 프로브 쌍을 제조하는데, 표적 서열이 존재하면, 각각의 쌍은 표적 서열의 반대편 상보적 가닥에 결합하여 서로 접하게 될 것이다. 리가아제가 존재하는 경우, 두 개의 프로브 쌍은 연결되어 단일 단위체를 형성할 것이다.
온도를 순환시켜, PCR에서와 같이, 결합된 연결 단위체들을 표적으로부터 분리시킨 후, 여분의 프로브 쌍의 연결을 위한 "표적 서열"로서 사용한다. 미국 특허 제4,883,750호는 프로브 쌍을 표적 서열에 결합시키기 위한 LCR과 유사한 방법을 기재하고 있다.
RNA 유도 RNA 중합 효소인 큐베타 복제효소 (Qbeta Replicase)를 본 발명의 또 다른 증폭 방법으로서 사용할 수 있다. 이 방법에 있어서, 타겟 부위와 상보적 부위를 갖는 복제성 RNA 서열을 RNA 중합 효소의 존재 하에서 샘플에 첨가한다. 중합 효소는 복제성 서열을 복제할 것이며, 이는 검출 가능할 것이다. 유사한 방법이 또한 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제4,786,600호에 기재되어 있으며, 이는 RNA 유도 RNA 중합 효소에 의한 상보적 단일 가닥 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있는 재조합 RNA 분자와 관련있다. 이와 같이 형성된 산물 분자는 또한 원래 재조합 RNA 분자의 추가적 복제본 합성을 위한 주형으로서 역할할 수 있다.
제한 효소 인식 부위의 하나의 가닥 내에 뉴클레오타이드 5'-[알파-티오]-트리포스페이트를 포함하는 표적 분자를 증폭시키기 위하여 제한 엔도뉴클레아제와 리가아제를 사용하는 등온 증폭법 (isothermal amplification method) 또한 본 발명의 핵산 증폭에 사용될 수 있다 (Walker 등, (1992), Proc.Nat'l Acad Sci. USA, 89: 392-396; 미국 특허 제5,270,184호, 이들은 본 명세서에 참조로서 포함됨). 미국 특허 제5,747,255호 (본 명세서에 참조로서 포함됨)는 폴리뉴클레오타이드 결실을 위하여 절단 가능한 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 등온 증폭을 기재하고 있다. 여기에 기재된 방법에 있어서, 서로 상보적 서열을 포함하고, 완벽하게 짝이 맞는 이중 가닥이 연결(linkage)을 포함하여 형성될 때 마다 절단되는 하나 이상의 절단 가능한 연결을 포함하는 별개의 올리고 뉴클레오타이드 집단이 제시되어 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드가 제1 올리고뉴클레오타이드 접촉할 때, 절단이 일어나고, 제2 올리고뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 제1 단편을 생성한다. 이러한 혼성화시에, 제2 올리고뉴클레오타이드를 절단하여 표적 폴리뉴클레오타이드와 유사한 방법으로 제1 올리고뉴클레오타이드와 차례로 혼성화 할 수 있는, 제2 단편을 방출한다.
가닥 치환 증폭법 (Strand Displacement Amplification, SDA)은, 예컨대 새김눈 번역(nick translation)과 같이, 여러번의 가닥 치환과 합성을 수반하는 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또 다른 방법이다 (예컨대, 미국 특허 제5,744,311호; 제5,733,752호; 제5,733,733호; 제5,712,124호). 회복 연쇄 반응 (Repair Chain Reaction, RCR)이라고 불리는 유사한 방법은 증폭을 위하여 표적화된 영역을 통하여 수 개의 프로브를 어닐링한 후, 4 개의 염기중 2 개만이 존재하는 회복 반응을 수반한다. 다른 두 개의 염기는 결실을 용이하게 하기 위하여 바이오틴화된 유도체로서 첨가할 수 있다. 유사한 접근이 SDA에 사용된다. 표적 특이적 서열은 또한 순환 프로브 반응 (cyclic probe reaction, CPR)을 사용하여 검출할 수 있다. CPR에 있어서, 비특이적 DNA의 3' 및 5' 서열 및 특이적 DNA의 중간 서열을 갖는 프로브가 샘플에 존재하는 DNA와 혼성화한다. 혼성화시 중에, 반응물을 RNaseH와, 분해 후 방출되는 특유의 산물로서 정의되는 프로브 산물로 처리한다. 원래 주형을 다른 순환 프로브로 어닐링시키고, 반응을 반복한다.
본 발명에 있어서, 본 명세서에 완전히 참조로서 포함된, 영국 출원 제2 202 328호와 PCT 출원 제PCT/US89/01025호에 기재된 또 다른 증폭법을 사용할 수 있다. 전자의 출원에 있어서, "변형된" 프라이머가 PCR 유사, 주형 의존 및 효소 의존 합성에 사용된다. 프라이머는 포획 모이어티 (예컨대, 바이오틴) 및/또는 검출자 모이어티 (예컨대, 효소)를 사용하는 표지에 의하여 변형될 수 있다. 후자의 출원에 있어서, 과량의 표지된 프로브를 샘플에 첨가한다. 표적 서열의 존재시, 프로브는 결합하고 촉매적으로 절단된다. 절단 후, 표적 서열은 그대로 방출되어 여분의 프로브에 의하여 결합된. 표지된 프로브의 절단은 표적 서열의 존재의 신호이다.
다른 핵산 증폭 과정은 핵산 서열 기초 증폭 (NASBA) 및 3SR (Kwok 등, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86: 1173; 및 WO 88/10315, 본 명세서에 완전히 침조로서 포함)을 포함하는 전사 기초 증폭 시스템 (TAS)을 포함한다. NASBA에 있어서, 표준 페놀/클로로포름 추출, 임상 샘플의 열 변성, 용해 버퍼 처리, DNA 및 RNA 또는 RNA의 구아니디움 클로라이드의 분리용 미니스핀 컬럼에 의한 증폭을 위한 핵산은 제조할 수 있다. 이들 증폭 기술은 표적 특이적 서열을 갖는 프라이머를 어닐링하는 것을 수반한다. 중합 후, DNA/RNA 하이브리드는 RNaseH로 처리하고, 이중 가닥 DNA 분자는 다시 열 변성시킨다. 두 경우 모두, 두 번째 표적 특이적 프라이머를 첨가하여 단일 가닥 DNA를 완전히 이중 가닥으로 만든 후, 중합시킨다. 그리고 나서, 이중 가닥 DNA 분자를 T7 또는 SP6과 같은 RNA 중합효소에 의하여 다중 전사시킨다. 등온 순환 반응에 있어서, RNA를 단일 가닥 DNA로 역전사시키고 나서, 이중 가닥으로 변환시킨 후, T7 또는 SP6와 같은 RNA 중합 효소로 다시 한번 전사시킨다. 절단된 형태이건 완전한 형태이건, 얻어진 산물은 표적 특이적 서열을 나타낸다.
Davey 등의 유럽 특허 제329 822호 (본 명세서에 완전히 참조로서 포함됨)는 본 발명에 사용될 수 있는, 단일 가닥 RNA (ssRNA), ssDNA 및 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 순환적으로 합성하는 것을 수반하는 핵산 증폭 방법을 개시하고 있다. ssRNA는 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 위한 주형으로, 역전사 효소 (RNA 의존 DNA 중합 효소)에 의하여 연장된다. 그리고 나서, 리보뉴클레아제 H (RNase H, DNA 또는 RNA 중 어느와의 이중 가닥에 특이적인 DNARNase)에 의하여 얻어진 DNA:RNA 이중 가닥으로부터 RNA를 제거하다. 얻어진 ssDNA는 제2 프라이머를 위한 주형이며, 이는 또한 주형에 대한 상동성에 대한 RNA 중합 효소 프로모터 (T7 RNA 중합 효소에 의하여 예시됨) 5' 서열을 포함한다. 그리고 나서, 이 프라이머를 DNA 중합 효소 (E. coli의 DNA 중합 효소 I의 큰 "Klenow" 단편에 의하여 예시됨)에 의하여 연장시켜, 프라이머들 사이에 원래 RNA와 동일한 서열을 갖고 한쪽 말단에 프로모터 서열을 추가로 갖는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 분자를 생성한다. 이 프로모터 서열은 적절한 RNA 중합 효소에 의하여 DNA의 많은 RNA 복제본을 만들기 위하여 사용할 수 있다. 그리고 나서, 이들 복제본을 순환에 재진입시켜, 매우 신속한 증폭을 이끌수 있다. 적절한 효소를 선택하여, 각 순환에 효소를 첨가하지 않고 상기 증폭을 등온적으로 수행할 수 있다. 상기 방법의 순환적 특성 때문에, 개시 서열은 DNA 또는 RNA 중 하나의 형태로 선택할 수 있다.
PCT 출원 WO 89/06700 (본 명세서에 완전히 참조로서 포함됨)은 프로모터/프라이머 서열의 표적 단일 가닥 DNA (ssDNA)와의 혼성화에 기초하여 핵산 서열의 증폭을 계획한 후, 상기 서열의 다수의 RNA 복사본을 전사하는 것을 개시한다. 이러한 계획은 비순환적으로, 즉, 새로운 주형이 RNA 전사체 생성물로부터 생산되지 않는다. 다른 증폭 방법은 "RACE"와 "한방향 (one-sided) PCR" (Frohman "In: PCR Protocols. A Guide To Methods And Applications, Academic Press, N. Y., 1990; 및 O'hara 등, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86: 5673-5677; 이들은 각각 완전히 참조로서 포함됨).
얻어진 "디올리고뉴클레오타이드"의 서열을 갖는 핵산의 존재하에서 두 개 (또는 그 이상의) 올리고뉴클레오타이드를 연결시켜 상기 디올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 것에 기초하는 방법 또한 본 발명의 증폭 단계에 사용할 수 있다 (Wu 등, (1989) Genomics, 4: 560, 본 명세서에 참조로서 포함됨).
서던(Southern)/노던(Northern) 블라팅
블라팅 기술은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 서던 블라팅은 표적으로서 DNA를 사용하는 반면, 노던 블라팅은 표적으로서 RNA를 사용한다. cDNA 블라팅은 블라팅 또는 RNA 종과 많은 측면에서 유사하지만, 이들은 각각은 상이한 유형의 정보를 제공한다.
간단히 말해서, 적절한 매트릭스, 가끔은 니트로셀룰로오스 필터 상에 고정되어 있는 DNA 또는 RNA 종을 표적화하기 위하여 프로브를 사용한다. 상이한 종은 공간적으로 분리되어 있어야 분석이 용이하다. 이는 종종 핵산 종을 겔 전기영동한 후 필터상으로 "블라팅"하여 달성할 수 있다.
이어서, 블라팅된 표적을 변성과 재혼성화를 촉진하는 조건 하에서 (일반적으로 표지된) 프로브와 함께 인큐베이팅한다. 상기 프로브는 표적과의 염기쌍으로 설계되기 때문에, 프로브는 변성 조건 하에서 표적 서열의 일부분에 결합할 것이다. 그리고 나서 결합하지 않은 프로브는 재거하고, 상기한 바와 같이 검출을 완료한다.
분리법
단일 단계 또는 다른 단계로, 주형과 특이적 증폭이 일어났는지 여부를 측정하기 위한 과량의 프라이머로부터 증폭 산물을 분리하는 것이 일반적으로 바람직하다. 한 구체예에 있어서, 증촉 산물을 표준 방법을 사용하여 아가로오스, 아가로오스-아크릴아마이드 또는 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동에 의하여 분리한다. Sambrook 등, 1989 참조.
또는, 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 많은 종류의 크로마토그래피가 있다: 흡수 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 분자체 크로마토그래피, 및 컬럼 크로마토그래피, 종이 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 포함하여 이들을 사용하기 위한 많은 특수 기술들 (Freifelder. Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed. Wm. Freeman and Co., New York, N. Y., 1982).
검출법
마커 서열의 증폭을 확인하기 위하여 산물을 가시화시킬 수 있다. 전형적인 한 가시화 방법은 에티디움 브로마이드를 사용하여 젤을 염색하고 UV광 하에서의 가시화를 수반한다. 또는, 증폭 산물을 방사선 표지 또는 형광 표지된 뉴클레오타이드로 내부 표지시킨다면, 증폭 산물은, 분리 후, 적절한 자극 스펙트럼 하에서 x-레이 필름에 노출되거나 가시화될 수 있다.
한 구체예에 있어서, 간접적으로 가시화시킬 수 있다. 증폭 산물의 분리 후, 표지된 핵산 프로브를 증폭된 마커 서열과 접촉시킨다. 프로브를 발색단 (chromophore)과 접합시키는 것이 바람직하지만, 방사선 표지할 수도 있다. 다른 구체예에 있어서, 프로브를 항체 또는 바이오틴과 같은 결합 파트너와 접합시키고, 결합 쌍의 다른 구성원은 검출 가능한 모이어티를 갖는다.
한 구체예에 있어서, 표지된 프로브를 사용하여 검출한다. 사용되는 기술은 이 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 분자 프로토콜에 대한 많은 표준 서적에서 찾아볼 수 있다. Sambrook 등, 1989 참조. 예컨대, 발색단 또는 방사선 표지된 프로브 또는 프라이머는 증폭 동안 또는 증폭 후에 표적을 동정한다.
상기한 바의 한 가지 예가, 본 명세서에 참조로서 포함된 미국 특허 제5,279,721호에 기재되어 있으며, 이는 자동 전기영동 및 핵산 전달을 위한 장치 및 방법을 개시하고 있다. 상기 장치는 젤의 외부적 조작없이 전기영동 및 블라팅을 가능하게 하고 본 발명의 방법을 수행하기에 이상적으로 적합화되어 있다.
또한, 표준 서열 분석법을 사용하여 상기의 증폭 산물의 서열 분석을 하여 다양한 종류의 변이를 확인할 수 있다. 특정 방법 내에서, 최적 시퀀싱을 위하여 설계된 프라이머 세트를 이용하는 서열 분석에 의하여 유전자의 완전 분석을 수행한다 (Pignon 등, (1994) Hum. Mutat., 3: 126-132,1994). 본 발명은 이러한 유형의 분석법 중 어느 것 또는 모두가 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 서열을 사용하여, GHR 유전자를 통한 서열의 증폭이 가능하도록 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계할 수 있으며, 그리고 나서 상기 유전자를 직접적 시퀀싱에 의하여 분석할 수 있다.
이 기술 분야에 알려진 모든 다향한 시퀀싱 반응을 사용하여 샘플 서열을 상응하는 야생형 (대조군) 서열과 비교함으로써 GHR 유전자를 직접적으로 시퀀싱할 수 있다. 시퀀싱 반응의 예는 Maxam와 Gilbert (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560) 또는 Sanger (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)에 의하여 개발된 기술에 기초한 것들을 포함한다. 또한, 진단 분석의 수행시에 모든 다양한 자동 시퀀싱 방법을 사용할 수 있는 것으로 예측된다.
키트 구성 요소
GHR 및 그의 변이체를 검출하고 시퀀싱하는데 필요한 모든 필수적인 물질 및 시약을 한 키트에 모두 집합시킬 수 있다. 이것은 일반적으로 미리 선택된 프라이머와 프로브를 포함할 것이다. 증폭에 필요한 반응 혼합물을 제공하기 위하여, 다양한 중합 효소 [RT, Taq, 시퀀스 (Sequence) 등] 등의 핵산 증폭에 적합한 효소, 데옥시뉴클레오타이드 및 완충액을 또한 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 일반적으로, 적절한 벙법으로, 각각의 개별적 시약과 효소 및 각각의 프라이머 또는 프로브용 분리된 용기를 포함할 것이다.
상대적 정량적 RT-PCR TM 에 대한 설계 및 이론적 고려.
RNA를 cDNA로 역전사 (RT)시킨 후 상대적 정량적 PCR (relative quantitative PCR, RT-PCR)를 수행하여 환자로부터 분리된 특정 mRNA 종의 상대적 농도를 측정할 수있다. 특정 mRNA 종의 농도가 다양하다는 것을 측정함에 의하여, 특정 mRNA를 코딩하는 유전자가 상이하게 발현하는 것으로 나타났다. 정량적 PCR은 예컨대 GHR 경로를통하여 작용하는 약제로 치료될 환자, 감소된 GHR 활성을 앓는 것으로 의심되는, 또는 바람직하게는 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용과 관련된 것일 수 있는 거인증 또는 말단 비대증; 나트륨 및 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 또는 고혈압을 앓고 있는 환자에서의 GHRd3 및 GHRfl mRNA의 상대적 농도를 조사하는데 사용할 수 있다.
PCR에 있어서, 증폭된 표적 DNA 분자의 수는 일부 시약이 고갈될 때 까지 반응의 매 순환마다 약 2 배씩 증가한다. 그리고 나서, 순환 간 증폭된 표적에 증가가 나타나지 않을 때까지 증폭률은 점점 감소하게 된다. 그래프를 X축이 순환 회수이고, Y축이 증폭된 표적 DNA 농도의 로그값이 되도록 플라팅하는 경우, 플라팅된 점들을 연결하면 특징적 모양의 곡선이 형성된다. 첫 번째 순환을 시작으로 하여, 선의 경사는 양의 값이고 일정하다. 이는 곡선의 선형 부분을 의미하는 것이다. 시약이 고갈된 후, 선의 경사는 감소하고 결국 0이 된다. 이 시점에서, 증폭된 표적 DNA의 농도는 어떤 고정값에 접근하게 된다. 이는 곡선의 편평한 부분을 의미하는 것이다.
PCR 증폭의 선형 부분에서의 표적 DNA의 농도는 반응 개시 전의 초기 표적 농도에 정비례한다. 동일한 횟수의 순환이 완료되고 선형 범위에 있는 PCR 반응에서의 표적 DNA의 증폭 산물의 농도를 측정함으로써, 원래 DNA 혼합물 내의 특정 표적 서열의 상대적 농도를 측정하는 것이 가능하다. DNA 혼합물이 상이한 조직 또는 세포로부터 분리된 RNA로부터 합성된 cDNA인 경우, 표적 서열이 유래하는 특정 mRNA의 상대적 과다(abundance)를 각 조직 도는 세포에 대하여 측정할 수 있다. 이러한 PCR 산물 농도와 상대적 mRNA 과다 간의 정비례는 PCR 반응의 선형 범위에서만 사실이다.
곡선의 편평한 부분에서의 표적 DNA의 최종 농도는 반응 혼합물 내의 시약의 가용성에 의하여 측정하고, 표적 DNA의 원래 농도에 의존한다. 따라서, RNA 집단의 수집을 위한 RT-PCR에 의하여 결정될 수 있는, mRNA 종의 상대적 과다 전에 충족되어야 하는 첫 번째 조건은 PCR 반응이 곡선의 선형 부분에 있을 때, 증폭 PCR 산물의 농도가 샘플링되어야 한다는 것이다.
특정 mRNA 종의 상대적 과다를 성공적으로 측정하기 위하여 RT-PCR 실험에 있어서 충족되어야 하는 두 번째 조건은 증폭된 cDNA의 상대적 농도가 몇 가지 독립적 기준으로 표준화되어야 한다는 것이다. RT-PCR 실험의 목적은 샘플에서의 모든 mRNA 종의 평균 과다값과 관련하여 특정 mRNA 종의 과다를 측정하는 것이다. 후술하는 실험에 있어서, GHRfl에 대한 mRNAs를 GHRd3 mRNA의 상대적 과다를 비교할 표준으로서 사용할 수 있다.
경쟁적 PCR에 대한 대부분의 프로토콜은 대략적으로 표적과 동일하게 과다한 내부 PCR 표준을 사용한다. 이들 계획은 PCR 증폭 산물이 선형기 동안에 샘플링된 것인 경우 효과적이다. 상기 산물이 반응이 편형기에 도달했을 때 샘플링된 것인 경우라면, 덜 과다한 산물이 상대적으로 과존재하게 된다. RNA 샘플의 특이한 발현의 조사시의 경우와 같이, 많은 상이한 RNA 샘플에 대하여 수행된 상대적 과다의 비교는 RNAs의 상대적 과다에 있어서의 차이가 이들의 실제보다 적게 나타나도록 하도록 왜곡되게 된다. 내부 표준이 표적보다 매우 많다면, 이는 크게 문제되지 않는다. 내부 표준이 표적보다 많다면, RNA 샘플들 간 직접적인 선형 비교를 수행할 수 있다.
상기 논의는 임상적으로 유도된 물질의 RT-PCR 분석에 대한 이론적 고려를 설명한 것이다. 임상 샘플 고유의 문제는 이들의 양이 다양하다는 것 (표준화 문제를 일으킴)과 이들의 질이 다양하다는 것 (바람직하게는 표적보다 크기가 큰 신뢰성 있는 내부 대조군의 공 증폭을 필요로 함)이다. RT-PCR을, 내부 표준이 표적 cDNA 단편보다 큰 증폭 가능한 cDNA 단편이고, 내부 표준을 코딩하는 mRNA의 과다가 표적을 코딩하는 mRNA보다 약 5 내지 100 배 큰, 내부 표준을 사용하는 상대적 정량적 RT-PCR로서 수행하는 경우, 이러한 문제점은 모두 해결된다. 이러한 분석은 각각의 mRNA 종의 상대적 과다를 측정하는 것이며, 절대적 과다를 측정하는 것이 아니다.
외부 표준 프로토콜을 사용하는 보다 전형적인 상대적 정량적 RT-PCR 분석을 사용하여 다른 연구를 수행할 수 있다. 이러한 분석은 증폭 곡선의 선형 부분 중의 PCR 산물을 샘플링한다. 샘플링에 대하여 최적화된 PCR 횟수는 각각의 표적 cDNA 단편에 대하여 실험적으로 결정하여야 한다. 또한, 다양한 조직 샘플에서 분리된 각각의 RNA 집단의 역전사효소 산물은 증폭 가능한 cDNA의 동등 농도에 대하여 신중하게 정상화하여야 한다. 이러한 농도는, 상기 분석이 절대적 mRNA 과다를 측정하는 것이기 때문에, 매우 중요하다. 절대적 mRNA 과다는 정상화된 샘플에서만 특이한 유전자 발현의 측정으로서 사용된다. cDNA 제제의 정상화 및 증폭 곡선의 선형 범위의 실험적 결정이 지연되고 시간이 많이 소요되는 과정인 반면, 얻어진 RT-PCR 분석은 내부 표준을 사용하는 상대적 정량적 RT-PCR로부터 얻어진 것보다 우수하다.
이러한 이점의 한 가지 이유는, 내부 표준/경쟁자 없이, 모든 시약이 증폭 곡선의 선형 범위에 있는 단독 PCR 산물로 변환될 수 있어서, 분석의 민감도를 상승시킨다는 것이다. 다른 이유는 하나의 PCR 산물만을 사용하는 전기 영동 젤 또는 다른 디스플레이 방법에서의 산물의 디스플레이가 덜 복잡하고, 배경 기술이 적으며, 이해하기 용이하다는 것이다.
칩 기술
Hacia 등 (1996, Nature Genetics, 14:441-447) 및 Shoemaker 등 (1996, Nature Genetics 14: 450-456)에 기재된 것과 같은 칩 기초 DNA 기술은 본 발명에 있어서 특히 고려된 기술이다. 간단히 말해서, 이들 기술은 대량의 유전자를 신속하고 정확하게 분석하기 위한 정량적 방법을 수반한다. 유전자를 올리고뉴클레오타이드로 표지하거나 또는 고정된 프로브 어레이를 사용함으로써, 고밀도 어레이로서 표적 분자를 분리하고 혼성화에 기쵸하여 이들 분자를 스크리닝하기 위하여 칩 기술을 사용할 수 있다. Pease 등 (1994, Proc.Nat'l Acad Sci. USA, 915022-5026); Fodor 등 (1991, Science, 251: 767-773) 참조.
GHRd3 또는 GHRfl 단백질의 검출 방법
ELISA와 웨스턴 블로팅과 같은 기술을 통하여, 건강한 조직과 병든 조직의 GHRd3 및/또는 GHRfl 함량을 특징화하는데 항체를 이용할 수 있다. GHRd3 및 GHRfl 폴리펩타이드를 수득하는 방법은 본 명세서에 상세히 설명되어 있으며 공지 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 마찬가지로, GHRd3 및 GHRfl 이소형과 선택적으로 결합할 수 있는 항체의 제조 방법도 자세히 설명한다.
한가지 구체예에서, GHRd3, GHRfl 및 GHRd3과 GHRfl을 식별하지 못하는 GHR 항체를 비롯한 GHR 항체들을 ELISA 측정에 이용하는 것을 고려할 수 있다. 예컨대, 선택된 표면, 바람직하게는, 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 웰과 같은 단백질 친화도를 나타내는 표면 상에 항GHR 항체를 고정시킨다. 불완전하게 흡착된 물질들을 제거하기 위해 세정한 후, 이 측정 플레이트를 소의 혈청 알부민 (BSA), 카제인 또는 분유 용액과 같이 테스트 항혈청과 관련하여 항원적으로 중립적인 것으로 알려진 비특이적 단백질과 결합 또는 코팅시키는 것이 바람직하다. 이에 의해 고정 표면 상의 비특이적 흡착 부위를 차단할 수 있고 따라서 그 표면에 대한 항원의 비특이적 결합에 기인하는 백그라운드도 감소시킬 수 있다.
항체를 웰에 결합시켜, 비반응성 물질로 코팅시켜 백그라운드를 감소시키고 비결합 물질을 제거하기 위해 세정한 후, 고정 표면을 테스트될 샘플과 접촉시켜 면역 복합체 (항원/항체)를 형성시킨다.
테스트 샘플과 결합 항체 사이의 특이적 면역복합체 형성 및 후속적인 세정 후, 면역복합체 형성의 생성 여부 및 심지어는 그 양조차도 이를 제1 항체와 달리 GHR에 대해 특이적인 제2 항체로 처리함으로써 측정할 수 있다. 적절한 조건은 바람직하게는 샘플을 BSA, 소의 감마 글로불린 (BGG) 및 포스페이트 완충염수 (PBS)/Tween과 같은 희석제로 샘플을 희석하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 이들 첨가된 제제들은 또한 비특이적 백그라운드를 감소시키는 경향이 있다. 이어서, 층을 형성하는 항혈청을 약 2 내지 약 4시간 동안, 바람직하게는 약 25 내지 27℃에서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 항혈청과 접촉된 표면을 세정하여 비면역복합체 물질을 제거한다. 바람직한 세정 공정은 PBS/Tween 또는 붕산염 완충액과 같은 용액을 이용한 세정을 포함한다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 항체는 적절한 발색 기질과 함께 인큐베이션될 경우 발색 반응을 나타내는 결합 효소를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 예컨대, 면역복합체 형성에 적절한 조건 및 기간 동안 제2 항체 결합 표면을 우레아제 또는 퍼옥시다제와 컨쥬게이션된 항인간 IgG와 함께 접촉 및 인큐베이션시키는 것이 소망될 수 있다 (예컨대, PBS/Tween와 같은 PBS 함유 용액 중 실온에서 2시간 인큐베이션).
제2 효소로 표시된 항체와 함께 인큐베이션되어 비결합 물질의 제거를 위해 세정을 거친 후, 우레아와 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지도-디-(3-에틸-벤즈티아졸린)-6-설폰한 (ABTS) 및 H2O2와 같은 발색 기질과 함께 인큐베이션시킴으로써 표지량을 정량한다 (효소 표지로서 퍼옥시다제를 사용한 경우). 이어서, 예컨대 육안검사 가능한 스펙트럼 분광광도계를 이용하여, 발색도를 측정함으로써 정량을 수행한다.
샘플을 측정 플레이트와 먼저 결합시킴으로써 전술한 포맷을 변형시킬 수도 있다. 이 경우, 일차 항체를 측정 플레이트와 함께 인큐베이션시킨 다음, 일차 항체에 대해 특이성을 갖는 표지된 이차 항체를 이용하여 결합된 일차 항체를 측정한다.
기타 여러가지 유용한 면역검출법의 공정들이 과학 문헌, 예컨대, Nakamura 등, In : Handbook of Experimental Immunology (제4판), Weir. E. , Herzenberg, L. A. Blackwell, C. , Herzenberg, L. (편집). Vol. 1. Chapter 27, Blackwell Scientific Publ. , Oxford, 1987에 설명되어 있으며 이들 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 통합된다. 면역측정법이란 가장 단순하고 직접적인 의미에서 결합 측정법이다. 어떤 바람직한 면역측정법은 방사선면역측정법 (RIA) 및 면역비드 포획측정법이다. 조직-섹션을 이용하는 면역조직화학적 검색법 역시 특히 유용하다. 그러나, 이러한 검색법이 이와 같은 기술로 한정되지 않음은 물론 웨스턴 블로팅, 도트 블로팅, FACS 측정법 등도 본 발명과 관련하여 이용가능함을 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
바람직한 예에서, 전술한 방법을 이용하여 GHRd3-특이적 항체를 이용하여 GHRd3 농도를 측정할 수 있다. 또 다른 방법에서는, GHRd3과 GHRfl을 구별하지 않고 GHR의 총량을 측정하고, GHRfl의 양을 측정한다. 미분화된 GHR과 GHRfl의 양의 차이가 곧, GHRd3의 존재량이다.
바람직하게는, 이러한 방법은 순환 중의 GHBP (예컨대 GHRd3 또는 GHRfl의 세포외 부분)의 양을 검출한다. 이 공정의 바람직한 예에 의해 미분화 GHR의 검색 (예컨대 GHRfl에 비해 미분화된 총 GHR로부터 GHRd3을 연역하기 위해), GHRd3의 검색 및/또는 GHRfl의 검색이 가능하다. 이러한 공정에는 ELISA 측정, 리간드 매개성 면역기능 측정 (LIFA) 및 방사선면역측정 (RIA)이 포함된다.
미분화된 GHR (예컨대 GHRd3 또는 GHRfl)을 검출하기 위해 Pflaum 등의 방법 ((1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101 (Suppl. 1):44) 및 Kratzsch 등의 방법 ((2001) Clin. Endocrinol. 54: 61-68)의 방법에 따라 LIFA를 수행할 수 있다. 간략히 설명하면, 한 예에서 마이크로타이터 플레이트를 코팅하기 위해 모노클로날 항rGHBP 항체를 사용하여 미분화 GHR를 검출한다. 혈청 샘플 또는 글라이코실화된 rGHBP 스탠다드를 10 ng/웰 hGH 및 바이오티닐화 트레이서로서 hGH에 대해 지향된 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 이 시그널을 유로피움으로 표지된 스트렙트아비딘 시스템에 의해 증폭시키고 플루오로미터를 이용하여 측정한다. 또 다른 예에서, Kratsch 등 ((1995) Eur. J. Endocrinol. 132:306-312)에 설명된 바와 같이 미분화된 GHBP를 검색하기 위하여, 표지된 항원으로서 125I-rhGHBP, 항rhGHBP 항체, 및 rhGHBP 스탠다드를 이용하여, 경쟁적 방사선면역측정법 (RIA)를 수행한다.
Kratsch 등 ((2001) Clin. Endocrinol. 54:61-68)에 설명된 또 다른 예에서는, 50 mmol/l 인산나트륨 완충액, pH 9.6 중에서 hGH 결합 부위 (Rowlinson 외 (1999)의 외부에서 GHBP에 결합하는 모노클로날 항체 10B8 100 ㎕로 마이크로타이터 플레이트를 코팅함으로써 미분화된 GHBP를 검출한다. 세정 단계 후, 75 ㎕의 측정 완충액 (50mM Tris-(히드록시메틸)-아미노메탄, 150 mM NaCl, 0.05% NaN3, 0.01% Tween 40, 0.5% BSA 0.05% 소의 감마 글로불린, 20 μmol/l 디에틸렌트리아민펜타 아세트산) 중 25 ㎕의 샘플 또는 스탠다드와 50 ng의 바이오틴-표지된 항GHGBP mAb 5C6 (gGH 결합 부위 (Rowlinson 외 (1999) 내에서 GHBP와 결합함)을 첨가하여 밤새 인큐베이션시킨다. 이어서 GHBP의 엑손 3-함유 fl형에 특이적인 항체를 이용하여 GHRfl의 양을 측정한다. 간단히는, 미분화 GHBP의 경우와 마찬가지로 마이크로타이터 플레이트 상에 mAb 10B8을 고정시킨다. 세척 단계 후, 25 ㎕의 샘플 또는 스탠다드와 Kratsch 등 (2001)에 설명된 GHRd3 펩타이드에 대한 토끼 폴리클로날 항체 75 ㎕를 첨가하고 밤새 인큐베이션시킨다. 각각의 웰에 20 ng 바이오티닐화된 쥐의 항토끼 IgG를 첨가하고 2시간 인큐베이션시킨 다음 반복하여 헹군다. 유로피움-표지되니 스트렙트아비딘 시스템에 의해 시그널을 증폭시키고 플루오로미터를 이용하여 측정한다. 양의 혈청으로 희석된, 재조합 비글라이코실화된 hGHBP를 스탠다드로서 사용한다.
본 발명에서 사용될 GHRd3에 특이적인 항체들을 공지 방법으로 수득할 수 있다. 분리된 GHRd3 단백질, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하여 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조를 위한 표준 기술을 이용하여 GHRd3에 결합하는 항체를 만든다. GHRd3 단백질을 사용할 수 있으며, 또는 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위해 GHRd3의 항원 펩타이드 단편을 제공한다.
GHRd3 폴리펩타이드는 공지 수단, 예컨대 개체로부터 얻은 생물학적 샘플을 정제시키거나 또는 보다 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드로부터 제조할 수 있다. GHRfl 아미노산 서열이 SEQ ID NOS:2 및 3에 나타나 있는데, GHRd3은 이들과는 엑손 3에 의해 코딩된 22개 아미노산이 결실된다는 차이가 있다. GHRd3의 항원성 펩타이드는 바람직하게는 SEQ ID NOS:2 및 3에 도시된 아미노산 서열의 적어도 8개의 아미노산 잔기를 포함하며 여기서 적어도 하나의 아미노산은 상기 엑손 3-코딩된 아미노산 잔기의 외부에 있다. 상기 항원성 펩타이드는 GHRd3의 에피토프를 포괄하며 이 펩타이드에 대해 발생된 항체가 GHRd3과 함께 특이적인 면역 복합체를 형성한다. 바람직하게는 이 항체가 GHRd3에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하고 GHRfl에는 실제로 결합하지 않는 것이 좋다. 바람직하게는, 항원 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 적어도 15개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 좋다.
항원성 펩타이드에 의해 포괄되는 바람직한 에피토프는 단백질의 표면에 위치한 GHRd3 대역들이다: 예컨대 친수성 대역.
GHRd3 면역원은 일반적으로, 적절한 대상 (예컨대 토끼, 염소, 마우스 또는 다른 포유류)을 면역원으로 면역시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적절한 면역원성 제제는 예컨대 재조합적으로 발현된 GHRd3 단백질 또는 화학적으로 합성된 GHRd3 폴리펩타이드이다. 이 제제는 애쥬번트, 프로인드 완전 또는 불완전 보조제 또는 면역자극제를 추가로 포함한다. 적절한 대상자를 면역원성 GHRd3 제제로 면역화시키면 폴리클로날 항GHRd3 항체 반응이 유도된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 항GHRd3 항체에 관한 것이다. 본 명세서에서 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 화성 부분, 즉, GHRd3와 같이, 항원에 특이적으로 결합 (면역반응하는)하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 가리킨다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분에는 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생산할 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 본 발명은 GHRd3에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 제공된다. 본 명세서에서 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 GHRd3의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위를 오직 1종만 함유하는 항체 분자들의 집단을 가리킨다. 따라서 모노클로날 항체 조성물은 일반적으로, 그것과 면역반응하는 특정 GHRd3 단백질에 대해 단일 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명은 SEQ ID NO: 2 또는 3의 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8 내지 10개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 45, 50, 또는 100개의 아미노산의 연속 스팬을 포함하는 에피토프 함유 폴리펩타이드에 선택적으로 결합할 수 있는 또는 선택적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 조성물에 관한 것으로서, 여기서 상기 연속적 스팬은 바람직하게는 GHR 유전자의 엑손 3에 의해 코딩된 상기 22 아미노산 스팬의 외부에 있는 적어도 1개의 아미노산을 포함하는 것이다.
폴리클로날 항GHRd3 항체는 전술한 바와 같이, 적절한 대상자를 GHRd3 면역원으로 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 면역화된 대상자의 항GHRd3 항체 역가는 고정화된 GHRd3을 이용하여 효소 결합된 면역흡착 측정법 (ELISA)와 같은 표준 기술에 의해 경시적으로 모니터링할 수 있다. 소망되는 경우, GHRd3에 지향된 항체 분자를 포유류 (예컨대 혈액으로부터)로부터 분리하고, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 공지 기술에에 의해 추가로 정제하여 IgG 분획을 얻는다. 면역화 후, 적절한 시기, 예컨대, 항GHRd3 항체 역가가 최고치에 달할 때, 항체 생산 세포를 대상자로부터 수득하여 Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495-497)에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 기술과 같은 표준 기술 (예컨대 Brown 등 (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown 등 (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh 등 (1976) PNAS 76:2927-31 ; 및 Yeh 등 (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), 보다 최근의 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kozbor 등 (1983) Immunol Today4 : 72), EBV-하이브리도마 기술 (Cole 등 (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77- 96) 또는 트리오마 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 사용할 수 있다. 모노클로날 항체 하이브리도마를 생산하기 위한 기술은 공지이다 (일반적으로 R. H. Kenneth, Monoclonal Antibodies 중: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp. , New York, N. Y. (1980); E. A. Lemer (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402; M. L. Gefter 등(1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36 참조). 간단하게는, 전술한 바와 같이 GHRd3 면역원으로 면역화시킨 포유동물로부터의 임파구 (일반적으로 비장세포)와 불멸 세포주 (일반적으로 골수종)를 융합시키고, 얻어진 하이브리도마 세포의 배양 상등액을 스크리닝하여 GHRd3과 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한다.
항GHRd3 모노클로날 항체 생산 목적을 위해, 임파구와 불멸화 세포주를 융합하는데 이용되는 많은 공지 프로토콜을 적용할 수 있다 (예컨대, G. Galfre 등 (1977) Nature 266: 55052; Gefter 등 Somatic Cell Genet., 상기문헌; Lerner, Yale J Biol. Med, 상기문헌; Kenneth, Monoclonal Antibodies, 상기문헌 참조). 또한, 당업자라면 이 밖에도 다른 많은 변형법들도 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 일반적으로, 불멸화 세포주 (예컨대 골수종 세포주)는 임파구와 동일한 포유동물 종으로부터 유래된다. 예컨대, 본 발명의 면역원 제제로 면역시킨 마우스로부터의 임파구를 불멸화 마우스 세포주와 융합시켜 쥐의 하이브리도마를 만들 수 있다. 바람직한 불멸화 세포주는 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지 ("HAT 배지")에 감수성이 있는 마우스 골수종 세포이다. 예컨대, P3-NSI/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Agl4 골수종 세포와 같은 여하한 수의 골수종 세포를 이 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 이용할 수 있다. 이 골수종 세포주들은 ATCC로부터 입수가능하다. 일반적으로, HAT-감수성 마우스 골수종 세포를 폴리에틸렌 글라이콜 ("PEG")를 이용하여 마우스 비장세포에 융합시킨다. 이 융합에 의해 결과된 하이브리도마 세포를, 융합되지 않거나 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는 (융합되지 않은 비장세포는 형질전환되지 않으므로 며칠 후 사멸한다) HAT 배지를 이용하여 선별한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 GHRd3에 결합하는 항체에 대해 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝함으로써 검색된다 (예컨대, 표준 ELISA 측정법).
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 제조에 대한 대안으로서, 모노클로날 항GHRd3 항체를 동정하고 GHRd3와 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리 (예컨대 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 분리함으로써, GHRd3에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원들을 분리한다. 파지 디스플레이 라이브러리를 제조 및 스크리닝하기 위한 키트는 시중에서 구입할 수 있다 (예컨대, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 No. 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAP.TM. Phage Display Kit, 카탈로그 No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 제조 및 스크리닝하는데 사용하기에 특히 적합한 방법과 시약의 예는 예컨대 Ladner 등 미국특허 No. 5,223, 409; Kang 등 PCT 국제 공개 No. WO 92/18619; Dower 등 PCT 국제 공개 No. WO91/17271 ; Winter 등 PCT 국제 공개 WO 92/20791; Markland 등 PCT 국제 공개 No. WO 92/15679 ; Breitling 등 PCT 국제 공개 WO 93/01288; McCafferty 등 PCT 국제 공개 No. WO 92/01047; Garrard 등 PCT 국제 공개 No. WO 92/09690; Ladner 등 PCT 국제 공개 No. WO 90/02809; Fuchs 등(1991)Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay 등 (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse 등 (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths 등 (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins 등 (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson 등 (1991) Nature 352: 624-628; Gram 등 (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad 등 (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom등 (1991)Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas 등 (1991) PNAS 88: 7978-7982; 및 cCafferty 등 Nature (1990) 348: 552-554에서 찾아볼 수 있다.
친화도 크로마토그래피 또는 면역침전법과 같은 표준 기술에 의해 GHRd3을 분리하기 위해 항 GHRd3 항체 (예컨대 모노클로날 항체)를 사용할 수 있다. 항 GHRd3 항체는 세포로부터 천연 GHRd3을 정제 및 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생산된 GHRd3의 정제를 용이하게 해준다. 뿐만 아니라, GHRd3 단백질의 발현 패턴과 풍부성을 평가하기 위해, GHRd3 단백질 (예컨대, 세포 용해물 또는 세포 상등액 중)을 검출하는데 항 GHRd3 항체를 사용할 수 있다. 예컨대 주어진 치료 섭생의 효능 측정을 위ㅐ, 임상적 테스트 공정의 일부로서 조직 중의 단백질 농도를 모니터링하기 위해 항GHRd3 항체를 진단적으로 이용할 수 있다. 검색은 항체를 검출가능한 물질과 커플링 (즉, 물리적 결합)시킴으로써 용이화시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보철기(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질 및 방사능 물질을 들 수 있다. 적절한 효소의 예로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있으며; 적절한 보철기 복합체의 예에는 스트렙트아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리쓰린이 포함되며; 발광 물질의 예로는 루미놀을 들 수 있고; 생체발광 물질의 예로는 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린을 들 수 있으며, 적절한 방사능 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 들 수 있다.
바람직한 예에서, 실질적으로 순수한 GHRd3 단백질 또는 폴리펩타이드가 얻어진다. 최종 제제 중의 단백질 농도를 예컨대 Amicon 필터 장치를 이용하여 ml 당 수마이크로그램 수준까지 농축시킴으로써 조정한다. 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 다음과 같이 제조할 수 있다: GHRd3 또는 그의 부분 중 에피토프에 대한 하이브리도마 융합 모노클로날 항체에 의한 모노클로날 항체 생산은 Kohler 및 Milstein의 고전적 방법 (Nature, 256: 495,1975) 또는 그의 유도변형법 (Harlow 및 Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53-242,1988)에 따라 제조될 수 있다.
간략히, 수주일에 걸쳐 GHRd3 또는 그의 부분 수 마이크로그램을 마우스에게 반복 접종한다. 이어서 마우스를 희생시키고 비장의 항체생산 세포를 분리한다. 이 비장 세포를 폴리에틸렌 글라이콜을 이용하여 마우스 골수종 세포와 융합시키고 융합되지 않은 과량의 세포들은 아미노프테린을 함유하는 선별 배지 (HAT 배지) 시스템에서 배양시킴으로써 파괴시킨다. 성공적으로 융합된 세포들을 희석하고 희석 부분 표본 (aliquot)을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣어 배양을 계속한다. Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980)에 최초로 설명되니 바와 같이, ELISA와 같은 면역측정 공정에 의해 웰의 상등액 중 항체 검출에 의해 항체 산생 클론을 동정한다. 선별된 양성 클론들을 증폭시키고 이들의 모노클로날 항체 산물을 수확한다. 모노클로날 항체 제조를 위한 상세한 공정은 Davis, L. 등 Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2에 설명되어 있다.
본 발명의 항체 조성물은 면역블롯 또는 웨스턴 블롯 측정법에 특히 유용하다. 이 항체는 니트로셀룰로스, 나일론 또는 이들의 조합과 같은 고상 지지체 매트릭스 상에 고정된 단백질의 동정을 위한 고친화도 일차 시약으로서 유용할 수 있다. 면역침전법 및 후속적인 젤 전기영동에서, 이들은 그에 대한 2차 시약이 항원 검색시 사용되는 불량 백그라운드를 일으키는, 항원을 검색하는데 사용되는 단일 공정 시약으로서 이용될 수 있다. 이와 관련해서, 웨스턴 블로팅과 연계적으로 사용되는, 면역학에 기초한 검색법은 독소 부분에 대해, 효소적으로, 방사선 표지되거나 형광 태그된 2차 항체를 사용하는 것이 특히 고려된다. 이러한 표지와 관련한 문헌으로 미국특허 제3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 및 4,366,241호를 들 수 있으며 이들 각각은 모두 본 명세서에 참조 통합된다. 물론, 당해 기술 분야에 알려진 바와 같이, 제2 항체 또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 어레인지먼트와 같은 2차 결합 리간드를 사용할 경우 부가적인 장점이 얻어질 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 GH는 천연 서열의 것이거나 변이체 형태일수도 있고, 천연, 합성 또는 재조합에 의해 만들어진 것일 수도 있다. 그 예로는 천연 서열이거나 또는 인간의 천연 서열과의 재조합 GH (GENOTROPINTM, 소마토트로핀 또는 소마트로핀)인 인간 성장 호르몬 (hGH), 및 소마트렘, 소마토트로핀 및 소마트로핀을 비롯하여, 재조합 DNA 기술 수단에 의해 생산된 모든 GH 또는 GH 변이체를 가리키는 재조합 성장 호르몬 (rGH)을 들 수 있다. 인간에 대해 사용하기 바람직한 것은 그의 N-말단에 메티오닌이 있거나 없을 수 있는, 재조합 인간 천연 서열, 성숙한 GH이다. 가장 바람직한 것은 재조합 인간 GH 폴리펩타이드인 GENOTROPINTM(Pharmacia, U.S.A.)이다. 또한 예컨대 1988년 7월 5일자 미국특허 4,775,465호 및 Goeddel 등의 Nature, 282:544 (1979)에 설명된 공정에 따라 E. coli에서 생산된 메티오닐 인간 성장 호르몬 (met-hGH)도 바람직하다. PROTROPINTM(Genentech, Inc. U.S.A.)로 시판되는 Met-hGH는 N 말단 메티오닌 잔기기 존재한다는 것을 제외하고, 천연 폴리펩타이드와 동일하다. 또 다른 예는 NUTROPINTM (Genentech, Inc., U.S.A.)로서 시판되는 재조합 hGH이다. 이 후자의 hGH에는 이 메티오닌 잔기가 없고 천연 호르몬과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. Gray 외, Biotechnology 2: 161 (1984). 또 다른 GH의 예로는 미국특허 제4,670,393호에 설명된 바와 같이 최유성 (lactogenic) 활성은 없으면서 순수한 체인성을 갖는 태반형인 hGH 변이체를 들 수 있다. 또한, 예컨대 WO90/04788 및 WO92/09690에 설명된 것과 같은 GH 변이체도 포함된다.
그 밖의 예로는 말단 비대층의 치료에 사용될 수 있는 펙비소먼트 (SOMAVERTTM, Pharmacia, U.S.A.)와 같은 GHR 길항제로서 작용하는 GH 조성물을 들 수 있다.
GH는 비경구, 비내, 폐내, 경구, 또는 피부를 통한 흡수와 같은 여하한 적당한 기술을 이용하여 대상자에게 직접 전달될 수 있다. 이들은 국소적으로 또는 전신적으로 투여 가능하다. 경구 투여의 예로는 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 및 복강내 투여를 들 수 있다. 바람직하게는 이들을 매일 피하 주사에 의해 투여하는 것이 좋다.
개체 대상자의 임상적 증상 (특히 GH 단독 치료시 부작용), GH 조성물(들)의 투여 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 기타 시술자에게 알려진 다른 변수들을 고려하여 치료법에 사용될 GH를 조성한 후 우수한 의료 처치에 따른 방법으로 투약한다. 본 발명의 목적상 각각의 성분들의 "유효량"은 따라서 이러한 고려 사항을 바탕으로 결정되며 대상자의 성장률을 증가시키는 양이다.
GH의 경우, 바람직하게는 약 0.2 mg/kg/주일 보다 많은 투여량, 더욱 바람직하게는 약 0.25 mg/kg/주일 보다 많은 투여량, 더욱 바람직하게는 약 0.3 mg/kg/주일 보다 많은 투여량으로 투여된다. 한가지 구체예에서, GH의 투여량은 약 0.3 내지 1.0 mg/kg/주일이고 또 다른 구체예에서는 0.35 내지 1.0 mg/kg/주일이다.
바람직하게는, GH를 하루에 한번 피하 투여하는 것이 좋다. 바람직한 측면에서, GH의 투여량은 약 0.001 내지 0.2 mg/kg/1일이다. 더욱 바람직하게는, GH의 투여량은 약 0.010 내지 0.10 mg/kg/1일이다.
전술한 바와 같이, GHRd3 대립 유전자에 동종접합적이거나 이종접합적인 대상자들은 GHRfl 대립 유전자에 동종접합적인 대상자보다 GH 치료에 대해 더 높은 양성 반응을 할 것으로 예상된다. 바람직한 측면에서, GHRfl 대립 유전자에 이종접합적인 대상자에 대한 투여량은 GHRd3 대립 유전자에 동종접합적 또는 이종접합적인 대상자에 대한 투여량보다 더 높은 것이 좋다.
GH는 특정 투여량의 주사제 형태로 특정 횟수로 (예컨대, 하루 한번) 연속적으로 또는 비연속적으로 적절히 투여하며, 주사시에는 혈장 GH 농도가 상승하고, 다음번 주사 시기가 되면 혈장 GH 농도가 저하될 것이다. 또 다른 비연속적 투여 방법은 PLGA 미세구 및 예컨대 활성 성분을 초기 방출한 후 일정 시간 후에 방출시키는 방식으로 활성 성분을 비연속적으로 방출시키는 다양한 이식 장치와 PLGA 미세구를 사용함으로써 비연속적 투여 방법을 수행할 수도 있다. 미국특허 4,767,628호 참조.
GH는 또한 GH의 투여 기간 내내 유지되는 방식으로, 혈액 중에 연속적으로 존재하도록 투여될 수도 있다. 이것은 예컨대 삼투압 미니 펌프와 같은 미니 펌프를 통해 연속적으로 주입함으로써 달성하는 것이 가장 바람직하다. 또는, GH를 자주 주사함으로써 수행하는 것도 적합하다 (즉, 하루에 한번 보다 많게, 예컨대, 하루 두번, 또는 하루 세번).
또 다른 구체예에서, GH는 혈액으로부터의 GH 소거를 지연시키던가 또는 예컨대 주사 부위로부터 GH를 서서히 방출시키는 지속성 GH 조성물을 이용하여 투여될 수도 있다. GH의 혈장 소거를 지연시키는 지속성 포뮬레이션은 그의 결합 단백질 (WO92/08985) 또는 수용성 폴리머가 PEG 및 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머와 폴리옥시에틸렌 폴리올 중에서 선택된 것인 거대분자, 즉, 실온에서 물에 녹는 거대분자와 착화되거나 그러한 거대분자에 공유적으로 컨쥬게이션된 (가역 또는 비가역적 결합에 의해) GH 형태일 수 있다. 또는, GH는 그의 순환 반감기를 증가시키기 위해 폴리머에 결합시키거나 폴리머와 착화시킬 수 있다. 이 목적에 유용한 폴리에틸렌 폴리올과 폴리옥시에틸렌 폴리올의 예로는 폴리에틸렌 글리세롤, 폴리에틸렌 그리콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 폴리옥시에틸렌 글루코스 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 글리세롤의 글리세롤 백본 (backbone)은 예컨대 동물과 인간의 모노, 디 및 트리글리세라이드에서 발생하는 것과 동일한 백본이다.
폴리머는 특정 분자량을 가질 필요는 없지만, 분자량이 약 3500 내지 100,000, 더욱 바람직하게는 5000 내지 40,000인 범위인 것이 바람직하다. 바람직하게는, PEG 호모폴리머가 치환되지 않은 것이 좋지만, 그의 한쪽 말단은 알킬기로 치환될 수도 있다. 바람직하게는, 알킬기는 C1-C4 알킬기인 것이 좋고 메틸기인 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직하게는, 폴리머는 PEG의 비치환 호모폴리머, PEG의 모노메틸 치환된 호모폴리머 (mPEG), 또는 폴리옥시에틸렌 글리세롤 (POG)인 것이 좋고 분자량은 약 5000 내지 40,000인 것이 좋다.
GH는 주로 반응 조건, 폴리머의 분자량 등에 따라 GH의 하나이 상의 아미노산 잔기를 통해 폴리머 상의 말단 반응성 기에 공유적으로 결합한다. 반응성기(들)을 갖는 폴리머는 본 발명에서 활성화 폴리머로서 지칭된다. 반응성기는 GH 상에서 유리 아미노산 또는 기타 반응성기와 선택적으로 반응한다. 그러나, 최적의 결과를 얻도록 선택된 반응성기의 종류와 양 및 사용된 폴리머의 종류는, 반응성기가 GH 상의 너무 많은 특히 활성적인 기들과 반응하는 것을 회피하도록, 사용된 특정 GH에 의존할 것이다. 그런데 이것을 완전히 회피하는 것은 불가능할 수 있기 때문에, 사용된 단백질 농도에 따라, 단백질 1몰 당 활성화 폴리머 약 0.1 내지 1000몰, 바람직하게는 2 내지 200몰을 사용하는 것이 일반적으로 권장된다. 단백질 1몰 당 활성화 폴리머의 최종량은 최적 활성을 유지하기 위한 밸런스인 한편, 동시에, 가능한 경우에는 그 단백질의 순환 반감기를 최적화시키는 양이다.
잔기는 단백질 상의 어떠한 반응성 아미노산이든 무방하고, 예컨대 하나 또는 두개의 시스테인이나 N-말단 아미노산기일 수 있지만, 바람직하게는, 반응성 아미노산은 그의 유리 엡실론-아미노기를 통해 활성화된 폴리머의 반응성기에 연결된 라이신, 또는 아미드 결합을 통해 폴리머에 연결된 글루탐산 또는 아스파르트산인 것이 좋다.
공유 변형 반응은, 만일 GH 상의 반응성기가 라이신기인 경우에는, 생물학적 활성 물질을 불활성 폴리머와 반응시키는데 일반적으로 사용되는 적절한 방법에 의해 바람직하게는 약 pH 5-9, 더욱 바람직하게는 pH 7-9에서 일어난다. 일반적으로, 이 공정은 활성화 폴리머 (적어도 하나의 말단 히드록실기를 갖는 것)를 제조하고, 이 폴리머로부터 활성 기질을 제조한 다음, GH를 상기 활성 기질과 반응시켜 포뮬레이션에 적합한 GH를 제조하는 공정을 포함하여 이루어진다. 상기 변형 반응은 한가지 이상의 공정을 포함할 수 있는 여러가지 방법에 의해 수행 가능하다. 1단계 공정 반응으로 활성화 폴리머를 제조하는데 사용될 수 있는 변형제의 예로는 시아누르산 클로라이드 (2,4,6-트리클로로-S-트리아진) 및 시아누르산 플루오라이드를 들 수 있다.
한가지 구체예에서, 이 변형 반응은 먼저 폴리머를 무수 숙신산이나 무수 글루타르산과 같은 산무수물과 반응시켜 카르복실산을 형성한 다음 이 카르복실산을, 카르복실산과 반응할 수 있는 화합물과 반응시켜 Gh와 반응하 수 있는 반응성 에스테르기를 갖는 호라성화되 폴리머를 형성시키는 2단계 공정으로 일어난다. 이러한 화합물의 예로는 N-히드록시숙신이미드, 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산, 등을 들 수 있고 N-히드록시숙신이미드나 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산을 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, 모노메틸 치환된 PEG를 고온, 바람직하게는 약 100-110℃에서 4시간 동안 무수 글루타르산과 반응시킬 수 있다. 이렇게 얻어진 모노메틸 PEG-글루타르산은 디시클로헥실 또는 이소프로필 카르보디이미드와 같은 카르보디이미드 시약의 존재 하에 N-히드록시숙신이미드와 반응시켜 활성화 폴리머인 메톡시폴리에틸렌 글라이콜릴-N-숙신이미딜 글루타레이트를 얻고 이를 GH와 반응시킬 수 있다. 이 방법은 Abuchowski 외, Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984)에 상세히 설명되어 있다. 또 다른 예에서는, 모노메틸 치환된 PEG를 무수 글루타르산과 반응시킨 다음 디시클로헥실 카르보디이미드 존재 하에 4-히드록시-3-니트로벤젠 설폰산 (HNSA)와 반응시켜 활성화된 폴리머를 얻는다. HNSA는 Bhatnagar 등, Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich etal.- (eds.) (Pierce Chemical Co. , Rockford, Ill.,1981), p. 97-100, 및 Nitecki 등, High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology : 1986) 제목: "Novel Agent for Coupling Synthetic
Peptides to Carriers and Its Applications."에 설명되어 있다.
PEG에 컨쥬게이션된 GH의 특별한 제조 방법으로는, PEG-GH에 관한 미국특허 제4,179,337호와 GH에 가역적으로, 그러나 공유적으로 결합된 PEG에 관해 설명하고 있는 미국특허 제4,935,465호를 들 수 있다.
GH는 또한 지속 방출형 시스템으로도 적절하게 투여 가능하다. 본 발명에 유용한 지속 방출형 조성물의 예로는 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형상의 반투과성 폴리머 매트릭스를 들 수 있다. 지속 방출형 매트릭스에는 폴리락타이드 (미국특허 제3,773,919호, EP 58,481호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트 (Sidman 외, Biopolymers, 22, 547-556 (1983), 폴리 (2-히드록시에틸 메타크릴레이트) (Langer 외, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer, CHem. Tech., 12:98-105 (1982), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer 외, 상기문헌) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988) 또는 PLGA 미세구가 포함된다.
지속 방출형 GH 조성물은 또한 리포좀에 포획된 GH도 포함한다. GH를 함유하는 리포좀은 공지 방법: 즉, DE 3,218,121; Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ; EP 142,641 ; 일본 특허출원 83-118008; 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324에 설명된 방법으로 제조한다. 보통, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰%를 초과하는 작은 (약 200-800 옹스트롱) 유니라멜라형으로서, 그 선택 비율은 최적 치료법에 적당하도록 변형한다. 또한, 생물학적으로 활성적인 지속 방출형 포뮬레이션은 미국특허 제4,857,505호에 설명된 활성 다당류에 공유 결합된 GH의 첨가물로부터 만들 수 있다. 또한, 미국특허 제4,837,381호는 지방이나 밀랍 또는 이들의 혼합물과 GH와의 느린 방출을 위한 미세구 조성물도 설명한다.
또 다른 구체예에서, 상기 동정된 개체들을 IGF-I의 유효량으로도 치료한다. 일반론적으로 볼 때, 1회 투여당 비경구적으로 투여된 IGF-I의 약학적 총유효량은 대상자 체중에 대해 약 50 내지 240 ㎍/kg/1일, 바람직하게는 100 내지 200 ㎍/kg/1일이 될 것이지만, 전술한 바와 같이, 이는 치료적 재량에 따라 크게 달라질 수 있다. 또한, 바람직하게는 IGF-I을 피하 주사로 하루 1번 또는 두번 투여하는 것이 좋다. 또 다른 구체예에서는, IGF-I과 GH의 두가지 모두를 각각의 유효량만큼, 또는 각각으로는 준최적량이지만 병합할 경우 소기의 효과를 나타내는 양으로 대상자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는, GH를 약 0.001 내지 0.2 mg/kg1일 또는 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 mg/kg/1일의 양으로 투여한다. 바람직하게는, IGF-I과 GH를 두가지 모두 예컨대 정맥 주사 또는 피하 주사 수단을 이용함으로써 주사하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, IGF-I과 GH의 두가지를 모두 피하 주사하는 것이 좋고, 가장 바람직하게는 매일 주사하는 것이 좋다.
IGH-I과 GH를 모두 투여할 것을 고려하는 시술자는 이들 호르몬 치료시 공지 부작용을 고려하여야 한다. GH의 경우, 그 부작용으로는 나트륨 체류와 세포외 용적의 팽창 (Ikkos 등, Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 (1959); Biglieri 등, J. Clin. Endocrinol. Metab. , 21: 361-370 (1961)), 및 과인슐린혈증 및 고혈당증을 들 수 있다. IGF-I의 주요한 현저한 부작용은 저혈당증이다. Guler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2868-2872 (1989). 실상, IGF-I과 GH의 조합은 두가지 약제 모두의 원치 않는 부작용을 감소시킬 수도 있고 (예컨대 IGF-I의 저혈당증과 GH의 과인슐린혈증), IGF-I에 의해 그 분비가 억압되는 GH의 혈중 농도를 회복시킬 수도 있다.
한가지 구체예에서 비경구 투여의 경우, 일반적으로는, 단위 투여 주사제형 (용액제, 현탁제, 또는 유제)의 소망되는 순도의 GH를 약학적으로 허용되는 담체, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 피투여자에게 무독하며 그 포뮬레이션의 다른 성분들과 양립가능한 담체와 혼합함으로써 GH를 조성시킨다. 예컨대, 이 포뮬레이션은 폴리펩타이드에 유해하다고 알려진 성분들이나 산화제는 함유하지 않는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이 포뮬레이션은 GH를 액상 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체상 담체 또는 두가지 모두와 접촉시킴으로써 제조한다. 이어서, 필요한 경우, 이 생성물을 원하는 포뮬레이션으로 성형한다. 바람직하게는, 담체가 비경구용 담체, 더욱 바람직하게는, 피투여자의 혈액과 등장인 용액인 것이 좋다. 이러한 담체 비히클의 예로는 물, 염수, 링거액, 및 덱스트로스 용액을 들 수 있다. 고정되 오일 및 에틸 올레이트와 같은 비수성 비히클 및 리포좀도 본 발명에서 유용하다.
캐리어는 등장성 및 화학 안정성을 증대시켜주는 물질과 같은 첨가제들을 소량 함유하는 것이 적절하다. 이러한 물질들은 사용되는 투여량과 농도에서 피투여자에게 무해한 물질들로서 예를 들면 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 및 기타 유기산 또는 그들의 염과 같은 완충액; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 (잔기가 약 10개 미만)의 폴리펩타이드, 예컨대, 폴리아르기닌 또는 트리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 기타 셀룰로스 또는 그의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린과 같은 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 카운터이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제가 이에 해당된다.
GH는 일반적으로 그러한 비히클 중에 개별적으로 약 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL, 바람직하게는 1-10 mg/mL의 농도로, 약 4.5 내지 8의 pH에서 조성된다. GH의 pH는 7.4 내지 7.8인 것이 좋다. 전술한 특정 부형제, 담체 또는 안정화제를 사용하여 GH염을 형성할 수 있을 것이라는 것이 이해될 것이다.
GH는 적당하기만 하면 어떠한 방법으로든 조성될 수 있지만, GH의 바람직한 포뮬레이션은 다음과 같다: 바람직한 hGH (GENOTROPINTM), 재조합 소마토트로핀을 0.2 mg, 0.4 mg, 0.6 mg, 0.8 mg, 1.0 mg, 1.2 mg, 1.4 mg, 1.6 mg, 1.8 mg 또는 2.0 mg 함유하는 단일 투여량의 시린지. 전술한 GENOTROPINTM 시린지는 또한 글라이신 0.21 mg, 만니톨 12.5 mg, 모노아트리움포스페이트 0.045 mg, 디소듐 포스페이트 0.025 mg 및 물 0.25 ml를 함유한다.
met-GH (PROTROPINTM)의 경우, 예비-동결건조시킨 벌크 용액은 met-GH 2.0 mg/mL, 만니톨 16.0 mg/mL, 소듐 포스페이트 0.14 mg/mL 및 pH 7.4의 소듐 포스페이트 1.6 mg/mL (일염기 일수화물)을 함유한다. met-GH의 5 mg 바이알은 met-GH 5 mg, 만니톨 40 mg, 및 pH 7.8의 총인산나트륨 (건량) (이염기 무수물) 1.7 mg을 함유한다. 10 mg 바이알은 met-GH 10 mg, 만니톨 80 mg, 및 pH 7.8의 총인산나트륨 (건량) (이염기 무수물) 3.4 mg을 함유한다.
met가 없는 (metless)-GH (NUTROPINTM)의 경우, 예비-동결건조시킨 벌크 용액은 GH 2.0 mg/mL, 만니톨 18.0 mg/mL, 글라이신 0.68 mg/mL, 소듐 포스페이트 0.45 mg/mL 및 pH 7.4의 소듐 포스페이트 1.3 mg/mL (일염기 일수화물)을 함유한다. GH의 5 mg 바이알은 GH 5 mg, 만니톨 45 mg, 글라이신 1.7 mg, 및 pH 7.4의 총인산나트륨 (건량) (이염기 무수물) 1.7 mg을 함유한다. 10 mg 바이알은 GH 10 mg, 만니톨 90 mg, 글라이신 3.4 mg 및 총인산나트륨 (건량) (이염기 무수물) 3.4 mg을 함유한다.
또는, NUTROPINTM hGH용 액상 포뮬레이션을 이용할 수도 있다. 예컨대: 5.0 ±0.5 mg/mL rhGH; 8.8 ± 0.9 mg/mL 소듐 클로라이드; 2.0 ± 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 20; 2.5 ± 0.3 mg/mL 페놀; 2.68 ± 0.3 mg/mL 소듐 시트레이트 디하이드레이트; 및 0.17 ± 0.02 mg/mL 무수 시트르산 (총 무수 무수 시트르산나트륨/시트르산은 2.5 mg/mL, 또는 10 mM임); pH 6.0 ± 0.3. 이 포뮬레이션을 10-mg 바이알에 적절히 넣는다. 이것은 3-cc 유리 바이알 중 전술한 조성물이 2.0-mL 채워진 것이다. 또는 전술한 포뮬레이션을 함유하는 10-mg (2.0 mL) 카트리지를, 대상자에게 액상 GH를 주사하기 위한 주사용 펜 내에 넣을 수도 있다.
치료용 투여를 위해 사용될 GH 조성물은 바람직하게는 멸균된 것이 좋다. 멸균 처리는 멸균 여과막 (예컨대, 0.2 마이크론 막)을 통해 여과에 의해 쉽게 수행가능하다. 치료용 GH 조성물을 일반적으로 멸균된 출구 포트가 달린 용기, 예컨대, 피하 주사 바늘로 천공가능한 스토퍼가 구비된 바이알 또는 정맥내 용액 백에 넣는다.
GH는 일반적으로 단위 또는 멀티 투여용 용기, 예컨대, 밀봉된 앰플이나 바이알과 같은 용기 내에서 수용액, 또는 재조성을 위한 동결건조된 포뮬레이션으로서 보관될 것이다. 동결건조된 포뮬레이션의 예로서, 바이알을 멸균 여과처리한 it (w/v) 수성 Gh 용액으로 충전시키고 얻어진 혼합물을 동결건조시킨다. 동결건조된 GH를 정균처리된 주사용수로 재조성시켜 주입 용액을 제조한다.
약물 스크리닝 측정법
GHRd3 대립 유전자를 지니는 개체가 GHRfl 대립 유전자에 대해 동종접합적인 개체에 비해 GHR 경로를 통해 작용하는 약제를 이용한 치료에 대해 증가된 양성 반응을 나타낸다는 발견으로부터, GHR 경로를 통해 작용하는 치료제를 평가하는데 사용될 수 있는 분석법이 개발되었다. 예컨대, GHR 활성 또는 GHRd3에 대한 결합을 측정하는 것에 기초한 스크리닝 분석법을 이용하여 GHRd3 대립 유전자를 발현하는 개체를 치료하는데 가장 효과적일 약제를 동정할 수 있다. 이하에서 더욱 상세히 설명하겠지만, 테스트될 수 있는 약제로는 소마토트로핀이나 소마트로핀, 바람직하게는 GENOTROPINTM, 또는 PROTROPINTM, NUTROPINTM 또는 펙비소만트, 바람직하게는 SOMAVERTTM을 포함하는 GH 조성물과 같이 질병 치료에 유용한 것으로 알려진 약제나, 또는 질병 치료에 대한 유용성 여부가 알려지지 않은 약제가 포함된다.
한가지 측면에서, 본 발명은 GHRd3 단백질을 발현하는 세포, 또는 그의 생물학적 활성 부분을 테스트 화합물과 접촉시켜, GHR 활성을 조절하는 그 테스트 화합물의 능력을 측정하는, 세포 기반 측정법을 제공한다. GHR 활성을 조절하는 (예컨대, 자극 또는 억제) 이 테스트 화합물의 능력의 측정은 GHR 폴리펩타이드의 활성을 모니터함으로써 수행 가능하다. GHR 활성의 측정은 예컨대 테스트 화합물에 의해 유발된 세포 증식, GHR 내재화(internalization) 및/또는 시그널 형질도입을 비롯한 적절한 검색가능한 활성을 측정하는 것을 포함하며, 이하에 상술한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 후보 GHR 모듈레이터 (예컨대 작용제 또는 길항제)를 동정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) GHRd3 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 제공하는 공정; b) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 자극하는지 또는 억제하는지를 측정하는 공정을 포함하여 이루어진다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 a) 인간 세포 (바람직하게는 293 세포)를 제공하는 공정; b) GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 공정; 및 c) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) GHR 활성을 검출하는 공정을 포함하여 이루어진다. 상기 화합물이 GHR 활성을 억제한다고 검색되면 상기 화합물은 GHRd3 억약제의 후보가 된다. 상기 화합물이 GHR 활성을 자극하는 것으로 검색되면 상기 화합물은 GHRd3 작용제의 후보가 된다. 또 다른 예에서는 이 방법은 Xenopus laevis (아프리카산 개구리)의 난모 세포를 제공하는 공정; b) 상기 Xenopus의 난모 세포에 GHRd3 cRNA를 도입하는 공정; c) 상기 Xenopus의 난모 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) 상기 Xenopus의 난모 세포에서 GHR 활성을 검출하는 공정을 포함하여 이루어진다. 여기서도 상기 화합물이 GHR 활성을 자극하는 것으로 검출되면 상기 화합물은 GHRd3 작용제의 후보이다. 상기 화합물이 GHR 활성을 억제하는 것으로 검출되면 상기 화합물은 GHRd3 길항제의 후보이다. 스크리닝 측정법에 대한 부가적인 상세 내용은 GHRd3/fl 이질 이합체 (heterodimers)와 관련한 이하의 부분에서 상술한다.
GHRd3/GHRfl 이질 이합체
GHRd3/fl 이질 이합체 활성의 측정 방법
전술한 바와 같이 본 발명은 GHRd3 폴리펩타이드가 GHRfl 폴리펩타이드와 함께 이질 이합체로서 자연적으로 존재할 수 있음을 시사한 바 있다. 따라서, 본 발명은 GHRd3 폴리펩타이드의 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 GHRd3 폴리펩타이드와 GHRfl 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 복합체의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 본 발명은 따라서 GHRd3 폴리펩타이드를 포함하는 GHR 폴리펩타이드 복합체의 활성 측정 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이 복합체는 GHRd3 폴리펩타이드, GHRfl 폴리펩타이드 및 GH 폴리펩타이드를 포함하는 복합체인 것이 좋다.
본 발명은 또한 변형된 GHRd3 핵산 또는 변이체를 제공하는 공정 및 그에 의해 코딩된 폴리펩타이드가 GHR 활성을 나타내는지를 평가하는 공정을 포함하는, 기능적 변이체 GHRd3 뉴클레오타이드 서열의 기능적 변이체의 활성을 측정 또는 수득하는 방법을 제공한다. 따라서, (a) GHRd3 폴리펩타이드와 GHRfl 폴리펩타이드를 제공하는 공정; 및 (b) GHR 활성을 평가하는 공정을 포함하는, GHRd3 폴리펩타이드의 기능 평가법도 본 발명에 포함된다. 무세포 (예컨대 막에 기반한) 포맷, 세포에 기반한 포맷 및 생체내 (in vivo) 포맷을 비롯하여, 모든 적절한 포맷이 이용 가능하다. 예컨대, 상기 측정법은 GHRd3 및 GHRfl 핵산을 숙주 세포 중에서 발현시키고 상기 세포 중에서의 GHR 활성을 관찰하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서는, GHRd3와 GHRfl 폴리펩타이드를 세포 내로 도입하고, GHR 활성을 관찰한다. 또 다른 예에서는, GHRd3 폴리펩타이드를 GHRfl 폴리펩타이드를 발현하는 세포 내로 도입하여 GHR 활성을 관찰한다.
바람직한 구체예에서는, GHR 활성의 측정법은 GHR 단백질이 다운스트림 이펙터 (예컨대, GHR 매개성 시그널 형질도입 경로 성분)의 활성을 추가로 조절할 수 있는지에 대해 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 적절한 표적 상의 이펙터 분자의 활성을 측정하거나 적절한 표적과 이펙터와의 결합을 전술한 바와 같이 측정할 수 있다. 바람직하게는, Jak-2/Stat-5 시그널링을 평가하는 것이 좋다. 또 다른 바람직한 구체예에서, GHR 활성의 측정법은 GHR 리간드에 의해 유발된 세포 증식, GHR 리간드에 대한 GHR의 결합, GHR 및/또는 리간드 내재화를 포함하여 여하한 적절한 검출가능한 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 GHR 리간드는 GH 폴리펩타이드이다. 이들 방법들에 의해 GHRd3 및 GHRfl 폴리펩타이드를 포함하여 이루어진 GHR 이질 이합체의 활성을 테스트할 수 있다.
GHRd3 활성의 평가 방법은 변형된 GHRd3 폴리펩타이드를 특징화시키는데 유용할 수 있다. 예컨대, 필수 또는 비필수 아미노산 잔기가 변이된 GHRd3 폴리펩타이드는 특징화될 수 있다. GHRd3 서열의 "비필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오타이드 치환을 수행할 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 GHR 폴리펩타이드의 야생형 서열로부터 그 생물학적 활성을 변경시킴이 없이 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경을 수반한다. 예컨대, 본 발명의 GHRd3 단백질에서 보존되는 아미노산 잔기들은 변경시키기가 덜 쉬울 것으로 예상된다. 뿐만 아니라, 부가적인 보존 아미노산 잔기들은 본 발명의 GHRd3 단백질들 간에 보존된 아미노산들일 수 있다. 또 다른 예에서, 집단 내에 존재할 수 있는 GHRd3 서열들의 자연 발생적인 대립 유전자 변이체들의 경우, GHRd3 핵산의 뉴클레오타이드 서열 중의 변이에 의해 변경을 도입할 수 있고, 이에 따라 GHRd3 단백질의 기능적 능력의 변경을 수반하거나 수반하지 않으면서, 코딩된 GHRd3 단백질의 아미노산 서열에 변화를 일으킬 수 있다.
약물 스크리닝 측정법
본 발명은 GHR 작용제 및 길항제, 즉, GHR 경로를 통해 작용하는 후보 화합물 또는 테스트 화합물 또는 약제 (예컨대, 바람직하게는 폴리펩타이드, 이 밖에도 펩타이드, 펩티도미메틱스, 소형 분자 또는 다른 약물들도 해당됨)를 동정 및/또는 평가하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, GHR 작용제 및 길항제는 GHRd3 및 GHRfl 단백질에 결합함으로써 바람직하게는 GHRd3 폴리펩타이드, GHRfl 폴리펩타이드 및 상기 화합물을 포함하는 복합체를 형성하는 것이 좋다. 측정법은 세포 기반 측정법일수도 있고 비세포 기반 측정법일 수도 있다. 바람직한 비세포 기반 측정법은 막기반 측정법이다. 이 측정법은 또한 본 명세서에서 "스크리닝 측정법"이라고도 칭하기도 한다. 스크리닝 측정법은 공지의 적절한 GHR 활성 측정법에 기초한, 결합 측정 또는 기타 기능 측정법일 수 있다.
한가지 측면에서, GHRd3 단백질 및 GHRfl 단백질 또는 생물학적으로 활성적인 그의 일부를 발현하는 세포를 테스트 화합물과 접촉시키고 GHR 활성을 조절하는 그 테스트 화합물의 능력을 측정하는 세포 기반 측정법도 있다. GHR 활성을 조절하는 (예컨대 자극 또는 억제하는) 테스트 화합물의 능력을 측정하는 것은 GHR 폴리펩타이드 (예컨대 GHRd3 및 GHRfl 단백질을 포함하는 GHR 폴리펩타이드 복합체)의 활성을 모니터링함으로써 수행 가능하다. GHR 활성의 측정은 예컨대 시험 화합물에 의해 유발된 세포 증식, GHR 내재화 및/또는 시그널 형질도입을 포함한 적절한 검출가능한 활성을 평가하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 후보 GHR 모듈레이터 (예컨대 작용제 또는 길항제)를 동정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) GHRd3 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 제공하는 공정; b) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; c) 상기 화합물이 GHR 활성을 선택적으로 자극하는지 또는 억제하는지를 측정하는 공정을 포함하여 이루어진다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 a) 인간 세포 (바람직하게는 293 세포)를 제공하는 공정; b) GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 상기 세포 내로 도입하고, 임의로 GHRfl 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 공정; 및 c) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) GHR 활성을 검출하는 공정을 포함하여 이루어진다. 상기 화합물이 GHR 활성을 억제한다고 검색되면 상기 화합물은 GHRd/GHRfl 이질 이합체 억약제의 후보가 된다. 상기 화합물이 GHR 활성을 자극하는 것으로 검색되면 상기 화합물은 GHRd3/GHRfl 이질 이합체 작용제의 후보가 된다. 또 다른 예에서는 이 방법은 Xenopus laevis의 난모 세포를 제공하는 공정; b) 상기 Xenopus의 난모 세포에 GHRd3 및 임의로 GHRfl cRNA를 도입하는 공정; c) 상기 Xenopus의 난모 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) 상기 Xenopus의 난모 세포에서 GHR 활성을 검출하는 공정을 포함하여 이루어진다. 여기서도 상기 화합물이 GHR 활성을 자극하는 것으로 검출되면 상기 화합물은 GHRd3/GHRfl 이질 이합체 작용제의 후보이다. 상기 화합물이 GHR 활성을 억제하는 것으로 검출되면 상기 화합물은 GHRd3/GHRfl 이질 이합체 길항제의 후보이다.
GHR의 활성 검출은 세포 증식, GHR의 GHR 리간드 (예커대 Gh 폴리펩타이드)에의 결합, GHR 및/또는 GHR 리간드의 내재화 및/또는 GHR-매개성 시그널 형질도입을 비롯한 적절한 검출 가능한 활성 평가에 의해 수행가능하다.
Maamra 등 (1999) J. Biol. Chem. 274:14791-14798에는 GHR-매개된 Jak2-Stat 5 시그널링에 대한 293 세포에서의 GHR 기능 분석의 예가 설명되어 있으며 상기 문헌은 본 명세서에 참조 통합되었다. Xenopus laevis 난모세포 중의 GHR 기능 분석은 Urbanek 등 (1993) J. Biol. Chem. 268(25): 19025-19032에 설명되어 있으며, 그 기재 내용은 본 명세서에 참조 통합되었다. cDNA 주형의 제조 방법, 생체외 전사 및 번역, 난모 세포 주입, 주입된 mRNA 안정성 분석, GHR 에 대한 GH의 결합 측정 및 수용체 내재화 분석은 기본적으로 Urbanek 등 (1993)의 설명에 따라 수행 가능하다.
또 다른 바람직한 측면은 GHRd3 단백질과 GHRfl 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 테스트 화합물과 접촉시키고 GHR 폴리펩타이드에 결합하는 이 테스트 화합물의 능력을 측정하는, 세포 기반 결합 측정법이다. 또 다른 관점에서는, GHRd3 단백질과 GHRfl 단백질을 포함하는 막 또는 그의 생물학적 활성 부분을 테스트 화합물과 접촉시키고 GHR 폴리펩타이드에 결합하는 이 테스트 화합물의 v력을 측정하는, 비세포 기반 결합 측정법이 제공된다. 테스트 화합물이 GHR (예컨대, GHRd3 또는 GHRfl) 폴리펩타이드에 결합하는 능력의 측정은 공지 방법에 따라 수행 가능하다.
결합 측정법은 예컨대: a) GHRd3 및 GHRf1 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 제공하는 공정; b) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 c) 상기 화합물이 GHR 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는지를 측정하는 공정을 포함하여 이루어진다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 a) 인간 세포 (바람직하게는 293 세포)를 제공하는 공정; b) GHRd3 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 상기 세포 내로 도입하고, 임의로 GHRfl 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 공정; 및 c) 상기 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) GHR 폴리펩타이드에 대해 상기 화합물이 선택적으로 결합하는지를 검색하는 공정을 포함하여 이루어진다. 상기 화합물이 GHR 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 검색되면 상기 화합물은 GHRd/GHRfl 이질 이합체 모듈레이터의 후보가 된다. 또 다른 예에서는 이 방법은 a) Xenopus laevis의 난모 세포를 제공하는 공정; b) 상기 Xenopus의 난모 세포에 GHRd3 및 임의로 GHRfl cRNA를 도입하는 공정; c) 상기 Xenopus의 난모 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 공정; 및 d) 상기 화합물이 GHR 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는지를 검색하는 공정을 포함하여 이루어진다. 여기서도 상기 화합물이 GHR 포리펩타이드에 결합하는 것으로 검색되면 상기 화합물은 GHRd3/GHRfl 이질 이합체 모듈레이터의 후보이다.
293 세포에 기반한 GHR 결합 측정법의 예는 Ross 등 (2001) J. Clin. Endocrinol. Metabol. 86(4) 1716-1723에 설명되어 있으며, 그 기재 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
상기 측정에 사용된 세포들은 GHRfl 폴리펩타이드를 발현하는 293 세포인 것이 바람직하다. GHR을 발현하는 293 세포는 Maamra 등 (1999) J. Biol. Chem. 274:14791-14798에 설명되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 통합된다.
이러한 측정법은 GH 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 변이체를 테스트하는데 특히 유용할 수 있다. 특히 바람직한 것은 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜 분자의 결합에 의해, 보다 장기간의 혈액순환 시간을 갖도록 변형된 GH 폴리펩타이드이다. 다른 구체예에서는, GH 폴리펩타이드는 GHR 단백질 (예컨대, 바람직하게는 GHRd3 및 GHRfl 단백질을 포함하는 복합체를 형성하는)에 결합하나, GHR 활성을 자극하지는 않는 GH 폴리펩타이드와 같은 GHR 길항체일 수 있다.
또 다른 구체예는, GHRd3 단백질과 GHRfl 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 GHR 리간드와 접촉시켜 측정 혼합물을 만들고, 이 측정 혼합물을 테스트 화합물과 접촉시켜 GHR 활성을 측정하는 것을 포함하는 측정법이다. 바라직하게는, 이 방법은 GHR 단백질 (예컨대, GHRd3 및 GHRfl 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 포함하는 GHR 이합체)의 활성을 자극 또는 억제하는 테스트 화합물의 능력을 측정하는 것으로서, 여기서 GHR 단백질의 활성을 억제하는 테스트 화합물의 능력의 측정은 GHR- 및 GHRfl-발현 세포의 생물학적 활성을 억제하는 테스트 화합물의 능력을 측정하는 것이다 (예컨대, 테스트 화합물이 시그널 형질도입 또는 단백질:단백질 상호반응을 억제하는 능력의 측정).
GHR 리간드와 결합하거나 상호반응하는 GHR 단백질의 능력은 직접 결합을 측정하는 전술한 방법들에 의해 측정할 수 있다. 다른 구체예에서는, GHRd3 단백질 또는 GHRd3 단백질을 함유하는 복합체가 GHR 리간드 분자와 결합 또는 상호 반응하는 능력은, 표적 (즉, 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3 등)의 세포성 제2 메신저의 유도를 검출하여, 적절한 기질에 대한 촉매/효소 활성을 검출하며, 리포터 유전자 (검출가능한 마커, 예컨대 루시페라제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 결합된 반응성 조절 요소를 포함함)의 유도를 검출하고, 또는 예컨대 시그널 형질도입 또는 단백질:단백질 상호반응과 같은 GHR-조절된 세포성 반응을 검출함으로써 측정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 측정법은 GHRd3 단백질과 GHrfl 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 막에 제공하고, GHR 단백질 또는 막을 테스트 화합물과 접촉시킨 다음, GHR 단백질 (예컨대 GHRd3 및/또는 GHRfl 단백질) 또는 그의 생물학적 활성 부분과 결합하는 테스트 화합물의 능력을 측정하는, 무세포 측정법이다. GHRd3 단백질에 대한 테스트 화합물의 결합은 전술한 바와 같이 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 측정법은 GHR 단백질 (예컨대 GHR 이질 이합체) 또는 그의 생물학적 활성 부분을 GHR과 결합하는 GH 폴리펩타이드와 같은 공지 화합물과 접축시켜 측정 혼합물을 만들고, 이 측정 혼합물을 테스트 화합물과 접촉시켜, GHR 단백질과 상호 반응하는 테스트 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함하여 이루어지며, 여기서 테스트 화합물의, GHR 이질 이합체 단백질과의 상호반응 능력 측정은 이 테스트 화합물이 공지 화합물과 비교해서, GHR 단백질이나 그의 생물학적 활성 부분과 우선적으로 결합하는지의 능력을 측정함으로 수행한다.
또 다른 구체예는 GHrd3 단백질과 GHRfl 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 막에 제공하고, 폴리펩타이드 또는 막을 테스트 화합물과 접촉시킨 다음 이 테스트 화합물이 GHR 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분의 활성을 조절 (예컨대 자극 또는 억제)하는 능력을 측정하는 것을 포함하는, 무세포 측정법이다. GHR 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력은, 예컨대, 세포 증식, GHR의 GHR 리간드 (예컨대 GH 폴리펩타이드)에 대한 결합, GHR 및/또는 GHR 리간드 내재화 및/또는 GHR 매개성 시그널 형질도입을 비롯한, 적절한 GHR 검출가능한 활성을 평가함으로써 측정할 수 있다.
GHR 활성을 억제하는 테스트 화합물의 능력의 측정은 또한 예컨대, GH 분자 단백질 또는 그의 일부 또는 그의 유도체와 같은 테스트 화합물을 방사능 동위원소 또는 효소 표지와 커플링시켜 복합체 중에서, 표지된 Gh 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 검출함으로써 GH 분자와 GH 이질 이합체와의 결합을 측정함으로써 수행가능하다. 예컨대, 화합물들 (예컨대, GH 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분)을 125I, 35S, 14C, 또는 3H로 직접 또는 간접적으로 표지시켜, 방사능 방출을 직접 측정하거나 또는 섬광 계수에 의해 방사능 동위원소를 검출할 수 있다. 또는 화합물들을 예컨대 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 루시페라제로 효소적으로 표지시켜, 이러한 효소 표지를 적절한 기질의 생성물로의 변환을 측정함으로써 검색할 수도 있다.
또한, 상호반응 물질로 표지시킴이 없이, GHR 폴리펩타이드 (예컨대 GHRd3/GHRfl 이질 이합체)와 상호 반응하는 화합물 (예컨대 GH 단백질 또는 그의 부분 또는 단편)의 능력을 측정하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 예컨대, 화합물이나 수용체를 표지시키지 않고, 화합물과 그의 인지체 표적 분자와의 상호반응을 검출하기 위해 마이크로피지오미터를 이용할 수 있다. McConnell, H.M. 외 (1992) Science 257:1906-1912. 사이토센서와 같은 마이크로피지오미터는 광전달 전위센서 (LAPS)를 이용하여 세포가 그의 주변을 산성화시키는 속도를 측정하는 분석 기이다. 이 산성화 속도의 변화를 화합물과 수용체 간의 상호작용의 척도로서 이용할 수 있다.
GHR 단백질이 GHR 리간드 또는 테스트 화합물에 결합하는 능력은 실시간 Biomolecular Interaction Analysis (BIA)와 같은 기술을 이용하여 측정할 수 있다. Sjolander, S. 및 Urbaniczky, C. (1991) Anal. CHem. 63:2338-2345 및 Szabo 외 (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. 본 발명에서 이용되는 바와 같이, "BIA"는 상호반응 물질 (예컨대 BIA 코어)을 표지시키지 않고, 실시간으로 생물특이적인 상호반응을 연구하기 위한 기술이다. 생물학적 분자들간의 실시간 반응의 척도로서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학 현상 변화를 이용할 수도 있다.
테스트 화합물
"후보" 또는 "테스트" 화합물 또는 "약제" (예컨대 테스트 GHR 작용제 및 길항제)는 폴리펩타이드, 펩타이드, 펩티도미메틱스, 소형 분자 및 기타 약물을 비롯한 여러가지 적당한 형태일 수 있다. 상기 화합물들 또는 약제들은 질병 치료에 유용한 것을 알려진 것들과 질병 치료에 유용한 것으로 아직까지 알려지지 않은 약제들을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 테스트 화합물은 GH 폴리펩타이드이다. 바람직한 GH는 천연 서열 또는 변이체 형태일 수 있고 천연, 합성 또는 재조합된 것일 수 있다. 그 예로는 천연 인간 성장 호르몬 (hGH) 또는 인간의 천연 서열과의 재조합 GH, 및 재조합 DNA 기술 수단에 의해 생산된 여하한 GH 또는 GH 변이체를 가리키는 재조합 성장 호르몬 (rGH)를 들 수 있다. 한가지 관점에서 GH는 GHR 수용체를 자극할 수 있는 것으로서, 소마토트로핀 또는 소마트로핀, 바람직하게는 GENOTROPINTM 또는 PROTROPINTM, NUTROPINtm이 포함된다.
또 다른 측면에서, GH 폴리펩타이드는 GHR 길항제로서 작용할 수 있는 GH 변이체이다. GHR 길항제는 GHR 폴리펩타이드와 결합하나 GHR 기능을 차단하도록 의도된 약물 집단이다. GHR 길항제의 한가지 예가 Ross 등 (2001) J. Clin. Endocrinol. Mebabol. 86(4) 1716-1723에 설명되어 있다. Ross 등에서 B2036-PEG로 명명된 이 GHR 길항제는 GHR 결합 촉진을 위해 부위 1이 변이되고 수용체 이합체화를 차단하기 위해 부위 2가 변이된 페길화 GH 변이체 폴리펩타이드이다. 바람직한 GHR 길항제 또는 억약제는 펙비소만트, 바람직하게는 SOMAVERTTM이다. GHR 길항제는 뇌하수체 선종으로부터 과다 분비된 GH에 의해 일반적으로 유발되는 증상인 말단 비대증을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 테스트 화합물들은 생물학적 라이브러리, 공간적으로 전달가능한 평행 고상 또는 고상 라이브러리; 탈합성 (deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리법; "원-비드 원-컴파운드" 라이브러리법; 및 친화도 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리법으르 비롯한, 기술분야에 잘 알려진 조합적 라이브러리법을 다양하게 접근시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 생물학적 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리와 함께 사용되는 반면, 다른 네가지 접근법은 펩타이드, 비펩타이드 올리고머 또는 화합물들의 소형 분자 라이브러리에 접근가능하다 (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 다음 문헌에 설명되어 있다: DeWitt 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 6909; Erb 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann 등 (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho 등 (1993) Science 261: 1303; Carrell 등 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell 등 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33 :2061 ; and in Gallop 등 (1994) J. Med. Chem.37 :1233.
화합물들의 라이브러리는 용액으로 (예컨대, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412- 421), 또는 비드 상에 (Lam (1991) Nature 354: 82-84), 칩 상에 (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), 세균 상에 (Ladner 미국특허 No. 5,223, 409), spores (Ladner 미국특허 No. '409), 플라스미드 상에 (Cull 등 (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) 또는 파지 상에 (Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devin (1990) Science 249: 404-406) 제공될 수 있다; (Cwirla 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 상기 문헌).
본 발명은 또한 전술한 스크리닝법에 의해 동정된 신규한 약제와 이들 측정법을 이용함으로써 이러한 약제를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다. 따라서, 한가지 구체예에서, 본 발명은 전술한 스크리닝법 (예컨대, 세포 기반 측정법 또는 무세포 측정법) 중 어느 한가지 공정을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 화합물 또는 약제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 화합물 또는 약제는 GH 폴리펩타이드 또는 그의 부분 또는 변이체를 포함한다.
따라서, 적절한 동물 모델에서 전술한 바와 같이 동정된 약제의 용도도 본 발명의 범위에 포함된다. 예컨대, 본 명세서에 설명된 바와 같이 동정된 약제 (예컨대, GH 폴리펩타이드 또는 그의 부분 또는 변이체와 같은 GH 조절제, 안티센스 GHRd3 핵산 분자, GHRd3-특이적 항체 또는 GHRd3-결합 파트너)들을 동물 모델에서 이용하여 그러한 약제의 효능, 독성 또는 치료시 부작용을 측정할 수 있다. 또는, 전술한 바와 같이 동정된 약제는 이러한 약제의 작용 메카니즘을 측정하기 위해 동물 모델에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 전술한 스크리닝 측정법에 의해 동정된 신규한 약제들의, 설명된 바와 같이 치료를 위한 용도에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 설명된 바와 같이 진단, 예측, 및 치료를 위한 전술한 스크리닝 측정에 의해 동정된 신규한 제제의 용도에 관한 것이기도 하다. 따라서, 본 명세서에 설명된 바와 같이 진단, 예측, 또는 치료를 위한 약물 또는 약학적 조성물의 고안, 조성, 합성, 제조 및/또는 생산을 위해 이러한 약제들을 이용하는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 예컨대, 한가지 구체예에서, 본 발명은 전술한 스크리닝 측정법에 의해 수득가능한 화합물의 구조 및/또는 특성을 참조로 약물 또는 약학적 조성물을 합성 또는 생산하는 방법을 포함한다. 예컨대, GHRd3 및 GHRfl 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 테스트 화합물과 접촉시키고 이 테스트 화합물이 GHR 폴리펩타이드 (바람직하게는 GHRd3 및 GHRfl 폴리펩타이드를 포함하는 복합체)와 결합하거나 그의 활성을 조절하는 능력을 측정하는 방법에 의해 얻어지는 화합물의 구조 및/또는 특성에 기초해서 약물 또는 약학적 조성물을 합성할 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 본 발명은 GHRd3 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분을 테스트 화합물과 접촉시키고 이 테스트 화합물이 GHR 단백질, 바람직하게는 GHRd3 및 GHRfl 단백질을 포함하는 GHR 이합체 또는 그의 생물학적 활성 부분의 활성을 변형 (예컨대, 자극 또는 억제)시키거나 이들과 결합하는 능력을 측정하는 방법에 의해 수득가능한 호하ㅏㅂ물의 구조 및/또는 특성에 기초해서 약물 또는 약학적 조성물을 합성 또는 생산하는 방법을 포함한다.
GHRd3 핵산 및 단백질
전술한 바와 같이, 본 발명은 GHRd3 핵산 및 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, GHRd3 단백질은 적어도 6개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 8 내지 10 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 600개 아미노산이 연속적으로 연장된 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서 아미노산의 이러한 연속 스트렛치는 GHRd3 단백질 서열 중에 아미노산을 결실, 부가, 교환 또는 절단시키는 것을 포함하여, 변이 또는 기능적 변이 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명의 문맥상 GHRd3 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되거나 이것과 충분히 상동적인 아미노산 서열을 포함하며, 전장 GHRd3 단백질보다는 아미노산을 덜 포함하고, GHR 단백질의 활성을 적어도 한가지 나타내는, GHRd3 단백질의 생물학적 활성 부분도 유용하다. 또 다른 구체예에서, GHRd3 단백질은 천연 GHRd3 서열에 실질적으로 상동적이며 천연 GHRd3 단백질의 기능적 활성을 유지하면서도, 천연 대립 유전자 변이 또는 돌연변이로 인해 아미노산 서열은 다르다. 따라서, 또 다른 구체예에서, GHRd3 단백질은 Urganek 등 (1992)에 설명된 아미노산 서열과 적어도 약 60% 상동성을 갖는 아미노산을 포함하면서, GHRd3 단백질의 기능적 활성을 각각 갖는 단백질이다. 바람직하게는, 이 단백질이 Urbanek 등 (1992)의 단백질과 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8% 상동성을 갖는 것이 좋다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 퍼센트 상동성을 측정하기 위해서, 서열들을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적 상태로 정렬시키기 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 중에 갭을 도입할 수 있으며, 비상동 서열은 비교 목적상 무시할 수도 있다). 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 레퍼런스 서열의 길이는 레퍼런스 서열의 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%인 것이 좋다 (예컨대, 제2 서열을 GHRd3 아미노산 서열과 정렬시킬 때, 적어도 100개, 바람직하게는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 정렬시킨다). 그 다음에, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 대응 위치에서와 마찬가지로 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점령된 경우, 그 위치에서 이 분자들은 상동적인 것이다 (즉, 본 명세서에서 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열들 간의 퍼센트 상동성은 그 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일 위치의 수/위치의 총 # * 100).
두 서열들 간의 서열 비교 및 퍼센트 상동성의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다. 서열 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직하고 비제한적인 예로서 Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 그의 변형법으로서 Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77의 방법을 들 수 있다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)에 통합되어 있다. 본 발명의 GHRd3 핵산 분자와 상동적인 핵산 서열을 얻기 위해, NBLAST 프로그램, 점수=100, 워드 길이=12로 하여 BLAST 뉴클레오타이드 검색을 수행할 수 있다. 본 발명의 GHRd3 단백질 분자와 상동적인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수=50, 워드 길이=3으로 하여 BLAST 단백질 검색을 수행할 수 있다. 비교 목적상, 갭을 갖는 정렬물들을 수득하기 위해, Altschul 등 (1997) Nucleic Acid Research 25(17):3389-3402에 설명된 바와 같이 Gapped Blast를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램 (예컨대 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 변수를 이용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.gov 참조. 서열 비교를 위해 사용되는 또 다른 바람직하고, 비제한적인 수학적 알고리듬의 예는 Myers와 Miller, CABIOS (199)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0) 내에 통합되어 있다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 weight residue 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용할 수 있다.
재조합 발현 벡터 및 숙주 세포
GHRd3 단백질 (또는 그의 일부)를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 마찬가지로, 바람직한 관점에서, GHRfl 단백질 (또는 그의 일부)를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 역시 제조할 수 있다. 필요에 따라, 발현 벡터는 GHrD3 단백질을 코딩하는 핵산과 GHRfl 단백질을 코딩하는 핵산을 함유할 것이다. 본 명세서에서 "벡터"라 함은 그것과 결합된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 칭한다. 벡터의 한가지 유형은 "플라스미드"로서 이것은 원형의 이중 나선 DNA 루프로서 그 안에 부가적인 DNA 세그먼트가 접합될 수 있는 것이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터로서, 여기서는 부가적인 DNA 세그먼트를 바이러스 게놈 내로 접합시킬 수 있다. 어떤 벡터들은이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제를 할 수 있다 (예컨대, 세균성 복제 기점과 에피좀성 포유류 벡터를 갖는 세균성 벡터). 다른 벡터들 (예컨대, 비에피좀성 포유류 벡터)은 숙제 세포 내로 도입할 경우 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 세놈과 함께 복제된다. 또한, 어떤 벡터들은 이들이 작동적으로 결합된 유전자 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터들은 본 명세서에서 "발현 벡터"라고 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 있어서 유용한 발현 벡터들은 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 서로 호환적으로 사용하며, 이는 가장 흔합 벡터 유형이 플라스미드이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 역할을 하는, 바이러스 벡터 (예컨대 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 유형의 발현 벡터도 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산을 발현하는데 적합한 형태로 GHRd3 및/또는 GHRfl 핵산을 포함하는데, 이는, 이 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열과 작동적으로 결합된, 발현에 사용될 숙주 세포에 기초해서 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미하는 것이다. 재조합 발현 벡터에서, "작동적으로 결합된"이라는 것은 목적하는 튜클레오타이드 서열이 그 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬 수 있게끔 하는 방식으로 조절 서열(들)에 결합되어 있음을 의미하는 것으로 한다 (예컨대, 생체외 전사/번역계 또는 숙주 세포 내로 벡터가 도입된 경우 숙주 세포 중에서). "조절 서열"이라 함은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예컨대 폴리아데닐화 시그널)을 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열들은 예컨대 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif (1990)에 설명되어 있다. 조절 서열들은 다양한 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 연속 발현을 지시하는 것과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것 (예컨대 조직 특이적인 조절 서열)을 포함한다. 당업자라면 발현 벡터의 고안은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 여러 인자에 따라 달라지리라는 것을 이해할 것이다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입함으로써 단백질 또는 펩타이드를 생산한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 GHRd3 단백질을 발현시키도록 고안할 수 있다. 예컨대, GHRd3 단백질은 E. coli와 같은 세균, 곤충 세포 (배큘로바이러스 박현 벡터를 이용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현되리 수 있다. Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif (1990)에 적절한 숙주 세포가 설명되어 있다. 또는, 이 재조합 발현 벡터를 예컨대 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 포리머라제를 이용하여, 생체외에서 전사 및 번역시킬 수 있다.
원핵생물에서의 단백질 발현은 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 지시하는 연속적이거나 또는 유동가능한 프로모터를 함유하는 벡터를 이용하여 E. coli에서 수행되는 것이 가장 흔하다. 융합 벡터는 아미노산의 수를 그 안에 코딩된 단백질, 대개는 재조합 단백질의 아미노 말단에 부가한다. 이러한 융합 벡터는 대개 다음의 세가지 목적의 기능을 한다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 용해도 증가; 및 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로서 재조합 단백질의 정제 보조. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제에 이어, 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리할 수 있도록 하기 위해, 단백질 가수분해 절단 부위는 융합 부분과 재조합 단백질의 정션에 도입된다. 이러한 효소 및 이들의 인지체 인식 서열은 Factor Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 전형적인 융합 발현 벡터로는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질에 융합시키는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. 및 Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.)를 들 수 있다.
적절한 유도가능한 비융합성 E. coli 발현 벡터의 예에는 pTrc (Amann 외, (1988) Gene 69:301-315) 및 pET11d (Studier 외, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)가 포함된다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자의 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 함께 발현된 (coexpressed) 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7 gn 1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스 폴리머라제는 lacUV5 프로모터의 전사 제어 하에 T7 gn1 유전자를 산생하는 체류 프로파지로부터 숙주 균주 Bl21 (DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
E. coli에서의 재조합 단백질 발현을 최대화시키기 위한 한가지 전략은 재조합 단백질을 단백질분해적으로 절단시키는 능력이 감소된 숙주 세균 내에서 그 단백질을 발현시키는 것이다 (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128). 또 다른 전략은 발현 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 핵산 서열을 변형시켜 각 아미노산에 대한 개별적 코돈이 E. col에서 바람직하게 이용가능한 것이 되도록 만드는 것이다 (Wada 등, (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). 본 발명의 이러한 핵산 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 구체예에서, GHRd3 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 S. cerevisiae의 발현 벡터의 예로는 pYepSec 1 (Baldari, 등, (1987) Embo J. 6: 229- 234), pMFa (Kurjan 및 Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등, (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)을 들 수 있다.
또는, GHRd3 단백질은 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하는 곤충 세포에서 발현될 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예컨대, Sf 9 세포) 중에서 단백질을 발현시킬 수 있는 배큘로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈 (Smith 등 (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow 및 Summers (1989) Virology 170: 31-39)가 포함된다. 특히 바람직한 구체예에서, GHRd3 단백질은 Karniski 등, Am. J. Physiol. (1998) 275:F79-87에 따라 발현된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산을 포유류의 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포로부터 발현시킨다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 외 (1987) EMBO J. 6:187-195)를 들 수 있다. 포유류 세포에서 사용될 경우, 이 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스의 조절 요소에 의해 제공된다. 예컨대, 흔히 이용되는 프로모터들은 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 Simian Virus 40이다. 원핵세포와 진핵세포의 두가지 모두에 대한 기타 적절한 발현계에 관해서는 Sambrook, J. , Fritsh, E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989에 설명되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 발명에서 호환적으로 쓰인다. 이러한 용어는 특정 세포에만 그런 것이 아니라 그러한 세포의 자손이나 잠재적인 자손에 대해서도 사용되는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 이어지는 후대에서도 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 친(친(親) 세포와는 동일할 수도, 또는 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 사용되는 한 이 범위에 포함되는 것으로 한다.
숙주 세포는 어떠한 원핵세포이든 또는 진핵세포이든 무방하다. 예컨대, GHRd3 단백질은 E. coli, 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포 (바람직하게는 인간의 293 세포)와 같은 세균 세포에서 발현될 수 있다. 기타 적절한 숙주 세포는 Xenopus laevis 난모세포를 비롯하여 당업자에게 잘 알려져 있다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서, "형질전환" 및 "트랜스펙션"이라는 용어는 외래 핵산 (예컨대 DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위한, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 기술, 예컨대, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침법, DEAE-덱스트란 매개성 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기영동을 가리키는 것으로 한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시키기 위한 적절한 방법은 Sambrook, 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) 및 기타 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.
포유류 세포의 안정한 트랜스펙션을 위해서, 사용된 발현 벡터와 트랜스펙션 기술에 따라, 오직 작은 분획의 세포만이 외래 DNA를 그의 게놈 내로 통합시킬 수 있다. 이러한 인테그런트를 동정 및 선별하기 위해, 선별가능한 마커 (예컨대, 항생제 내성 마커)를 코딩하는 유전자를 목적하는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것들이다. 적절한 마커를 코딩하는 핵산은 GHRd3 단백질을 코딩하는 것과 동일한 벡터를 이용하여 숙주 세포 내로 도입할 수도 있고, 또는 별개의 벡터를 이용하여 도입할 수도 있다. 도입된 핵산에 의해 안정하게 트랜스펙션된 세포들을 약물 선별에 의해 동정할 수 있다 (예컨대, 선별가능한 마커 유전자가 통합된 세포들은 살아 남고, 그렇지 않은 세포들은 사멸할 것이다).
배양 중의 원핵 또는 진핵 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포는 GHRd3 단백질을 생산 (즉, 발현)하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용하여 GHRd3 단백질을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 본 발명의 숙주 세포 (GHRd3 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되어 있는 숙주)를 적절한 배지에서 배양하여 GHRd3 단백질을 생산하는 것을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 숙주 세포는 또한 GHRd3 대립 유전자에 동종접합적이거나 이종접합적인 비인간 트랜스제닉 동물을 만드는데도 이용가능하다. 예컨대, 일 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 수정된 난모 세포이거나 또는 GHRd3-코딩 서열이 도입된 배아 줄기 세포이다. 이러한 숙주 세포를 이용하여 외인성 GHRd3 서열이 그들의 게놈내로 도입된 비인간 트랜스제닉 동물, 또는 내인성 GHRfl 서열이 변경된 동종 재조합 동물을 만들 수 있다. 이러한 동물들은 GHRd3의 융합 및/또는 활성을 연구하고 GHRd3 활성의 조절자를 동정 및/또는 평가하는데 유용하다. 본 명세서에서, "트랜스제닉 동물"이라 함은 그 동물의 하나 이상의 세포가 트랜스유전자를 포함하고 있는 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 래트 또는 마우스와 같은 설치류를 가리킨다. 트랜스제닉 동물의 기타 예로는 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등을 들 수 있다. 트랜스유전자는 어떤 세포의 게놈 내로 통합된 외인성 DNA로서 그 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발달하여, 그 성숙한 동물의 게놈 내에 잔존함으로서, 코딩된 유전자 산물의 발현이 그 트랜스제닉 동물의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직을 지시하게 된다. 본 명세서에서 "동종 재조합 동물"이라 함은 내인성 GHR 유전자 (예컨대 GHRfl 대립 유전자)가 그 동물의 세포, 예컨대 그 동물의 발달 전, 그 동물의 배아 세포 내로 도입된 내인성 유전자와 외인성 DNA 분자 간의 동종 재조합에 의해 변경된 비인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스를 가리킨다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 예컨대 마이크로인젝션, 레트로바이러스 감염 수단에 의해, GHRd3을 코딩하는 핵산을 수정된 난모 세포의 웅성 전핵 (male pronuclei) 내로 도입하고, 이 난모 세포를 거짓 임신된 암컷 대리모 동물에서 발달시킴으로써 만들 수 있다. GHRd3 cDNA 서열을 비인간 동물의 게놈 내로 트랜스유전자로서 도입할 수 있다. 인트론 서열과 폴리아데닐화 시그널 역시 트랜스유전자 내레 포함시켜 트랜스유전자의 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 조직 특이적인 조절 서열(들)을 GHRd3 트랜스유전자에 작동적으로 결합시켜 GHRd3 단백질의 발현을 특정 세포로 지향시킬 수 있다. 배아 조작 및 마이크로인젝션을 통해, 트랜스제닉 동물, 특히 마우스와 같은 트랜스제닉 동물을 제조하는 방법은 기술 분야에 통상적인 것이 되었으며, 예컨대 Ledar 등의 미국특허 제4,736,866호 및 4,870,009호, Wagner 등의 미국특허 제4,873,191호 및 Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)에 기재되어 있다. 유사한 다른 트랜스제닉 동물을 생산하는데 유사한 방법들이 이용된다. 트랜스제닉 파운더 동물은 그의 게놈 중에 GHRd3 트랜스유전자가 존재하는지 및/또는 그 동물의 조직이나 세포 중의 GHRd3 mRNA의 발현 여부에 기초해서 동정할 수 있다. 이어서 트랜스제닉 파운더 동물을 이용하여 그 트랜스유전자를 지니는 부가적인 동물들을 육종할 수 있다. 뿐만 아니라, GHRd3 단백질을 코딩하는 트랜스제닉 동물들을, 다른 트랜스유전자를 지니는 다른 트랜스제닉 동물들로 더욱 육종시킬 수 있다.
동종 재조합 동물을 만들기 위해, 내인성 GHR (GHRfl) 유전자를 변경시키도록, GHRd3 핵산의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다. 이 GHRd3 유전자는 인간의 유전자이거나 또는 인간의 GHR 유전자의 비인간 상동체(homologue)일 수 있다 (예컨대, SEQ ID NO:1, 4 또는 6으로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열과의 엄격(stringent) 하이브리다이제이션에 의해 분리된 cDNA). 바람직하게는 엑손 3 핵산이 결실되도록 비인간 GHR 서열을 변형시켜 비인간 상동체를 제조하는 것이 좋다. GHRd3 대립 유전자는 마우스에서 관찰되지 않기 때문에, 마우스 GHRd3 핵산은 공지 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 따라서, 어떤 측면에서, 합성 마우스 GHRd3 유전자를 마우스 게놈의 내인성 GHR 유전자를 변경시키는데 적합한 상동성 재조합 벡터에서 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벡터를 상동 재조합에 의해, 내인성 GHR 유전자를, 기능적 GHRd3 단백질을 코딩하는 GHRd3 유전자 (예컨대, 업스트림의 조절 대역이 변경됨으로 해서 내인성 GHRd3 단백질의 발현도 변경됨)로 대체시키도록, 벡터를 고안한다. 상동 재조합 벡터에서는, GHRd3 유전자의 5' 및 3' 말단이 GHR 유전자의 부가적인 핵산 서열에 인접되어, 벡터에 의해 운반되는 외인성 GHRd3 유전자와 배아 줄기 세포 내의 내인성 GHR 유전자 간에 상동 재조합이 일어난다. 부가적인 인접 GHR 핵산 서열은 내인서어 유전자와의 성공적인 상동 재조합에 충분한 길이를 갖는다. 일반적으로, 이 벡터에는 수 킬로베이스에 달하는 인접 DNA (5' 말단과 3' 말단 모두)가 포함된다 (상동 재조합 벡터의 설명에 관해서는 예컨대, Thomas, K.R. 및 Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 참조). 벡터를 배아 줄기 세포주 (예컨대 전기영동에 의해) 내로 도입하고, 도입된 GHRd3 유전자가 내인성 GHR 유전자와 상동 재조합된 세포를 선별한다 (예컨대, Li, E. 등 (1992) Cell 69:915 참조). 이어서, 선별된 세포들을 그 동물 (예컨대, 마우스)의 낭포 내로 주입하여 응집 키메라 (aggregation chimeras)를 얻는다 (예컨대, Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E. J. Robertson, 편집 (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152 참조). 이 키메라 배아를 적절한 거짓 임신 대리모 동물에 이식해서 임신 기간을 개시한다. 그 배아 세포에 상동 재조합된 DNA를 산생하는 후손들을 이용하여 그 동물의 모든 세포가 트랜스유전자의 배 전달에 의해 상동 재조합된 DNA를 함유하는 동물들을 육종할 수 있다. 상동 재조합 벡터 및 상동 재조합 동물의 제조 방법은 Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829 및 PCT 국제 공개 WO 90/11354 (Le Mouellec 등); WO 91/01140 (Smithies 등); WO 92/0968 (Zijlstra 등); 및 WO 93/04169 (Berns 등)에 설명되어 있다.
또 다른 구체예에서, 트랜스유전자의 조절적 발현을 가능케하는 선별된 시스템을 함유하는 트랜스제닉 비인간 동물들을 제조할 수 있다. 이러한 시스템의 한가지 예는 박테리오파지 Pl의 cre/loxP 재조합 효소 시스템이다. cre/loxP 재조합 효소 시스템에 관한 설명은 예컨대 Lakso 등 (1992) PNAS 89:6232-6236에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 재조합 효소 시스템의 예는 사카로마이세스 세레베지에 (O'Gorman 등 (1991) Science 251:1351-1355)의 FLP 재조합 시스템이다. 트랜스유전자의 발현 조절을 위해 cre/loxP 재조합 효소 시스템을 사용할 경우, Cre 재조합효소와, 선별된 단백질 두가지 모두를 코딩하는 트랜스유전자를 함유하는 동물이 필요하다. 이러한 동물들은 예컨대, 선택된 단백질을 코딩하는 트랜스유전자를 함유하는 동물과 재조합 효소를 코딩하는 트랜스유전자를 함유하는 또 다른 동물을 교배시킴으로써, "이중(double)" 트랜스유전자 동물의 구축을 통해 제공할 수 있다.
다음의 실시예를 참고로 하면 본 발명이 보다 잘 이해될 것이다. 그러나 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 모든 문헌 및 특허문헌 인용은 참조로 본문에 통합된다.
실시예 1
GHRd3 및 GHRfl의 PCR RFLP 유전형
PCR RFLP
각 웰마다, DNA 200 ng, MgCl2 1.5 mM, 반응 완충액 (Perkin Elmer) 5 ㎕ 10X, 0.2 mM 씩의 dNTP, 0.2 μM 씩의 각각의 프라이머 및 Taq 폴리머라제 (Perkin Elmer) 1.25 U를 함유하는 반응 혼합물 50 ㎕을 함유하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 (Perkin Elmer)에서 PCR 증폭을 수행하였다.
9700 Perkin Elmer 써모싸이클러를 이용하여 35 PCR 사이클을 수행하였다. PRC 산물을 아가로스 젤 상에서 검출하였다.
프라이머 (5'-3') 어닐링 온도 PCR 산물 검출 방법
G1: TGTGCTGGTCTGTTGGTCTGG2: AGTCGTTCCTGGGACAGAGAG3: CCTGGATTAACACTTTGCAGACTC 60℃ fl/fl:935 bpfl/d3:935 및 532 bpd3/d3:532 bp 0.5 X TBE 중 1% 아가로스 젤
실시예 2
GH 반응과 연관된 GHRd3 대립 유전자의 검출
재조합 GH를 이용한 치료가 시도된 것으로 등록된 바 있는 특발성 단신증 (ISS: idiopathic short stature)을 앓는 어린이 97명에 대해 공통되는 GHR 엑손 3 변이체와 GH를 이용한 치료에 대한 성장 속도 반응과의 관련성을 검사하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, GHRd3 대립 유전자는 47명의 환자에 존재하였고, 이 중 3명은 GHRd3/d3 동종접합자였으며, 44명은 GHRd3/fl 이종접합자였다.
코커서스 인종 개체들에 있어서의 GHR 유전형 분포
fl/fl 50 210
d3/fl 44 181
d3/d3 3 12
일반적인 단신 환자들도 포함되었다. 배제된 사람들은 다음과 같았다: 성장 호르몬이 "실제로" 결핍된 환자 (GHD), CNS 종양 환자, GHR 유전자가 돌연변이된 환자, 기타 호르몬이 결핍된 환자, 터너 증후군 환자, PHP, 연골 발육부전 환자 또는 기타의 골 형성이상 환자, 라론씨병 또는 기타 질환 환자. 마지막으로, 포함된 환자들은 2년 후 GH 치료 말기에 사춘기 증후군 (유방, 고환)을 나타내지 않았다.
유전형 그룹은 다른 의료 및 치료적 특징과 관련하여 필적할만 하였다. 부모의 신장과 생후 크기, 연령, 성별, rGH 투약량을 비롯한 환자의 특징들을 고려하였다 (표 2, 3, 및 4).
시험 개시 무렵의 임상적 및 생물학적 표현형
GHR 유전형 fl/fl fl/d3 또는 d3/d3
N 50 47
연령 (나이) 7.63±0.32 7.80±0.30
성별 29M/21F 32M/15F
GH 피크 (ng/ml)OAIGBX기타 8.8±0.9 (31)8.2±1.3 (23)10.8±2.0 (28)8.7±1.9(18) 9.2±1.5 (28)8.1±1.2 (17)10.0±1.5 (30)6.9±1.1(17)
2가지 유전형 그룹에 있어서의 GH 약량학
fl/fl fl/d3, d3/d3
rGH 투여량 제1년 (U.kg.w.) 0.714±0.055 0.727±0.066
rGH 투여량 제2년 (U.kg.w.) 0.712±0.056 0.727±0.060
생후 크기 및 부모의 신장
GHR 유전형 fl/fl dl/fl 또는 d3/d3
n 50 47
생후 신장 (cm) 47.2±0.4 47.6±0.4
생후 무게 (g) 2885±90 2929±85
부친 신장 (cm) 170±1.2 169.2±0.8
모친 신장 (cm) 157.2±0.9 157.3±0.9
rhGH를 이용한 치료기간인 2년 동안 성장 속도를 추적하였다. 연령, 성별, rGH의 투여량 조정 후, GHRd3 변이체를 갖는 어린이들은 rGH로 치료받았을 때 훨씬 빠른 속도로 성장하였다. 성장 속도는 GHRd3/fl 또는 GHRd3/d3 유전형을 갖는 어린이들에 이어서, 치료 첫 해에는 9.0 +/-0.3 cm/1년이었고, 두번째 해에는 7.8 +/-0.2 cm/1년인 반면, GHRfl/fl 유전형을 갖는 어린이들에 있어서는 각각 7.4 +/-0.2 cm/1년과 6.5 +/-0.2 cm/1년이었다 (P < 0.0001). GHR 서열의 게놈 변이는 따라서 rGH 효능의 현저한 차이와 관련이 있다.
두가지 유전형 그룹에 있어서의 성장 속도
fl/fl fl/d3 또는 d3/d3 P
50 47
치료 개시무렵의 성장 속도 (cm/1년)첫 해두번째 해 4.83±0.117.39±0.206.48±0.19 4.30±0.159.01±0.307.77±0.24 < 0.0001< 0.0001
보정된 Y1-0 (cm/1년) 2.55±0.24 4.72±0.38 < 0.0001
보정된 Y2-0 (cm/1년) 1.65±0.21 3.47±0.32 < 0.0001
성장 속도의 다변량 분석을 위해, 그 개체 자체의 측정치들 간의 상관관계를 모델화하기 위해 혼합식 선형 모델을 이용하였다 (표 6). 참고된 공변량에는 연령, 성별, 재조합 GH로 치료되기 전의 성장 속도 (VC0) (승마 효과), 치료 개시무렵의 신장, GH 투여량, GHR 유전형 및 서브젝트 (인터셉트)이 포함된다.
그 결과, 엑손 3이 결실된 GHR (GHRd3)을 갖는 환자들의 성장 속도는 공변량 조정 후, 전장 GHR 이소형 (GHRfl)에 동종접합적인 환자들보다 더 높은 것으로 나타났다. 상관 매트릭스는 이 효과가 다른 공련량과는 무관함을 보여준다.
다양한 변수에 대한 선형 회귀 모델
다중 회귀
t값 p값
연령 -5.308 < 0.0001
GV0 -3.017 0.0033
성별 3.495 0.0007
rGH 투여량 3.389 0.001
GHR 유전형 4.520 < 0.0001
<110> PFIZER HEALTTH AB <120> Methods for Predicting Therapeutic Response to Agents Acting on the Growth Hormone Receptor <130> KP-CH-056284 <150> 60/434,861 <151> 2002-12-19 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 4414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (44)..(1957) <220> <221> misc_feature <222> (488)..(742) <223> FNS; Region: Fibronectin type 3 domain <220> <221> misc_feature <222> (524)..(775) <223> FNS; Region: Fibronectin type III domain <220> <221> variation <222> (579) <223> allele = A; allele = G <220> <221> variation <222> (601) <223> allele = A ; allele = G A is G in GHR.262 and GHR.501 <220> <221> variation <222> (729) <223> allele = A ; allele = G <220> <221> variation <222> (1167) <223> G is U in GHR.501 <220> <221> variation <222> (1362) <223> Allele = G; Allele = T <220> <221> variation <222> (1516) <223> Allele = C; Allele = T <220> <221> variation <222> (1526) <223> Allele = A; Allele = C <220> <221> variation <222> (1673) <223> Allele = A; Allele = C <220> <221> variation <222> (1778) <223> Allele = A; Allele = C <220> <221> variation <222> (2260) <223> Complement - Allele = C; Allele = T <220> <221> variation <222> (2479) <223> C is U in GHR.110 <220> <221> variation <222> (3751) <223> Allele = A; Allele = G <220> <221> polyA_signal <222> (3751) <220> <221> polyA_site <222> (4414) <400> 1 ccgcgctctc tgatcagagg cgaagctcgg aggtcctaca ggt atg gat ctc 52 Met Asp Leu 1 tgg cag ctg ctg ttg acc ttg gca ctg gca gga tca agt gat gct ttt 100 Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser Asp Ala Phe 5 10 15 tct gga agt gag gcc aca gca gct atc ctt agc aga gca ccc tgg agt 148 Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp Ser 20 25 30 35 ctg caa agt gtt aat cca ggc cta aag aca aat tct tct aag gag cct 196 Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu Pro 40 45 50 aaa ttc acc aag tgc cgt tca cct gag cga gag act ttt tca tgc cac 244 Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys His 55 60 65 tgg aca gat gag gtt cat cat ggt aca aag aac cta gga ccc ata cag 292 Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile Gln 70 75 80 ctg ttc tat acc aga agg aac act caa gaa tgg act caa gaa tgg aaa 340 Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys 85 90 95 gaa tgc cct gat tat gtt tct gct ggg gaa aac agc tgt tac ttt aat 388 Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn 100 105 110 115 tca tcg ttt acc tcc atc tgg ata cct tat tgt atc aag cta act agc 436 Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser 120 125 130 aat ggt ggt aca gtg gat gaa aag tgt ttc tct gtt gat gaa ata gtg 484 Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile Val 135 140 145 caa cca gat cca ccc att gcc ctc aac tgg act tta ctg aac gtc agt 532 Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser 150 155 160 tta act ggg att cat gca gat atc caa gtg aga tgg gaa gca cca cgc 580 Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arg 165 170 175 aat gca gat att cag aaa gga tgg atg gtt ctg gag tat gaa ctt caa 628 Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu Gln 180 185 190 195 tac aaa gaa gta aat gaa act aaa tgg aaa atg atg gac cct ata ttg 676 Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile Leu 200 205 210 aca aca tca gtt cca gtg tac tca ttg aaa gtg gat aag gaa tat gaa 724 Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr Glu 215 220 225 gtg cgt gtg aga tcc aaa caa cga aac tct gga aat tat ggc gag ttc 772 Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe 230 235 240 agt gag gtg ctc tat gta aca ctt cct cag atg agc caa ttt aca tgt 820 Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys 245 250 255 gaa gaa gat ttc tac ttt cca tgg ctc tta att att atc ttt gga ata 868 Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile Phe Gly Ile 260 265 270 275 ttt ggg cta aca gtg atg cta ttt gta ttc tta ttt tct aaa cag caa 916 Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser Lys Gln Gln 280 285 290 agg att aaa atg ctg att ctg ccc cca gtt cca gtt cca aag att aaa 964 Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro Lys Ile Lys 295 300 305 gga atc gat cca gat ctc ctc aag gaa gga aaa tta gag gag gtg aac 1012 Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu Glu Val Asn 310 315 320 aca atc tta gcc att cat gat agc tat aaa ccc gaa ttc cac agt gat 1060 Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe His Ser Asp 325 330 335 gac tct tgg gtt gaa ttt att gag cta gat att gat gag cca gat gaa 1108 Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu Pro Asp Glu 340 345 350 355 aag act gag gaa tca gac aca gac aga ctt cta agc agt gac cat gag 1156 Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser Asp His Glu 360 365 370 aaa tca cat agt aac cta ggg gtg aag gat ggc gac tct gga cgt acc 1204 Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser Gly Arg Thr 375 380 385 agc tgt tgt gaa cct gac att ctg gag act gat ttc aat gcc aat gac 1252 Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn Ala Asn Asp 390 395 400 ata cat gag ggt acc tca gag gtt gct cag cca cag agg tta aaa ggg 1300 Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg Leu Lys Gly 405 410 415 gaa gca gat ctc tta tgc ctt gac cag aag aat caa aat aac tca cct 1348 Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn Asn Ser Pro 420 425 430 435 tat cat gat gct tgc cct gct act cag cag ccc agt gtt atc caa gca 1396 Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val Ile Gln Ala 440 445 450 gag aaa aac aaa cca caa cca ctt cct act gaa gga gct gag tca act 1444 Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala Glu Ser Thr 455 460 465 cac caa gct gcc cat att cag cta agc aat cca agt tca ctg tca aac 1492 His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser Leu Ser Asn 470 475 480 atc gac ttt tat gcc cag gtg agc gac att aca cca gca ggt agt gtg 1540 Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala Gly Ser Val 485 490 495 gtc ctt tcc ccg ggc caa aag aat aag gca ggg atg tcc caa tgt gac 1588 Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser Gln Cys Asp 500 505 510 515 atg cac ccg gaa atg gtc tca ctc tgc caa gaa aac ttc ctt atg gac 1636 Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe Leu Met Asp 520 525 530 aat gcc tac ttc tgt gag gca gat gcc aaa aag tgc atc cct gtg gct 1684 Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile Pro Val Ala 535 540 545 cct cac atc aag gtt gaa tca cac ata cag cca agc tta aac caa gag 1732 Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu Asn Gln Glu 550 555 560 gac att tac atc acc aca gaa agc ctt acc act gct gct ggg agg cct 1780 Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala Gly Arg Pro 565 570 575 ggg aca gga gaa cat gtt cca ggt tct gag atg cct gtc cca gac tat 1828 Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val Pro Asp Tyr 580 585 590 595 acc tcc att cat ata gta cag tcc cca cag ggc ctc ata ctc aat gcg 1876 Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile Leu Asn Ala 600 605 610 act gcc ttg ccc ttg cct gac aaa gag ttt ctc tca tca tgt ggc tat 1924 Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser Cys Gly Tyr 615 620 625 gtg agc aca gac caa ctg aac aaa atc atg cct tag cctttctttg 1970 Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro 630 635 gtttcccaag agctacgtat ttaatagcaa agaattgact ggggcaataa cgtttaagcc 2030 aaaacaatgt ttaaaccttt tttgggggag tgacaggatg gggtatggat tctaaaatgc 2090 cttttcccaa aatgttgaaa tatgatgtta aaaaaataag aagaatgctt aatcagatag 2150 atattcctat tgtgcaatgt aaatatttta aagaattgtg tcagactgtt tagtagcagt 2210 gattgtctta atattgtggg tgttaatttt tgatactaag cattgaatgg ctatgttttt 2270 aatgtatagt aaatcacgct ttttgaaaaa gcgaaaaaat caggtggctt ttgcggttca 2330 ggaaaattga atgcaaacca tagcacaggc taattttttg ttgtttctta aataagaaac 2390 ttttttattt aaaaaactaa aaactagagg tgagaaattt aaactataag caagaaggca 2450 aaaatagttt ggatatgtaa aacatttact ttgacataaa gttgataaag attttttaat 2510 aatttagact tcaagcatgg ctattttata ttacactaca cactgtgtac tgcagttggt 2570 atgacccctc taaggagtgt agcaactaca gtctaaagct ggtttaatgt tttggccaat 2630 gcacctaaag aaaaacaaac tcgtttttta caaagccctt ttatacctcc ccagactcct 2690 tcaacaattc taaaatgatt gtagtaatct gcattattgg aatataattg ttttatctga 2750 atttttaaac aagtatttgt taatttagaa aactttaaag cgtttgcaca gatcaactta 2810 ccaggcacca aaagaagtaa aagcaaaaaa gaaaaccttt cttcaccaaa tcttggttga 2870 tgccaaaaaa aaatacatgc taagagaagt agaaatcata gctggttcac actgaccaag 2930 atacttaagt gctgcaattg cacgcggagt gagtttttta gtgcgtgcag atggtgagag 2990 ataagatcta tagcctctgc agcggaatct gttcacaccc aacttggttt tgctacataa 3050 ttatccagga agggaataag gtacaagaag cattttgtaa gttgaagcaa atcgaatgaa 3110 attaactggg taatgaaaca aagagttcaa gaaataagtt tttgtttcac agcctataac 3170 cagacacata ctcatttttc atgataatga acagaacata gacagaagaa acaaggtttt 3230 cagtccccac agataactga aaattattta aaccgctaaa agaaactttc tttctcacta 3290 aatcttttat aggatttatt taaaatagca aaagaagaag tttcatcatt ttttacttcc 3350 tctctgagtg gactggcctc aaagcaagca ttcagaagaa aaagaagcaa cctcagtaat 3410 ttagaaatca ttttgcaatc ccttaatatc ctaaacatca ttcatttttg ttgttgttgt 3470 tgttgttgag acagagtctc gctctgtcgc caggctagag tgcggtggcg cgatcttgac 3530 tcactgcaat ctccacctcc cacaggttca ggcgattccc gtgcctcagc ctcctgagta 3590 gctgggacta caggcacgca ccaccatgcc aggctaattt ttttgtattt tagcagagac 3650 ggggtttcac catgttggcc aggatggtct cgagtctcct gacctcgtga tccacccgac 3710 tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt gtaagccacc gtgcccagcc ctaaacatca 3770 ttcttgagag cattgggata tctcctgaaa aggtttatga aaaagaagaa tctcatctca 3830 gtgaagaata cttctcattt tttaaaaaag cttaaaactt tgaagttagc tttaacttaa 3890 atagtatttc ccatttatcg cagacctttt ttaggaagca agcttaatgg ctgataattt 3950 taaattctct ctcttgcagg aaggactatg aaaagctaga attgagtgtt taaagttcaa 4010 catgttattt gtaatagatg tttgatagat tttctgctac tttgctgcta tggttttctc 4070 caagagctac ataatttagt ttcatataaa gtatcatcag tgtagaacct aattcaattc 4130 aaagctgtgt gtttggaaga ctatcttact atttcacaac agcctgacaa catttctata 4190 gccaaaaata gctaaatacc tcaatcagtc tcagaatgtc attttggtac tttggtggcc 4250 acataagcca ttattcacta gtatgactag ttgtgtctgg cagtttatat ttaactctct 4310 ttatgtctgt ggattttttc cttcaaagtt taataaattt attttcttgg attcctgata 4370 atgtgcttct gttatcaaac accaacataa aaatgatcta aacc 4414 <210> 2 <211> 638 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser 1 5 10 15 Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala 20 25 30 Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser 35 40 45 Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe 50 55 60 Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly 65 70 75 80 Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln 85 90 95 Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys 100 105 110 Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 115 120 125 Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp 130 135 140 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 145 150 155 160 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 165 170 175 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 195 200 205 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 210 215 220 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 245 250 255 Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser 275 280 285 Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro 290 295 300 Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe 325 330 335 His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu 340 345 350 Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser 355 360 365 Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser 370 375 380 Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn 385 390 395 400 Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg 405 410 415 Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn 420 425 430 Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val 435 440 445 Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala 450 455 460 Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser 465 470 475 480 Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala 485 490 495 Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser 500 505 510 Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe 515 520 525 Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile 530 535 540 Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu 545 550 555 560 Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala 565 570 575 Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val 580 585 590 Pro Asp 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Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 115 120 125 Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp 130 135 140 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 145 150 155 160 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 165 170 175 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 195 200 205 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 210 215 220 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 245 250 255 Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser 275 280 285 Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro 290 295 300 Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu 305 310 315 320 Glu 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Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile 530 535 540 Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu 545 550 555 560 Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala 565 570 575 Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val 580 585 590 Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile 595 600 605 Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser 610 615 620 Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro 625 630 635 <210> 4 <211> 6789 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(6789) <223> Growth Hormone Receptor (GHR) <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> repeat_region <222> (580)..(882) <223> complement MER4B dispersed <220> <221> repeat_region <222> (884)..(1226) <223> complement MER4D dispersed <220> <221> misc_feature <222> (1064) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> repeat_region <222> (1227)..(1915) <223> complement MER21 dispersed 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aataataaaa 180 tttagagaga gaataaaaaa gaaacacttt cacagctgaa aggctgcttc ccagttagct 240 aactgggagg agttactgaa aaagtacatt gaaaagcggc tcaggggcag gtgaattgga 300 ctcaccaggc tctgacattc agagagatgg gaatgagtca gctcactgtc cagcacatct 360 ttattttatt tctctttctt gttttatatc agaaatagat ttcttggcat tgttactgtg 420 ggtttctatt aaggactgaa caaaagtatt aataatctga gagtatgtaa aaaaaaattc 480 attttctcct actatactct cataacacag aatattttgg tgaccagaga tcaccaaaat 540 gtgtgtggtg tcaacgaaaa gagtcaaact ctctaaaata tttgaagaga ttttttctga 600 gccaaatgtg agtgaacatg gcctgtgaca tagccctcag gaggtcctga gaacatgtgc 660 ccaaggtggt cagggtacag cttggttttt atatatttta gggaggcata agacatcaat 720 caaatacatt taagaaatac gttgatttgg ttcagaaagg caggacaact caaatgggga 780 gcttccaggc tataggtaaa tttaaacatt ttctggttga caattagttg agtttgtctg 840 aagacctggg attaatggaa aggactattc aggttaagat atgtttctta ttggacctaa 900 aactgtgcct ggctcttagt tgattactgc ctggatctgg gaaggaagga aggaaaacaa 960 agggggaagg ggattctcta tagaatgtgg atttttccca taagagactt tgtagggcaa 1020 tttcaaggca tggcaaggaa atatactttg gggctaatat tttnccttgt ctcataatgt 1080 tatgccagag tcatattgaa aagcaagtca caatatacaa ggtcaaataa aaccatctga 1140 tgagaaccca tggtttgtag ggcatgactc cccagaaccc ttaggtagga atttgggcaa 1200 gataaaaaat cggaacttag tcctcggcgg gaatctctcc ccacacaaat tctccaacag 1260 attcttcagt gggacaccaa ctgggtggtt ctcaaattca attcaattct gaccaatcta 1320 cctatctacc tggaaatagc atcagataac cacaggttta cggctcattc caacaatact 1380 gtcccccact tcagatgcca actgcaagta ataggttgtt acctatactt ctagccagtc 1440 agctgtnaan tggtgttccc acaacctccc cctccggttt gataatttga gacagcttgc 1500 ttacatgtac cagcttatta gaaaggatat tacaaaggac acagatgaag agatggatag 1560 ggtaaggtat gtgggttgga gttgcagagt ttccatgacc tctctgagtg cagcatcttc 1620 atgtgttcag ctatccagaa tctctcggat taagacattg gccactggtg atcaaattaa 1680 ccttgagtcc ctctcccctt cctgaggttg gagagtgggg ctgaagtgtc tcaacctcta 1740 atcaactctt ggtctttcct gtgaccatgc cccatcctga ggctctccag gagcccccag 1800 gcatcagtca actcattagc atacgaaaga cacttatcac tacagagatt cgaaggattt 1860 taggaactgt gtcaagaaac ggagacaagg tcaaatatgt atttcacaat atcaccagta 1920 gtttcactgg gaggtaaaac tcagtgttta ctgtgggcct gagccatgct gaccctctaa 1980 gaataactta gaggtaacgt gatcagatgt ggggaattct ggagaaacac ctttcaccac 2040 caagcccaga caagagatgc atacttttct agctgggatg cttacaaagc aacccactct 2100 aatacttcaa ggtagagtga cactacattc atcatttttc attttttcct gttttttatg 2160 ccatctacta ctaatgtcaa tcaaattacg actgtgttta tagtggatga attatggacc 2220 atctcacacc ataaagttct gtttctctca tgttgagctt ttcacctccc ttcattccct 2280 ccctacttcc aggatcattc acatgtttat ttctaaaaat aaactttttt tactgaactt 2340 tttttcatac tgtttaaaaa gaatttatat ttctcttcat tcttacagat aagattcaag 2400 tttaaactca aataatgtag gaaatctttt tttaaaaaat tgttccctac tgtgtctagg 2460 cgtgagaccc aaaagtaatt aagaccaggt tttcatttgc tgtgatttgt gtgagttctt 2520 tttagaggtt aggtgcaatt ttaattttta aaagggggat tattatgaga ggagaaatca 2580 tactttatca tttgaaaatg atgccataac aggtgttagc agaaaaatca aactgtaaaa 2640 tattttaaag agatttattc tgagccaata taagtgactg tggccccatt gaaatgagcg 2700 agttccctga tccctctcac agagcttgcg acagggatgt ggctcacctg ttcagttgcc 2760 ccaccgctca aacccctagg gggagaatac agacggtcag gtgcaaaggc tggggcaagt 2820 gccttggccc cttggcccct tagccccgag gtagtgtcta ggggtggggt gcctgcaacc 2880 ccagtgttac aaagttcttt cagctttgca gtccacggac agcttgagtg ttaatcagct 2940 caatggaccc tctgccttat agcaaaggca gagggccagt gtgacagctt tctgtatccc 3000 aagctcttgc ccagtgtcct agaaaaaaca gatcatacag gggctcgaag gatgagtgca 3060 aggttttatt gagtagtgga ggtggctctc agcaagatgg atggggagtg ggaagtgggg 3120 atggagtggg aaggtgaact tcctctgaag tcgggcagcc cagtggctgg actcttctcc 3180 aacctccccc aggcaagctc ctctcagcgt ccagatgttc ctcttccctc tctctctctg 3240 ccgcatcatt tcaccatctg tctgctggtc agctggcttg ctggtgtgct ggtctgttgg 3300 tctgctggtc tgcttctgga acctcaggtt cagagtttat atgagtgcac gatagggggt 3360 gttttgggcc aaaaggtagc tttttggaca tgaaaacgga aatgcctgtt cccatttagg 3420 gctgcaggtc ttcaggcttg agggtggggc ctttgcccag gaactaccct cttctaccca 3480 gtgtttccct gtctcctgtc catatcacca gtattcacag tctcaaggag tcttgagaaa 3540 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accatcaact ctgtggggaa gcgtctccaa attctctagt cctgaacaac atgctgcctt 5200 ctctgcttcc atggaacttt gtcctttaca acatgatagc gtttgcctcc tgacatttta 5260 gtgtgtgtgt tagccctgca tatagaactc accagattgt gtggtctgca tgaatgaatt 5320 aattctattg aactttaagg caaagcctaa actttatgct tcttctaaat cccttacatc 5380 tcctaaaaaa attctgatcc atagtagtag gtacttgttt aattaaattt tagggatgga 5440 tatttttcat cagtggaagt atatgctaga gtccatatta tgcaataagg gaagggaaga 5500 cagtgtacct aaatcagtta agatattgct attcttgttg ttattctaaa tcagttaaga 5560 tattgctatt cttgttgtta ttctagagtc acgaaatcat aatttgaatt ttatgactaa 5620 attgcagaat taatttccaa tgtgagattt taacattatt tccttggagg tgaccaaaaa 5680 ggagagctgg tactgttttt aacaactgtc attcaattgt cagttgtgcc agaccacaaa 5740 tcctttatag ccctcctgtt taagaagcat ctgacatgtt aagctgctcc ctaattaaca 5800 cagaggttgt aaaagaagtg gctgtttggt tctgtttggg tttcccagcc agtatattcc 5860 aaagcctttt ttcactcaac agatgagtta tgtgctttat attctgtaag gaaatgagaa 5920 gtaatcagtt gaaaatgtgt tactaatggt acatgcttca cattgaaacc atcctcctga 5980 cacaaacata atactttgcc cttcactgtc ccccaaagtg gcagtaggat ttctctaagt 6040 aattttcttt acttatatga gtgcaggata gggggtgttt tgggccaaaa ggtagctttt 6100 tggacatgaa aacggaaatg cctgttccca tttagggctg caggtcttca ggcttgaggg 6160 tggggccttt gcccaggaac taccctcttc tacccagtgt ttccctgtct cctgtccata 6220 tcaccagtat tcacagtctc aaggagtctt gagaaagtgt gcccaaggcc gtcagattca 6280 gtttggttct gtatgtcaca gggtctaaga agcgtaaaca ttgtgccttg ttgaaataca 6340 gcctctaggt atggaggatg tgttgaacaa cttcctacca gtcatttggc atatgttgat 6400 ttcctgtctt catgatacgt aagacgacta gctaattatc attcatatgt ggtaagtcac 6460 atagatactg acttccccta tctttccagc tttttcttat caaaagtcac ctgctctctg 6520 tcccaggaac gactggctaa agtaacctat atcagtgtct gtaacagtgg gcacctatca 6580 tagtgcacat gcttgaacat atcattgcct tttatcatca cgagcctcac atccagatgt 6640 gacagactca agtgctcaca tcacctcact ctgtcactgt atacattgtt accgtgtcac 6700 aaatatttaa cagtctgctg tgtactcagt ctttagctgt gtgccctgag ggagacagag 6760 taagatactg ccttgacatc aaggagctc 6789 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo 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cttgagtgtt aatcagctca atggaccctc tgccttatag 540 caaaggcaga gggccagtgt gacagctttc tgtatcccaa gctcttgccc agtgtcctag 600 aaaaaacaga tcatacaggg gctcgaagga tgagtgcaag gttttattga gtagtggagg 660 tggctctcag caagatggat ggggagtggg aagtggggat ggagtgggaa ggtgaacttc 720 ctctgaagtc gggcagccca gtggctggac tcttctccaa cctcccccag gcaagctcct 780 ctcagcgtcc agatgttcct cttccctctc tctctctgcc gcatcatttc accatctgtc 840 tgctggtcag ctggcttgct ggtgtgctgg tctgttggtc tgctggtctg cttctggaac 900 ctcaggttca gagtttatat gagtgcagga tagggggtgt tttgggccaa aaggtagctt 960 tttggacatg aaaacggaaa tgcctgttcc catttagggc tgcaggtctt caggcttgag 1020 ggtggggcct ttgcccagga actaccctct tctacccagt gtttccctgt ctcctgtcca 1080 tatcaccagt attcacagtc tcaaggagtc ttgagaaagt gtgcccaagg ccgtcagatt 1140 cagtttggtt ctgtatgtca cagggtctaa gaagcgtaaa cattgtgcct tgttgaaata 1200 cagcctctag gtatggagga tgtgttgaac aacttcctac cagtcatttg gcatatgttg 1260 atttcctgtc ttcatgatac gtaagacgac tagctaatta tcattcatat gtggtaagtc 1320 acatagatac tgacttcccc tatctttcca gctttttctt atcaaaagtc acctgctctc 1380 tgtcccagga acgactggct aaagtaacct atatcagtgt ctgtaacagt gggcacctat 1440 catagtgcac atgcttgaac atatcattgc cttt 1474

Claims (43)

  1. GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜서, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  2. 환자의 신장 또는 성장 속도를 증가시키는 약제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  3. 비만 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  4. 감염 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  5. 당뇨 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  6. 말단 비대증 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  7. 나트륨 또는 물의 정체와 관련된 증상의 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  8. 대사 증후군 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  9. 기분 장애 또는 수면 장애 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  10. 암 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  11. 심장 질환 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  12. 고혈압 치료제에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법으로서,
    환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 치료제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시켜, 상기 치료제를 사용하는 치료에 대하여 증가된 반응 가능성을 갖는 환자 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 단계를 포함하는,
    예측 방법.
  13. GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상의 증가 또는 감소된 치료 가능성을 갖는 환자를 동정하는 방법으로서,
    a) GHR 유전자의 대립 유전자의 존재를 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제에 대한 환자의 반응과 상호 관련시키고,
    b) 환자에서 단계 a)의 대립 유전자를 검출하여 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성을 갖는 환자를 동정하는 것을 포함하는 방법.
  14. GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상의 증가 또는 감소된 치료 가능성과 상호 관련된 GHR 유전자의 대립 유전자를 동정하는 방법으로서,
    a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존재를 측정하고,
    b) 단계 a)의 대립 유전자의 존재를 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제를 사용하는 질환 또는 증상의 증가 또는 감소된 치료 가능성과 상호 관련시켜, 상기 약제를 사용하는 치료에 대하여 증가 또는 감소된 반응 가능성과 관련된 대립 유전자를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제1항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GHR 단백질에 결합할 수 있는 약제가 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환을 치료할 수 있는 약제인 방법: 단신, 비만, 감염 또는 당뇨병; 말단 비대증 또는 거인증, 또는 이와 관련된 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 작용; 나트륨 또는 물의 정체와 관련된 증상; 대사 증후군; 기분 장애 및 수면 장애, 암, 심장 질환 및 고혈압.
  16. 환자의 성장 증가 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 환자의 성장을 증가시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 투여할 환자에 대한 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 비만 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 비만 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 당뇨 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 당뇨 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 감염 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 감염 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 말단 비대증 또는 거인증을 앓는 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 말단 비대증 또는 거인증 또는 이들과 관련된 유즙 분비 촉진, 당뇨 유발, 지질 분해 및 단백질 동화 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 비정상적 나트륨 또는 물 정체와 관련된 증상을 앓는 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 비정상적 나트륨 또는 물 정체와 관련된 상기 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 대사 증후군 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 대사 증후군 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 기분 장애 또는 수면 장애를 앓는 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 상기 기분 장애 또는 수면 장애, 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 암 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 암을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 심장 질환 또는 고혈압 환자의 치료 방법으로서,
    (a) 환자에서의 GHR 유전자의 대립 유전자의 존부를 측정하고, 상기 대립 유전자를 심장 질환 또는 고혈압, 또는 그의 증상을 개선시킬 수 있는 약제에 대한 양성 반응이 증가 또는 감소될 가능성과 상호 관련시키고,
    (b) 상기 환자에게 투여될 상기 약제의 유효량을 선택 또는 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제16항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 상기 환자에게 상기 약제의 상기 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한는 방법.
  27. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 DNA가 엑손 3에서 결실을 갖는 GHR 폴리펩타이드를 코딩하는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  28. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 환자에서의 GHRd3 대립 유전자의 존부를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 환자가 GHRd3 대립 유전자에 대하여 동형 접합성인지 이형 접합성인지 측정하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 단계가 샘플에서 GHRd3 핵산을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 측정 단계가 혼성화 분석을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 단계가 샘플에서 GHRd3 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 검출 단계가 샘플에서 GHRd3 폴리펩타이드에 대한 항체를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  34. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  35. 제16항에 있어서, 환자가 ISS를 앓는 환자인 방법.
  36. 제16항에 있어서, 환자가 연령과 성별을 고려한 정상 신장보다 약 2 이하의 표준 편차의 작은 신장을 갖는 환자인 방법.
  37. 제16항 또는 제26항에 있어서, 환자가 연령과 성별을 고려한 정상 신장보다 약 2 이하의 표준 편차의 작은 신장을 갖는지 여부를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 성장 호르몬 폴리펩타이드, 또는 그의 단편 또는 그의 변이체인 방법.
  39. 제38항에 있어서, GH의 유효량이 약 0.2mg/kg/week 이상인 방법.
  40. 제38항에 있어서, GH의 유효량이 약 0.25 mg/kg/week 이상인 방법.
  41. 제38항에 있어서, GH의 유효량이 약 0.3 mg/kg/week 이상인 방법.
  42. 제38항에 있어서, GH의 유효량이 약 0.001 mg/kg/day 내지 약 0.2 mg/kg/day인 방법.
  43. 제38항에 있어서, GH의 유효량이 약 0.01 mg/kg/day 내지 약 0.1 mg/kg/day인 방법.
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