HRP20050563A2

HRP20050563A2 - Methods for predicting therapeutic response to agents acting on the growth hormone receptor

Info

Publication number: HRP20050563A2
Application number: HR20050563A
Authority: HR
Inventors: Bougneres Pierre
Original assignee: Pfizer Health Ab
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2005-06-16
Publication date: 2005-12-31
Also published as: CA2510045A1; KR20050085855A; RU2005122665A; NO20053490D0; US20040180358A1; NO20053490L; SE0300959D0; CN1747968A; EP1572738A1; JP2006525785A; WO2004056864A1; AU2003278503A1

Description

Područje izuma

Predmetni izum se odnosi na metode za predviđanje veličine terapeutskog odgovora nekog subjekta na agense koji djeluju na receptor hormona rasta. Preferirani aspekti uključuju metode za povećavanje visine ljudskih subjekata koji su niskog stasa, i za liječenje pretilosti i akromegalije.

Stanje tehnike

Većina djece sa značajno niskim stasom nemaju deficijenciju hormona rasta (Growth Hormone Deficiency, GHD) kako se klasično definira odgovorom hormona rasta (Growth Hormone, GH) na provokativne stimulanse. Jednom kada su poznati uzroci niskoga stasa isključeni, ovi subjekti se klasificiraju pod različite termine, uključujući obiteljski niski stas, konstitutivno odgađanje rasta, "idiopatska niska statura" (Idiopathic Short Stature, ISS). Slučaj djece koja se rađaju malena od roditelja normalne visine naziva se "intrauterina retardacija rasta" (Intra Uterine Growth Retardation, IUGR). Djeca koja se rađaju malena za njihovu dob zovu se "mala za gestacijsku dob" (Small for Gestational Age, SGA). Neka, i po svoj prilici veliki broj te djece možda neće doseći svoj genetički potencijal za visinu, iako se o rezultatima iz longitudinalnih studija u velikom mjerilu nije do sada izvještavalo. Budući da ima toliko mnogo faktora koji doprinose normalnom rastu i razvitku, vjerojatno je da su subjekti s ISS, IUGR, SGA, kako su definirani, heterogeni s obzirom na njihovu etiologiju niskog stasa. Premda nije klasično GH-deficijentna, većina djece s ISS reagira na liječenje s GH, iako ne sva jednako dobro.

Mnogi su istraživači istraživali poremećaje spontane GH-sekrecije u takvom skupu subjekata. Jedna hipoteza sugerira, da neki od ovih subjekata imaju neadekvatnu sekreciju endogenoga GH pod fiziološkim uvjetima, ali su sposobni demonstrirati porast u GH, u odgovoru na farmakološke stimulanse, kao u tradicionalnim GH stimulacijskim testovima. Ovaj je nazvan "GH neurosekrecijska disfunkcija", i ta dijagnoza počiva na demonstraciji abnormalnog obrasca cirkulatornog GH, tijekom prolongiranoga serumskog uzorkovanja. Brojni su istraživači izvještavali o rezultatima takvih studija, i našli su da je ta abnormalnost samo povremeno prisutna. Drugi su istraživači pretpostavili, da ovi subjekti imaju "bioinaktivni GH"; međutim to se još nije uvjerljivo demonstriralo.

Kada je receptor hormona rasta, GH receptor (Growth Hormone Receptor, GHR) kloniran, pokazalo se da je glavna aktivnost vezivanja GH u krvi bila zahvaljujući jednom proteinu koji potječe od istoga gena kao i GHR i odgovara ekstracelularnoj domeni u punoj duljini GHR. Gotovo svi subjekti sa sindromom neosjetljivosti za hormon rasta (Growth Hormone Insensitivity Syndrome, GHIS ili Laron sindrom) nemaju aktivnosti vezanja receptora hormona rasta i nedostaje ili imaju vrlo nisku aktivnost GH-vezujućeg proteina (GH-Binding Protein, GHBP) u krvi. Takvi subjekti imaju rezultat bodovanja za standardnu devijaciju srednje visine (hight Standard Deviation Score, SDS) od oko -5 do -6, oni su rezistentni na GH-liječenje, i imaju povišene serumske koncentracije GH i niske serumske koncentracije inzulinu-sličnog faktora rasta (Insulin-like Growth Factor, IGF-I). Oni reagiraju na tretmane s IGF-I. U subjekata s defektima u ovoj ekstracelularnoj domeni tog GHR, nedostatak funkcionalnog GHBP u cirkulaciji može služiti kao marker za ovu GH-neosjetljivost.

Subjekti s ISS koji su liječeni s egzogenim GH pokazali su različite brzine odgovora na liječenje. Naročito, mnoga djeca reagiraju ponešto, ali ne potpuno, na GH tretman. Ovi subjekti imaju povećanje u brzini njihovog rasta koje je samo oko polovica onoga u djece koja reagiraju potpuno. Ovaj dječji ukupni prirast visine koji slijedi nakon tijeka liječenja je stoga reduciran prema onome u djece koja reagiraju potpuno, ovisno o trajanju liječenja. Jedan način za poboljšanje liječenja subjekata koji ne reagiraju potpuno, je bio da se poveća doza GH, koja je rezultirala u ponešto poboljšanim brzinama rasta i ukupnom prirastu visine. Međutim, povećano doziranje GH nije poželjno za sve subjekte zbog potencijalnih nuspojava. Povećano doziranje GH također predstavlja povećane troškove. Nažalost, do sada ne postoji metoda za identificiranje subjekata za koje je vjerojatno da će manje reagirati prije dugotrajnog liječenja i perioda promatranja

Postoji stoga potreba u struci za metodama koje bi se mogle koristiti za identificiranje jedne podskupine subjekata koji pokazuju smanjene stope odgovora na liječenje s GH. Postoji također potreba za metodama koje omogućuju razvitak poboljšanih medikamenata za liječenje subjekata koji imaju smanjeni odgovor na egzogeni GH. Postoji također potreba u struci za metodama koje se mogu koristiti za identificiranje jedne podskupine subjekata koja pokazuje povišene stope odgovora na GH i potreba za metodama koje omogućuju razvitak poboljšanih medikamenata za liječenje subjekata koji imaju pojačani odgovor na GH.

Ovi subjekti mogu uključivati, na primjer, pojedince niskog stasa, ali uključujući i pojedince koji pate od pretilosti, infekcije ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma, koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stanjima povezanim sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkim sindromima; poremećajima raspoloženja i sna, rakom, srčanom bolesti i hipertenzijom.

Izlaganje biti izuma

Predmetni se izum zasniva na otkriću da ljudski subjekti koji nose alel za receptor hormona rasta (GHR) koji ima deleciju egzona 3 (GHRd3) imaju povećani pozitivni odgovor na liječenje s agensom koji djeluje putem GHR putanje (GHR pathway) nego subjekti koji ne nose ovaj GHRd3 alel. Naročito, subjekti koji nose ovaj GHRd3 alel pokazivali su veći pozitivni odgovor na liječenje s rekombinantnim hormonom rasta (GH), nego subjekti koji nisu nosili rečeni GHRd3 alel. Tijekom liječenja s rekombinantnim GH, subjekti koji imaju ISS, IUGR ili SGA i nose GHRd3 imali su prirast u stopi rasta gotovo dvostruk od onih ISS subjekata koji su bili homozigotni za GHRfl alel. Promjena njihove ukupne visine se povećava u srazmjeru s tim učinkom.

GH aktivnost je posredovana s GH receptorom (GHR), prodiskutiranom gore. Pokazalo se, da dvije molekule GHR ostvaruju interakciju s jednom jedinom molekulom GH (Cunningham et al., (1991) Science 254: 821-825; de Vos et al., (1992) Science 255: 306-312; Sundstrom et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 32197-32203; i Clackson et al., (1998) J. Mol. Biol. 277: 1111-1128). Ovo se vezivanje događa na dva jedinstvena GHR vezna mjesta na GH i na jednom zajedničkom veznom džepu u ekstracelularnoj domeni od dvaju receptora. Mjesto 1 na toj GH molekuli ima veći afinitet nego Mjesto 2, i misli se da se receptorska dimerizacija događa sekvencijalno, s jednim receptorom koji se veže na Mjesto 1 na GH, iza čega slijedi regrutiranje drugog receptora za Mjesto 2. Cunningham et al., (1991, supra) su predložili, da je dimerizacija receptora onaj ključni događaj koji vodi do aktivacije signala i da je dimerizacija tjerana s GH vezivanjem (Ross et al., J. Clin. Endocrinol. & Metabolism (2001) 86(4): 1716-1717). Nakon vezivanja liganda, GHR-ovi se brzo internaliziraju (Maamra et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 14791-14798; i Harding et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 6708-6712), a s jednim dijelom recikliraju u staničnu membranu (Roupas et al., (1987) Endocrinol. 121: 1521-1530).

Recentnije, za izoformu GHR-a, koju nazivamo GHRd3, otkriveno je da sadrži deleciju eksona 3 (Urbanek M et al., Mol. Endocrinol. (1992 Feb) 6(2): 279-287; Godowski et al., (1989) PNAS USA 86: 8083-8087). Za ovu deleciju se mislilo, da je rezultat alternativnog načina izrezivanja/nadovezivanja (splicing), što dovodi bilo do zadržavanja ili izbacivanja eksona 3, bilo do pune duljine izoforme GHRfl (Growth Hormone Receptor full length) ili do izoforme GHRd3 s deletiranim eksonom 3. Nekoliko kontradiktornih rezultata slijedilo je identifikaciju ove GHRd3 izoforme. Izvještaji su sugerirali da je GHRd3 izoforma bila predmetom tkivno-specifičnog izrezivanja/nadovezivanja, da je obrazac ekspresije bio razvojno reguliran, dok su drugi izvještaji predlagali, da je GHRd3 izoforma bila specifična za nekog pojedinca. Drugi je izvještaj sugerirao da je izrezivanje/nadovezivanje rezultiralo od genetičkog polimorfizma koji se nasljeđuje kao Mendelovsko svojstvo i mijenja izrezivanje/nadovezivanje (Stallings-Mann et al., (1996) PNAS USA 94: 12394-12399). Konačno su Pantel et al., ((2000), J. Biol. Chem. 275(25): 18664-18669) nakon analize ovog GHR lokusa demonstrirali da se u ljudi ova GHRd3 izoforma transkribira s GHR alela koji je nosio 2,7 kb genomsku deleciju koja je uključivala ekson 3. Pantel je nadalje identificirao, dva krilna retroelementa u ovim genomičkim DNA uzorcima od pojedinaca koji eksprimiraju samo GHRfl, ali samo jedan jedincati retroelement u DNA od pojedinaca koji eksprimiraju GHRd3, što sugerira da je delecija eksona 3 rezultat homolognog rekombinacijskog događaja između ova dva retroelementa smještena na istom GHRfl alelu.

Ovaj hGHRd3 protein razlikuje se od hGHR pune dužine (GHRfl) delecijom od 22 aminokiseline unutar ekstracelularne domene ovog receptora. GHRd3 izoforma kodira stabilan i funkcionalan GHR protein (Urbanek et al., (1993) J. Biol. Chem. 268(25): 19025-19032). Dok su Urbanek et al., (1993) izvijestili da je GHRd3 izoforma stabilno integrirana u staničnoj membrani i vezuje i internalizira ligand jednako tako efikasno kao i hGHR, nikakve funkcionalne razlike od GHRfl izoforme nisu bile identificirane.

Predmetni izum se odnosi na identifikaciju GHR alela i izoforme kao važnog čimbenika koji doprinosi razlikama u pozitivnom odgovoru na egzogeni GH. Izum tako daje metodu za predviđanje stupnja pozitivnog odgovora na liječenje sa spojevima koji djeluju preko GHR putanje, ili pogodno spojeva koji se vezuju na GHR, kao što su GH sastavi. Ova metoda dozvoljava klasifikaciju pacijenata a priori, kao na pr. visoki ili niski responderi. Omogućujući da liječenje bude adaptirano prema jednom naročitom subjektu rezultira ekonomskim prednostima i/ili redukcijom nuspojava (na pr. od upotrebe pravilne doze GH sastava ili od korištenja nekog spoja prema kojemu subjekti ne pokazuju smanjenu GHR reakciju).

Izum također demonstrira da subjekti heterozigotni za GHRd3 i GHRfl alel pokazuju stope rasta i promjene visine u reakciji (odgovoru) na liječenje s GH koje su veće nego u subjekata homozigotnih za GHRfl alel. Izuma stoga pruža metode za detektiranje i dijagnosticiranje smanjenoga GHR odgovora ili GHR aktivnosti u nekog pojedinca koji je homozigotan za GHRfl alel. Smanjena aktivnost GHR može biti rezultat na pr. od smanjenih GHR razina, ekspresije ili proteinske aktivnosti. Također su ponuđene metode za detektiranje i dijagnosticiranje povišenog GHR odgovora ili GHR aktivnosti u nekog pojedinca koji je homozigotan ili heterozigotan za GHRd3 alel. Za detektiranje povišene ili smanjene GHR aktivnosti predviđa se da bi bilo korisno pri liječenju lepeze poremećaja liječivih koristeći terapeutske agense koji djeluju preko GHR putanje. Primjeri uključuju liječenje niskog rasta (na pr. preferentno ISS, IUGR, ili SGA), pretilosti, infekcije ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja se mogu povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stanjima povezanim sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkim sindromima; poremećajima raspoloženja i sna, rakom, srčanom bolesti i hipertenzijom. Preferirani primjeri uključuju agense koji vezuju taj GHR protein, kao što su rekombinantni GH sastavi koji djeluju kao GHR agonisti ili antagonisti.

Izum tako daje metode za determiniranje ili predviđanje GHR-posredovane aktivnosti, uključujući metode za predviđanje GHR odgovora na liječenje, i metode za identificiranje nekog subjekta koji je pod rizikom dijagnosticiranja nekog stanja povezanog sa smanjenom GHR aktivnošću. Pogodnije, izum daje metode za predviđanje odgovora nekog subjekta na neki agens koji ima sposobnost interakcije (na pr. vezanje na) s GHR polipeptidom.

U skladu s tim, u jednom aspektu, izum otkriva metodu za predviđanje odgovora nekog subjekta na agens koji ima sposobnost vezivanja jednog GHR proteina, uključujući determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se taj alel korelira s vjerojatnošću da ima povišeni ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući tu osobu da ima povišenu ili smanjenu vjerojatnost odgovaranja na liječenje s rečenim agensom.

Izum također daje metodu predviđanja odgovora na agens za liječenje stanja, subjekta odabranog iz skupine sastavljene od niskog rasta (na pr. pogodno ISS, IUGR, ili SGA), pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stanjima povezanim sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkim sindromima; poremećajima raspoloženja i sna, rakom, srčanom bolesti i hipertenzijom; rečena metoda uključuje: determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu taj alel korelira s vjerojatnosšću da ima povišeni ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući tu osobu da ima povišenu ili smanjenu vjerojatnost odgovaranja na liječenje s rečenim agensom. U preferiranim aspektima, izum daje metodu za predviđanje odgovora nekog subjekta na agens za povećavanje visine subjekta, uključujući determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu taj alel korelira s vjerojatnosti da ima povišeni ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući tu osobu da ima povišenu ili smanjenu vjerojatnost odgovaranja na liječenje s rečenim agensom.

Pogodno, metode izuma sadrže određivanje u tom subjektu prisustva ili odsustva GHR alela koji ima deleciju, inserciju ili supstituciju jedne ili više nukleinskih kiselina u eksonu 3, ili najpovoljnije koji ima jednu deleciju od, u osnovi cjelokupnog eksona 3.

Također se daje metoda za identificiranje nekog subjekta koji ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost za liječenje poremećaja ili stanja s agensom sposobnim za vezanje na GHR protein, uključujući:

(a) koreliranje prisustva alela GHR gena sa subjektovim odgovorom na agens koji je sposoban vezati se na GHR protein; i

(b) detektiranje alela iz koraka (a) u tom subjektu, time identificirajući subjektu povećanu ili smanjenu vjerojatnost odgovora na liječenje s rečenim agensom.

U još jednom drugom aspektu, obuhvaćena je metoda za identificiranje alela u GHR genu koreliranog s povećanom ili smanjenom vjerojatnosti za liječenje poremećaja ili stanja s agensom sposobnim za vezanje na GHR protein, uključujući:

(a) determiniranje u nekom subjektu prisustva alela GHR gena; i

(b) koreliranje prisustsva alela iz koraka (a) s povećanom ili smanjenom vjerojatnošću liječenja nekog poremećaja ili stanja s agensom sposobnim za vezanje na GHR protein, time identificirajući alel koreliran s povećanom ili smanjenom vjerojatnosti reagiranja na liječenje s rečenim agensom.

Rečeni poremećaj ili stanje može biti stanje odabrano iz skupine koja se sastoji od: niskog rasta (na pr. pogodno ISS, IUGR, ili SGA), pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stana povezanih sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

Najpogodnije, metode uključuju determiniranje genotipa nekog subjekta na eksonu 3 GHR gena, gdje je prisustvo eksona 3 indikativno da rečeni subjekt pati od toga da ima povećani rizik za stanje u vezi sa smanjenim GHR odgovorom, ili gdje je delecija u eksonu 3 indikativna da rečeni subjekt ima smanjeni rizik za stanje u vezi sa smanjenim GHR odgovorom.

Metode izuma mogu se koristiti naročito povoljno u metodama za liječenje. Pogodno, rečeni genotip je indikativan za učinkovitost ili terapeutske dobrobiti od rečene terapije. U jednom primjeru, metode izuma se koriste za determiniranje količine medikamenta koju treba dati subjektu. U drugom primjeru, ove metode se koriste za procjenu terapeutskog odgovora subjekata u kliničkom ispitivanju ili za selekciju subjekata za uključivanje u kliničko ispitivanje. Na primjer, ove metode izuma mogu uključivati determiniranje genotipa nekog subjekta u eksonu 3 GHR gena, u čemu rečeni genotip smještava rečen subjekt u podgrupu u kliničkom ispitivanju ili u podgrupu za uključivanje u kliničko ispitivanje.

Izum također pruža metodu za liječenje nekog subjekta, s time da metoda uključuje:

(a) determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, gdje taj alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban za vezanje na GHR protein ili djelovanje preko GHR putanje; i

(b) selektiranje ili determiniranje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

Agens sposoban za vezanje uz GHR protein ili djelovanje preko GHR putanje prema bilo kojoj od metoda izuma je pogodno agens učinkovit u liječenju stanja odabranog iz grupe sastavljene od: niskog rasta (t.j. pogodno ISS, IUGR, ili SGA), pretilosti, infekcije ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma, koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stanja povezanih sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

Naročito, izum daje metode za liječenje nekog subjekta uključujući:

(a) determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, gdje taj alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban za liječenje stanja odabranog iz grupe koja se sastoji: od niskog rasta (t.j. pogodno ISS, IUGR, ili SGA), pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima; stanja povezanih sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije; i

U naročito preferiranim izvedbama, izum otkriva metodu za povećavanje rasta nekog subjekta, s time da metoda obuhvaća:

(a) determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva nekog alela GHR gena, gdje taj alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na neki agens sposoban za pojačavanje rasta neke osobe; i

U pogodnom aspektu, izum otkriva metodu za povećavanje stope rasta ljudskog subjekta, s time da rečena metoda uključuje:

(a) detektiranje da li taj subjekt ima visinu manju od oko 1 standardne devijacije, ili pogodnije manju od oko 2 standardne devijacije ispod normale za dob i spol,

(b) detektiranje da li DNA ovog subjekta kodira GHRd3 polipeptid; i

(c) davanje tome subjektu učinkovite količine GH koja povećava stopu rasta tog subjekta. Pogodno, taj subjekt neće biti subjekt koji ima Laronov sindrom.

Pogodno, rečene metode za liječenje ljudskog subjekta uključuju davanje subjektu, homozigotnom za GHRfl alel, učinkovite doze nekog agensa koja je veća od učinkovite doze koja bi bila davana inače identičnom subjektu čija DNA kodira GHRd3 protein.

U pogodnim aspektima, navedeni agens je GH molekula. Pogodno, učinkovita količina GH administrirana nekom subjektu je između oko 0,001 mg/kg/dan i oko 0,2 mg/kg/dan; još pogodnije učinkovita količina GH je između oko 0,01 mg/kg/dan i oko 0,1 mg/kg/dan. U drugim aspektima, učinkovita količina GH administrirana nekom subjektu je barem oko 0,2 mg/kg/tjedan. U drugom aspektu, učinkovita količina GH je barem oko 0,25 mg/kg/tjedan. U drugom aspektu učinkovita količina GH je barem oko 0,3 mg/kg/tjedan. Pogodno, GH se daje jedamput na dan. Pogodno GH se administrira supkutanim injekcijama. Najpogodnije, hormon rasta se formulira na pH od približno 7,4 do 7,8.

Drugi aspekt izuma tiče se metode za korištenje medikamenta koja uključuje: pribavljanje DNA uzorka od nekog subjekta, determiniranje da li taj DNA uzorak sadrži neki alel GHR gena povezan s povećanim pozitivnim odgovorom na taj medikament i/ili, da li taj DNA uzorak sadrži neki alel GHR gena povezan sa smanjenim pozitivnim odgovorom na taj medikament, i davanje učinkovite količine tog medikamenta tome subjektu ako DNA uzorak sadrži neki alel GHR gena povezan s povećanim pozitivnim odgovorom na taj medikament i/ili, ako taj DNA uzorak nema alel GHR gena povezan sa smanjenim pozitivnim odgovorom prema tom medikamentu.

U drugom aspektu, izum uključuje liječenje nekog subjekta koji pati od smanjenog odgovora na egzogeni GH. U tom aspektu, predmetni izum daje metodu za korištenje nekog medikamenta uključivo: pribavljanje DNA uzorka od nekog subjekta, determiniranje da li taj DNA uzorak sadrži alel GHR gena povezan s povećanim pozitivnim odgovorom na taj medikament i/ili, da li taj DNA uzorak sadrži neki alel GHR gena povezan sa smanjenim pozitivnim odgovorom na taj medikament, te davanje učinkovite količine tog medikamenta tom subjektu, ako taj DNA uzorak sadrži alel GHR gena povezan sa smanjenim pozitivnim odgovorom na taj medikament i/ili, ako DNA uzorak nema alel od GHR gena povezan s povećanim pozitivnim odgovorom na taj medikament.

Kako se raspravljalo, ove metode uključuju determiniranje u subjektu prisustva ili odsustva GHR alela koji ima deleciju, inserciju ili substituciju od jedne ili više nukleinskih kiselina u eksonu 3, ili najpogodnije, ima deleciju od stvarno cijelog eksona 3. Alel tog GHR gena povezan s povećanim pozitivnim odgovorom na taj medikament je GHR alel kojemu manjka ekson 3, pogodno GHRd3 alel. Alel tog GHR gena povezan sa smanjenim pozitivnim odgovorom na taj medikament je pogodno GHR alel (GHRfl) koji sadrži ekson 3 (kada je subjekt homozigot za ovaj alel).

Izum se također tiče metode za kliničko testiranje nekog medikamenta, a ta metoda uključuje slijedeće korake:

davanje medikamenta populaciji individua; i

iz rečene populacije, identificiranje prve subpopulacije individua, čije DNA kodiraju GHRd3 polipeptidnu izoformu i druge subpopulacije individua čije DNA ne kodiraju GHRd3 polipeptidnu izoformu.

Rečena metoda može nadalje uključivati: (a) procjenjivanje odgovora na rečeni medikament u rečenoj prvoj subpopulaciji individua; i/ili (b) procjenjivanje odgovora na rečeni medikament u rečenoj drugoj subpopulaciji individua. Pogodno, odgovor na rečeni medikament se procjenjuje i rečenoj prvoj, i u rečenoj drugoj subpopulaciji individua. Pogodno, rečeni odgovor se procjenjuje odvojeno u rečenoj prvoj, i drugoj subpopulaciji individua. Procjenjivanje odgovora na rečeni medikament pogodno uključuje determiniranje promjene u visini nekog subjekta.

Izum se također tiče metode za kliničko testiranje nekog medikamenta, s time da metoda uključuje slijedeće korake.

identificiranje prve populacije individua, čije DNA kodiraju GHRd3 polipeptid i druge populacije individua, čije DNA ne kodiraju GHRd3 polipeptid;

davanje medikamenta individuama rečene prve i/ili rečene druge populacije individua. U jednoj izvedbi, medikament se daje individuama rečene prve populacije ali ne i individuama rečene druge populacije. U jednoj izvedbi, taj medikament se daje individuama rečene druge populacije, ali ne i individuama rečene prve populacije. U drugoj izvedbi, taj medikament se daje individuama i rečene prve i rečene druge populacije.

Medikament prema prethodnim metodama je pogodno medikament za liječenje niskog rasta, pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

Jedan pogodni aspekt izuma se odnosi na metodu za kliničko testiranje medikamenta, pogodno medikamenta sposobnog za povećanje stope rasta nekog ljudskog subjekta. Ova metoda uključuje slijedeće korake:

- davanje medikamenta, pogodno medikamenta sposobnog da povećava brzinu rasta nekog ljudskog subjekta populaciji individua; i

- od rečene populacije, identificiranje prve subpopulacije individua, čije DNA kodiraju GHRd3 polipeptidnu izoformu i druge subpopulacije individua, čije DNA ne kodiraju GHRd3 polipeptidnu izoformu.

Drugi pogodni aspekt izuma tiče se metode za kliničko testiranje medikamenta, pogodno medikamenta sposobnog za povećanje brzine rasta nekog ljudskog subjekta ili sposobnog za popravljanje ISS, IUGR ili SGA. Ova metoda uključuje slijedeće korake:

- identificiranje prve populacije individua, čije DNA kodiraju GHRd3 polipeptid i druge populacije individua, čije DNA ne kodiraju GHRd3 polipeptid; i

- davanje medikamenta, pogodno medikamenta sposobnog da povećava brzinu rasta nekog ljudskog subjekta ili sposobnog za popravljanje ISS, IUGR ili SGA, pojedincima iz rečene prve i/ili rečene druge populacije individua. U jednoj izvedbi, medikament se daje individuama rečene prve populacije, ali ne i individuama rečene druge populacije.U jednoj izvedbi, taj medikament se daje individuama rečene druge populacije, ali ne i individuama rečene prve populacije. U drugoj izvedbi, taj medikament se daje individuama i rečene prve i rečene druge populacije.

Procjenjivanje odgovora na neki medikament koji ima sposobnost da povećava brzinu rasta nekog ljudskog subjekta ili sposobnost da popravi ISS, IUGR ili SGA uključuje procjenjivanje promjene u visini kod neke individue. Povećanje brzine rasta nekog ljudskog subjekta uključuje ne samo ovu situaciju gdje taj subjekt postiže barem istu konačnu visinu kao GH-deficijentni subjekti liječeni s GH (t. j. subjekti kojima je dijagnosticirana GHD), već se također odnosi na situaciju gdje taj subjekt dostiže visinu pri istoj brzini rasta kao i GH-deficijentni subjekti liječeni s GH, ili dostiže odraslu visinu koja je unutar ciljnog visinskog raspona, t. j. konačna visina konzistentna s njihovim genetičkim potencijalom kako je određen srednjom-parentalnom ciljnom visinom.

U jednom aspektu bilo koje od metoda izuma, korak određivanja da li DNA subjekta kodira neku posebnu GHR polipeptidnu izoformu može se provoditi koristeći molekulu nukleinske kiseline koja specifično veže GHR nukleinskokiselinsku molekulu. U drugom aspektu, ovaj korak za determiniranje da li ta DNA subjekta kodira GHR polipeptidnu izoformu, se provodi koristeći nukleinskokiselinsku molekulu koja specifično veže GHR nukleinskokiselinsku molekulu. Pogodno, ove metode izuma uključuju determiniranje, da li DNA od neke individue kodira GHRd3 protein ili polipeptid. Ovo bi stoga moglo uključivati determinaciju, da li genomska DNA neke individue sadrži GHRd3 alel, da li mRNA dobivena od individue kodira GHRd3 polipeptid, ili da li taj subjekt eksprimira GHRd3 polipeptid.

Na primjer, u bilo kojoj od prethodnih izvedbi, determiniranje da li DNA neke individue kodira GHRd3 polipeptid može uključivati ove korake:

pribavljanje biološkog uzorka;

dovođenje u kontakt rečenog biološkog uzorka s:

ii) polinukleotidom koji se hibridizira pod oštrim uvjetima uz GHRd3, pogodno GHRd3 nukleinsku kiselinu; ili

iii) detektabilnim polipeptidom koji se selektivno veže na GHR, pogodno na GHRd3 polipeptid; i

detektiranje prisustva ili odsustva hibridizacije između rečenog polinukleotida i RNA vrste unutar rečenog uzorka, ili prisustva ili odsustva vezivanja rečenog detektabilnog polipeptida uz polipeptid unutar rečenog uzorka.

Pogodno, taj biološki uzorak se dovodi u kontakt s polinukleotidom koji se hibridizira pod ograničavajućim uvjetima uz GHRd3 nukleinsku kiselinu ili detektabilnim polipeptidom koji se selektivno veže na GHRd3 polipetid, u čemu detekcija rečene hibridizacije ili navedenog vezivanja ukazuje, da je rečeni GHRd3 eksprimiran unutar navedenog uzorka.

Pogodno, rečeni polinukleotid je početnica/primer, a gdje je rečena hibridizacija detektirana pomoću detekcije prisustva amplifikacijskog produkta koji uključuje rečenu sekvencu početnice. Pogodno, rečeni detektabilni polipeptid je antitijelo. Detektiranje GHRd3 i GHRfl polipeptida ili nukleinskih kiselina može biti provedeno bilo kojom pogodnom metodom. Na primjer, serumska razina ekstracelularne domene od GHRd3 ili GHRfl može biti procijenjena (na pr. visoko-afinitetnim GH veznim proteinom). Oligonukleotidne probe (sonde) ili početnice (primers) koji se hibridiziraju specifično s GHRd3 genomičkom ili cDNA sekvencom su također dio predmetnog izuma, kao i DNA amplifikacija i detekcijske metode koristeći rečene početnice i probe.

Izum se također tiče metoda za identificiranje kandidata za modulatore GHRd3 polipeptida. Takve metode mogu biti izvedene, na primjer, kao metode za identificiranje GHR agonista ili inhibitora koji su efektivni u individua homozigotnih ili heterozigotnih za taj GHRd3 alel. Ove metode se mogu koristiti za identificiranje spojeva od poznatih sastava, na primjer GENOTROPINTM, PROTROPINTM, NUTROPINTM, SOMAVERTTM (pegvisomant), za identificiranje najefektivnijih spojeva za liječenje. Ove metode mogu stoga biti korisne za identificiranje medikamenata sposobnih za povećavanje brzine rasta nekog ljudskog subjekta, sposobnih za amelioraciju pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

U jednom aspektu izum se tiče metode za identificiranje nekog kandidata za modulator GHRd3 polipeptida, a rečena metoda uključuje:

a) pribavljanje GHRd3 polipeptida;

b) dovođenje rečene smjese u kontakt s test spojem; i

c) determiniranje da li se rečeni spoj selektivno veže na rečeni GHRd3 polipeptid;

gdje detekcija da se rečeni spoj selektivno veže na rečeni polipeptid ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za modulator rečenoga GHRd3 polipeptida. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHRd3 polipeptid. U preferiranim izvedbama rečeni GHRd3 polipeptid je inkorporiran u membranu.

Izum također daje metodu za identificiranje nekog kandidata za modulator GHRd3 polipeptida, a rečena metoda uključuje:

a) pribavljanje GHRd3 polipeptida;

b) dovođenje rečene smjese u kontakt s test spojem; i

b) determiniranje da li rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost;

gdje detekcija da rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za modulator GHRd3 polipeptidne aktivnosti. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHRd3 polipeptid. Detekcija da taj test spoj stimulira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za agonist. Detekcija da taj test spoj inhibira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za inhibitor. U pogodnim izvedbama rečeni GHRd3 polipeptid je inkorporiran u membranu.

a) pribavljanje stanice koja uključuje GHRd3 polipeptid;

b) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i

c) determiniranje da li rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost;

gdje detekcija da rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za modulator GHRd3 polipeptidne aktivnosti. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHRd3 polipeptid. Detekcija da taj test spoj stimulira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za agonist. Detekcija da taj test spoj inhibira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za inhibitor. Pogodno, rečena stanica je ljudska 293 stanica. U drugom aspektu rečene metode, ta stanica je Xenopus laevis oocita, i korak a) uključuje uvođenje u rečenu stanicu GHRd3 cRNA.

Izum također daje da GHR može postojati kao GHRd3 i GHRfl heterodimerni polipeptid. Stoga, u drugom aspektu, ovaj se izum također tiče metoda za identificiranje kandidata za modulatore GHR heterodimernih (GHRd3/fl) polipeptida. Takve metode mogu biti izvedene, na primjer, kao metode za identificiranje GHR agonista ili inhibitora. Takve metode mogu također biti izvedene kao metode za identificiranje medikamenata sposobnih za povećavanje brzine rasta nekog ljudskog subjekta, sposobnih za amelioraciju pretilosti, infekcije, ili dijabetesa; akromegalije ili stanja gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja ili sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

U jednom aspektu izum se tiče metode za identificiranje nekog kandidata za modulator GHR heterodimernog polipeptida, a rečena metoda uključuje:

c) miješanje GHRfl i GHRd3 polipeptida;

d) dovođenje rečene smjese u kontakt s nekim test spojem; i

b) determiniranje da li se rečeni spoj selektivno veže s GHRfl ili GHRd3 polipeptidom;

u čemu detekcija da se rečeni spoj selektivno veže na rečeni polipeptid indicira, da je rečeni spoj kandidat za modulator rečenog GHR heterodimernog polipeptida. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili jedan njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHR heterodimer. U pogodnim izvedbama rečeni GHRfl i GHRd3 polipeptidi inkorporirani su u membranu.

Izum također daje metodu za identificiranje kandidata za modulator GHR heterodimernog polipeptida, a rečena metoda uključuje:

c) miješanje GHRfl i GHRd3 polipeptida;

d) dovođenje rečene smjese u kontakt s test spojem; i

c) determiniranje da li rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost;

u čemu detekcija da rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost indicira, da je rečeni spoj kandidat za modulator GHR heterodimerne aktivnosti. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili jedan njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHR heterodimer. Detekcija da taj test spoj stimulira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za agonist. Detekcija da taj test spoj inhibira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za inhibitor. U pogodnim izvedbama rečeni GHRfl i GHRd3 polipeptid su inkorporirani u membranu.

Izum također daje metodu za identificiranje nekog kandidata za modulator GHR heterodimernog polipeptida, a rečena metoda uključuje:

c) pribavljanje stanice koja ima GHRfl i GHRd3 polypeptid;

d) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i

c) determiniranje da li rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost;

gdje detekcija da rečeni spoj selektivno modulira GHR aktivnost indicira, da je rečeni spoj kandidat za modulator GHR heterodimerne aktivnosti. Pogodno, taj test spoj je GH polipeptid ili jedan njegov dio ili njegova varijanta. Taj spoj može biti agonist ili inhibitor za taj GHR heterodimer. Detekcija da taj test spoj stimulira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za agonist. Detekcija da taj test spoj inhibira GHR aktivnost indicira, da je taj test spoj kandidat za inhibitor. Pogodno, rečena stanica je ljudska 293 stanica. U drugom aspektu rečene metode, ta stanica je Xenopus laevis oocita, i korak a) uključuje uvođenje u rečenu stanicu GHRd3 cRNA.

Pogodno, ta stanica je stanica koja eksprimira GHRfl i GHRd3 polipeptid. U preferiranim aspektima, korak a) uključuje uvođenje u rečenu stanicu nukleinske kiseline koja sadrži GHRd3 nukleotidnu sekvencu i nukleinske kiseline koja sadrži GHRfl nukleotidnu sekvencu. U drugim aspektima, korak a) uključuje uvođenje u stanicu koja eksprimira GHRfl nukleinsku kiselinu, nukleinsku kiselinu koja sadrži GHRd3 nukleotidnu sekvencu. U još drugim aspektima, korak a) uključuje uvođenje u stanicu koja eksprimira GHRd3 nukleinsku kiselinu, nukleinsku kiselinu koja sadrži GHRfl nukleotidnu sekvencu.

Izum također daje rekombinantni vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira GHRd3 i GHRfl polinukleotid. Također, uključena je stanica domaćin koja ima rekombinantni vektor u skladu s izumom. Izum također daje set od barem dva rekombinantna vektora, uključujući prvi rekombinantni vektor koji sadrži GHRd3 polinukleotid i drugi rekombinantni vektor koji sadrži GHRfl polinukleotid. Izum također daje stanicu domaćina koja u skladu s tim sadrži rečeni prvi i rečeni drugi rekombinantni vektor, kao i non-humanu životinju domaćina ili sisavca koji imaju rečene rekombinantne vektore.

Izum također daje stanicu domaćina sisavca koja ima GHR gen prekinut homolognom rekombinacijom s "knock-out" vektorom koji sadrži GHRd3 polinukleotid. Izum nadalje daje non-humanog sisavca domaćina koji ima GHR gen prekinut homolognom rekombinacijom s "knock-out" vektorom koji sadrži GHRd3 polinukleotid.

Kako se razmatralo, procjenjuje se da rečene metode za provođenje testova, metode za identificiranje modulatora GHR heterodimera, rekombinantnoga vektora, stanice domaćina i non-humanog domaćina sisavca mogu koristiti GHRd3 alel koji ima deleciju od gotovo cijelog eksona 3, ili može namjesto toga koristiti bilo koji odgovarajući GHR alel ili izoformu kodiranu s GHR nukleinskom kiselinom koja ima neku deleciju, inserciju ili supstituciju od jedne ili više nukleinskih kiselina u eksonu 3.

Kratki opis crteža

Slika 1 pokazuje cDNA sekvencu (SEQ ID NO: 1) koja kodira GHRfl izoformu.

Slika 2 pokazuje aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NOS: 2 i 3) od GHRfl izoforme.

Slika 3 pokazuje genomičku DNA sekvencu (SEQ ID NO: 4) koja okružuje ekson 3 ljudskoga GHR gena (Genbank accession number AF 155912).

Slika 4 pokazuje genomičku DNA sekvencu (SEQ ID NO: 6) koja okružuje deletirani ekson 3 od GHRd3 alela ljudskoga GHR gena (Genbank accession number AF210633).

Detaljni opis

97-ero djece s idiopatskim niskim rastom (Idiopathic Short Stature, ISS) koja su bila upisana u ispitivanja za liječenje s rekombinantnim GH (rGH) ispitana su za povezanost obične GHR ekson 3 varijante i odgovora u brzini rasta na liječenje s GH. GHRd3 alel bio je prisutan u 47 pacijenata, od kojih su 3 bili GHRd3/d3 homozigoti, a 44 su bili GHRd3/fl heterozigoti. Nakon podešavanja za dob, spol, dozu rGH, nađeno ja, da su djeca koja su nosila GHRd3 varijantu, rasla većom brzinom kada su liječena s rGH. Brzina rasta bila je 9,0 +/- 0,3 cm/godinu u prvoj godini terapije i 7,8 +/- 0,2 cm/godinu druge godine u djece sa GHRd3/fl ili GHRd3/d3 genotipovima, u usporedbi sa 7,4 +/- , odnosno 0,2 i 6,5 +/- 0,2 cm/godinu, u djece s GHRfl/fl genotipovima (P<0,0001). Genotipske grupe bile su usporedive s obzirom na druge medicinske i terapeutske karakteristike. Genomička varijacija GHR sekvence je stoga povezana s markiranom razlikom rGH učinkovitosti.

Kako se diskutiralo gore, predmetni izum odnosi se na polje farmakogenomike i prediktivne medicine u kojoj se dijagnostički testovi, prognostički testovi, i monitorinška-klinička ispitivanja koriste za prognostičke (prediktivne) svrhe da se pomoću njih liječi neka individua. Prema tome, jedan aspekt predmetnog izuma odnosi se na dijagnostičke testove za determiniranje GHR proteina i/ili ekspresije nukleinske kiseline u kontekstu nekog biologiškog uzorka (na pr. krvi, seruma, stanica, tkiva), da se njima determinira priroda GHR odgovora nekog pojedinca, naročito na tretman s nekim egzogenim GH sastavom. To bi moglo biti korisno također za detekciju, da li je neka individua pogođena bolešću ili poremećajem, ili je pod rizikom razvoja poremećaja, povezanog sa smanjenim GHR odgovorom ili aktivnošću. Poremećaji ili stanja koja uključuju GHR aktivnost uključuju niski rast, pretilost, infekciju, ili dijabetes; akromegaliju ili stanja gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličke sindrome; poremećaje raspoloženja i sna, rak, srčanu bolest i hipertenziju. Izum također omogućuje prognostičke testove (ili testove predviđanja) za determiniranje, da li je neka individua pod rizikom razvoja nekog poremećaja povezanog s GHR proteinskom aktivnosti. Na primjer, GHRd3 i GHRfl izoforme mogu biti testirane u nekom biološkom uzorku. Takvi testovi se mogu koristiti za svrhu prognoze ili predviđanja, da se njima profilaktički tretira individua prije nastupa poremećaja karakteriziranoga ili povezanog sa smanjenim GHR odgovorom, na primjer davanjem učinkovite količine GH tako, da neki subjekt dostigne neku konačnu visinu, konzistentnu s njegovim genetičkim potencijalom. U drugim aspektima, izum pruža metode za detektiranje agensa koji moduliraju GHRd3/GHRfl heterodimernu aktivnost. Takvi agensi mogli bi biti korisni u tretmanu prethodno spomenutih stanja ili poremećaja koji uključuju GHR aktivnost.

Definicije

Izraz "agens" se koristi ovdje da označi kemijski spoj, smjesu kemijskih spojeva, biološku makromolekulu, preferentno peptid ili protein, ili ekstrakt učinjen od biološkog materijala kao što su bakterije, biljke, fungi, ili životinjske (naročito od sisavca) stanice ili tkiva.

U kontekstu predmetnog izuma, "pozitivni odgovor" ili "pozitivni terapeutski odgovor" na neki medikament ili agens može biti definiran kao da se sastoji od smanjenja simptoma povezanih s nekom bolesti ili stanjem. Na primjer, pozitivni odgovor može biti povećanje visine ili brzine rasta nakon davanja nekog agensa. U kontekstu predmetnoga izuma, "negativni odgovor" na neki medikament može biti definiran ili kao da nema pozitivni odgovor na medikament ili da dovodi do nuspojeve opažene nakon davanja medikamenta.

Izraz "polipeptid" odnosi se na polimer aminokiselina bez obzira na duljinu tog polimera, tako su unutar definicije polipeptida uključeni, peptidi, oligopeptidi i proteini. Taj izraz također ne specificira niti isključuje post-ekspresijske modifikacije polipeptida, na primjer, polipeptidi koji uključuju kovalentno pripajanje glikozilnih grupa, acetilnih grupa, fosfatnih grupa, lipidnih grupa i sličnih, su izričito obuhvaćeni terminom polipeptida. Također su unutar ove definicije uključeni polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga od neke aminokiseline (uključujući na pr. aminokiseline koje se prirodno ne pojavljuju, aminokiseline koje se pojavljuju samo prirodno u nekom nesrodnom biološkom sistemu, modificirane aminokiseline iz sistema sisavaca i t.d.), polipeptidi sa supstituiranim vezama, kao i druge modifikacije poznate u struci, koje se prirodno pojavljuju i koje se prirodno ne pojavljuju.

"Izolirani" ili "pročišćeni" protein ili biološki aktivni njegov dio je u biti bez celularnog materijala ili drugih kontaminirajućih proteina iz staničnog ili tkivnog izvora iz kojeg je taj protein potekao, ili u biti bez kemijskih prekursora ili drugih kemikalija kada je kemijski sintetiziran. Izraz "u biti bez celularnog materijala" uključuje preparacije GH ili GHR proteina u kojima se taj protein separira od celularnih komponenti tih stanica iz kojih je on izoliran ili rekombinantno proizveden. U jednoj izvedbi, izraz "u biti bez celularnog materijala” uključuje preparacije GH ili GHR proteina koje imaju manje od oko 30% (suhe težine) od non-GH ili non-GHR proteina (također ih ovdje nazivamo kao "kontaminirajući protein"), pogodnije manje od oko 20% od non-GH ili non-GHR proteina, još pogodnije manje od oko 10% od non-GH ili non-GHR proteina, i najpogodnije manje od oko 5% non-GH ili non-GHR proteina. Kada je GH ili GHR protein ili njegov biološki aktivni dio proizveden rekombinantno, on je također preferentno u biti bez medija kulture, t.j., medij kulture predstavlja manje od oko 20%, pogodnije manje od oko 10%, i najpogodnije manje od oko 5% volumena te proteinske preparacije.

Izraz "u biti bez kemijskih prekursora ili drugih kemikalija" uključuje preparacije GH ili GHR proteina u kojima je protein separiran od kemijskih prekursora ili drugih kemikalija koje su uključene u sintezi tog proteina. U jednoj izvedbi, izraz "u biti bez kemijskih prekursora ili drugih kemikalija" uključuje preparacije GH ili GHR proteina koje imaju manje od oko 30% (suhe težine) kemijskih prekursora ili non-GH ili non-GHR kemikalija, pogodnije manje od oko 20% kemijskih prekursora ili non-GH ili non-GHR kemikalija, još pogodnije manje od oko 10% kemijskih prekursora ili non-GH ili non-GHR kemikalija, i najpogodnije manje od oko 5% kemijskih prekursora ili non-GH ili non-GHR kemikalija.

Izraz "rekombinantni polipeptid" se ovdje koristi da označi polipeptide koji su artificijelno kreirani i koji uključuju barem dvije polipeptidne sekvence koje se ne mogu naći kao polipeptidne sekvence koje se dotiču u njihovom inicijalnom prirodnom okolišu, ili da označi polipeptide koji su eksprimirani od rekombinantnog polinukleotida.

Nukleinska kiselina je "operativno vezana" kada je ona stavljena u funkcionalni odnos s drugom nukleokiselinskom sekvencom. Na primjer, promotor ili pojačivač je operativno vezan uz kodirajuću sekvencu, ako on utječe na transkripciju te sekvence. S obzirom na transkripcijske regulatorne sekvence, operativno vezane znači da se DNA sekvence koje su vezane dotiču kao susjedne i, gdje je potrebno da spajaju dvije proteinske kodirajuće regije, susjedne i u okviru čitanja.

Izraz "početnica" (primer) označava specifičnu oligonukleotidnu sekvencu koja je komplementarna prema ciljnoj nukleotidnoj sekvenci i koristi se da se hibridizira uz tu ciljnu nukleotidnu sekvencu. Početnica služi kao inicijacijska točka za polimerizaciju nukleotida kataliziranu bilo s DNA polimerazom, RNA polimerazom ili reverznom transkriptazom.

Izraz "proba" označava definirani segment nukleinske kiseline (ili nukleotidnog analognog segmenta, na pr. polinukleotida kako se definira ovdje) koji se može koristiti za identificiranje specifične polinukleotidne sekvence prisutne u uzorcima, a rečeni nukleinskokiselinski segment sadrži nukleotidnu sekvencu komplementarnu za specifičnu polinukleotidnu sekvencu koju treba identificirati.

Kako se ovdje koristi, "test uzorak" odnosi se na neki biološki uzorak pribavljen od nekog subjekta od interesa. Na primjer, test uzorak može biti neka biološka tekućina (na pr. serum), uzorak stanice ili tkivo.

Izrazi "svojstvo" i "fenotip" koriste se ovdje izmjenjivo i odnose se na bilo koje klinički razlučivo, detektabilno ili drugačije mjerljivo svojstvo nekog organizma kao što su na primjer, simptomi bolesti, ili osjetljivost na neku bolest. Tipično termini "svojstvo" ili “fenotip” koriste se ovdje da znače odgovor neke individue na neki agens koji djeluje na GHR.

Izraz "genotip" kako se ovdje koristi, odnosi se na identitet alela prisutnih u neke individue ili nekom uzorku. U kontekstu predmetnog izuma genotip se preferentno odnosi na opis alela prisutnih u individue ili uzorku. Izraz "genotipiziranje" nekog uzorka ili neke individue za neki alel uključuje determiniranje specifičnog alela kojeg nosi neka individua.

Izraz "alel" se ovdje koristi, da označi varijantu nukleotidne sekvence. Na primjer, aleli od GHR nukleotidne sekvence uključuju GHRd3 i GHRfl.

Kako se ovdje koristi, "izoforma" i "GHR izoforma" odnose se na polipeptid koji je kodiran s barem jednim eksonom od GHR gena. Primjeri za GHR izoforme uključuju GHRd3 i GHRfl polipeptide.

Izraz "polimorfizam" kako se ovdje koristi, znači pojavljivanje dviju ili više alternativnih genomičkih sekvenca ili alela između ili među raznim genomima ili individuama. "Polimorfan" se odnosi na stanje u kojem se dvije ili više varijanta neke specifične genomičke sekvence može naći u nekoj populaciji. "Polimorfno mjesto" je onaj lokus na kojem se pojavljuje ta varijacija. Polimorfizam može uključivati supstituciju, deleciju ili inserciju jednog ili više nukleotida. Jedan jedincati nukleotidni polimorfizam (single nucleotide polymorphism) je zamjena jednog para baza.

Kako se koristi ovdje, "ekson" se odnosi na bilo koji segment prekinutog gena koji je predstavljen u zrelom RNA produktu.

Kako se ovdje koristi, "intron" se odnosi na neki segment prekinutog gena koji nije predstavljen u zrelom RNA produktu. Introni su dio primarnog nuklearnog transkripta, ali su izrezani da proizvedu mRNA, koja se tada transportira u citoplazmu.

Kako se ovdje koristi, "hormon rasta" ili "GH" odnosi se na hormon rasta u nativnoj sekvenci ili u varijantnom obliku, i iz bilo kojeg izvora, bilo prirodnog, sintetskog, ili rekombinantnog. Primjeri uključuju ali nisu i ograničeni na ljudski hormon rasta (human growth hormone, hGH), koji je prirodni ili rekombinantni GH s ljudskom nativnom sekvencom (na primjer GENOTROPINTM, somatotropin ili somatropin), i rekombinantni hormon rasta (recombinant growth hormone, rGH), koji se odnosi na bilo koji GH ili GH varijantu proizvedenu pomoću rekombinantne DNA tehnologije, uključujući somatrem, somatotropin, somatropin i pegvisomant. GH molekula može biti agonist ili antagonist prema GHR.

Kako se ovdje koristi, "receptor hormona rasta" ili "GHR" (Growth Hormone Receptor) odnosi se na receptor hormona rasta u nativnoj sekvenci ili u varijantnoj formi, i iz bilo kojeg izvora, bilo prirodnog, sintetskog, ili rekombinantnog. Izraz "GHR" obuhvaća GHRfl kao i GHRd3 izoforme. Primjeri uključuju ljudski receptor hormona rasta (human Growth Hormone Receptor, hGHR), koji je prirodni ili rekombinantni GHR s ljudskom nativnom sekvencom. Kako se ovdje koristi, "GHRd3" odnosi se na ekson 3-deletiranu izoformu od GHR. Izraz "GHRfl" odnosi se na GHR izoformu koja sadrži ekson 3. Izraz GHRd3 uključuje, ali nije ograničen na polipeptid opisan u Urbanek M. et al., Mol. Endocrinol. 1992 Feb; 6(2): 279-287, uključeno ovdje referencom. Izraz GHRfl uključuje, ali nije ograničeni na polipeptid opisan u Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987), uključeno ovdje referencom.

Termin "GHR gen", kada se koristi ovdje, obuhvaća genomičke, mRNA i cDNA sekvence koje kodiraju bilo koji GHR protein, uključivo i neprevedene regulatorne regije u genomičkoj DNA. Termin "GHR gen" također obuhvaća alele od GHR gena, kao GHRd3 alel i GHRfl alel.

Ljudski GHR gen i protein

Ljudski GHR gen je jedan jednom zastupljeni gen koji pokriva 90kb u 5p13-12 kromosomskoj regiji. On sadrži devet kodirajućih eksona (numerirani 2-10) i nekoliko neprevedenih eksona: ekson 2 kodira signalni peptid, eksoni 3 do 7 kodiraju ekstracelularnu domenu, ekson 8 kodira transmembransku domenu i eksoni 9 i 10 kodiraju citoplazmatsku domenu. Kako je diskutirano gore, hGHRd3 protein razlikuje se od hepatičkog hGHR delecijom 22 aminokiselina unutar ekstracelularne domene ovog receptora, Godowski et al. (1989). Genbank accession number AF155912, otkriće koje sekvence je inkorporirano ovdje referencom, daje nukleotidnu sekvencu genomičke DNA regije koja okružuje ekson 3 GHR gena (t. j. GHRfl alel). Ovaj 6,8 bp fragment, uključujući ekson 3 i jedan dio introna 2 i 3, također uključuje dva 251 bp repetitivna elementa. Ovi repetitivni elementi bočno ograničavaju exon 3, s 5' i 3' ponovljenim elementima lokaliziranim 577 bp uzvodno i l821 bp nizvodno od tog eksona. Ti elementi su sastavljeni od 171 bp fragmenta dugačkog terminalnog ponavljanja (Long Terminal Repeat, LTR) od humanog endogenoga retrovirusa koji pripada u HERV-P familiju (Boeke, J. D., i Stoye, J. P. (1997) u Retroviruses (Coffin, J. M. , Hughes, S. H. i Varmus, H. E., eds), pp. 343-435, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Tom LTR-u slijedi 80 bp iz sekvence srednje ponavljanih frekvencija MER4-tipa (Smit, A. F. (1996) Curr. Opin. Genet. Dev. 6, 743-748). Sekvence ovih dviju 251 bp-dugačkih kopija oslovljenih kao 5' i 3' ponavljanja su 99% identične, razlikujući se samo u tri nukleotida na pozicijama 14, 245 i 246 ovoga ponavljanja. Naročito, kako su izvijestili Pantel et al. (2000), onaj element koji je lociran uzvodno od eksona 3 nosi citozin na poziciji 14 i timin na pozicijama 245 i 245, dok onaj element lociran nizvodno od eksona 3 nosi gvanin, citozin i adenin na tim pozicijama. Nadalje, druge sekvence virusnog porijekla su nađene da bočno ograničuju ekson 3.

GHRd3 alel sadrži deleciju eksona 3 i okolne djelove introna 2 i 3. Za razliku od GHRfl alela, GHRd3 alel sadrži jedan jedini 251 bp LTR koji je identičan u sekvenci LTR elementu prema 3' kopiji identificiranoj na GHRfl alelima. Genomička DNA sekvenca od GHRd3 alela u regiji deletiranog eksona 3 je prikazana u Genbank accession number AF210633, otkriće koje sekvence je inkorporirano ovdje referencom. Bazirano na GHRd3 i GHRfl sekvenci, poznate metode za detekciju GHR nukleinskih kiselina ili polipeptida mogu se koristiti za determinaciju, da li neka individua nosi neki GHRd3 alel.

GHRd3 protein koji sadrži deleciju eksona 3 razlikuje se od pune dužine hGHR (GHRfl) delecijom od 22 aminokiselina unutar ekstracelularne domene tog receptora. Bilo koja poznata metoda može stoga biti korištena da detektira prisustvo GHRd3 ili GHRfl proteina. GHRd3 i GHRfl mogu također biti detektirani u njihovoj neprikraćenoj formi, ili u prikraćenoj formi, kao "visoko-afinitetni vezni protein za hormon rasta" ("high-affinity growth hormone binding protein"), "visoko-afinitetni GHBP" ("high-affinity GHBP") ili "GHBP", koji se odnosi na ekstracelularnu domenu GHR-a koja cirkulira u krvi i funkcionira kao GHBP u nekoliko vrsta (Ymer i Herington, (1985) Mo1. Cell. Endocrinol. 41: 153; Smith i Talamantes, (1988) Endocrinology, 123: 1489-1494; Emtner i Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 (1990), uključivo man. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 62: 134-141 (1986); EP 366,710; Herington et al., J. Clin. Invest., 77: 1817-1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Postoje razne raspoložive metode za mjerenje funkcionalnog GHBP u serumu, s time da je preferirana metoda onaj ligandom-posredovan imunofunkcionalni test (Ligand-mediated Immunofunctional Assay, LIFA), opisan u U.S. pat. br. 5,210,017 i dalje ovdje.

GHRd3 u dijagnostici, terapiji i farmakogenetici

U preferiranim izvedbama, izum uključuje determiniranje, da li neki subjekt eksprimira GHR alel povezan s povećanim ili smanjenim odgovorom na tretman ili s povećanom ili smanjenom GHR aktivnošću. Determiniranje da li neki subjekt eksprimira GHR alel može biti provedeno detekcijom GHR proteina ili nukleinske kiseline.

Pogodno, metode liječenja, dijagnosticiranja ili procjenjivanja nekog subjekta uključuju procjenjivanje ili determiniranje, da li neki subjekt eksprimira GHRd3 i/ili GHRfl alel, na pr. determiniranje, da li je neki subjekt homozigot za GHRfl alel (GHRfl/fl), homozigot za GHRd3 alel (GHRd3/d3), ili heterozigot (GHRd3/fl). Izum stoga pogodno uključuje determiniranje, da li je GHRd3 eksprimiran unutar biološkog uzorka, uključivo: a) dovođenje rečenog biološkog uzorka u kontakt s: i) polinukleotidom koji se hibridizira pod ograničavajućim uvjetima s GHRd3 nukleinskom kiselinom; ili ii) detektabilnim polipeptidom koji se selektivno veže uz GHRd3 polipeptid; i b) detektiranje prisustva ili odsustva hibridizacije između rečenog polinukleotida i RNA vrste unutar rečenog uzorka, ili prisustva ili odsustva vezivanja rečenoga detektabilnog polipeptida uz polipeptid unutar rečenog uzorka. Detekcija rečene hibridizacije ili rečenog vezivanja ukazuje, da je rečeni GHRd3 alel ili izoforma eksprimiran(a) unutar rečenog uzorka. Pogodno, taj polinukleotid je početnica, a gdje je rečena hibridizacija detektirana detekcijom prisustva amplifikacijskog produkta koji sadrži rečenu početničku sekvencu, ili detektabilni polipeptid je antitijelo.

Također je zamišljena metoda za determiniranje, da li sisavac, pogodno čovjek, ima povišenu ili reduciranu razinu GHRd3 ekspresije, koja uključuje: a) pribavljanje biološkog uzorka od rečenog sisavca; i b) uspoređivanje količine GHRd3 polipeptida ili od neke GHRd3 RNA vrste koja kodira GHRd3 polipeptid unutar rečenog biološkog uzorka s razinom utvrđenom u ili očekivanom od kontrolnog uzorka. Povećana količina rečenog GHRd3 polipeptida ili rečene GHRd3 RNA vrste unutar rečenog biološkog uzorka uspoređena s rečenom razinom određenom u ili očekivanom od rečenog kontrolnog uzorka ukazuje, da rečeni sisavac ima povećanu razinu GHRd3 ekspresije, i gdje je smanjena količina rečenoga GHRd3 polipeptida ili rečene GHRd3 RNA vrste unutar rečenog biološkog uzorka uspoređenom s rečenom razinom utvrđenom u ili očekivanom od rečenog kontrolnog uzorka ukazuje, da rečeni sisavac ima reduciranu razinu GHRd3 ekspresije.

Primjerna metoda za utvrđivanje prisustva ili odsustva GHRd3 proteina ili nukleinske kiseline u biološkom uzorku uključuje pribavljanje biološkog uzorka od test subjekta i dovođenje tog biološkog uzorka u kontakt sa spojem ili agensom sposobnim za utvrđivanje GHRd3 proteina ili nukleinske kiseline (na pr., mRNA, genomičke DNA) koja kodira GHRd3 protein tako, da se prisustvo GHRd3 proteina ili nukleinske kiseline utvrdi u tom biološkom uzorku. Preferirani agens za detekciju GHRd3 mRNA ili genomičke DNA je markirana nukleinsko kiselinska proba sposobna za hibridiziranje s GHRd3 mRNA ili genomičkom DNA. Nukleinsko kiselinska proba može biti, na primjer, ljudska nukleinska kiselina, ili jedan njezin dio, kao što je oligonukleotid od barem 15, 30, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida u duljini i dovoljan da se specifično hibridizira pod ograničavajućim uvjetima s GHRd3 mRNA ili genomičkom DNA. Druge odgovarajuće probe za upotrebu u dijagnostičkim testovima izuma opisane su ovdje.

Preferirani agens za detekciju GHRd3 proteina je antitijelo, sposobno za vezivanje uz GHRd3 protein, pogodno antitijelo s detektabilnim biljegom. Antitijela mogu biti poliklonska, ili pogodnije, monoklonska. Intaktno antitijelo, ili jedan njegov fragment (na pr., Fab ili F(ab’)2) mogu se koristiti. Izraz "obilježen", obzirom na probu ili antitijelo, ima namjenu da obuhvati direktno obilježavanje probe ili antitijela spajanjem (t. j., fizičkim vezanjem) detektabilne supstance na probu ili antitijelo, kao i indirektno obilježavanje probe ili antitijela s reaktivnošću s drugim reagensom koji je direktno obilježen. Primjeri indirektnog obilježavanja uključuju detekciju nekog primarnog antitijela koristeći fluorescentno obilježeno sekundarno antitijelo i obilježavanje kraja (end-labeling) neke DNA probe s biotinom, tako da ono može biti detektirano s fluorescentno obilježenim streptavidinom.

Izraz "biološki uzorak" ima namjenu da uključi tkiva, stanice i biološke tekućine izolirane iz nekog subjekta, kao i tkiva, stanice i tekućine prisutne unutar nekog subjekta. To jest, ova detekcijska metoda izuma može se koristiti da odredi kandidatske mRNA, protein, ili genomičku DNA u nekom biološkom uzorku in vitro kao i in vivo. Na primjer, in vitro tehnike za detekciju kandidatskih mRNA uključuju Northern hibridizacije i in situ hibridizacije. In vitro tehnike za detekciju kandidatskog proteina uključuju enzimom vezane imunosorpcijske testove (enzyme linked immunosorbent assays, ELISAs), Western blotove, imunoprecipitacije i imunofluorescenciju. In vitro tehnike za detekciju kandidatske genomske DNA uključuju Southern hibridizacije. Nadalje, in vivo tehnike za detekciju GHRd3 proteina uključuju uvođenje obilježenog anti- antitijela u subjekt. Na primjer, to antitijelo može biti obilježeno radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokacija u nekom subjektu može biti utvrđena standardnim slikovnim tehnikama.

U jednoj izvedbi, biološki uzorak sadrži proteinske molekule test subjekta. Alternativno, biološki uzorak može sadržavati mRNA molekule od test subjekta ili genomičke DNA molekule od test subjekta. Preferirani biološki uzorak je serumski uzorak izoliran uobičajenim sredstvima iz subjekta.

U drugoj izvedbi, ove metode nadalje uključuju pribavljanje kontrolnog biološkog uzorka od kontrolnog subjekta, dovođenje kontrolnog uzorka u kontakt sa spojem ili agensom sposobnim za detekciju GHRd3 proteina, mRNA, ili genomičke DNA, tako da se prisustvo GHRd3 proteina, mRNA ili genomičke DNA detektira u tom biološkom uzorku, i uspoređivanje prisustva GHRd3 proteina, mRNA ili genomičke DNA u kontrolnom uzorku s prisustvom GHRd3 proteina, mRNA ili genomičke DNA u test uzorku.

Izum također obuhvaća komplete za detektiranje prisustva GHRd3 proteina, mRNA, ili genomičke DNA u nekom biološkom uzorku. Na primjer, takav komplet može sadržavati obilježeni spoj ili agens sposoban za detektiranje GHRd3 proteina ili mRNA u biološkom uzorku; sredstva za determiniranje količine GHRd3 proteina ili mRNA u tom uzorku; i sredstva za uspoređivanje količine GHRd3 proteina, mRNA, ili genomičke DNA u tom uzorku s nekim standardom. Taj spoj ili agens može biti pakiran u pogodan spremnik. Taj komplet može dalje imati instrukcije za korištenje kompleta za detekciju GHRd3 proteina ili nukleinske kiseline.

Najpogodnije, testovi opisani ovdje, kao što su prethodni dijagnostički testovi ili slijedeći testovi, mogu se koristiti da identificiraju subjekt koji ima ili je pod rizikom razvijanja smanjenog GHR odgovora. Naročito, GHRfl homozigotni subjekt se identificira kao da ima ili je pod rizikom razvijanja smanjenog GHR odgovora. U drugim aspektima, dijagnostičke metode opisane ovdje mogu se koristiti da identificiraju subjekte koji imaju ili su pod rizikom razvijanja neke bolesti, poremećaja ili svojstva povezanog s aberantnim ili točnije, smanjenim GHR razinama, ekspresijom ili aktivnosti. Na primjer, testovi opisani ovdje, kao što su prethodni dijagnostički testovi ili slijedeći testovi, mogu se koristiti da identificiraju subjekt koji ima ili je pod rizikom razvijanja nekog svojstva povezanog sa smanjenim GHR razinama, ekspresijom ili aktivnosti. U drugom primjeru, testovi opisani ovdje mogu se koristiti da identificiraju subjekt koji ima ili je pod rizikom da razvije neko svojstvo povezano sa smanjenim GHR razinama, ekspresijom ili aktivnosti. Kako je diskutirano, za GHRd3/fl heterozigot se očekuje da ima povećani GHR odgovor ili GHR aktivnost u usporedbi s GHRfl/fl homozigotom.

Prognostički testovi opisani ovdje mogu se koristiti za determiniranje da li, i/ili prema kakvom se režimu davanja nekom subjektu treba davati neki agens koji djeluje preko GHR putanje za liječenje neke bolesti ili poremećaja. Stoga, predmetno otkriće pruža metode za determiniranje, da li će se neki subjekt moći učinkovito liječiti nekim agensom koji djeluje kroz GHR putanju, u kojem se pribavlja test uzorak i određuje GHRd3 protein ili ekspresija ili aktivnost nukleinske kiseline. Kako je razmotreno, za neki subjekt koji pokazuje GHRd3 protein ili nukleinsku kiselinu se očekuje da ima povećani pozitivni odgovor na rečeni agens, u odnosu na neki subjekt koji ne pokazuje GHRd3 protein ili nukleinsku kiselinu.

Velikim dijelom, budući da se davanje agensa koji djeluju preko GHR-posredovanih putanja može adaptirati prema subjektima koji imaju veću ili manju sposobnost odgovora na taj agens, ova detekcija osjetljivosti na smanjenu GHR aktivnost u pojedinaca je vrlo važna. Rečeni agensi ne trebaju nužno djelovati direktno na taj GHR protein, već mogu djelovati uzvodno od tog GHR proteina, na primjer djelujući na neku drugu molekulu koja konačno uspostavlja interakciju s GHR proteinom. U pogodnoj izvedbi, taj agens je agens koji djeluje direktno na taj GHR protein. Najpogodnije, taj agens je agens koji veže taj GHR protein i djeluje ili kao agonist ili antagonist. Najpogodnije, taj agens je GH protein sposoban za aktivaciju tog GHR proteina. U drugim izvedbama, taj agens je GH protein sposoban za vezanje, ali ne i za aktiviranje GHR proteina.

Poremećaji koji uključuju GHR obuhvaćaju na primjer niski rast, pretilost, infekciju, ili dijabetes; stanja akromegalije ili gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličke sindrome; poremećaje raspoloženja i sna, rak, srčanu bolest i hipertenziju. Stoga, metode izuma mogu se koristiti za predviđanje odgovora nekog subjekta na liječenje s nekim agensom za bilo koji od ovih poremećaja.

Kako je diskutirano, predmetno otkriće opisuje metodu za liječenje subjekta koji pati od stanja odabranog iz skupine koja uključuje niski rast, pretilost, infekciju, ili dijabetes; stanja akromegalije ili gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličke sindrome; poremećaje raspoloženja i sna, rak, srčanu bolest i hipertenziju, a ta metoda obuhvaća:

(a) determiniranje u tom subjektu prisustva ili odsustva nekog alela GHR gena, u čemu taj alel korelira s mogućnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na neki agens sposoban da ameliorira rečeno stanje; i

(b) odabir ili determiniranje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

Prema tome, izum se također tiče metode za liječenje sisavca, pogodno čovjeka, koja sadrži slijedeće korake:

- po izboru, determiniranje da li DNA individue kodira GHRd3 protein;

- odabiranje individue čija DNA ne kodira GHRd3 protein;

- praćenje rečene individue za pojavljivanje (i po izboru razvitak) simptoma povezanih sa smanjenim GHR odgovorom; i

- davanje učinkovite količine liječenja koje djeluje protiv smanjenog GHR odgovora ili protiv njegovih simptoma rečenoj individui u odgovarajućem stadiju.

Druga izvedba predmetnog izuma uključuje metodu za liječenje sisavca, pogodno čovjeka, koja sadrži slijedeće korake:

- po izboru, determiniranje da li DNA individue kodira GHRd3 protein;

- odabiranje individue čija DNA ne kodira GHRd3 protein;

- davanje preventivnog liječenja za smanjeni GHR odgovor rečenoj individui.

U daljnjoj izvedbi, predmetni se izum tiče metode za liječenje sisavca, pogodno čovjeka, koja sadrži slijedeće korake:

- po izboru, determiniranje da li DNA individue kodira GHRd3 protein;

- odabiranje individue čija DNA ne kodira GHRd3 protein;

- davanje preventivnog liječenja za smanjeni GHR odgovor rečenoj individui;

- praćenje rečene individue za pojavljivanje i razvitak simptoma povezanih sa smanjenim GHR odgovorom; i po izboru

- davanje liječenja koje djeluje protiv smanjenog GHR odgovora ili protiv njegovih simptoma rečenoj individui u odgovarajućem stadiju.

Za korištenje u određivanju toka liječenja individue, predmetni izum se također tiče metode za liječenje koja sadrži slijedeće korake:

- odabiranje neke individue čija DNA kodira protein povezan sa smanjenim GHR odgovorom, aktivnošću ili ekspresijom, ili od njihovih simptoma; i

- davanja liječenja koje je učinkovito protiv smanjenog GHR odgovora ili njegovih simptoma rečenoj individui. U pogodnim izvedbama, rečeni protein povezan sa smanjenim GHR odgovorom ili njegovim simptomima je GHR protein, još pogodnije GHRfl protein. Najpogodnije, ta individua će biti homozigotna za GHRfl/fl izoformu.

Ta individua prema metodama izuma može biti neka individua koja pati od ili je osjetljiva na stanje odabrano iz grupe koja sadrži: niski rast (na pr. pogodno ISS), pretilost, infekciju, ili dijabetes; stanje akromegalije ili gigantizma koje bi moglo biti povezano s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličke sindrome; poremećaje raspoloženja i sna, rak, srčanu bolest i hipertenziju.

Smanjeni GHR odgovor je pogodno smanjeni odgovor na liječenje s agensom sposobnim da djeluje kroz GHR putanju, ili pogodnije da se veže uz GHR protein. Preferirani primjeri agensa uključuju agense za liječenje niskog rasta, pretilosti, infekcije ili dijabetesa; stanja akromegalije ili gigantizma koja bi mogla biti povezana s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezanih s retencijom natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

Liječenje učinkovito protiv smanjenog GHR odgovora ili njegovih simptoma može se razlikovati u bilo kojem odgovarajućem aspektu od liječenja pruženog pojedincima koji nemaju smanjeni GHR odgovor. U jednom aspektu, ovo liječenje razlikuje se u količini datog agensa. U drugom aspektu, ovo liječenje razlikuje se u formulaciji. U još jednom drugom aspektu, razlikuje se vrijeme metode davanja tog sastava. U daljnjem aspektu, neki agens korišten u liječenju, učinkovit protiv smanjenog GHR odgovora ili njegovih simptoma razlikuje se u strukturi od agensa korištenog za liječenje temeljnih stanja (na pr. niski rast, pretilost). U pogodnom aspektu, sastav uključujući GH protein, njegovu varijantu ili njegov fragment, se daje individui homozigotnoj za GHRfl u većoj količini od one koja se daje nekoj individui čija DNA kodira GHRd3 protein.

Pogodno, rečeni agens je GH polipeptid ili njegov fragment, i pogodnije, rekombinantni GH polipeptid ili njegov fragment, primjeri kojih će se dalje diskutirati ovdje. Rekombinantni GH polipeptid može biti GHR agonist (na pr. za povećanje rasta ili liječenje pretilosti) ili GHR antagonist (na pr. za liječenje stanja akromegalije ili gigantizma). Taj odgovor, kako se dalje ovdje razlaže, može biti promjena u visini ili brzini rasta, poboljšanju simptoma pretilosti (na pr. indeksa tjelesne mase, Body Mass Index, BMI), infekcije, ili dijabetesa; poboljšanju simptoma stanja akromegalije ili gigantizma; ili poboljšanju simptoma stanja povezanih s retencijom natrija i vode, metaboličkih sindroma, poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

U jednom aspektu, pojedinac može već patiti od, ili biti osjetljiv na neki poremećaj i možda je već prije bio i liječen, može biti podvrgnut terapiji, ili može biti kandidat za buduću terapiju. Najpogodnije, pojedinac će patiti od, ili biti osjetljiv na stanja odabrana od skupine koja sadrži: niski rast, pretilost, infekciju ili dijabetes; stanje akromegalije ili gigantizma koje bi moglo biti povezano s laktogeničkim, dijabetogeničkim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim efektima; stanja povezana s retencijom natrija i vode; metaboličke sindrome; poremećaj raspoloženja i sna, rak, srčanu bolest i hipertenziju. U preferiranim aspektima, izum stoga pruža metode za liječenje pojedinaca koji imaju jedan ili više od rečenih poremećaja. Predmetni izum stoga omogućuje ciljano liječenje, u skladu s naročitom metodom liječenja onih subjekata koji imaju smanjeni GH odgovor, kako je gore definirano.

DNA uzorak se pribavlja od pojedinca kojeg treba testirati da bi se odredilo da li ta DNA kodira GHRd3 protein. DNA uzorak je analiziran da se odredi da li on sadrži GHRd3 sekvencu ili da li je taj pojedinac homozigotan za GHRfl izoformu. DNA koja kodira GHRd3 protein bit će povezana s većim pozitivnim odgovorom na liječenje medikamentom, a odsustvo DNA koja kodira GHRd3 alele bit će povezano sa smanjenim pozitivnim odgovorom kada se usporedi s GHRd3 pojedincima.

Metode izuma mogu također biti korisne u procjenjivanju i provođenju kliničkih ispitivanja medikamenata. Prema tome, ove metode uključuju identificiranje prve populacije pojedinaca koji odgovaraju pozitivno na rečeni medikament, i druge populacije individua koji odgovaraju negativno na rečeni medikament ili čiji pozitivni odgovor na rečeni medikament je smanjen u usporedbi s rečenom prvom populacijom individua. U jednoj izvedbi, taj medikament može se davati subjektu u kliničkom ispitivanju, ako taj DNA uzorak sadrži alele za jedan ili više alela povezanih s pozitivnim odgovorom na liječenje tim medikamentom i/ili ako taj DNA uzorak nema alele za jedan ili više alela povezanih s negativnim ili smanjenim pozitivnim odgovorom na liječenje tim medikamentom. U drugom aspektu, taj medikament može se davati subjektu u kliničkom ispitivanju, ako DNA uzorak sadrži alele za jedan ili više alela povezanih s negativnim ili smanjenim pozitivnim odgovorom na liječenje tim medikamentom i/ili ako taj DNA uzorak nema alele za jedan ili više alela povezanih s pozitivnim ili povećanim pozitivnim odgovorom na liječenje tim medikamentom.

Stoga, koristeći metodu predmetnog izuma, učinkovitost lijeka može se procijeniti uzimajući u obzir razlike u GHR odgovoru među subjektima ispitivanja lijeka. Ako je poželjno, ispitivanje za evaluaciju učinkovitosti lijeka može se provoditi u populaciji sastavljenoj u biti od pojedinaca koji će vjerojatno povoljno reagirati na taj medikament, ili u populaciji u biti sastavljenoj od pojedinaca koji će vjerojatno reagirati manje povoljno na taj medikament, nego druga populacija. Na primjer, sastav koji ima GH protein može biti evaluiran bilo u populaciji od GHRd3 individua ili u populaciji od GHRfl/fl individua. U drugom aspektu, medikament oblikovan da liječi pojedince koji pate od smanjenog GH odgovora može biti evaluiran u boljim uvjetima u populaciji od GHRfl/fl pojedinaca.

Detekcija GHRd3 i GHRfl

Promišlja se, da druge mutacije u ovome GHR genu mogu biti identificirane u skladu s predmetnim izumom pomoću detekcije nukleotidne promjene u određenoj nukleinskim kiselinama (U.S. pat. br. 4,988,617, inkorporiran ovdje referencom). Raznoliki različiti testovi su razmatrani u tom smislu, uključivo ali ne i ograničeno na, fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH; U.S. pat. br. 5,633,365 i U.S. pat. br. 5,665,549, svaki inkorporiran ovdje referencom), direktno DNA sekvenciranje, PFGE analizu, Southern ili Northern blotting, jedno-lančanu konformacijsku analizu (single-stranded conformation analysis, SSCA), protekcijski test od RNAze (RNAse protection assay), alelu-specifičan oligonukleotid (allele-specific oligonucleotide, ASO na pr., U.S. pat. br. 5,639,611), točkastu blot analizu denaturirajuće gradijentne gel elektroforeze (dot blot analysis denaturing gradient gel electrophoresis, na pr., U.S. pat. br. 5,190,856 inkorporiran ovdje referencom), RFLP (na pr., U.S. pat. br. 5,324,631 inkorporiran ovdje referencom) i PCR-SSCP. Metode za detekciju i kvantificiranje genskih sekvenci u na pr. biološkim tekućinama su opisane u U.S. pat. br. 5,496,699, i inkorporirane ovdje referencom).

Početnice (primers) i probe

Za izraz početnica (primer), kako je ovdje definiran, se smatra da obuhvaća bilo koju nukleinsku kiselinu sposobnu za započimanje (priming) sinteze neke nascentne nukleinske kiseline u o kalupu-ovisnom procesu. Tipično, početnice su oligonukleotidi od deset do dvadeset parova baza u dužinu, ali se mogu koristiti i duže sekvence. Početnice mogu biti dane u dvolančanom ili jednolančanom obliku, premda je jednolančani oblik preferiran. Probe se definiraju drugačije, iako i one mogu djelovati kao početnice. Probe, iako možda sposobne za poticanje, konstruirane su za vezanje uz ciljnu DNA ili RNA i ne treba ih se koristiti u amplifikacijskom procesu.

Slike 3 i 4 daju genomičke DNA sekvence koje okružuju ekson 3, odnosno mjesto delecije eksona 3 u GHR genu. GHRfl cDNA sekvenca je prikazana u SEQ ID NO 1. Bilo koja razlika u nukleotidnoj sekvenci između GHRd3 i GHRfl alela može se koristiti u metodama izuma da se detektira i razlikuje posebni GHR alel u individue. Za identificiranje neke GHRfl genomičke DNA ili cDNA molekule, može biti oblikovana početnica koja hibridizira uz ekson 3 nukleinske kiseline. Za identificiranje GHRd3 genomičke DNA, početnica ili proba može biti oblikovana tako, da ona zahvaća spajanje introna 2 i 3 od tog GHR gena, kako se nalazi u genomičkoj DNA sekvenci u GHRd3 alelu, tako razlikujući GHRfl alel koji ima ekson 3 i GHRd3 alel koji nema ekson 3. U drugom primjeru, GHRd3 cDNA molekula može biti identificirana oblikovanjem početnice ili probe koja zahvaća spajanje eksona 2 i 4, tako razlikujući GHRfl cDNA molekulu koja ima ekson 3 i GHRd3 cDNA molekulu koja nema ekson 3. Drugi primjeri pogodnih početnica za detekciju GHRd3 su popisani u Pantel et al. (supra) i u Primjeru 1 dolje.

Predmetni izum obuhvaća polinukleotide za upotrebu kao početnica i proba u metodama izuma. Ovi polinukleotidi mogu se sastojati od, sastoje se u osnovi od, ili sadrže susjedni raspon (contiguous span) nukleotida od sekvence iz bilo koje sekvence dane ovdje kao i sekvenci koje su komplementarne njima (complementary thereto, njihovi komplementi "complements thereof"). Susjedni raspon ("contiguous span") može biti barem 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 ili 1000 nukleotida u duljinu do obima da je susjedni raspon od tih duljina konzistentan s duljinama od te posebne Sekvence ID. Treba primijetiti, da polinukleotidi predmetnog izuma nisu ograničeni da imaju točne bočne granične sekvence koje okružuju neku ciljnu sekvencu od interesa, koje su pobrojene u Listi sekvenci (Sequence Listing). Štoviše, procjenjuje se, da ove bočne granične sekvence (flanking sequences) koje okružuju ove polimorfizme, ili bilo koja od početnica ili proba predmetnog izuma, koje su udaljenije od ovih markera, mogu biti produžene ili skraćene do bilo kojeg obima, kompatibilno s njihovom namjeravanom upotrebom, i predmetni izum specifično razmatra takve sekvence. Procjenjuje se, da polinukleotidi o kojima je ovdje riječ, mogu biti bilo koje duljine kompatibilno s njihovom namjeravanom upotrebom. Također, bočne granične regije izvan ovog susjednog raspona (contiguous span) ne trebaju biti homologne nativnim bočnim graničnim sekvencama koje se stvarno pojavljuju u ljudskim subjektima. Dodavanje bilo koje nukleotidne sekvence, koja je kompatibilna s namjeravanom uporabom nukleotida, se specifično razmatra. Preferirani polinukleotidi mogu se sastojati od, sastoje se u osnovi od, ili sadrže susjedni raspon (contiguous span) nukleotida od sekvence od SEQ ID Br. 1, 4 ili 6, kao i sekvenci koje su komplementarne njima. Ovaj susjedni raspon ("contiguous span') može biti barem 8, 10, 12, 15, 50, 70, 80, 100, 250, 500 ili 1000 nukleotida u duljinu.

Probe predmetnog izuma mogu biti oblikovane iz otkrivenih sekvenca za bilo koju metodu poznatu u struci, naročito za metode koje omogućuju testiranje ako je prisutna neka naročita sekvenca ili marker koja je ovdje otkrivena. Preferirani set proba može biti oblikovan za upotrebu u hibridizacijskim testovima izuma na bilo koji način poznat u struci, tako da se one selektivno vežu uz jedan alel od nekog polimorfizma, ali ne uz drugi pod bilo kojim sklopom uvjeta testiranja.

Bilo koji od polinukleotida predmetnog izuma može biti obilježen, ako se želi, inkorporiranjem biljega detektabilnog spektroskopskim, fotokemijskim, biokemijskim, imunokemijskim, ili kemijskim načinima. Na primjer, korisni biljezi uključuju radioaktivne supstance, fluorescentne boje ili biotin. Pogodno, polinukleotidi se obilježavaju na svojim 3' i 5' krajevima. Biljeg može također biti upotrebljen da uhvati tu početnicu, tako da olakša imobilizaciju bilo početnice ili ekstenzijskog produkta te početnice, kao što je amplificirana DNA, na tvrdi nosač. Biljeg hvatanja (capture label) se dodaje na početnice ili probe i može biti specifični vezni član koji tvori vezni par sa specifičnim veznim članom reagensa krute faze (solid phase reagent's specific binding member, na pr. biotin i streptavidin). Stoga, ovisno o tipu biljega nošenog od nekog polinukleotida ili neke probe, on može biti iskorišten da uhvati ili da detektita ciljnu DNA. Dalje, biti će shvaćeno da ti polinukleotidi, početnice ili probe dane ovdje, mogu, same po sebi, služiti kao biljezi hvatanja. Na primjer, u slučaju gdje je vezni član reagensa čvrste faze nukleokiselinska sekvenca, ona se može odabrati tako da ona veže komplementarni dio neke početnice ili probe, da time imobilizira tu početnicu ili probu uz tu krutu fazu. U slučajevima gdje polinukleotidna proba sama služi kao taj vezni član, stručne osobe iz odgovarajućeg područja će prepoznati da će ta proba sadržavati sekvencu ili rep ("tail“) koji nije komplementaran prema cilju. U onom slučaju gdje polinukleotidna početnica sama služi kao taj biljeg hvatanja, barem jedan dio te početnice biti će slobodan da se hibridizira s nukleinskom kiselinom na čvrstoj fazi. DNA tehnike obilježavanja dobro su poznate stručnoj osobi iz odgovarajućeg područja.

Bilo koji od polinukleotida, početnica i proba predmetnog izum može biti zgodno imobiliziran na neku čvrstu podlogu. Čvrste podloge su poznate stručnim osobama iz odgovarajućeg područja i uključuju zidove bunarića na reakcijskoj ploči, epruveti, polistirenskim zrncima, magnetskim zrncima, nitroceluloznim trakama, membranama, mikropartiklima takvim kao latex partikli, ovčje (ili od drugih životinja) crvene krvne stanice, duracite i druge. Čvrsta podloga nije kritična i može je odabrati stručna osoba iz odgovarajućeg područja. Tako, latex partikli, mikropartikli, magnetska ili ne-magnetska zrnca, membrane, plastične epruvete, stijenke mikrotitarskih bunarića, stakleni ili silikonski čipovi (chips), ovčje (ili od drugih pogodnih životinja) crvene krvne stanice i duracite su sve pogodni primjeri. Pogodne metode za imobiliziranje nukleinskih kiselina na krute faze uključuju ionske, hidrofobne, kovalentne interakcije i slično. Kruti nosač kako se ovdje koristi, odnosi se na bilo koji materijal koji je netopiv, ili može biti učinjen netopivim naknadnom reakcijom. Kruti nosač može biti odabran zbog svoje intrinzičke sposobnosti da privuče i imobilizira reagens za hvatanje. Alternativno, ova čvrsta faza može zadržati dodatni receptor koji ima sposobnost da privuče i imobilizira reagens hvatanja. Dodatni receptor može uključiti neku tvar s nabojem, koja je suprotno nabijena obzirom na sam reagens hvatanja, ili na nabijenu tvar konjugiranu na reagens hvatanja. Kao još jedna mogućnost, receptorska molekula može biti bilo koji specifični vezni član koji je imobiliziran na (pričvršćen na) taj kruti nosač i koji ima sposobnost da imobilizira reagens hvatanja posredstvom specifične vezne reakcije. Receptorske molekule omogućuju indirektno vezivanje reagensa za hvatanje uz materijal krutog nosača prije provođenja testiranja ili za vrijeme provođenja testiranja. Kruti nosač tako može biti plastika, derivirana plastika, magnetski ili ne-magnetski metal, staklena ili silikonska površina epruvete, mikrotitarski bunarić, ploča, zrnca, mikropartikl, čipovi, ovčje (ili od drugih pogodnih životinja) crvene krvne stanice, duraciti i druge konfiguracije poznate stručnim osobama iz odgovarajućeg područja. Polinukleotidi ovog izuma mogu biti pričvršćeni ili imobilizirani na nekom krutom nosaču individualno ili u grupama od barem 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20, ili 25 distinktnih polinukleotida ovoga izuma na jedan jedini kruti nosač. Dodatno, polinukleotidi drugačiji od onih u ovome otkriću mogu biti spojeni na isti taj kruti nosač kao jedan ili više polinukleotida predmetnog izuma.

Bilo koji polinukleotid dan ovdje može biti spojen u preklapajućim površinama ili na nasumičnim lokacijama na krutome nosaču. Alternativno, polinukleotidi predmetnoga izuma mogu biti spojeni u poredanom rasporedu u kojem je svaki polinukleoid spojen na distinktnu regiju krutog nosača koja se ne preklapa s mjestom spajanja bilo kojeg drugog polinukleotida. Pogodno, takav uređeni raspored polinukleotida oblikovan je da bude adresabilan ("adressable“), gdje su ove distinktne lokacije zabilježene i mogu biti pristupačne kao dio procedure testiranja. Adresabilni polinukleotidni rasporedi tipično uključuju pluralnost različitih oligonukleotidnih proba koje su vezane na površinu nekog supstrata u raznim poznatim lokacijama. Poznavanje precizne lokacije za lokaciju svakog polinukleotida čini ove adresabilne rasporede naročito korisnim u hibridizacijskim testovima. Bilo koja tehnologija adresabilnih rasporeda poznata u struci može biti korištena s polinukleotidima iz izuma. Jedna naročita izvedba ovih polinukleotidnih rasporeda je poznata kao Genechips, i općenito je opisana u U.S. patentu 5,143, 854; PCT publications WO 90/15070 i 92/10092. Ovi rasporedi mogu općenito biti proizvedeni koristeći mehaničke sintetičke metode ili svjetlom upravljane sintetičke metode, koje inkorporiraju kombinaciju fotolitografskih metoda i oligonukleotidnu sintezu u krutoj fazi (Fodor et al., Science, 251: 767-777, 1991). Imobilizacija rasporeda oligonukleotida na krutim podlogama postala je mogućom s razvitkom tehnologije općenito identificirane kao "Sinteza imobiliziranih polimera u vrlo velikom mjerilu" ("Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis", VLSIPS) u kojoj su, tipično, probe imobilizirane u rasporedu velike gustoće, na krutoj površini čipa. Primjeri za VLSIPS tehnologije dani su u U.S. patentima 5,143,854 i 5,412,087 i u PCT publikacijama WO 90/15070, WO 92/10092 i WO 95/11995, koje opisuju metode za oblikovanje oligonukleotidnih rasporeda pomoću tehnika kao što su svjetlom usmjerene sintetske tehnike. U oblikovanju strategija usmjerenih da daju rasporede nukleotida imobiliziranih na krutim nosačima, daljnje prezentacijske strategije su razvijene da poredaju i izlože ove oligonukleotidne nizove na te čipove u pokušaju da se makisimiziraju hibridizacijski obrasci i sekvencijska informacija. Primjeri takvih prezentacijskih strategija su otkriveni u PCT publikacijama WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 i WO 97/31256.

Amplifikacijske metode ovisne o kalupu

Nekoliko o kalupu ovisnih procesa je raspoloživo za amplifikaciju marker sekvenci prisutnih u nekom datom kalupnom uzorku. Jedna od najpoznatijih amplifikacijskih metoda je lančana reakcija polimeraze (polymerase chain reaction, PCR) koja je detaljno opisana u U.S. pat. br. 4,683,195, 4,683,202 i 4,800,159 i u Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc. San Diego Calif, 1990., svaka od kojih je inkorporirana ovdje referencom u svojoj cjelini.

Ukratko, u PCR, pripremljene su dvije početničke sekvence (primer sequences) koje su komplementarne regijama na suprotnim komplemenarnim lancima marker sekvence. Suvišak deoksinukleozid trifosfata je dodan u reakcijsku smjesu zajedno s DNA polimerazom, na pr., Taq polimerazom. Ako je marker sekvenca prisutna u uzorku, ove početnice će se vezati uz taj marker i polimeraza će uzrokovati da se početnice produže niz ovu marker sekvencu pridodavanjem nukleotida. Sa povišenjem i smanjenjem temperature reakcijske smjese, ove produžene početnice će se disocirati od markera da daju reakcijske produkte i taj proces se ponavlja.

PCR amplifikacijski postupak s reverznom transkriptazom (reverse transcriptase PCR amplification procedure) može se provesti da bi se kvantificirala količina amplificirane mRNA. Metode za reverzno transkribiranje RNA u cDNA dobro su poznate i opisane u Sambrook et al., In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Alternativne metode za reverznu transkripciju koriste termostabilne RNA-ovisne DNA polimeraze. Ove su metode opisane u WO 90/07641. Metodologije polimerazne lančane reakcije dobro su poznate u struci.

Druga metoda za amplifikaciju je ligazna lančana reakcija (ligase chain reaction, "LCR" U.S. pat. br. 5,494,810, 5,484,699, EPO br. 320 308, svaki inkorporiran ovdje referencom). U LCR, dva komplementarna para proba se pripravljaju, i u prisustvu ciljne sekvence, svaki par će se vezati na suprotne komplementarne lance od te ciljne sekvence tako da se one dotiču. U prisustvu ligaze, ova dva para proba će se povezati da tvore jednu jedinu jedinicu.

Pomoću termičkih ciklusa, kao u PCR-u, vezane ligirane jedinice disociraju se od ciljne sekvence i tada služe kao „ciljne sekvence“ ("target sequences“) za ligaciju viška parova proba. U.S. pat. br. 4,883,750 opisuje metodu sličnu LCR za vezanje parova proba uz ciljnu sekvencu.

Qbeta replikaza (Qbeta Replicase), RNA-ovisna RNA polimeraza, može se koristiti kao još jedna amplifikacijska metoda u predmetnom izumu. U toj metodi, replikativna sekvenca u RNA koja ima regiju komplementarnu s onom u nekom cilju se dodaje uzorku u prisustvu RNA polimeraze. Ta polimeraza će kopirati tu replikativnu sekvencu koja se tada može detektirati. Slične metode također su opisane u U.S. pat. br. 4,786,600, inkorporiran ovdje referencom, koje se tiču rekombinantnih RNA molekula sposobnih da služe kao kalup za sintezu komplementarnih jednolančanih molekula s RNA-ovisnom RNA polimerazom. Ovako nastale producirane molekule su također sposobne da služe kao kalup za sintezu dodatnih kopija originalne rekombinantne RNA molelule.

Izotermna amplifikacijska metoda (isothermal amplification method), u kojoj se restrikcijske endonukleaze i ligaze koriste da se postigne amplifikacija ciljnih molekula koje sadrže nukleotid 5'-[alfa-thio]-trifosfata u lancu restrikcijskog mjesta također može biti korisna za amplifikaciju nukleinskih kiselina u predmetnom otkriću (Walker et al., (1992), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89: 392-396; U.S. pat. br. 5,270,184 inkorporiran ovdje referencom). U.S. pat. br. 5,747,255 (inkorporiran ovdje referencom) opisuje izotermnu amplifikaciju koristeći rascjepive oligonukleotide za detekciju polinukleotida. U toj metodi opisanoj ovdje, daju se separirane populacije oligonukleotida koje sadrže komplementarne sekvence jedna prema drugoj i koje sadrže barem jednu raskoljivu (scissile) vezu, koja se cijepa kadgod se stvara jedan perfektno podudaran dupleks koji sadrži takvu vezu. Kada ciljni polinukleotid kontaktira prvi oligonukleotid događa se cijepanje i stvoren je prvi fragment koji može hibridizirati s drugim oligonukleotidom. Nakon takve hibridizacije, drugi oligonukleotid se cijepa oslobađajući drugi fragment koji se može zatim hibridizirati s prvim oligonukleotidom na način sličan na onome od ciljnog polinukleotida.

Amplifikacija istisnućem lanca (Strand Displacement Amplification, SDA) je druga metoda za provođenje izotermne amplifikacije nukleinskih kiselina koja uključuje multiple krugove istiskivanja lanca i sinteze, t.j. translacije ureza (nick translation) (na pr. U.S. pat. br. 5,744,311; 5,733,752; 5,733,733; 5,712,124). Slična metoda, nazvana Reakcija popravka lanca (Repair Chain Reaction, RCR), uključuje sljubljivanje (annealing) nekoliko proba kroz cijelu regiju naciljanu za amplifikaciju, iza koje slijedi reparacijska reakcija u kojoj su prisutne samo dvije od četiri baze. Preostale dvije baze mogu biti dodane kao biotinilirani derivati za laku detekciju. Sličan pristup se koristi u SDA. Ciljne specifične sekvence mogu također biti utvrđene koristeći cikličku reakciju probe (cyclic probe reaction, CPR). U CPR, proba koja ima 3' i 5' sekvence od ne-specifične DNA i srednju sekvencu od specifične RNA hibridizira se uz DNA koja je prisutna u uzorku. Nakon hibridizacije ta se reakcija tretira s RNazom H, i ovi produkti od te probe identificiraju se kao distinktivni produkti koji se oslobađaju nakon digestije. Originalni kalup se sljubljuje uz drugu cikličnu probu i ta se reakcija ponavlja.

Još druge amplifikacijske metode opisane u GB Application br. 2 202 328, i u PCT Application br. PCT/US89/01025, koje su obje inkorporirane ovdje referencom u svojoj potpunosti, mogu biti korištene u skladu s predmetnim izumom. U prethodnoj prijavi "modificirane" početnice se koriste u, PCR-u sličnoj sintezi, koja je ovisna o kalupu i o enzimu. Te početnice mogu biti modificirane obilježavanjem s hvatajućim dijelom (capture moiety) (na pr. biotin) i/ili detektorskim dijelom (na pr. enzimom). U posljednoj prijavi, suvišak obilježene probe se dodaje uzorku. U prisustvu ciljne sekvence, proba se veže i cijepa katalitički. Nakon cijepanja, ova ciljna sekvenca se oslobađa intaktna da bi se vezala na suvišak probe. Cijepanje obilježene probe signalizira prisustvo ciljne sekvence.

Druge procedure za amplifikaciju nukleinskih kiselina uključuju na transkripciji zasnovane amplifikacijske sustave (transcription-based amplification systems, TAS), uključujući amplifikaciju zasnovanu na sekvenci nukleinske kiseline (nucleic acid sequence based amplification, NASBA) i 3SR (Kwok et al., (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86: 1173; i WO 88/10315, inkorporirane ovdje referencom u njihovoj potpunosti). U NASBA, ove nukleinske kiseline mogu biti pripravljene za amplifikaciju standardnom ekstrakcijom fenolom/kloroformom, toplinskom denaturacijom kliničkog uzorka, obradom s lizirajućim puferom i minispin kolonama za izolaciju DNA i RNA ili gvanidin-kloridnom ekstrakcijom RNA. Ove amplifikacijske tehnike uključuju sljubljivanje početnice koja ima ciljno-specifične sekvence. Nakon polimerizacije, DNA/RNA hibridi se razgrađuju s RNazom H, dok se dvolančane DNA molekule ponovno toplinski razgrađuju. U oba slučaja, jednolančana DNA se čini potpuno dvolančanom dodavanjem druge ciljno-specifične početnice, iza čega slijedi polimerizacija. Ove dvolančane DNA molekule su tada multiplo transkribirane s RNA polimerazom kao što je T7 ili SP6. U izotermnoj cikličkoj reakciji, ove RNA molekule su reverzno transkribirane u jednolančane DNA, koje se zatim konvertiraju u dvolančanu DNA, i zatim transkribiraju još jednom RNA polimerazom kao što je T7 ili SP6. Ovi rezultirajući proizvodi, bilo prikraćeni ili kompletni, ukazuju na ciljno specifične sekvence.

Davey et al., EPO br. 329 822 (inkorporirano ovdje referencom u svojoj potpunosti) otkriva nukleinskokiselinski amplifikacijski proces koji uključuje cikličko sintetiziranu jednolančanu RNA (single-stranded RNA, "ssRNA"), ssDNA; i dvolančanu DNA (double-stranded DNA, dsDNA), koja može biti korištena u skladu s predmetnim izumom. Ova ssRNA je kalup za oligonukleotid prve početnice, koji se elongira s reverznom transkriptazom (RNA-ovisna DNA polimeraza, RNA-dependent DNA polymerase). Ova RNA se tada uklanja iz rezultirajućeg DNA:RNA dupleksa djelovanjem ribonukleaze H (RNase H, RNaza specifična za RNA u dupleksu bilo s DNA ili RNA). Rezultirajuća ssDNA je kalup za drugu početnicu, koja također uključuje sekvence RNA polimeraznog promotora (kao primjer je T7 RNA polimeraza) 5' prema svojoj homologiji prema tom kalupu. Ova početnica se zatim produžuje s DNA polimerazom (kao primjer je veliki „Klenow-ljev“ fragment od E. coli DNA polimeraze 1), rezultirajući dvolančanom DNA ("dsDNA") molekulom, koja ima sekvencu identičnu s onom od originalne RNA između početnica, i koja ima dodatno, na jednom kraju, promotorsku sekvencu. Ova promotorska sekvenca može se koristiti odgovarajućom RNA polimerazom da stvori mnogo RNA kopija od DNA. Ove kopije mogu zatim ponovno ući u ciklus što dovodi do vrlo brze amplifikacije. Pravilnim izborom enzima, ova se amplifikacija može provoditi izotermalno, bez dodavanja enzima u svakom ciklusu. Zbog cikličke prirode ovoga procesa, startna sekvenca se može odabrati da bude bilo u obliku DNA ili RNA.

PCT Application WO 89/06700 (inkorporirana ovdje referencom u svojoj potpunosti) otkriva amplifikacijsku shemu za nukleokiselinske sekvence, zasnovanu na hibridizaciji promotorsko/početničke sekvence uz ciljnu jednolančanu DNA (single-stranded DNA, "ssDNA") iza čega slijedi transkripcija mnogih RNA kopija sekvence. Ova shema nije ciklička, t.j. novi kalupi se ne proizvode od nastalih RNA transkripata. Druge amplifikacijske metode uključuju "RACE" i jednostrani PCR ("one-sided PCR", Frohman, In: PCR Protocols. A Guide To Methods And Applications, Academic Press, N.Y., 1990.; i O'hara et al., (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86: 5673-5677; svaka inkorporirana ovdje referencom u svojoj potpunosti).

Metode utemeljene na ligaciji dva (ili više) oligonukleotida u prisustvu nukleinske kiseline koja ima sekvencu od rezultirajućih "di-oligonukleotida", time amplificirajući ove di-oligonukleotide, također se mogu koristiti u amplifikacijskom koraku predmetnoga izuma. (Wu et al., (1989) Genomics, 4: 560, inkorporirano ovdje referencom).

Southern/Northern bloting

Bloting tehnike dobro su poznate stručnim osobama iz odgovarajućeg područja. Southern bloting uključuje korištenje DNA kao cilja, dok Northern bloting uključuje korištenje RNA kao cilja. Svaka pruža različite vrste informacije, iako je cDNA blotiranje analogno, u mnogim aspektima, s blotiranjem RNA vrsta.

Ukratko, proba se koristi da nacilja vrstu DNA ili RNA, koja je imobilizirana na neki odgovarajući matriks, često filter od nitroceluloze. Razne vrste moraju biti prostorno odijeljene da bi se olakšala analiza. To se često postiže pomoću gel elektroforeze nukleokiselinskih vrsta iza čega slijedi „blotting“ (upijanje) na takav filter.

Kasnije, taj blotirani cilj se inkubira s nekom probom (obično obilježenom) pod uvjetima koji potiču denaturaciju i rehibridizaciju. Budući da je proba oblikovana da se bazama sparuje s tim ciljem, proba će se vezati s jednim dijelom ciljne sekvence pod uvjetima renaturacije. Nevezana proba se tada uklanja i detekcija se dovršava kako je opisano gore.

Separacijske metode

Normalno je poželjno, u jednoj fazi ili drugoj, odvojiti amplifikacijske produkte od kalupa i od suvišnih početnica sa svrhom, da se odredi da li se dogodila specifična amplifikacija. U jednoj izvedbi, amplifikacijski produkti se separiraju agaroznom, agaroza-akrilamidnom ili poliakrilamidnom gel elektroforezom koristeći standardne metode. Vidi Sambrook et al. 1989.

Alternativno, mogu se koristiti kromatografske tehnike da se postigne separacija. Postoje mnoge vrste kromatografije koje mogu biti korištene u predmetnom izumu: adsorpcija, odjeljivanje, ionska izmjena i molekularno prosijavanje, i mnoge specijalizirane tehnike za njihovo korištenje, uključujući kolonu, papirnu, tankoslojnu i plinsku kromatografiju (Freifelder. Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 2nd ed. Wm. Freeman and Co., New York, N.Y., 1982.)

Detekcijske metode

Produkti mogu biti vizualizirani kako bi se potvrdila amplifikacija ovih marker sekvenci. Jedna tipična vizualizacijska metoda uključuje bojenje gela s etidij bromidom i vizualiziranje pod UV svjetlom. Alternativno, ako su amplifikacijski produkti integralno obilježeni radio- ili fluorometrički obilježenim nukleotidima, ti amplifikacijski produkti mogu zatim biti eksponirani na rentgenskom filmu ili vizualizirani pod odgovarajućim stimulacijskim spektrima, nakon separacije.

U jednoj izvedbi, vizualizacija se postiže indirektno. Nakon separacije amplifikacijskih produkata obilježena nukleokiselinska proba se dovodi u kontakt s amplificiranom marker sekvencom. Ta proba pogodno je konjugirana s nekim kromoforom, ali može biti i radiomarkirana. U drugoj izvedbi, ta proba je konjugirana na vezni partner, kao što je antitijelo ili biotin, a drugi član tog veznog para nosi detektabilni dio.

U jednoj izvedbi, detekcija je s obilježenom probom. Uključene tehnike dobro su poznate stručnim osobama iz odgovarajućeg područja i mogu se naći u mnogim standardnim knjigama o molekularnim protokolima. Vidi Sambrook et al., 1989. Na primjer, kromoforom ili radio-obilježene probe ili početnice identificiraju taj cilj u toku ili nakon amplifikacije.

Jedan primjer prethodnoga opisan je u U.S. pat. br. 5,279,721, inkorporiran ovdje referencom, koji otkriva aparat i metodu za automatizirane elektroforeze i transfer nukleinskih kiselina. Taj aparat omogućuje elektroforezu i bloting bez eksterne manipulacije gela i idealno je pogodan za provođenje metoda prema predmetnom izumu.

Dodatno, amplifikacijski produkti opisani gore mogu biti podvrgnuti analizi sekvence radi identificiranja specifičnih vrsta varijacija, koristeći standardne tehnike za analizu sekvence. Unutar određenih metoda, provodi se sveobuhvatna analiza gena analizom sekvence, koristeći setove početnica oblikovanih za optimalno sekvenciranje (Pignon et al., (1994) Hum. Mutat., 3: 126-132, 1994). Predmetni izum daje metode kojima se bilo koja od njih ili sve u ovim tipovima analiza mogu koristiti. Koristeći sekvence otkrivene ovdje, oligonukleotidne početnice se mogu oblikovati da se omogući amplifikacija sekvenci kroz cijeli GHR gen, koja može zatim biti analizirana direktnim sekvenciranjem.

Bilo koja od raznih sekvencirajućih reakcija poznatih u struci, može biti korištena da direktno sekvencira taj GHR gen komparirajući sekvencu iz uzorka s odgovarajućom sekvencom divljeg tipa (kontrola). Primjeri sekvencirajućih reakcija uključuju one utemeljene na tehnikama razvijenim od Maxam i Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560) ili Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Također se razmatra, da bilo koja od raznih automatiziranih procedura sekvenciranja može biti korištena kada se provode ovi dijagnostički testovi.

Komponente kompleta

Svi bitni materijali i reagensi potrebni za detektiranje i sekvenciranje GHR i njegovih varijanti mogu biti skupljeni zajedno u komplet (kit). Ovo će općenito sadržavati unaprijed odabrane početnice i probe. Uključeni mogu također biti enzimi pogodni za amplificiranje nukleinskih kiselina, uključujući razne polimeraze (RT, Taq, SequenaseTM i t.d.), deoksinukleotidi i puferi da dadu potrebnu reakcijsku smjesu za amplifikaciju. Takvi kompleti također će općenito sadržavati, na odgovarajući način, odijeljene spremnike za svaki pojedinačni reagens i enzim kao i za svaku početnicu ili probu.

Oblikovanje i teoretska razmatranja za Relativni kvantitativni RT-PCRTM.

Reverzna transkripcija (RT) od RNA u cDNA, iza koje slijedi relativna kvantitativna PCR (RT-PCR) može se koristiti za određivanje relativnih koncentracija specifičnih mRNA vrsti izoliranih iz subjekata. Određivanjem da koncentracija neke specifične vrste mRNA varira, pokazuje se da je gen koji kodira tu specifičnu mRNA vrstu diferencijalno eksprimiran. Kvantitativna PCR može biti korisna, na primjer, u ispitivanju relativnih razina GHRd3 i GHRfl mRNA u subjekata koje treba liječiti nekim agensom koji djeluje putem GHR putanje, u subjekta pod sumnjom da pati od smanjene GHR aktivnosti, ili pogodno, da pati od niskog rasta, pretilosti, infekcije ili dijabetesa, stanja akromegalije ili gigantizma, koja bi se mogla povezati s laktogenim, dijabetogenim, lipolitičkim i proteinskim anaboličkim učincima, stanja povezanih sa zadržavanjem natrija i vode; metaboličkih sindroma; poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

U PCR, broj molekula od amplificirane ciljne DNA povećava se s faktorom koji se približava dva, sa svakim ciklusom te reakcije, dok neki reagens ne postane ograničavajući. Otada dalje, ova brzina amplifikacije počinje se sve više smanjivati, dok više nema povećanja amplificiranog cilja između ciklusa. Ako se prikaže grafikon u kojem je broj ciklusa na X osi, a logaritam koncentracije amplificirane ciljne DNA je na Y osi, oblikuje se krivulja karakterističnog oblika povezivanjem unesenih točaka. Počev s prvim ciklusom, nagib ove krivulje je pozitivan i konstantan. Za njega se kaže, da je linearni dio ove krivulje. Nakon što neki reagens postane ograničavajući, nagib krivulje počinje se smanjivati i konačno postaje nula. U toj točki koncentracija amplificirane ciljne DNA postaje asimptotska za neku fiksnu vrijednost. Za ovo se kaže da je ravni dio ove krivulje.

Koncentracija ove ciljne DNA u linearnom dijelu PCR amplifikacije je direktno proporcionalna početnoj koncentraciji ovog cilja prije nego je reakcija započela. Određivanjem koncentacije amplificiranih produkata ciljne DNA u PCR reakcijama koje su završile isti broj ciklusa i koje su u svojim linearnim područjima, moguće je odrediti relativne koncentracije specifične ciljne sekvence u originalnoj DNA smjesi. Ako ove DNA smjese jesu cDNA molekule sintetizirane od RNA molekula izoliranih iz raznih tkiva ili stanica, relativne abundancije ove specifične mRNA iz koje je bila potekla ta ciljna sekvenca, mogu biti determinirane za ova odgovarajuća tkiva ili stanice. Ova direktna proporcionalnost između koncentracije ovih PCR produkata i relativne mRNA abundancije je vjerna samo u linearnom području PCR reakcije.

Finalna koncentracija ciljne DNA u ravnom dijelu krivulje se određuje pomoću raspoloživosti reagenasa u toj reakcijskoj smjesi i neovisna je od originalne koncentracije ciljne DNA. Stoga, prvi uvjet koji se mora zadovoljiti prije nego što se relativne abundancije nekih mRNA vrsta mogu determinirati s RT-PCR za skupljanje RNA populacija jest, da koncentracije ovih amplificiranih PCR produkata moraju biti uzorkovane kada se te PCR reakcije nalaze u linearnom dijelu svojih krivulja.

Drugi uvjet koji se mora zadovoljiti za RT-PCR eksperiment da bi se uspješno odredilo relativne abundancije određenih mRNA vrsti jest, da relativne koncentracije od ovih amplifikabilnih cDNA moraju biti normalizirane prema nekom nezavisnom standardu. Svrha RT-PCR eksperimenta je determiniranje ove abundancije posebne mRNA vrste u odnosu na prosječnu abundanciju svih mRNA vrsta u nekom uzorku. U dolje opisanim eksperimentima, mRNA molekule za GHRfl mogu se koristiti kao standardi prema kojima se uspoređuje relativna abundancija od GHRd3 mRNA molekula.

Većina protokola za kompetitivni PCR koristi interne PCR standarde koji su približno toliko abundantni koliko i taj cilj. Ove strategije su učinkovite, ako se produkti PCR amplifikacija uzorkuju tijekom njihovih linearnih faza. Ako se ovi produkti uzorkuju kada se ove reakcije približavaju ravnoj fazi, tada manje abundantni produkt postaje relativno previše reprezentiran. Usporedbe relativnih abundancija učinjene za mnogo raznih RNA uzoraka, kao u slučaju kada se ispituju RNA uzorci za diferencijalnu ekspresiju, postaju iskrivljenim na takav način da se razlike u relativnim abundancijama RNA molekula čine manjima nego što one u stvari jesu. To nije značajan problem, ako je taj interni standard mnogo više abundantan nego taj cilj. Ako je interni standard više abundantan nego cilj, tada se direktne linearne usporedbe mogu praviti između RNA uzoraka.

Gornja diskusija opisuje teoretska razmatranja za RT-PCR test za materijale kliničkoga porijekla. Problemi inherentni u kliničkim uzorcima jesu, da su oni različite količine (što čini normalizaciju problematičnom), i da su oni raznolike kvalitete (što čini potrebnom ko-amplifikaciju pouzdane interne kontrole, pogodno veće veličine nego što je cilj).

Oba ova problema se prevladavaju, ako se RT-PCR provodi kao relativna kvantitativna RT-PCR s internim standardom, u kojem je interni standard amplifikabilni cDNA fragment, koji je veći od ciljnog cDNA fragmenta i u kojem je abundancija mRNA, koja kodira taj interni standard, grubo 5-100 puta viša od mRNA koja kodira taj cilj. Ovakav test mjeri relativnu abundanciju, a ne apsolutnu abundanciju od odnosne mRNA vrste.

Druge studije mogu se provoditi koristeći konvencionalniji relativni kvantitativni RT-PCR test s protokolom za eksterni standard. Ovakvi testovi uzorkuju PCR produkte u linearnom dijelu njihovih amplifikacijskih krivulja. Broj PCR ciklusa koji je optimalan za uzorkovanje mora biti empirijski određen za svaki ciljni cDNA fragment. Dodatno, produkti reverzne transkriptaze od svake RNA populacije, izolirane iz različitih tkivnih uzoraka, moraju biti pažljivo normalizirani na jednake koncentracije amplifikabilnih cDNA molekula. Ovo razmatranje je vrlo važno budući da test mjeri apsolutnu mRNA abundanciju. Apsolutna mRNA abundancija može se koristiti kao mjera diferencijalne ekspresije gena samo u normaliziranim uzorcima. Dok su empirijska determinacija linearnog područja amplifikacijske krivulje i normalizacija cDNA preparacija zamorni i vremenski zahtjevni procesi, rezultirajući RT-PCR testovi mogu biti superiorni onima dobivenim od testa relativnog kvantitativnog RT-PCR s internim standardom.

Jedan razlog za tu prednost jest, da bez ovakvog internog standarda/kompetitora, svi ovi reagensi mogu biti konvertitani u jedan jedini PCR produkt u linearnom području amplifikacijske krivulje, tako povećavajući osjetljivost testa. Drugi razlog jest, da sa samo jednim PCR produktom, pokazivanje toga produkta na elektroforetskom gelu ili drugoj metodi prikazivanja postaje manje složeno, ima manje pozadine i lakše je za interpretiranje.

Čip (Chip) tehnologije

Specifično zamišljene od strane ovih izumitelja, su na-čipu zasnovane DNA tehnologije (chip-based DNA technologies) kao štu one opisane od Hacia et al., ((1996) Nature Genetics, 14: 441-447) i Shoemaker et al., ((1996) Nature Genetics 14: 450-456). Ukratko, ove tehnike uključuju kvantitativne metode za analiziranje velikog broja gena brzo i točno. Označivanjem gena (tagging genes) s oligonukleotidima ili korištenjem fiksiranih rasporeda (arrays) proba, može se upotrebiti čip tehnologiju da odvoji ciljne molekule kao rasporede visoke gustoće i pretraži ove molekule na temelju hibridizacije. Vidi također Pease et al, ((1994) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 91: 5022-5026); Fodor et al., ((1991) Science, 251: 767-773).

Metode za detektiranje GHRd3 ili GHRfl proteina

Antitijela mogu biti korištena u karakteriziranju GHRd3 i/ili GHRfl sadržaja zdravih i bolesnih tkiva pomoću tehnika kao što su ELISA i Western bloting. Metode za pribavljanje GHRd3 i GHRfl polipeptida se dalje opisuju ovdje i mogu se izvoditi koristeći poznate metode. Slično, metode za pripremanje antitijela sposobnih za selektivno vezivanje GHRd3 i GHRfl izoformi su dalje ovdje opisane.

U jednom primjeru razmatra se, da GHR antitijela uključujući GHRd3, GHRfl i GHR antitijela koja se ne razlikuju između GHRd3 i GHRfl, mogu biti korištena u ELISA testu. Na primjer, anti-GHR antitijela se imobiliziraju na odabranu površinu, pogodno na površinu koja pokazuje afinitet za proteine kao što su bunarići polistirenske mikrotitarske ploče. Nakon ispiranja, da se ukloni nepotpuno adsorbirani materijal, poželjno je vezati ili presvući tu ploču za testiranje s nespecifičnim proteinom za koji se zna da je antigenički neutralan obzirom na antiserume ovog testa, kao što je goveđi serumski albumin (bovine serum albumin, BSA), kazein ili otopine od mlijeka u prahu. Ovo omogućava blokiranje nespecifičnih adsorpcijskih mjesta na imobilizirajuću površinu i tako smanjuje pozadinu uzrokovanu s ne-specifičnim vezivanjem antigena na tu površinu.

Nakon vezanja antitijela na bunarić, oblaganje ne-reaktivnim materijalom da se smanji pozadina, i ispiranje da se ukloni nepovezani materijal, ova imobilizirana površina se dovodi u kontakt s uzorkom kojeg treba testirati na način pogodan za formiranje imunog kompleksa (antigen/antitijelo).

Nakon formiranja specifičnih imunokompleksa između test uzorka i povezanog antitijela, i naknadnog ispiranja, pojavljivanje i formiranje jednake količine imunokompleksa može biti određeno podvrgavanjem istoga drugome antitijelu koje ima specifičnost za GHR, koje se razlikuje od prvog antitijela. Odgovarajući uvjeti pogodno uključuju razrjeđivanje uzorka razrjeđivačima kao što je BSA, goveđi gama globulin (bovine gamma globulin, BGG) i fosfatom puferirana fiziološka otopina (phosphate buffered saline, PBS)/Tween. Ovi dodani agensi također teže da pomognu u smanjenju nespecifične pozadine. Naneseni antiserumi se zatim ostavljaju na inkubiranju tijekom od oko 2 do oko 4 sata, pri temperaturama pogodno od oko 25 ºC do oko 27 ºC. Nakon inkubacije, antiserumom-kontaktirana površina se ispire tako da se ukloni non-imunokompleksirani materijal. Preferirana procedura ispiranja uključuje pranje otopinom kao što je PBS/Tween ili boratni pufer.

Za sredstvo detekcije, ovo drugo antitijelo će pogodno imati pridruženi enzim, koji će potaknuti stvaranje boje nakon inkubacije s odgovarajućim kromogenim substratom. Tako, na primjer, netko će poželjeti da kontaktira i inkubira ovu, sa sekundarnim antitijelom vezanu površinu s ureazom ili s peroksidazom-konjugirani anti-humani IgG tijekom vremenskog perioda i pod okolnostima koje favoriziraju razvitak stvaranja imunokompleksa (na pr. inkubacija tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi u otopini koja sadrži PBS, kao što je PBS/Tween).

Nakon inkubacije sa sekundarnim, enzimom-označenim antitijelom, i naknadno iza ispiranja da se ukloni nevezani materijal, kvantificira se količina biljega inkubacijom s kromogenim substratom, kao što je urea i bromkrezol purpurno ili 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolin)-6-sulfonska kiselina (ABTS) i H202, u slučaju peroksidaze kao enzimskog biljega. Kvantificiranje se tada postiže mjerenjem stupnja stvaranja boje, na pr., koristeći spektrofotometar za vidljivi spektar.

Prethodni format može biti promijenjen najprije vezanjem tog uzorka na ploču za testiranje. Tada se primarno antitijelo inkubira s tom pločom za testiranje, iza čega slijedi detekcija vezanog primarnog antitijela, koristeći obilježeno sekundarno antitijelo sa specifičnosti za to primarno antitijelo.

Ovi koraci raznih drugih korisnih imunodetekcijskih metoda opisani su u znanstvenoj literaturi, kao na pr. Nakamura et al., In: Handbook of Experimental Immumology (4th Ed.), Weir, E., Herzenberg, L. A., Blackwell, C., Herzenberg, L. (eds). Vol. 1. Chapter 27, Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1987; inkorporirano ovdje referencom). Imunoeseji, u njihovom najjednostavnijem i direktnom smislu, su testovi vezivanja. Neki preferirani imunoeseji su razni tipovi radioimunoeseja (radioimmunoassays, RIA) i test hvatanja imunozrnca (immunobead capture assay). Imunohistokemijska detekcija koristeći tkivne presjeke također je naročito korisna. Međutim, lako će se procijeniti da detekcija nije limitirana na takve tehnike; a u vezi s predmetnim izumom mogu se također korisiti Western bloting, dot bloting, FACS analize, i slične.

U preferiranom primjeru, GHRd3 razine mogu se detektirati koristeći GHRd3-specifično antitijelo korištenjem gore opisanih metoda. U drugim metodama, ukupna količina GHR je određena bez diferenciranja između GHRd3 i GHRfl, a količina GHRfl je određena. Razlika u količini nediferenciranog GHR i GHRfl pokazuje količinu prisutnog GHRd3.

Pogodno takve metode određuju GHBP (na pr. ekstracelularni dio od GHRd3 ili GHRfl) u cirkulaciji. Preferirani primjeri procedura dozvoljavaju detekciju nediferenciranog GHR (na pr. Za deduciranje GHRd3 od totalnog nediferenciranog GHR uspoređeno s GHRfl), detekciju GHRd3 i/ili detekciju GHRfl. Takve procedure uključuju ELISA test, ligandom-posredovani imunofunkcionalni test (immunofunctional assay, LIFA) i radioimuno test (radioimunoassay, RIA).

LIFA za utvrđivanje nediferenciranog (t.j. GHRd3 ili GHRfl) GHR-a može biti provedena prema metodama Pflaum et al., (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101 (Suppl. 1): 44) i Kratzsch et al. ((2001) Clin. Endocrinol. 54: 61-68. Ukratko, u jednom primjeru, nediferencirani GHR se određuje koristeći monoklonalno anti-rGHBP antitijelo za presvlačenje mikrotitarskih ploča. Serumski uzorak ili glikozilirani rGHBP standardi se inkubiraju zajedno s 10 ng/bunariću hGH i monoklonalnim antitijelom usmjerenim protiv hGH kao biotinilirani trag. Signal je amplificiran s europij-obilježenim streptavidin sistemom i izmjeren koristeći fluorometar. U drugom primjeru, kompetitivni radioimunoesej (RIA) je proveden da se odredi nediferencirani GHBP, koristeći anti-rhGHBP antitijelo, rhGHBP standarde i 125I-rhGHBP kao obilježeni antigen kako je opisano u Kratsch et al., ((1995) Eur. J. Endocrinol. 132: 306-312).

U drugom primjeru opisanom u Kratzsch et al. ((2001) Clin. Endocrinol. 54: 61-68), nediferencirani GHBP je detektiran presvlačenjem mikrotitarske ploče s 100 μl monoklonskog antitijela 10B8 koje veže GHBP izvan hGH veznog mjesta (Rowlinson et al., (1999), u 50 mmol/1 natrij fosfatnom puferu, pH 9,6. Nakon koraka ispiranja, 25 μl uzorka ili standarda i 50 ng biotinom-obilježenog anti-GHGBP mAb 5C6 (koji veže GHBP unutar ovog hGH veznog mjesta (Rowlinson et al. (1999)) u 75 μl test puferu (50 mM Tris-(hidroksimetil)-aminometan, 150 mM NaCl, 0,05% NaN3, 0,01% Tween 40, 0,5% BSA, 0,05% goveđi gama-globulin, 20 μmol/l dietilentriaminpenta octena kiselina) se dodaju i inkubiraju preko noći. Količina GHRfl se zatim određuje koristeći antitijelo specifično za ekson 3-sadržavajuću fl formu od GHBP. Ukratko, mAb 10B8 je imobiliziran na mikrotitarskim pločama kao u slučaju nediferenciranog GHBP. Nakon koraka ispiranja, 25 μl uzorka ili standarda i 75 μl kunićjeg poliklonskog antitijela protiv GHRd3 peptida opisanog u Kratzsch et al. (2001) (razrijeđenog 1: 10.000) su dodani i inkubirani preko noći. 20 ng biotiniliranog mišjeg antikunićjeg IgG se dodaje u svaki bunarić i inkubira 2 sata iza čega slijedi ponovljeno ispiranje. Signali se amplificiraju s europij-obilježenim streptavidin sistemom i mjere koristeći fluorometar. Rekombinantni ne-glikozilirani hGHBP, razrijeđen u ovčjem serumu, se koristi kao standard.

Antitijela specifična za GHRd3 za upotrebu u skladu s predmetnim izumom mogu se dobiti koristeći poznate metode. Izolirani GHRd3 protein, ili jedan njegov dio ili njegov fragment, se koristiti kao imunogen da generira antitijela koja vežu GHRd3 koristeći standardne tehnike za pripravu poliklonskih i monoklonskih antitijela. Može se koristiti GHRd3 protein ili, alternativno, izum daje fragmente antigenog peptida od GHRd3 za upotrebu kao imunogena.

GHRd3 polipeptidi mogu biti pripravljeni koristeći poznate načine, bilo purifikacijom iz biološkog uzorka pribavljenog od nekog pojedinca ili pogodnije kao rekombinantni polipeptidi. GHRfl aminokiselinska sekvenca je pokazana u SEQ ID NOS: 2 i 3, od koje se GHRd3 razlikuje delecijom 22 aminokiselina kodiranih eksonom 3. Ovaj antigeni peptid od GHRd3 pogodno uključuje barem 8 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinske sekvence pokazane u SEQ ID NOS: 2 i 3, u kojem je barem jedna aminokiselina izvan rečenih, eksonom 3 kodiranih aminokiselinskih ostataka. Rečeni antigeni peptid obuhvaća epitop od GHRd3, tako da antitijelo razvijeno protiv tog peptida stvara specifični imuni kompleks s GHRd3. Pogodno, to antitijelo veže se selektivno ili preferencijalno uz GHRd3, a u biti se ne veže s GHRfl. Pogodno, antigeni peptid sadrži barem 10 aminokiselinskih ostataka, još pogodnije barem 15 aminokiselinskih ostataka, i dapače još pogodnije barem 20 aminokiselinskih ostataka, i još najpogodnije barem 30 aminokiselinskih ostataka.

Preferirani epitopi obuhvaćeni antigenim peptidom su regije od GHRd3 koje su smještene na površini tog proteina, t.j. hidrofilne regije.

GHRd3 imunogen tipično se koristi za pripravu antitijela imunizacijom nekog pogodnog subjekta, (na pr. kunića, koze, miša ili drugog sisavca) tim imunogenom. Podesna imunogena preparacija može sadržavati na primjer, rekombinantno izražen GHRd3 protein ili kemijski sintetizirani GHRd3 polipeptid. Ova preparacija može dalje obuhvaćati neki adjuvans, kao Freundov potpuni ili nepotpuni adjuvans, ili sličan imunostimulativni agens. Imunizacija pogodnog subjekta imunogenom GHRd3 preparacijom inducira odgovor poliklonskog anti-GHRd3 antitijela.

Prema tome, drugi aspekt izuma odnosi se na anti-GHRd3 antitijela. Izraz "antitijelo" kako se ovdje koristi, odnosi se na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne dijelove imunoglobulinskih molekula, t.j. molekula koje imaju antigensko vezno mjesto koje specifično veže (imunoreagira sa) neki antigen, kao što je GHRd3. Primjeri imunološki aktivnih dijelova imunoglobulinskih molekula uključuju F(ab) i F(ab')2 fragmente koji mogu biti stvoreni tretiranjem tog antitijela s enzimom kao što je pepsin. Izum pruža poliklonska i monoklonska antitijela koja vežu GHRd3. Izraz "monoklonsko antitijelo" ili "sastav monoklonskog antitijela", kako se ovdje koristi, odnosi se na populaciju molekula antitijela koje sadrže samo jednu vrstu nekog antigen-veznog mjesta sposobnog za imunoreagiranje s naročitim epitopom GHRd3. Sastav monoklonskog antitijela tako tipično pokazuje jedan jedini afinitet vezivanja za neki naročiti GHRd3 protein s kojim on imunoreagira.

Izum se tiče sastava antitijela, bilo poliklonskih ili monoklonskih, sposobnih da selektivno vežu, ili da se selektivno vežu na polipeptid s nekim epitopom koji sadrži raspon od barem 6 susjednih aminokiselina koje se dotiču, pogodno barem 8 do 10 aminokiselina, pogodnije barem 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ili 100 aminokiselina od SEQ ID NO: 2 ili 3, s time da rečeni susjedni raspon pogodno uključuje barem jednu aminokiselinu izvan rečenoga 22-aminokiselinskog raspona kodiranog s eksonom 3 od tog GHR gena.

Poliklonska anti-GHRd3 antitijela mogu biti pripravljena kako je prethodno opisano imuniziranjem nekog pogodnog subjekta s GHRd3 imunogenom. Titar anti-GHRd3 antitijela u tom imuniziranom subjektu može se pratiti tijekom vremena standardnim tehnikama, kao s enzimom-povezanim imunosorpcijskim testom (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) koristeći imobilizirani GHRd3. Ako se želi, molekule antitijela usmjerene protiv GHRd3 mogu biti izolirane iz sisavca (t.j. iz krvi) i dalje pročišćene dobro poznatim tehnikama, kao protein A kromatografijom da se dobije IgG frakcija. U neko odgovarajuće vrijeme nakon imunizacije, t.j. kada su titri anti-GHRd3 antitijela najviši, stanice koje proizvode antitijela mogu biti dobivene iz subjekta i korištene za pripravu monoklonskih antitijela standardnim tehnikama, kao što je tehnika hibridoma originalno opisana od Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495-497) (vidi također, Brown et al., (1981) J. Immunol. 127: 539-546; Brown et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-4983; Yeh et al., (1976) PNAS 76: 2927-31; i Yeh et al., (1982) Int. J. Cancer 29: 269-275), recentnija humana B stanična hibridoma tehnika (Kozbor et al., (1983) Immunol Today 4: 72), EBV-hibridoma tehnika (Cole et al., (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) ili trioma tehnike. Ova tehnologija za proizvodnju monoklonskih antititijela hibridoma dobro je poznata (vidi općenito R. H. Kenneth, u Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402; M. L. Gefter et al., (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-236). Ukratko, imortalizirana stanična linija (tipično jednog mieloma) se fuzionira s limfocitima (tipično splenocitima) iz sisavca imuniziranog s GHRd3 imunogenom, kako je gore opisano, i supernatanti kulture rezultirajućih hibridoma stanica su pretraženi radi identificiranja hibridoma koji producira monoklonsko antitijelo koje veže GHRd3.

Bilo koji od mnogih dobro poznatih protokola korištenih za fuzioniranje limfocita i imortaliziranih staničnih linija može biti primijenjen sa svrhom da generira anti-GHRd3 monoklonsko antitijelo (vidi na pr. G. Galfre et al., (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al., Somatic Cell Genet., citirano gore; Lerner, Yale J. Biol. Med, citirano gore; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citirano gore;). Štoviše, stručna osoba iz odgovarajućeg područja procijenit će da postoje mnoge varijacije takvih metoda koje bi također bile korisne. Tipično, imortalizirana stanična linija (t.j. mieloma stanična linija) je dobivena od iste vrste sisavca kao i ti limfociti. Na pr. mišji hibridomi mogu biti učinjeni fuzioniranjem limfocita iz miša imuniziranog s imunogenom preparacijom predmetnoga izuma, s imortaliziranom mišjom staničnom linijom. Pogodne imortalizirane stanične linije su mišje mieloma stanične linije koje su osjetljive na medij kulture, koji ima hipoksantin, aminopterin i timidin ("HAT medij"). Bilo koji broj od nekoliko mieloma staničnih linija može biti korištena kao fuzijski partner prema standardnim tehnikama, na pr. P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 ili Sp2/O-Agl4 mieloma linije. Ove mieloma-linije su raspoložive od ATCC. Tipično, HAT-osjetljive mišje mieloma stanice se fuzioniraju s mišjim splenocitama koristeći polietilenglikol ("PEG'). Hibridoma stanice koje rezultiraju iz te fuzije se zatim selektiraju koristeći HAT medij, koji ubija nefuzionirane i neproduktivno fuzionirane mieloma stanice (nefuzionirane splenocite umiru nakon nekoliko dana jer one nisu transformirane). Hibridoma stanice koje proizvode monoklonsko antitijelo izuma se detektiraju probiranjem među supernatantima hibridoma kultura za antitijela koja vežu GHRd3, t.j. koristeći standardni ELISA test.

Alternativno pripremanju hibridoma koji izlučuju monoklonska antitijela, monoklonsko anti-GHRd3 antitijelo može biti identificirano i izolirano probirom rekombinantne kombinatorijske imunoglobulinske knjižnice (recombinant combinatorial immunoglobulin library) (na pr. pokazne knjižnice antitijela faga, (antibody phage display library)) s GHRd3, da se time izoliraju članovi imunoglobulinske knjižnice koji vežu GHRd3. Kompleti za generiranje i pretraživanje fagnih pokaznih knjižnica su komercijalno dostupni (na pr., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAP.TM. Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Dodatno, primjeri metoda i reagensa naročito pogodnih za korištenje u stvaranju i probiranju pokaznih knjižnica anitijela mogu se naći u na pr. Ladner et al. U.S. pat. br. 5,223,409; Kang et al., PCT International Publication br. WO 92/18619; Dower et al., PCT International Publication br. WO 91/17271; Winter et al., PCT International Publication WO 92/20791; Markland et al., PCT International Publication br. WO 92/15679; Breitling et al., PCT International Publication WO 93/01288; McCafferty et al., PCT International Publication br. WO 92/01047; Garrard et al., PCT International Publication br. WO 92/09690; Ladner et al., PCT International Publication br. WO 90/02809; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al., (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al., (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al., (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al., (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al., (1991) PNAS 88:7978-7982; i McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554.

Anti-GHRd3 antitijelo (na pr. monoklonsko antitijelo) može se koristiti za izolaciju GHRd3 standardnim tehnikama, kao što je afinitetna kromatografija ili imunoprecipitacija. Anti-GHRd3 antitijelo može olakšati pročišćavanje prirodnog GHRd3 iz stanica i od rekombinantno proizvedenog GHRd3 eksprimiranog u stanicama domaćina. Štoviše, anti-GHRd3 antitijelo može se koristiti za detekciju GHRd3 proteina (na pr. u staničnom lizatu ili staničnom supernatantu) radi evaluiranja abundancije i obrasca ekspresije ovog GHRd3 proteina. Anti-GHRd3 antitijela mogu se koristiti dijagnostički za monitoring proteinskih razina u tkivu kao dio kliničkog ispitivanja, na pr. da se odredi učinkovitost nekog datog režima liječenja. Detekcija može biti olakšana kopuliranjem (t.j. fizičkim vezivanjem) tog antitijela na neku detektabilnu supstancu. Primjeri detektabilnih supstanci uključuju razne enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale i radioaktivne materijale. Primjeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu hrena, alkalnu fosfatazu, galaktozidazu, ili acetilkolinesterazu; primjeri kompleksa odgovarajućih prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primjeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocianat, rodamin, diklorotriazinilamin fluorescein, danzil klorid ili fikoeritrin; primjer nekog luminiscentnog materijala uključuje luminol; primjeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin (aequorin), a primjeri prikladnog radioaktivnog materijala uključuju 125I, 131I, 35S ili 3H.

U preferiranom primjeru, dobiva se gotovo čisti GHRd3 protein ili polipeptid. Koncentracija proteina u finalnoj preparaciji podešava se, na primjer, koncentriranjem na Amicon uređaju za filtriranje, do razine od nekoliko mikrograma po ml. Monoklonska ili poliklonska antitijela prema proteinu mogu zatim biti pripravljena kako slijedi: Produkcija monoklonskih antitijela s hibridoma fuzijom monoklonskih antitijela na epitope u GHRd3 ili jednom njegovom dijelu, mogu biti pripravljena od mišjih hibridoma prema klasičnoj metodi od Kohler i Milstein (Nature, 256: 495, 1975) ili od nje izvedenih metoda (vidi Harlow i Lane: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53-242, 1988).

Ukratko, miš se ponovljeno inokulira s nekoliko mikrograma GHRd3 ili njegovog dijela kroz razdoblje od nekoliko tjedana. Taj miš se zatim žrtvuje i stanice koje proizvode antitijela izoliraju se iz slezene. Stanice slezene se fuzioniraju pomoću polietilenglikola s mišjim mieloma stanicama, i prekobrojne nefuzionirane stanice se razore rastom sistema na selektivnim medijima koji imaju aminopterin (HAT mediji). Uspješno fuzionirane stanice se razrjeđuju i alikvoti ovog razrjeđenja se stavljaju u bunariće mikrotitarske ploče, gdje se nastavlja rast kulture. Klonovi koji proizvode antitijela se identificiraju detekcijom antitijela u supernatantnoj tekućini bunarića imunoesej procedurama, kao što je ELISA, kako je originalno opisano od Engvall, E., Meth. Enzymol. 70: 419 (1980). Odabrani pozitivni klonovi mogu se ekspandirati i njihov produkt monoklonskih antitijela prikupiti za upotrebu. Detaljne procedure za proizvodnju monoklonskih antitijela opisane su u Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New York. Sekcija 21-2.

Sastavi antitijela predmetnog izuma naći će veliku primjenu u imunoblot ili Western blot analizi. Ova antitijela mogu se koristiti kao visoko-afinitetni primarni reagensi za identifikaciju proteina imobiliziranih na kruti oslonački matriks, kao što je nitroceluloza, najlon ili njihove kombinacije. U vezi s imunoprecipitacijom, iza koje slijedi gel elektroforeza, one se mogu koristiti kao reagens jedinog koraka za korištenje u detektiranju antigena protiv kojih sekundarni reagensi korišteni u detekciji tog antigena uzrokuju štetnu pozadinu. Imunološki-zasnovane detekcijske metode za korištenje u sprezi s Western blotingom uključuju enzimatski-označena, radio-obilježena, ili fluorescentno označena sekundarna antitijela protiv toksinskog dijela, i smatra se da su naročito korisne u tom pogledu. U.S. patenti koji se tiču korištenja takvih biljega uključuju U.S. pat. br. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 i 4,366,241, svi inkorporirani ovdje referencom. Naravno, moguće je naći dodatne prednosti kroz korištenje sekundarnog vezujućeg liganda kao što je sekundarno antitijelo ili vezni aranžman s biotin/avidinskim ligandom, kako je poznato u struci.

Davanje lijeka u GH sastavima

GH koji se koristi u skladu s izumom može biti u nativnoj sekvenci ili u varijantnom obliku, i iz bilo kojeg izvora, bilo prirodnoga, sintetičkoga ili rekombinantnog. Primjeri uključuju humani hormon rasta (human growth hormone, hGH), koji je prirodan ili rekombinantni GH s ljudskom nativnom sekvencom (GENOTROPINTM, somatotropin ili somatropin), i rekombinantni hormon rasta (recombinant growth hormone, rGH), koji se odnosi na bilo koju GH ili GH varijantu produciranu pomoću rekombinantne DNA tehnologije, uključivo somatrem, somatotropin i somatropin. Preferirana u ovome za ljudsku uporabu je rekombinantna humana nativna-sekvenca, zreli GH sa ili bez metionina na svojem N-terminusu. Najviše preferiran je GENOTROPINTM (Pharmacia, U.S.A.) koji je rekombinantni humani GH polipeptid. Također je preferiran metionil humani hormon rasta (methionyl human growth hormone, met-hGH) produciran u E. coli, na pr. procesom opisanim u U.S. pat. br. 4,755,465 izdan 5. srpnja 1988 i Goeddel et al., Nature, 282: 544 (1979). Met-hGH, prodavan kao PROTROPINTM (Genentech, Inc. U.S.A.), je identičan prirodnom polipeptidu, s izuzetkom prisustva N-terminalnog metioninskog ostatka. Drugi primjer je rekombinantni hGH prodavan kao NUTROPINTM (Genentech, Inc., U.S.A.). Ovaj posljednji hGH nema tog metioninskog ostatka i ima aminokiselinsku sekvencu identičnu onoj u prirodnom hormonu. Vidi Gray et al., Biotechnology 2: 161 (1984). Drugi GH primjer je hGH varijanta koja je placentalna forma od GH s čistom somatogeničkom i bez laktogeničke aktivnosti kako je opisano u U.S. pat. br. 4,670,393. Također su uključene GH varijante, na primjer takve kao one opisane u WO 90/04788 i WO 92/09690.

Drugi primjeri uključuju GH sastave koji djeluju kao GHR antagonisti, kao što je pegvisomant (SOMAVERTTM, Pharmacia, U.S.A.), koji se može upotrijebiti za liječenje akromegalije.

GH se može davati direktno subjektu putem bilo koje pogodne tehnike, uključivo parenteralno, intranazalno, intrapulmonalno, oralno, ili apsorpcijom kroz kožu. Oni se mogu davati lokalno ili sistemski. Primjeri parenteralnog davanja uključuju supkutano, intramuskularno, intravenozno, intra-arterijsko i intraperitonealno davanje. Pogodno, oni se daju putem dnevne supkutane injekcije.

GH koji se koristi u ovoj terapiji biti će formuliran i doziran na način konzistentan s dobrom medicinskom praksom, uzimajući u obzir kliničko stanje pojedinačnog subjekta

(naročito nuspojave od liječenja sa samim GH), mjesto davanja GH sastava, metodu davanja, raspored davanja lijeka, i drugih faktora poznatih praktičarima. "Učinkovite količine“ od svake komponente za ove svrhe su stoga determinirane takvim razmatranjima i jesu one količine koje povećavaju brzinu rasta ovih subjekata.

Za GH se pogodno koristi, doza veća od oko 0,2 mg/kg/tjedan, još pogodnije veća od oko 0,25 mg/kg/tjedan, i još više pogodnije veća ili jednaka od oko 0,3 mg/kg/tjedan. U jednoj izvedbi, ta doza za GH kreće se u rasponu od oko 0,3 do 1,0 mg/kg/tjedan i u drugoj izvedbi, 0,35 do 1,0 mg/kg/tjedan.

Pogodno, GH se daje jednom na dan supkutano. U preferiranim aspektima, doza GH je između oko 0,001 i 0,2 mg/kg/dan. Ipak, još pogodnije, doza GH je između oko 0,010 i 0,10 mg/kg/dan.

Kako je diskutirano, za subjekte homozigotne ili heterozigotne za taj GHRd3 alel se očekuje da imaju veći pozitivni odgovor na GH liječenje nego subjekti homozigotni za GHRfl alel. U preferiranim aspektima, jedna doza dana subjektima homozigotnim za taj GHRfl alel bit će veća nego ona doza dana kao lijek nekome subjektu koji je homozigot ili heterozigot za GHRd3 alel.

GH se pogodno daje kontinuirano ili ne-kontinuirano, kao u određeno vrijeme (na pr. jednom dnevno) u obliku injekcije određene doze, kada će porasti GH koncentracija u plazmi za vrijeme injektiranja, i zatim pasti GH koncentracijia u plazmi do vremena slijedećeg injektiranja. Druga ne-kontinuirana metoda davanja lijeka rezultira iz korištenja PLGA mikrosfera i mnogih raspoloživih implantacijskih sredstava koja daju diskontinuirano oslobađanje aktivnog sastojka, kao što je početna provala, i zatim usporavanje prije oslobađanja aktivnog sastojka. Vidi na pr. U.S. pat. br. 4,767,628.

GH se može također davati tako da ima kontinuirano prisustvo u krvi koje se održava tokom trajanja davanja GH. To se najpogodnije ostvaruje pomoću kontinuirane infuzije putem na pr. mini-pumpe kao što je osmotska mini-pumpa. Alternativno, to se ispravno ostvaruje upotrebom čestih injektiranja GH (t.j. više nego jednom dnevno, na primjer, dva puta ili tri puta dnevno).

U još jednoj izvedbi, GH se može davati koristeći GH formulacije dugog djelovanja, koje bilo da odlažu klirens (clearance) GH iz krvi ili uzrokuju polagano oslobađanje GH iz, na pr. nekog mjesta injekctiranja. GH formulacija dugog djelovanja koja produžuje GH plazma klirens može biti u obliku GH kompleksiranog ili kovalentno konjugiranog (s reverzibilnim ili ireverzibilnim vezanjem) uz neku makromolekulu, kao što je jedan ili više njegovih veznih proteina (WO 92/08985) ili u vodi topivi polimer odabran od PEG i polipropilen glikol homopolimera i polioksietilen poliola, t.j. onih koji su topivi u vodi pri sobnoj temperaturi. Alternativno, taj GH može biti kompleksiran ili vezan uz polimer da se poveća njegov cirkulatorni poluvijek (circulatory half-life). Primjeri polietilen poliola i polioksietilen poliola korisnih za ovu svrhu uključuju polioksietilen glicerol, polietilen glikol, polioksietilen sorbitol, polioksietilen glukozu, ili slične. Glicerolska struktura polioksietilen glicerola je ista struktura koja se javlja, na primjer, u životinja i u ljudi, u mono-, di-, i trigliceridima.

Taj polimer ne treba imati neku određenu molekularnu masu, ali preferira se da molekularna masa bude između oko 3.500 i 100.000; pogodnije između 5.000 i 40.000. Pogodno, PEG homopolimer je nesupstituiran, ali on može također biti supstituiran na jednom kraju s alkilnom grupom. Pogodno, ta alkilna grupa je Cl-C4 alkilna grupa, a najpogodnije metilna grupa. Najpogodnije, polimer je nesupstituirani homopolimer od PEG, monometil-supstituirani homopolimer od PEG (mPEG), ili polioksietilen glicerol (POG) i ima molekularnu masu od oko 5.000 do 40.000.

GH je kovalentno vezan preko jednog ili više aminokiselinskih ostataka od GH uz terminalnu reaktivnu grupu na tom polimeru, što ovisi uglavnom o uvjetima reakcije, molekularnoj masi tog polimera, i t.d. Polimer s reaktivnom(im) grupom(ama) se ovdje označava kao aktivirani polimer. Reaktivna grupa selektivno reagira sa slobodnom amino ili drugim reaktivnim grupama na GH. Treba razumjeti međutim, da će tip i količina odabrane reaktivne grupe, kao i tip upotrebljenog polimera da se postignu optimalni rezultati, ovisiti o tom naročitom GH, upotrebljenom da se izbjegne da reaktivna grupa reagira s previše naročito aktivnih grupa na tom GH. Kako to možda neće biti moguće posve izbjeći, preporučuje se, da se koristi općenito od oko 0,1 do 1.000 molova, pogodnije 2 do 200 molova aktiviranog polimera po molu proteina, ovisno o koncentraciji proteina. Finalna količina aktiviranog polimera po molu proteina je balans za održavanje optimalne aktivnosti, dok u isto vrijeme optimizira ako je moguće, cirkulatorni poluvijek proteina.

Dok ovi aminokiselinski ostaci mogu biti bilo koja reaktivna aminokiselina na tom proteinu, kao što su jedan ili dva cisteina ili N-terminalna aminokiselinska grupa, pogodno reaktivna aminokiselina je lizin, koji je vezan uz reaktivnu grupu na aktiviranom polimeru preko svoje slobodne epsilon-aminogrupe, ili glutaminska ili aspartinska kiselina, koja je vezana na taj polimer putem amidne veze.

Kovalentna modifikacijska reakcija može se provesti s bilo kojom odgovarajućom metodom općenito korištenom za reagiranje biološki aktivnih materijala s inertnim polimerima, pogodno kod oko pH 5-9, pogodnije 7-9, ako ove reaktivne grupe na tom GH-u jesu lizinske grupe. Općenito, taj proces uključuje pripremu aktiviranog polimera (s barem jednom terminalnom hidroksilnom grupom), pripremu aktivnog supstrata iz tog polimera, i nakon toga reagiranje tog GH s aktivnim supstratom da se proizvede GH pogodan za formulaciju. Ova gornja modifikacijska reakcija može se provoditi pomoću nekoliko metoda, koje mogu uključivati jedan ili više koraka. Primjeri modificirajućih agensa koji se mogu koristiti za proizvodnju aktiviranog polimera u jednostepenoj reakciji uključuju klorid cijanurne kiseline (2,4,6-trikloro-S-triazin) i fluorid cijanurne kiseline.

U jednoj izvedbi, modifikacijska reakcija događa se u dva stepena u kojima polimer najprije reagira s kiselinskim anhidridom, kao što je anhidrid jantarne ili glutarne kiseline, da nastane karboksilna kiselina, i ta karboksilna kiselina zatim reagira sa spojem sposobnim za reagiranje s tom karboksilnom kiselinom da tvori aktivirani polimer s reaktivnom esterskom grupom koja je sposobna da reagira s GH. Primjeri za takve spojeve uključuju N-hidroksisukcinimid, 4-hidroksi-3-nitrobenzensulfonsku kiselinu, i slične, a pogodno se koriste N-hidroksisukcinimid ili 4-hidroksi-3-nitrobenzensulfonska kiselina. Na primjer, monometil supstituirani PEG može reagirati pri povišenim temperaturama, pogodno oko 100-110 ºC tokom četiri sata, s glutarnim anhidridom. Monometil PEG-glutarna kiselina tako proizvedene, zatim reagira s N-hidroksisukcinimidom u prisustvu karbodiimidnog reagensa, kao što je dicikloheksil ili izopropil karbodiimid da proizvede aktivirani polimer, metoksipolietilen glikolil-N-sukcinimidil glutarat, koji može zatim reagirati s GH. Ta metoda je detaljno opisana u Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984). U drugom primjeru, monometil supstitutuirani PEG može reagirati s glutarnim anhidridom iza čega slijedi reakcija s 4-hidroksi-3-nitrobenzen sulfonskom kiselinom (HNSA) u prisustvu dicikloheksil karbodiimida da se proizvede aktivirani polimer. HNSA je opisana u Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al., (eds.) (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1981), p. 97-100, i u Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) entitled „Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications.“

Specifične metode za proizvodnju GH konjugiranog sa PEG uključuju metode opisane u U.S. pat. br. 4,179,337 na PEG-GH i U.S. pat. br. 4,935,465, koja otkriva PEG reverzibilno, ali kovalentno vezan na GH.

GH se može također pogodno davati sistemima odgođenog oslobađanja. Primjeri za sastave s odgođenim oslobađanjema korisnih u ovome uključuju polupropusne polimerne matrice u formi oblikovanih artikala, na pr. filmova ili mikrokapsula. Matrice odgođenog oslobađanja uključuju polilaktide (U.S. pat br. 3,773,919, EP 58, 481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(2-hidroksietil metakrilat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D-(-)-3-hidroksimaslačnu kiselinu (EP 133,988), ili PLGA mikrosfere.

GH sastavi za odogođeno oslobađanje također uključuju liposomski obuhvaćeni GH. Liposomi koji sadrže GH pripravljaju se metodama poznatim per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Pat. Appln. 83-118008; U.S. pat. br. 4,485,045 i 4,544,545; i EP 102,324. Obično, liposomi su malog (oko 200-800 Angstrema) unilamelarnog tipa u kojima je sastav lipida veći od oko 30 mol. postotaka kolesterola, i taj odabrani omjer se podešava za optimalnu terapiju. Dodatno, biološki aktivna formulacija za odgođeno oslobađanje može biti učinjena od adukta toga GH kovalentno vezanog na aktivirani polisaharid kako je opisano u U.S. pat. br. 4,857,505. Dodatno, U.S. pat. br. 4,837,381 opisuje mikrosferni sastav od masti ili voska ili njihove smjese i GH za polagano oslobađanje.

U drugoj izvedbi, subjekti identificirani gore se također liječe učinkovitom količinom IGF-I. Kao opći prijedlog, ukupna farmaceutski učinkovita količina IGF-I davana parenteralno po dozi biti će u rasponu od oko 50 do 240 μg/kg/dan, pogodno 100 do 200 μg/kg/dan tjelesne mase subjekta, premda kako je opaženo gore, to će velikim dijelom biti predmetom terapeutske slobodne odluke. Također pogodno, IGF-I se daje jednom ili dva puta na dan supkutanim injektiranjem. U daljnjoj izvedbi, i IGF-I i GH mogu se davati subjektu, svaki u učinkovitim količinama, ili svaki u količinama koje su suboptimalne, ali kada se združe, postaju učinkovite. Pogodno se GH daje u količini od oko 0,001 do 0,2 mg/kg/dan ili pogodnije oko 0,01 do 0,1 mg/kg/dan. Pogodno davanje i IGF-I i GH je injektiranje koristeći, na pr. intravenozne i supkutane načine. Još pogodnije, ovo davanje lijeka je supkutanim injektiranjem i za IGHF-I i GH, najpogodnije dnevnim injekcijama.

Primjećujemo se da bi praktičari koji osmišljavaju doze i od IGF-I i od GH trebali uzeti u obzir poznate nuspojave liječenja ovim hormonima. Za GH, nuspojave uključuju zadržavanje natrija i ekspanziju ekstracelularnog volumena (Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 (1959); Biglieri et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 21: 361-370 (1961), kao i hiperinsulinemiju i hiperglicemiju. Glavna očita nuspojava od IGF-I je hipoglikemija (Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989). Zaista, ova kombinacija od IGF-I i GH može voditi do smanjenja neželjenih nuspojava od oba agensa (na pr., hipoglicernija za IGF-I i hiperinsulinizam za GH) i do obnove razina GH u krvi, sekrecija kojega je suprimirana s IGF-I.

Za parenteralno davanje, u jednoj izvedbi, GH se formulira općenito miješanjem GH poželjnog stupnja čistoće, u jediničnoj dozi injektabilne forme (otopina, suspenzija, ili emulzija), s farmaceutski prihvatljivim nosiocem, t.j. koji nije toksičan za primaoce u tim dozama i koncentracijama koje se koriste i koja je kompatibilna s drugim sastavima ove formulacije. Na primjer, formulacija pogodno ne uključuje oksidirajuće agense i druge spojeve za koje se zna da su štetni za polipeptide. Općenito, formulacije se pripravljaju dovođenjem u kontakt GH s tekućim nosiocima ili fino usitnjenim krutim nosiocima, ili obim. Zatim se, ako je potrebno, proizvod oblikuje u željenu formulaciju. Pogodno nosilac je parenteralni nosilac, pogodnije otopina koja je izotonična s krvi primaoca. Primjeri takvih nosivih prijenosnika vozila uključuju vodu, fiziološku otopinu, Ringerovu otopinu i otopinu dekstroze. Bezvodni prijenosnici kao što su fiksirana ulja i etil oleat su također ovdje korisni, kao i liposomi.

Nosilac prikladno sadrži manje količine aditiva, kao što su supstance koje pojačavaju izotoničnost i kemijsku stabilnost. Takvi materijali nisu toksični za primaoce pri korištenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što je fosfat, citrat, sukcinat, octena kiselina, i druge organske kiseline ili njihove soli; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina; polipeptide niske molekularne mase (manje nego oko deset ostataka), na pr. poliarginin ili tripeptide; proteine, kao što je serumski albumin, želatinu ili imunoglobuline; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutaminska kiselina, aspartinska kiselina, ili arginin; monosaharide, disaharide, i druge karbohidrate uključujući celulozu ili njene derivate, glukozu, manozu, ili dekstrine; kelirajuće agense kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što je manitol ili sorbitol; protuione kao što je natrij; i/ili ne-ionske surfaktante kao što su polisorbati, poloksameri, ili PEG.

GH se tipično formulira individualno u takvim prijenosnicima pri koncentraciji od oko 0,1 mg/ml do 100 mg/ml, pogodno 1-10 mg/ml, pri pH od oko 4,5 do 8. GH je pogodno kod pH od 7,4-7,8. Razumije se, da će korištenje određenog od prethodnih ekscipijenata, nosioca ili stabilizatora rezultirati u stvaranju GH soli.

Dok GH može biti formuliran bilo kojom pogodnom metodom, preferirane formulacije za GH su kako slijedi: za preferirani hGH (GENOTROPINTM), šprica s pojedinačnom dozom sadrži 0,2 mg, 0,4 mg, 0,6 mg, 0,8 mg, 1,0 mg, 1,2 mg, 1,4 mg, 1,6 mg, 1,8 mg ili 2,0 mg rekombinantnog somatropina. Rečena GENOTROPINTM šprica također sadrži 0,21 mg glicina, 12,5 mg manitola, 0,045 mg mononatrij fosfata, 0,025 mg dinatrij fosfata i vode do 0,25 ml.

Za met-GH (PROTROPINTM), pred-liofilizirana osnovna otopina sadrži 2,0 mg/ml met-GH, 16,0 mg/ml manitola, 0,14 mg/ml natrij fosfata, i 1,6 mg/ml natrij fosfata (monobazični monohidrat), pH 7,8. 5-mg sterilna bočica met-GH sadrži 5 mg met-GH, 40 mg manitola, i 1,7 mg ukupno natrij fosfata (suha težina) (dibazični bezvodni), pH 7,8. 10-mg sterilna bočica sadrži 10 mg met-GH, 80 mg manitola, i 3,4 mg ukupno natrij fosfata (suha težina) (dibazični bezvodni), pH 7,8.

Za metless-GH (NUTROPINTM), pred-liofilizirana osnovna otopina sadrži 2,0 mg/ml GH, 18,0 mg/ml manitola, 0,68 mg/ml glicina, 0,45 mg/ml natrij fosfata, i 1,3 mg/ml natrij fosfata (monobazični monohidrat), pH 7,4. 5-mg sterilna bočica sadrži 5 mg GH, 45 mg manitola, 1,7 mg glicina, i 1,7 mg ukupno natrij fosfata (suha težina) (dibazični bezvodni), pH 7,4. 10-mg sterilna bočica sadrži 10 mg GH, 90 mg manitola, 3,4 mg glicina, i 3,4 mg ukupno natrij fosfata (suha težina) (dibazični bezvodni).

Alternativno, tekuća formulacija za NUTROPINTM hGH može biti korištena, na primjer: 5,0 6 0,5 mg/ml rhGH; 8,860,9 mg/ml natrij klorida; 2,0 6 0,2 mg/ml Polisorbata 20; 2,56 0,3 mg/ml fenola; 2,686 0,3 mg/ml natrij citrata dihidrata; i 0,176 0,02 mg/ml bezvodne citronske kiseline (ukupni bezvodni natrij citrat/citronska kiselina je 2,5 mg/ml, ili 10 mM); pH 6,06 0,3. Ova formulacija se pogodno stavlja u 10-mg sterilnu bočicu, koja je napunjena s 2,0 ml gornje formulacije u staklenoj sterilnoj bočici od 3 cm3. Alternativno, 10-mg (2,0 ml) patrona koja sadrži gornju formulaciju može biti stavljena u injekcijsku "olovku" za injiciranje tekućeg GH subjektu.

GH sastavi koje treba koristiti za terapeutsko davanje su pogodno sterilni. Sterilnost se pogodno postiže filtracijom kroz sterilne filtracijske membrane (na pr. membrane od 0,2 mikrona). Terapeutski GH sastavi općenito se stavljaju u spremnik koji ima ulaz za sterilni pristup, na primjer, vrećicu za intravenoznu otopinu ili sterilnu bočicu koja ima poklopac koji se može probušiti hipodermalnom injekcijskom iglom.

GH će se obično uskladištiti u spremnicima za jednu ili više doza, na primjer, zabrtvljenim ampulama ili sterilnim bočicama, kao vodena otopina, ili kao liofilizirana formulacija za rekonstituciju. Kao primjer liofilizirane formulacije, bočice se pune sterilno filtriranim vodenim GH otopinama, i nastala smjesa se liofilizira. Infuzijska otopine se pripravlja rekonstituiranjem liofiliziranog GH koristeći bakteriostatsku vodu za injekcije.

Testovi za probir lijeka

Otkriće da pojedinci koji nose GHRd3 alel imaju povećani pozitivni odgovor na liječenje agensom koji djeluje preko GHR putanje, u usporedbi s pojedincima homozigotnima za GHRfl alel je dalo testove koji se mogu koristiti za evaluaciju terapeutskih agensa koji djeluju preko GHR putanje. Na primjer, testovi probiranja utemeljeni na GHRd3 u kojima se procjenjuje GHR aktivnost ili vezanje za GHRd3 mogu biti korišteni za identificiranje agensa koji će biti najkorisniji u liječenju pojedinaca koji eksprimiraju GHRd3 alel. Kako je dolje dalje opisano, agens koji se može testirati, uključuje agense poznate da su korisni za liječenje bolesti kao GH sastavi koji uključuju somatotropin ili somatropin, pogodno GENOTROPINTM, ili PROTROPINTM, NUTROPINTM, ili pegvisomant, pogodno SOMAVERTTM, ili agense koji još nisu poznati da bi bili korisni za takvo liječenje bolesti.

U jednom aspektu, izum daje test baziran na stanici, u kojem se stanica koja eksprimira GHRd3 protein, ili biološki aktivni njegov dio, dovodi u kontakt s test spojem i određuje se sposobnost test spoja da modulira GHR aktivnost. Determiniranje sposobnosti test spoja da modulira (na pr. stimulira ili inhibira) GHR aktivnost, može biti provedena monitoringom aktivnosti GHR polipeptida. Detekcija GHR aktivnosti može uključivati procjenjivanje bilo koje pogodne detektabilne aktivnosti, uključujući na primjer staničnu proliferaciju induciranu test spojem, GHR internalizaciju i/ili transdukciju signala, kako se dalje diskutira dolje.

U preferiranim izvedbama, izum pruža metodu za identificiranje kandidata za GHR modulator (na pr. agonista ili antagonista), s time da rečena metoda uključuje a) dobavu stanice koja ima GHRd3 polipeptid; b) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i c) determiniranje da li rečeni spoj selektivno stimulira ili inhibira GHR aktivnost. U jednoj izvedbi, ova metoda uključuje a) dobavu ljudske stanice (pogodno 293 stanice); b) unošenje vektora koji ima nukleinskokiselinsku sekvencu koja kodira GHRd3 polipeptid u rečenu stanicu, i c) dovođenje u kontakt rečene stanice s test spojem; i d) detektiranje GHR aktivnosti. Detekcija da rečeni spoj inhibira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3 inhibitor. Detekcija da rečeni spoj stimulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3 agonist. U drugom primjeru ova metoda uključuje a) dobavu oocite od Xenopus laevis; b) unošenje GHRd3 cRNA u rečenu Xenopus oocitu; c) dovođenje u kontakt rečene Xenopus oocite s test spojem; i d) detekciju GHR aktivnosti u rečenoj Xenopus oociti. Nadalje, detekcija da rečeni spoj stimulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3 agonist. Detekcija da rečeni spoj inhibira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3 antagonist. Slijedeći detalji probirnih testova opisani su dolje u kontekstu GHRd3/fl heterodimera.

GHRd3/GHRfl heterodimeri

Metode za procjenu GHRd3/fl heterodimerne aktivnosti

Kako je raspravljeno, izum daje da GHRd3 polipeptid može postojati prirodno kao heterodimer s GHRfl polipeptidom. Stoga, izum daje metode za procjenu ove aktivnosti GHRd3 polipeptida. U pogodnim aspektima, izum uključuje detekciju aktivnosti polipeptidnog kompleksa koji sadrži GHRd3 polipeptid i GHRfl polipeptid. Izum time daje metodu za procjenu aktivnosti GHR polipeptidnog kompleksa koji ima GHRd3 polipeptid. Pogodno, taj kompleks je kompleks koji ima GHRd3 polipeptid, GHRfl polipeptid i GH polipeptid.

Izum nadalje daje metode testiranja aktivnosti ili pribavljanja funkcionalne varijantne GHRd3 nukleotidne sekvence, uključujući davanje varijantne ili modificirane GHRd3 nukleinske kiseline i procjenu da li polipeptid kodiran njom pokazuje GHR aktivnost. Obuhvaćena je dakle metoda za procjenu funkcije GHRd3 polipeptida uključivo: (a) pribavljanje GHRd3 polipeptida i GHRfl polipeptida; i (b) procjenjivanje GHR aktivnosti. Može se koristiti bilo koji pogodni format, uključivo bez-stanične (na pr. na membrani bazirane), na stanici bazirane i in vivo formate. Na primjer, rečeni test može uključiti ekspresiju GHRd3 i GHRfl nukleinske kiseline u stanici domaćinu, i promatranje GHR aktivnosti u rečenoj stanici. U drugom primjeru, GHRd3 i GHRfl polipeptid se unose u stanicu, i GHR aktivnost se promatra. U drugom primjeru, GHRd3 polipeptid se unosi u stanicu koja eksprimira GHRfl polipeptid, i GHR aktivnost se promatra.

U povoljnim izvedbama, detekcija GHR aktivnosti može uključiti određivanje sposobnosti GHR proteina da dalje modulira aktivnost nizvodnog efektora (na pr. komponente GHR-om posredovane signal-transdukcijske putanje). Na primjer, može se odrediti aktivnost efektorske molekule na odgovarajući cilj, ili vezanje efektora na odgovarajući cilj može biti određeno kako je prethodno opisano. Pogodno, procjenjuje se Jak-2/Stat-5 signalizacija. U drugim preferiranim izvedbama, detekcija GHR aktivnosti može također uključiti procjenu bilo koje pogodne detektabilne aktivnosti, uključivo GHR ligandom induciranu staničnu proliferaciju, vezanje GHR na neki GHR ligand, GHR i/ili ligand internalizaciju. Najpogodnije, rečeni GHR ligand je GH polipeptid. Ove metode omogućuju testiranje aktivnosti nekog GHR heterodimera sastavljenog od GHRd3 i GHRfl polipeptida.

Metode za procjenu GHRd3 aktivnosti mogu biti korisne za karakteriziranje modificiranih GHRd3 polipeptida. Na primjer, GHRd3 polipeptidi koji imaju mutaciju na esencijalnom ili ne-esencijalnom aminokiselinskom ostatku mogu biti karakterizirani. Nukleotidne supstitucije koje dovode do aminokiselinskih supstitucija na "ne-esencijalnim" aminokiselinskim ostatcima mogu biti učinjene u sekvencama od GHRd3. Neki "ne-esencijalni" aminokiselinski ostatak je ostatak koji može biti preinačen od sekvence divljeg tipa za GHRd3 polipeptid, bez promjene njegove biološke aktivnosti, dok je "esencijalni" aminokiselinski ostatak potreban za biološku aktivnost. Na primjer, za aminokiselinske ostatke koji su konzervirani među GHRd3 proteinima predmetnog izuma predviđa se da su manje podložni preinaci. Nadalje, dodatni konzervirani aminokiselinski ostaci mogu biti aminokiseline koje su konzervirane između GHRd3 proteina predmetnog izuma. U drugim primjerima, za aleličke varijante koje se prirodno pojavljuju od GHRd3 sekvenci, koje mogu postojati u populaciji, promjene mogu biti unesene mutacijom u nukleotidne sekvence GHRd3 nukleinske kiseline, time dovodeći do promjena u aminokiselinskoj sekvenci kodiranih GHRd3 proteina, sa ili bez mijenjanja funkcionalne sposobnosti GHRd3 proteina.

Pokusi probiranja lijekova

Izum pruža metode za identificiranje i/ili procjenu GHR agonista i antagonista, t.j. kandidata ili test spojeva ili agensa (na pr. pogodno polipeptida, ali također peptida, peptidomimetika, malih molekula ili drugih lijekova) koji djeluju putem GHR putanje. Pogodno, GHR agonisti i antagonisti su spojevi koji se vežu na GHRd3 i GHRfl proteine i time pogodno tvore kompleks, sastavljen od GHRd3 polipeptida, GHRfl polipeptida i rečenoga spoja. Pokusi mogu biti testovi bazirani na stanicama ili testovi koji se ne baziraju na stanicama. Preferirani testovi koji se ne baziraju na stanicama su testovi bazirani na membrani. Ti pokusi mogu biti također nazvani ovdje kao "probirni testovi" ("screening assays“). Probirni testovi mogu biti pokusi vezivanja ili drugi funkcionalni pokusi, kakvi su bazirani na bilo kojim pogodnim poznatim analizama GHR aktivnosti.

U jednom aspektu, pokus je pokus baziran na stanici u kojem se stanica, koja eksprimira GHRd3 protein i GHRfl protein, ili biološki aktivne njihove dijelove, dovodi u kontakt s test spojem i određuje se sposobnost test spoja da modulira GHR aktivnost. Određivanje sposobnosti test spoja da modulira (na pr. stimulira ili inhibira) GHR aktivnost može biti provedeno monitoringom aktivnosti GHR polipetida (na pr. GHR polipeptidnog kompleksa koji ima GHRd3 i GHRfl proteine). Detekcija GHR aktivnosti može uključivati procjenu bilo koje pogodne odredive aktivnosti, uključujući na pr. proliferaciju stanica induciranu test spojem, GHR internalizaciju, i/ili signalnu transdukciju.

U preferiranim izvedbama, izum daje metodu za identificiranje kandidata za GHR modulator (na pr. agonist ili antagonist), rečena metoda uključuje a) pribavljanje stanice koja ima GHRd3 i GHRfl polipeptid; b) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i c) određivanje da li rečeni spoj selektivno stimulira ili inhibira GHR aktivnost. U jednoj izvedbi, ova metoda uključuje a) pribavljanje ljudske stanice (pogodno 293 stanice); b) unošenje vektora koji ima nukleinskookiselinsku sekvencu koja kodira GHRd3 polipeptid u rečenu stanicu, i po izboru unošenje vektora koji ima nukleinskokiselinsku sekvencu koja kodira GHRfl polipeptid u rečenu stanicu; c) dovođenje u kontakt rečene stanice s test spojem; i d) detektiranje GHR aktivnosti. Detekcija da rečeni spoj inhibira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3/GHRfl heterodimer inhibitor. Detekcija da rečeni spoj stimulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3/GHRfl heterodimer agonist. U drugom primjeru ova metoda uključuje a) pribavljanje oocite od Xenopus laevis; b) unošenje GHRd3 i po izboru GHRfl cRNA u rečenu Xenopus oocitu; c) dovođenje u kontakt rečene Xenopus oocite s test spojem; i d) detekciju GHR aktivnosti u rečenoj Xenopus oociti. Nadalje, detekcija da rečeni spoj stimulira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3/GHRfl heterodimer agonist. Detekcija da rečeni spoj inhibira GHR aktivnost ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3/GHRfl heterodimer antagonist.

Određivanje GHR aktivnosti može uključivati procjenu bilo koje pogodne odredive aktivnosti, uključujući proliferaciju stanica, vezanje GHR na neki GHR ligand (na pr. GH polipeptid), GHR i/ili GHR ligand internalizaciju i/ili GHR-om posredovanu signalnu transdukciju.

Primjer za pokus GHR funkcionalnosti u 293 stanicama za GHR-om posredovanu Jak2-Stat5 signalizaciju je opisano u Maamra et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 14791-14798, koje je otkriće ovdje ugrađeno referencom. Primjer za pokus GHR funkcionalnosti u oocitama Xenopus laevis je opisan u Urbanek et al., (1993) J. Biol. Chem. 268(25): 19025-19032, koje je otkriće ovdje ugrađeno referencom. Metode za stvaranje cDNA kalupa, in vitro transkripcija i translacija, injiciranje oocite, analiza stabilnosti injektirane mRNA, određivanje GH vezanja na GHR i analiza internalizacije receptora mogu se provoditi u biti kako je opisano u Urbanek et al., (1993).

U drugom preferiranom aspektu, pokus je na stanici bazirani test vezanja u kojem se stanica koja eksprimira GHRd3 protein i GHRfl protein, ili biološki aktivne njihove dijelove, dovodi u kontakt s test spojem i određuje se sposobnost test spoja da veže GHR polipeptid. U drugom aspektu, pokus je test vezanja koji nije baziran na stanici u kojem se membrana koja ima GHRd3 protein i GHRfl protein ili biološki aktivne njihove dijelove, dovodi u kontakt s test spojem, i određuje se sposobnost test spoja da veže GHR polipeptid. Određivanje sposobnosti test spoja da se veže na GHR (na pr. GHRd3 ili GHRfl) polipeptid može biti izvršeno koristeći poznate metode.

Pokusi vezanja mogu na pr. uključivati: a) pribavljanje stanice koja ima GHRd3 i GHRfl polipeptid; b) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i c) određivanje da li se rečeni spoj selektivno veže na GHR polipeptid. U jednoj izvedbi, ova metoda uključuje a) pribavljanje ljudske stanice (pogodno 293 stanice); b) unošenje vektora koji ima nukleinskokiselinsku sekvencu koja kodira GHRd3 polipeptid u rečenu stanicu, i po izboru unošenje vektora koji ima nukleinskokiselinsku sekvencu koja kodira GHRfl polipeptid u rečenu stanicu; c) dovođenje rečene stanice u kontakt s test spojem; i d) detektiranje da li se rečeni spoj selektivno veže na GHR polipeptid. Detekcija da se rečeni spoj veže na neki GHR polipeptid ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za GHRd3/GHRfl heterodimer modulator. U drugom primjeru ova metoda uključuje a) pribavljanje oocite od Xenopus laevis; b) unošenje GHRd3 i po izboru GHRfl cRNA u rečenu Xenopus oocitu; c) dovođenje rečene Xenopus oocite u kontakt s test spojem; i d) detekciju da li se rečeni spoj selektivno veže na GHR polipeptid. Nadalje, detekcija da se rečeni spoj veže na GHR polipeptid ukazuje, da je rečeni spoj kandidat za modulator GHRd3/GHRfl heterodimera.

Primjer za na 293-stanicama baziranom pokusu GHR vezanja je opisan u Ross et al., (2001) J. Clin. Endocrinol. Metabol. 86(4): 1716-1723, koje je otkriće ovdje ugrađeno referencom.

Pogodno, stanice korištene u gornjim pokusima su 293 stanice koje eksprimiraju GHRfl polipeptid. 293 stanice koje eksprimiraju GHR opisane su u Maamra et al., (1999) J. Biol. Chem. 274: 14791-14798, koje je otkriće ovdje ugrađeno referencom.

Takvi pokusi mogu biti naročito korisni za testiranje GH polipeptida ili njihovih fragmenata ili varijanti. Naročito preferirani su GH polipeptidi koji su modificirani tako da imaju duža vremena cirkulacije u krvi, na primjer pomoću vezivanja molekula polietilen glikola. U drugim izvedbama, GH polipeptidi mogu biti GHR antagonisti kao što su GH polipeptidi koji vežu GHR protein (na pr. preferentno formirajući kompleks uključivo GHRd3 i GHRfl protein), ali koji ne stimuliraju GHR aktivnost.

U drugoj izvedbi, ovaj pokus uključuje dovođenje stanice koja eksprimira GHRd3 protein i GHRfl protein ili biološki aktivne njihove dijelove, u kontakt s GHR ligandom da formira pokusnu smjesu, dovođenje u kontakt pokusne smjese s test spojem, i detektiranje GHR aktivnosti. Pogodno, ta metoda uljučuje utvrđivanje sposobnosti test spoja da stimulira ili inhibira aktivnost GHR proteina (na pr. GHR dimera sastavljenog od GHRd3 i GHRfl proteina ili njihovih biološki aktivnih dijelova), u čemu određivanje sposobnosti test spoja da inhibira aktivnost GHR proteina uključuje determiniranje sposobnosti test spoja da inhibira biološku aktivnost u ovim GHRd3- i GHRfl-eksprimirajućim stanicama (na pr. određivanje sposobnosti test spoja da inhibira signalnu transdukciju ili interakcije protein:protein).

Određivanje sposobnosti GHR proteina da se veže na, ili uzajamno djeluje s GHR ligandom može biti ostvareno bilo kojom od metoda opisanih gore za određivanje direktnog vezanja. U drugim izvedbama, određivanje sposobnosti GHRd3 proteina ili kompleksa koji sadrži GHRd3 protein, da se veže na ili međusobno reagira s GHR ligand molekulom, može biti provedeno pomoću detekcije indukcije staničnog sekundarnog glasnika za taj cilj (t.j. intracelularni Ca2+, diacilglicerol, IP3, i t. d.), detektiranjem katalitičko/enzimatske aktivnosti na pogodnom supstratu, detektiranje indukcije reporter gena (koji sadrži responzivni regulatorni element operativno vezan na nukleinsku kiselinu koja kodira detektabilan marker, na pr. luciferazu), ili detektiranjem GHR-reguliranog celularnog odgovora, na pr., signal transdukcije ili interakcije protein:protein.

U još jednoj izvedbi, pokus predmetnog izuma je bez-stanični test u kojem su GHRd3 protein i GHRfl protein ili biološki aktivni njihovi dijelovi, dani u membrani i GHR proteini ili membrana se dovodi u kontakt s test spojem, i određuje se sposobnost test spoja da se veže na GHR protein (na pr. GHRd3 i/ili GHRfl protein) ili biološki aktivne njihove dijelove. Vezanje test spoja na GHRd3 protein može se odrediti bilo direktno ili indirektno kako je gore opisano. U pogodnoj izvedbi, taj pokus uključuje dovođenje u kontakt GHR proteina (na pr. GHR heterodimera) ili biološki aktivnog njegovog dijela s poznatim spojem kao što je GH polipeptid koji veže GHR, tako da nastane pokusna smjesa, dovođenje u kontakt pokusne smjese s test spojem, i određivanje sposobnosti test spoja da međusobno djeluje s GHR proteinom, u čemu određivanje sposobnosti test spoja da međusobno djeluje s GHR heterodimernim proteinom uključuje određivanje sposobnosti toga test spoja da se pogodno veže na GHR protein ili biološki aktivni njegov dio, u usporedbi s poznatim spojem.

U drugoj izvedbi, ovaj pokus je bez-stanični test u kojem su GHRd3 protein i GHRfl protein ili biološki aktivni njihovi djelovi, dani u membrani i peptidi ili membrana se dovode u kontakt s test spojem, a određuje se sposobnost test spoja da modulira (na pr. stimulira ili inhibira) aktivnost GHR proteina ili biološki aktivnog njegovog dijela. Utvrđivanjem sposobnosti tog test spoja da modulira GHR aktivnost može se ostvariti, na primjer, procjenjivanjem bilo koje pogodne utvrdive GHR aktivnosti, uključujući proliferaciju stanica, vezanje GHR na neki GHR ligand (na pr. GH polipeptid), GHR i/ili GHR ligand internalizaciju i/ili GHR-om posredovanu signal transdukciju.

Određivanje sposobnosti test spoja da inhibira GHR aktivnost može se također postići, na pr. kopuliranjem test spoja, kao što su GH proteinske molekule, ili njegovog dijela ili derivata s radioizotopom ili enzimskim biljegom, tako da se vezanje GH molekule uz GHR heterodimer može odrediti detekcijom obilježenog GH proteina ili biološki aktivnog njegovog dijela u kompleksu. Na primjer, spojevi (na pr. GH protein ili biološki aktivni njegov dio) mogu biti obilježeni s 125I, 35S,14C, ili 3H, bilo direktno ili indirektno, i taj se radioizotop detektira direktnim brojenjem radioemisije ili scintilacijskim brojenjem. Alternativno, spojevi mogu biti enzimatski označeni sa, na pr. peroksidazom hrena, alkalnom fosfatazom, ili luciferazom, a enzimatski biljeg detektiran determinacijom konverzije pogodnog supstrata u produkt.

Isto je tako unutar opsega ovog izuma determiniranje sposobnosti nekog spoja (na pr. GH proteina ili njegovog dijela ili fragmenta) da međusobno djeluje s GHR polipeptidom (na pr. GHRd3/GHRfl heterodimerom) bez obilježavanja bilo kojeg od sudionika međusobnih reakcija. Na primjer, mikrofiziometar može biti korišten da odredi interakciju spoja sa svojom istorodnom ciljnom molekulom bez obilježavanja bilo spoja ili receptora. McConnell, H. M. et al., (1992) Science 257: 1906-1912. Mikrofiziometar takav kao što je citosenzor (cytosensor) je analitički instrument koji mjeri brzinu kojom neka stanica zakiseljuje svoj okoliš koristeći svjetlom-adresabilni potenciometrijski senzor (light-addressable potentiometric sensor, LAPS). Promjene u brzini zakiseljavanja mogu se koristiti kao indikator interakcije između spoja i receptora.

Određivanje sposobnosti GHR proteina da se veže na GHR ligand ili test spoj može se također provesti koristeći tehnologiju, kao što je biomolekularna interakcijska analiza u realnom vremenu (real-time Biomolecular Interaction Analysis, BIA). Sjolander, S. i Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 i Szabo et al., (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705. Kako se koristi ovdje, "BIA" je tehnologija za proučavanje biospecifičnih interakcija u realnome vremenu, bez obilježavanja bilo kojeg od sudionika u međusobnim interakcijama (na pr. BIAcore). Promjene u optičkom fenomenu površinske plazmonske rezonance (surface plasmon resonance, SPR) mogu se koristiti kao indikacija ovih "real-time" reakcija između bioloških molekula.

Test spojevi

"Kandidati" ili "test" spojevi ili "agensi" (na pr. testirani GHR agonisti i antagonisti) mogu biti bilo kojeg odgovarajućeg oblika, uključujući polipeptide, peptide, peptidomimetike, male molekule i druge lijekove. Rečeni spojevi ili agensi uključuju one za koje se zna da su korisni za liječenje bolesti, ili agense za koje se još ne zna da su korisni za liječenje bolesti.

U pogodnoj izvedbi, test spoj je GH polipeptid. Pogodni GH može biti u nativnoj sekvenci ili u varijantnom obliku, i iz bilo kojeg izvora, bilo prirodnog, sintetskog ili rekombinantnog. Primjeri uključuju ljudski hormon rasta (human growth hormone, hGH), koji je prirodni ili rekombinantni GH s ljudskom nativnom sekvencom, i rekombinantni hormon rasta (rGH), koji se odnosi na bilo koji GH ili GH varijantu proizvedenu pomoću rekombinantne DNA tehnologije. U jednom aspektu GH je sposoban stimulirati GHR receptor; primjeri uključuju somatotropin ili somatropin, pogodno GENOTROPINTM, ili PROTROPINTM, NUTROPINTM.

U drugom aspektu, GH polipeptid je GH varijanta sposobna da djeluje kao GHR antagonist. GHR antagonisti su klasa lijekova namijenjenih da vežu GHR polipeptide, ali tako, da blokiraju GHR funkciju. Primjer GHR antagonista je opisan u Ross et al., (2001) J. Clin. Endocrinol. Metabol. 86(4): 1716-1723. GHR antagonist otkriven u Ross et al., nazvan kao B2036-PEG, je pegilirani GH varijantni polipeptid koji ima mutacije u mjestu 1 da pojača GHR vezivanje, i u mjestu 2 da blokira dimerizaciju receptora. Preferirani GHR antagonist ili inhibitor je pegvisomant, pogodno SOMAVERTTM. GHR antagonisti su korisni za liječenje akromegalije, stanja obično uzrokovanog prekomjernom GH sekrecijom iz adenoma hipofize.

Test spojevi iz predmetnoga izuma mogu se pribaviti koristeći bilo koji od brojnih pristupa u kombinatoričkim knjižničkim metodama (combinatorial library methods) poznatih u struci, uključujući: biološke knjižnice; prostorno adresabilne paralelne knjižnice krute faze ili prostorno adresabilne paralelne knjižnice tekuće faze (spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries); sintetske knjižničke metode (synthetic library methods) koje zahtijevaju dekonvoluciju (deconvolution); "jedno zrno – jedan spoj" knjižnička metoda (the "one-bead one-compound“ library method); i sintetske knjižničke metode koje koriste afinitetnu kromatografsku selekciju (synthetic library methods using affinity chromatography selection). Ovaj pristup bioloških knjižnica (biological library approach) se koristi s knjižnicama peptida (peptide libraries), dok su četiri preostala pristupa primjenjiva na peptidne, ne-peptidne oligomerne (non-peptide oligomer) ili knjižnice spojeva malih molekula (small molecule libraries of compounds) (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Primjeri metoda za ovu sintezu molekularnih knjižnica mogu se naći u struci, na primjer u: DeWitt et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., (1994). J. Med. Chem 37: 2678; Cho et al., (1993) Science 261: 1303; Carrell et al., (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al., (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; i u Gallop et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.

Knjižnice spojeva mogu biti prezentirane u otopini (na pr. Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), ili na zrncima (Lam (1991) Nature 354: 82-84), čipovima (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bakterijama (Ladner U.S. pat. br. 5.223.409), sporama (Ladner U.S. pat. br. '409), plazmidima (Cull et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) ili na fagu (Scott i Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382), (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner supra.).

Izum se dalje odnosi na nove agense identificirane pomoću gore opisanih probirnih testova i na procese za proizvodnju takvih agensa korištenjem ovih testova. Prema tome, u jednoj izvedbi, predmetni izum uključuje spoj ili agens koji se može dobiti pomoću metode koja uključuje korake od bilo kojeg od prethodno spomenutih probirnih testova (na pr. testovi na bazi stanica ili testovi bez stanica). Pogodno, rečeni spoj ili agens uključuje GH polipeptid, ili njegov dio ili njegovu varijantu.

Prema tome, unutar je opsega ovog izuma da se dalje koristi agens identificiran kako je ovdje opisano u odgovarajućem animalnom modelu. Na primjer, agens identificiran kako je ovdje opisano (na pr. GHR modulirajući agens, kao što je GH polipeptid ili njegov dio ili njegova varijanta, antisense GHRd3 nukleinskokiselinska molekula, GHRd3-specifično antitijelo, ili GHRd3-vezni partner) može biti korišten u animalnom modelu da se odredi učinkovitost, toksičnost, ili nuspojave od liječenja s takvim agensom. Alternativno, agens identificiran kako je opisano ovdje, može se koristiti u animalnom modelu da se odredi mehanizam djelovanja takvog agensa. Nadalje, ovaj izum se odnosi na korištenja novih agensa identificiranih pomoću gore opisanih probirnih testova za liječenja, kako je ovdje opisano.

Predmetni izum se također odnosi na upotrebe novih agensa identificiranih gore opisanim probirnim testovima za dijagnoze, prognoze, i liječenja kako je opisano ovdje. Prema tome, unutar je opsega predmetnog izuma da se koriste takvi agensi u oblikovanju, formulaciji, sintezi, izradi i/ili produkciji nekog lijeka ili farmaceutskog sastava za korištenje u dijagnozi, prognozi, ili liječenju kako je opisano ovdje. Na primjer, u jednoj izvedbi, predmetni izum uključuje metodu za sintetiziranje ili produkciju lijeka ili farmaceutskog sastava s referencom na tu strukturu i/ili svojstva nekog spoja koji se može dobiti jednim od gore opisanih probirnih testova. Na primjer, lijek ili farmaceutski sastav može se sintetizirati na temelju te strukture i/ili svojstava spoja dobivenog pomoću metode u kojoj se stanica koja eksprimira GHRd3 i GHRfl polipeptide dovodi u kontakt s test spojem i određuje se sposobnost test spoja da se veže na, ili da modulira aktivnost tog GHR polipeptida (pogodno kompleksa sastavljenog od GHRd3 i GHRfl polipeptida). U drugoj primjernoj izvedbi, predmetni izum uključuje metodu za sintetiziranje ili produkciju lijeka ili farmaceutskog sastava utemeljenog na strukturi i/ili svojstvima spoja, koji se može dobiti pomoću metode u kojoj se GHRd3 protein ili njegov biološki aktivni dio, dovodi u kontakt s test spojem i određuje se sposobnost test spoja da se veže na, ili da modulira (na pr. stimulira ili inhibira) aktivnost GHR proteina, pogodno GHR dimera, koji uključuje GHRd3 i GHRfl protein, ili biološki aktivne njegove dijelove.

GHRd3 nukleinske kiseline i proteini

Kako se ovdje diskutiralo, predmetni se izum odnosi na upotrebu GHRd3 nukleinskih kiselina i polipeptida.

U preferiranoj izvedbi, GHRd3 protein uključuje susjedni raspon od barem 6 aminokiselina, pogodno barem 8 do 10 aminokiselina, pogodnije barem 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ili 600 aminokiselina. U drugim preferiranim izvedbama ovaj susjedni raspon aminokiselina uključuje mjesto mutacije ili funkcionalne mutacije, uključujući deleciju, adiciju, izmjenjivanje (swap) ili prikraćivanje (truncation) u aminokiselinama u GHRd3 proteinskoj sekvenci. Stoga, također korisni u tom kontekstu predmetnog izuma su biološki aktivni dijelovi GHRd3 proteina, uključivo peptidi koji sadrže aminokiselinske sekvence dovoljno homologne sa, ili s porijeklom od ove aminokiselinske sekvence toga GHRd3 proteina, koji uključuje manje aminokiselina nego oni GHRd3 proteini pune duljine, i pokazuju barem jednu aktivnost GHR proteina. U drugim izvedbama, GHRd3 protein je u biti homologan s nativnom GHRd3 sekvencom i zadržava tu funkcionalnu aktivnost nativnoga GHRd3 proteina, a ipak se razlikuje u sekvenci aminokiselina zbog prirodne aleličke varijacije ili zbog mutageneze. Prema tome, u drugoj izvedbi, GHRd3 protein je protein koji ima aminokiselinsku sekvencu barem oko 60% homolognu prema aminokiselinskoj sekvenci opisanoj u Urbanek et al., (1992) i odgovarajuće zadržava funkcionalnu aktivnost GHRd3 proteina. Pogodno, protein je barem oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 99,8% homologan prema Urbanek et al., (1992).

Da se odredi postotak homologije dviju aminokiselinskih sekvenci ili od dvije nukleinske kiseline, ove sekvence su poredane u ravnoj crti u svrhu optimalne komparacije (na pr. praznine mogu biti unesene u tu sekvencu od prve aminokiselinske sekvence ili nukleinsko kiselinske sekvence za optimalno poravnavanje s drugom aminokiselinskom ili nukleinskokiselinskom sekvencom, a nehomologne sekvence mogu biti zanemarene u svrhu komparacije). U preferiranoj izvedbi, duljina referentne sekvence poravnane u svrhu komparacije je barem 30%, pogodno barem 40%, pogodnije barem 50%, još više pogodno barem 60%, i čak još više pogodno barem 70%, 80%, 90% ili 95% od duljine te referentne sekvence (na pr. kada se poravnava jedna druga sekvenca prema GHRd3 aminokiselinskoj sekvenci, barem 100, pogodno barem 200 aminokiselinskh ostataka se poravnavaju). Aminokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama ili nukleotidnim pozicijama se zatim kompariraju. Kada je pozicija u prvoj sekvenci okupirana istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao korespondirajuća pozicija u drugoj sekvenci, tada su te molekule homologne na toj poziciji (t.j. kako se koristi u ovome, aminokiselinski ili nukleinskokiselinski "identitet" je ekvivalentan s aminokiselinskom ili nukleokiselinskom "homologijom”). Postotak homologije između ovih dviju sekvenci je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke tim dvjema sekvencama (t.j. % homologije = broj identičnih pozicija / ukupni broj pozicija x 100).

Komparacija sekvenci i determinacija postotka homologije između dviju sekvenci može se provesti koristeći matematički algoritam. Pogodan, neograničavajući primjer matematičkog algoritma korištenog za komparaciju sekvenci je algoritam od Karlin i Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, modificirano prema Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Takav algoritam inkorporiran je u NBLAST i XBLAST programe (version 2.0) od Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. BLAST pretraga nukleotida može biti provedena s NBLAST programom, rezultat (score) = 100, duljina riječi (wordlength) = 12 da se dobiju nukleotidne sekvence homologne s GHRd3 nukleinskokiselinskim molekulama izuma. BLAST proteinske pretrage se mogu provesti s XBLAST programom, rezultat (score) = 50, duljina riječi (wordlength) =3 da se dobiju aminokiselinske sekvence homologne prema GHRd3 proteinskim molekulama izuma. Da se dobiju prazninama podešeni (gapped) rasporedi u svrhu komparacije, može biti korišten Gapped BLAST kako je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, "default" parametri od tih respektivnih programa (na pr. XBLAST i NBLAST) mogu biti korišteni. Vidi http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Drugi preferirani, ne-limitirajući primjer matematičkog algoritma korištenog za komparaciju sekvenci je algoritam od Myers i Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je inkorporiran u ALIGN program (verzija 2.0) koji je dio GCG softverskog paketa za poravnanje sekvenci. Kada se koristi ALIGN program za usporedbu aminokiselinskih sekvenci, može biti korištena PAM120 tablica težina ostatka (weight residue table), kazna za duljinu praznine (gap length penalty) od 12, i kazna praznine od 4.

Rekombinantni ekspresijski vektori i stanice domaćini

Vektori, pogodnije ekspresijski vektori, koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira GHRd3 protein (ili njegov dio) mogu biti pripravljeni prema bilo kojoj prikladnoj metodi. Slično, u preferiranim aspektima, mogu također biti pripravljeni ekspresijski vektori koji imaju nukleinsku kiselinu koja kodira GHRfl protein (ili njegov dio). Po izboru, ekspresijski vektor će imati nukleinsku kiselinu koja kodira GHRd3 protein kao i nukleinsku kiselinu koja kodira GHRfl protein. Kako se ovdje koristi, izraz "vektor" odnosi se na molekulu nukleinske kiseline sposobnu da transportira drugu nukleinsku kiselinu uz koju je ona bila povezana. Jedan tip vektora je "plazmid" koji se odnosi na cirkularnu dvolančanu DNA petlju u koju se mogu povezati (ligated) dodatni DNA segmenti. Drugi tip vektora je virusni vektor, u kojemu dodatni DNA segmenti mogu biti ligirani u taj virusni genom. Neki vektori su sposobni za autonomno repliciranje u stanici domaćinu u koju su uneseni (na pr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko ishodište replikacije i episomalni vektori sisavaca). Drugi vektori (na pr. ne-episomalni vektori sisavaca) su integrirani u genom stanice domaćina nakon što su uneseni u stanicu domaćina, i time se repliciraju zajedno s genomom domaćina. Štoviše, određeni vektori su sposobni da upravljaju ekspresijom gena uz koje su oni operativno vezani. Takve vektore nazivamo ovdje kao "ekspresijski vektori". Općenito, ekspresijski vektori od koristi u rekombinantnim DNA tehnikama su često u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu se koristiti izmjenjivo, budući da je plazmid najčešče upotrebljavana forma vektora. Međutim, namjera je izuma da uključi takve druge oblike ekspresijskih vektora, kao što su viralni vektori (na pr. replikacijske defektne retroviruse, adenoviruse i adeno-srodne viruse), koji služe ekvivalentnim funkcijama.

Rekombinantni ekspresijski vektori izuma sadrže GHRd3 i/ili GHRfl nukleinsku kiselinu u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline u stanici domaćinu, što znači da rekombinantni ekspresijski vektori uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, selektiranih na temelju stanica domaćina koje će se koristiti za ekspresiju, koje su operativno vezane uz nukleinsko kiselinsku sekvencu koja se treba eksprimirati. Unutar rekombinantnog ekspresijskog vektora, za "operativno povezan" ("operably linked") je namjera, da znači da je nukleotidna sekvenca od interesa povezana s regulatornom(im) sekvencom(ama) na način koji omogućava ekspresiju nukleotidne sekvence (na pr. u in vitro transkripcijskom/translacijskom sistemu ili u stanici domaćinu kada je taj vektor umetnut u stanicu domaćina). Namjera je, da izraz "regulatorna sekvenca" uključi promotore (promoters), pojačivače (enhancers) i druge ekspresijske kontrolne elemente (na pr. poliadenilacijske signale). Takve regulatorne sekvence su opisane, na primjer, u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulatorne sekvence uključuju one koje upravljaju konstitutivnom ekspresijom nukleotidne sekvence u mnogim tipovima stanica domaćina i one koje upravljaju ekspresijom nukleotidne sekvence samo u nekim stanicama domaćinima (na pr. tkivno-specifične regulatorne sekvence). Stručne osobe iz odgovarajućeg područja će procijeniti da dizajn tog ekspresijskog vektora može ovisiti o takvim faktorima kao što je izbor stanice domaćina koja će biti transformirana, poželjna razina ekspresije proteina, i t.d. Ovi ekspresijski vektori mogu biti umetnuti u stanice domaćina da s time producira proteine i peptide.

Rekombinantni ekspresijski vektori izuma se mogu dizajnirati za ekspresiju GHRd3 proteina u prokariontskim ili u eukariontskim stanicama. Na primjer, GHRd3 proteini mogu biti eksprimirani u bakterijskim stanicama kao što je E. coli, stanicama insekta (koristeći baculovirus ekspresijske vektore) stanicama kvasaca, ili stanicama sisavaca. Pogodne stanice domaćini su dalje prodiskutirane u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativno, rekombinantni ekspresijski vektor se može transkribirati i translatirati in vitro, na pr. koristeći T7 promotorske regulatorne sekvence i T7 polimerazu.

Ekspresija proteina prokarionata najčešće se provodi u E. coli s vektorima koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore koji upravljaju tom ekspresijom bilo od fuzioniranih ili ne-fuzioniranih proteina. Fuzionirani vektori pridodaju broj aminokiselina proteinu kodiranom u tome, obično na amino terminus od rekombinantnog proteina. Takvi fuzionirani vektori tipično služe za tri svrhe: 1) da povećaju ekspresiju rekombinantnog proteina; 2) da povećaju topivost rekombinantnog proteina; i 3) da pomognu pročišćavanju rekombinantnoga proteina, time da djeluju kao ligand u afinitetnoj purifikaciji. Često, u fuzioniranim ekspresijskim vektorima, proteolitičko rascjepno mjesto se umeće na spoj fuzionirane polovice rekombinantnog proteina da se omogući separacija rekombinantnog proteina od fuzionirane polovice nakon purifikacije fuzioniranog proteina (fusion protein). Takvi enzimi, i njihove srodne sekvence prepoznavanja, uključuju Faktor Xa, trombin i enterokinazu. Tipični fuzionirani ekspresijski vektori uključuju pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D. B. i Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) i pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) koji fuzioniraju glutation S-transferazu (glutathione S-transferase, GST), maltoza E vezni protein, odnosno protein A, na takav ciljni rekombinantni protein.

Primjeri pogodnih inducibilnih ne-fuzioniranih E. coli ekspresijskih vektora uključuju pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) i pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Ekspresija ciljnog gena iz pTrc vektora oslanja se na transkripciju RNA polimerazom domaćina s hibridnog trp-lac fuzijskog promotora. Ekspresija ciljnog gena iz pET 11d vektora oslanja se na transkripciju iz T7 gn10-lac fuzijskog promotora posredovanu s ko-eksprimiranom viralnom RNA polimerazom (T7 gn 1). Ova virusna polimeraza dobavlja se od domaćinskih sojeva BL21 (DE3) ili HMS174 (DE3) od rezidentnog profaga koji ima T7gn 1 gen pod transkripcijskom kontrolom lacUV5 promotora.

Jedna strategija za maksimiziranje ekspresije rekombinantnog proteina u E. coli jest, eksprimirati taj protein u bakteriji domaćinu sa smanjenom sposobnošću da proteolitički rascijepi rekombinantni protein (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128). Druga strategija jest, promijeniti nukleinsko kiselinsku sekvencu nukleinske kiseline koja se treba insertirati u ekspresijski vektor, tako da ti individualni kodoni za svaku aminokiselinu jesu oni koji se preferencijalno koriste u E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Takva preinaka nukleinskokiselinskih sekvenci izuma može se provoditi standardnim tehnikama za DNA sintezu.

U drugoj izvedbi, GHRd3 ekspresijski vektor je kvaščev ekspresijski vektor. Primjeri vektora za ekspresiju u kvascu S. cerevisiae uključuju pYepSec 1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan i Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), i picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Alternativno, GHRd3 proteini mogu biti eksprimirani u stanicama insekta koristeći baculovirus ekspresijske vektore. Baculovirus vektori raspoloživi za ekspresiju proteina u kultviranim stanicama insekta (na pr. Sf9 stanice) uključuju pAc seriju (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) i pVL seriju (Lucklow i Summers (1989) Virology 170: 31-39). U naročito preferiranim izvedbama, GHRd3 proteini se eksprimiraju prema Karniski et al., Am. J. Physiol. (1998) 275: F79-87.

U još jednoj drugoj izvedbi, nukleinska kiselina predmetnog izuma se eksprimira u stanicama sisavca koristeći ekspresijski vektor sisavaca. Primjeri ekspresijskih vektora sisavaca uključuju pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) i pMT2PC (Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6: 187-195). Kada se koriste u stanicama sisavaca, ove kontrolne funkcije ekspresijskoga vektora su često dane viralnim regulatornim elementima. Na primjer, obično korišteni promotori su porijeklom od polyoma, Adenovirusa 2, cytomegalovirusa i Simian Virusa 40. Za druge pogodne ekspresijske sisteme i za prokariontske i eukariontske stanice vidi poglavlja 16 i 17 u Sambrook, J., Fritsh, E. F., i Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Drugi aspekt izuma odnosi se na stanice domaćina u koje je umetnut rekombinantni ekspresijski vektor iz izuma. Izrazi "stanica domaćin" ("host cell") i "rekombinantna stanica domaćin" ("recombinant host cell") se ovdje koriste izmjenjivo. Podrazumijeva se, da se takav termin ne odnosi samo na naročitu stanicu subjekta, već i na potomstvo ili potencijalno potomstvo od takve stanice. Budući da se određene modifikacije mogu dogoditi u slijedećim generacijama, bilo zbog mutacija ili utjecaja okoline, takvo potomstvo ne može u stvari biti identično s ishodišnom stanicom, ali su još uvijek uključene unutar opsega ovoga izraza kako se ovdje koristi.

Stanica domaćin može biti bilo koja prokariontska ili eukariontska stanica. Na primjer, GHRd3 protein može biti eksprimiran u bakterijskim stanicama kao što je E. coli, u stanicama insekta, stanicama kvasca ili stanicama sisavaca (pogodno ljudskim 293 stanicama). Druge prikladne stanice domaćini su poznate stručnim osobama iz odgovarajućeg područja, uključivo i Xenopus laevis oocite.

Vektorska DNA može biti umetnuta u prokariontske ili u eukariontske stanice putem konvencionalnih transformacijskih ili transfekcijskih tehnika. Kako se ovdje koriste, za izraze "transformacija" i "transfekcija" je namjera da se odnose na raznolikost tehnika u struci za umetanje (introducing) strane nukleinske kiseline (na pr. DNA) u stanicu domaćina, uključujući ko-precipitaciju s kalcij fosfatom ili kalcij kloridom, DEAE-dekstranom-posredovanu transfekciju, lipofekciju ili elektroporaciju. Pogodne metode za transformiranje ili transficiranje stanica domaćina mogu se naći u Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), i drugim laboratorijskim priručnicima.

Za stabilnu transfekciju stanica sisavaca, poznato je, da se ovisno o ekspresijskom vektoru i upotrebljenoj tehnici transfekcije, samo mala frakcija stanica može integrirati stranu DNA u njihove genome. Kako bi se identificirali i odabrali ovi integranti, gen koji kodira marker pogodan za odabiranje (na pr. rezistencija na antibiotike) se općenito unosi unutar te stanice domaćina zajedno s onim genom od interesa. Preferirani selektabilni markeri uključuju one koji daju rezistenciju na lijekove, kao što je G418, higromicin i metotreksat. Nukleinska kiselina koja kodira selektabilni marker može biti umetnuta u stanicu domaćina na istom tom vektoru kao onom koji kodira GHRd3 protein ili može biti umetnuta na odvojenom vektoru. Stanice stabilno transfektirane s umetnutem nukleinskom kiselinom mogu biti identificirane pomoću odabira lijekom (na pr. stanice koje su inkorporirale selektabilni marker gen će preživjeti, dok ove druge stanice umiru).

Stanica domaćin predmetnoga izuma, kao što je prokariontska ili eukariontska stanica domaćin u kulturi, može biti upotrebljena da proizvede (t.j. eksprimira) GHRd3 protein. Prema tome, izum dalje pruža metode za produkciju GHRd3 proteina koristeći ove stanice domaćine iz izuma. U jednoj izvedbi, ova metoda uključuje kultiviranje stanice domaćina izuma (u koju je rekombinantni ekspresijski vektor koji kodira GHRd3 protein umetnut), u odgovarajućem mediju tako da se proizvede GHRd3 protein.

Stanice domaćini iz izuma mogu se također koristiti da proizvedu non-humane transgeničke životinje, homozigotne ili heterozigotne za GHRd3 alel. Na primjer, u jednoj izvedbi, stanica domaćin iz ovoga izuma je oplođena oocita ili embrionalna matična stanica (embryonic stem cell) u koju su umetnute GHRd3-kodirajuće sekvence. Takve stanice domaćini mogu zatim biti korištene da kreiraju non-humane transgeničke životinje u koje su egzogene GHRd3 sekvence umetnute u njihove genome ili homologne rekombinantne životinje u kojima su endogene GHRfl sekvence bile preinačene. Takve su životinje korisne za proučavanje funkcije i/ili aktivnosti GHRd3 i za identificiranje i/ili evaluiranje modulatora za GHRd3 aktivnost. Kako se ovdje koristi, "transgenička životinja" ("transgenic animal") je non-humana životinja, pogodno sisavac, pogodnije glodavac kao što je štakor ili miš, u kojem jedna ili više stanica te životinje uključuju transgen. Drugi primjeri transgenih životinja uključuju non-humane primate, ovce, pse, krave, koze, piliće, vodozemce it.d. Transgen je egzogena DNA koja je integrirana u genom stanice iz koje se razvija transgenička životinja i koji ostaje u genomu odrasle životinje, i s time upravlja ekspresijom kodiranog genskog produkta u jednoj ili više staničnih tipova ili tkiva transgeničke životinje. Kako se ovdje koristi, "homologna rekombinantna životinja" ("homologous recombinant animal") je non-humana životinja, pogodno sisavac, pogodnije miš, u kojemu je endogeni GHR gen (na pr.GHRfl alel) preinačen pomoću homologne rekombinacije između endogenog gena i egzogene DNA molekule umetnute u stanicu životinje, na pr. embrionalnu stanicu životinje, prije nego je počeo razvitak te životinje.

Transgenička životinja iz izuma može biti stvorena umetanjem GHRd3-kodirajuće nukleinske kiseline u muški pronukleus fertilizirane oocite, na pr. putem mikroinjekcije, retrovirusne infekcije, i dozvoljavanjem da se ta oocita razvija u pseudogravidnoj ženskoj životinji pomajci. GHRd3 cDNA sekvenca može biti umetnuta kao transgen u genom non-humane životinje. Intronske sekvence i poliadenilacijski signali mogu također biti uključeni u transgen da se poveća učinkovitost ekspresije toga transgena. Tkivno specifična regulatorna(e) sekvenca(e) može biti operativno vezana uz GHRd3 transgen da usmjerava ekspresiju GHRd3 proteina u posebne stanice. Metode za generiranje transgeničkih životinja putem manipulacije embrija i mikroinjiciranja, naročito životinja kao što su miševi, već su postale konvencionalne u struci i opisane su, na pr. u U.S. pat. br. 4,736,866 i 4,870,009, oba od Leder et al., U.S. pat. br. 4,873,191 od Wagner et al., i u Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Slične metode se koriste za produkciju drugih transgeničkih životinja. Transgenička osnivačka (founder) životinja može biti identificirana na temelju prisustva GHRd3 transgena u njenom genomu i/ili ekspresije GHRd3 mRNA u tkivima i stanicama tih životinja. Transgenička osnivačka životinja može zatim biti korištena da uzgoji dodatne životinje koje nose taj transgen. Štoviše, transgeničke životinje koje nose transgen koji kodira GHRd3 protein mogu se razmnožavati s drugim transgeničkim životinjama koje nose druge transgene.

Da se stvori homologna rekombinantna životinja, pripravlja se vektor koji sadrži barem jedan dio od GHRd3 nukleinske kiseline da time promijeni endogeni GHR (GHRfl) gen. GHRd3 gen može biti ljudski gen ili non-humani homolog od humanog GHR gena (na pr. cDNA izolirana ograničavajućom hibridizacijom s nukleotidnom sekvencom deriviranom od SEQ ID NO: 1, 4 ili 6). Pogodno, non-humani homolog se generira modifikacijom non-humane GHR sekvence, da se deletira nukleinska kiselina od eksona 3. Budući da GHRd3 alel nije opažen u miševa, na primjer, mišja GHRd3 nukleinska kiselina se može pripremiti koristeći poznate metode. Stoga, u određenim aspektima, sintetski mišji GHRd3 gen može se koristiti u homologno rekombinacijskom vektoru pogodnom za promjenu endogenog GHR gena u mišjem genomu. U preferiranoj izvedbi, vektor se dizajnira tako, da se nakon homologne rekombinacije, endogeni GHR gen nadomješta s GHRd3 genom, rečeni GHRd3 gen koji kodira funkcionalni GHRd3 protein (na pr. uzvodna regulatorna regija može biti preinačena da se time promijeni ekspresiju tog endogenoga GHRd3 proteina). U homolognom rekombinacijskom vektoru, GHRd3 gen je bočno ograničen (flanked) na svojim 5' i 3' krajevima s dodatnim nukleinskokiselinskim sekvencama od GHR gena da omogući da se homologna rekombinacija ostvari između egzogenog GHRd3 gena, nošenog tim vektorom i endogenog GHR gena u embrionalnoj matičnoj stanici. Dodatna bočna (flanking) GHR nukleokiselinska sekvenca je dovoljne duljine za uspješnu homolognu rekombinaciju s endogenim genom. Tipično, nekoliko kilobaza od granične (flanking) DNA (i na 5' i na 3' kraju) su uključene u taj vektor (vidi na pr. Thomas, K. R. i Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 za opis vektora za homolognu rekombinaciju). Vektor je umetnut u embrionalnu matičnu staničnu liniju (na pr. elektroporacijom), a stanice u kojima se umetnuti GHRd3 gen homologno rekombinirao s endogenim GHR genom su selektirane (vidi na pr. Li, E. et al., (1992) Cell 69: 915). Ove selektirane stanice su zatim injicirane u blastocistu životinje (na pr. miša) da se formiraju agregacijske himere (aggregation chimeras), (vidi na pr. Bradley, A. u Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). Himerični embrij (chimeric embryo) može zatim biti implantiran u odgovarajuću pseudogravidnu (pseudopregnant) žensku životinju-pomajku (female foster animal) i taj embrij se nosi do poroda (brought to term). Potomstvo koje njeguje tu homologno rekombiniranu DNA u svojim spolnim stanicama može biti korišteno da se rasplođuju životinje u kojima sve stanice od te životinje sadrže homologno rekombiniranu DNA putem prenosa germinativnom linijom (germline transmission) toga transgena. Metode za konstruiranje homolognih rekombinantnih vektora i homolognih rekombinantnih životinja su opisane dalje u Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829, i u PCT International Publication Nos.: WO 90/11354 od Le Mouellec et al.; WO 91/01140 od Smithies et al.; WO 92/0968 od Zijlstra et al.; i WO 93/84169 od Berns et al.

U drugoj izvedbi, mogu se proizvoditi transgeničke non-humane životinje koje sadrže odabrane sisteme koji omogućuju reguliranu ekspresiju tog transgena. Jedan primjer takvog sistema je cre/loxP rekombinazni sistem u bakteriofaga P1. Za opis cre/loxP rekombinaznog sistema, vidi na pr. Lakso et al., (1992) PNAS 89: 6232-6236. Drugi primjer rekombinaznog sistema je FLP rekombinazni sistem od Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., (1991) Science 251: 1351-1355. Ako se upotrebi cre/loxP rekombinazni sistem da regulira ekspresiju transgena, potrebne su životinje koje imaju transgene koji kodiraju i Cre rekombinaze i odabrani protein. Takve se životinje mogu pribaviti putem konstrukcije "dvostruko" transgeničkih životinja, na pr. parenjem dviju transgeničkih životinja, jedne koja ima transgen koji kodira odabrani protein i druge koja ima transgen koji kodira rekombinazu.

Izum će se potpunije shvatiti pozivanjem na slijedeće primjere. Njih se, međutim, ne bi trebalo shvatiti kao limitirajuće za opseg izuma. Sva literatura i citati patenata izričito su inkorporirani ovdje referencom.

PRIMJERI

Primjer 1

PCR RFLP genotipiziranje za GHRd3 i GHRfl

PCR RFLP

PCR amplifikacija je provedena u mikrotitarskim pločama s 96-bunarića (Perkin Elmer), svaki bunarić sadržavao je 50 μl reakcijske smjese uključivo 200 ng DNA, 1,5 mM MgCl2, 5 μl 10X reakcijskog pufera (Perkin Elmer), 0,2 mM svakog dNTP, 0,2 μM od svake početnice i 1,25 U Taq Polymerase (Perkin Elmer).

35 PCR ciklusa su provedena koristeći 9700 Perkin Elmer termocikler. PCR produkti su detektirani na agaroznom gelu.

[image]

Primjer 2

Detekcija GHRd3 alela povezanog s odgovorom na GH

97 djece s idiopatski niskim stasom (idiopathic short stature, ISS) koja su uključena u ispitivanja za liječenje s rekombinantnim GH ispitano je za povezanost zajedničke GHR ekson 3 varijante i odgovora brzine rasta na liječenje s GH. GHRd3 alel je bio prisutan u 47 pacijenata, od kojih su 3 bila GHRd3/d3 homozigoti, a 44 su bili GHRd3/fl heterozigoti, kako je pokazano u Tablici 1.

Tablica 1: GHR genotipska distribucija u bijelih pojedinaca

[image]

Bili su uključeni pacijenti koji su imali normalni niski stas. Isključeni su bili: pacijenti koji su bili "istinski" deficijentni u hormonu rasta ("truly" deficient in growth hormone, GHD), pacijenti koji su imali CNS tumore, pacijenti koji su imali mutacije u GHR genu, pacijenti koji su imali druge hormonske deficite, pacijenti koji su imali Turnerov sindrom, PHP, hipohondroplaziju ili druge koštane displazije, Laronovu bolest ili druge bolesti.

Konačno, uključeni pacijenti nisu pokazivali pubertetske znakove (dojke, testes) prilikom završavanja GH liječenja nakon 2 godine.

Genotipske grupe su bile komparabilne s obzirom na druge medicinske i terapeutske karakteristike. Karakteristike pacijenata uključivale su dob, spol, dozu rGH i duljinu pri porodu (size at birth) a bile su uzete u obzir i visine roditelja (Tablice 2, 3 i 4).

Tablica 2: Klinički i biološki fenotipovi pri početku

[image]

Tablica 3: GH posologija u dvije genotipske grupe

[image] Tablica 4: Veličina pri porodu (size at birth) i parentalne visine

[image]

Brzine rasta bile su praćene tokom razdoblja od dvije godine za vrijeme liječenja s rhGH (Tablica 5). Nakon podešavanja za dob, spol, dozu rGH, djeca koja su nosila tu GHRd3 varijantu rasla su većom brzinom kada su bila liječena s rGH. Brzina rasta bila je 9,0 ± 0,3 cm/god. u prvoj godini terapije i 7,8 ± 0,2 cm/god. u drugoj godini u djece s GHRd3/fl ili GHRd3/d3 genotipovima, uspoređeno sa 7,4 ± 0,2, odnosno 6,5 ± 0,2 cm/god. u djece s GHRfl/fl genotipovima (P<0,0001). Genomička varijacija ove GHR sekvence je stoga povezana sa značajnom razlikom u učinkovitosti rGH.

Tablica 5: Brzine rasta u dvije genotipske grupe

[image]

Za multivarijantnu analizu brzine rasta, miješani linearni model je upotrebljen da modelira korelaciju između intra-individualnih mjera (Tablica 6). Razmatrane kovarijance uključivale su dob, spol, brzinu rasta (growth velocity, GV0) prije liječenja s rekombinantnim GH (učinak jahanja konja), visinu na početku, GH dozu, GHR genotip i subjekt (intercept).

Rezultati su pokazali da je brzina rasta pacijenata s ekson-3 deletiranim GHR (GHRd3) veća kod pacijenata homozigotnim za GHR izoformu pune duljine (full length, GHRfl) nakon podešavanja na kovarijancama. Korelacioni matriks pokazuje da je ovaj efekt nezavisan od drugih kovarijanca.

Tablica 6: Linearni regresijski model za razne parametre

[image]

Claims

1. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens sposoban da se veže na GHR protein, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

2. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za povećavanje visine ili brzine rasta, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

3. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje pretilosti, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

4. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje infekcije, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

5. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje dijabetesa, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

6. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje stanja akromegalije ili gigantizma, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

7. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje stanja povezanog s retencijom natrija i vode, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

8. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje metaboličkog sindroma, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

9. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje poremećaja raspoloženja ili sna, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

10. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje raka, naznačena time, da uključuje određivanje u tom subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

11. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje srčane bolesti, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

12. Metoda za predviđanje odgovora subjekta na agens za liječenje hipertenzije, naznačena time, da uključuje određivanje u subjektu prisustva ili odsustva alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnosti da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na rečeni agens, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

13. Metoda za identificiranje subjekta koji ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost liječenja poremećaja ili stanja agensom sposobnim za vezanje na GHR protein, naznačena time, da sadrži: a) koreliranje prisustva alela GHR gena s odgovorom subjekta na agens sposoban da se veže uz GHR protein; i b) detektiranje alela iz koraka a) u subjektu, time identificirajući subjekt da ima povećanu ili smanjenu vjerojatnost reagiranja na liječenje rečenim agensom.

14. Metoda za identificiranje alela u GHR genu koreliranog s povećanom ili smanjenom vjerojatnosti liječenja poremećaja ili stanja agensom sposobnim za vezanje na GHR protein, naznačena time, da sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti alela GHR gena; i b) koreliranje prisustva alela iz koraka a) s povećanom ili smanjenom vjerojatnosti liječenja poremećaja ili stanja agensom sposobnim da se vezuje uz GHR protein, time identificirajući alel koreliran s povećanom ili smanjenom vjerojatnošću reagiranja na liječenje rečenim agensom.

15. Metoda prema patentnim zahtjevima 1 ili 13 do 14, naznačena time, da navedeni agens koji je sposoban za vezanje na GHR protein, jest agens sposoban za liječenje poremećaja odabranog iz grupe koja se sastoji od: niskog stasa, pretilosti, infekcije ili dijabetesa; stanja akromegalije ili gigantizma ili laktogenog, dijabetogenog, lipolitičkog i proteinskog anaboličkog efekta povezanog s ovime, stanja povezanog s retencijom natrija ili vode; metaboličkih sindroma, poremećaja raspoloženja i sna, raka, srčane bolesti i hipertenzije.

16. Metoda za povećanje rasta subjekta, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da poveća rast subjekta; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

17. Metoda za liječenje subjekta koji pati od pretilosti, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi pretilost ili njene simptome; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

18. Metoda za liječenje subjekta koji pati od dijabetesa, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi dijabetes ili njegove simptome; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

19. Metoda za liječenje subjekta koji pati od infekcije, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi infekciju ili njene simptome; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

20. Metoda za liječenje subjekta koji pati od stanja akromegalije ili gigantizma, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi stanje akromegalije ili gigantizma ili laktogeni, dijabetogeni, lipolitički i proteinski anabolički simptom povezan s ovim; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

21. Metoda za liječenje subjekta koji pati od stanja povezanog s abnormalnom retencijom natrija ili vode, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi rečeno stanje povezano s abnormalnom retencijom natrija ili vode; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

22. Metoda za liječenje subjekta koji pati od metaboličkog sindroma, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi rečeni metabolički sindrom ili njegov simptom; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

23. Metoda za liječenje subjekta koji pati od poremećaja raspoloženja ili sna, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi rečeni poremećaj raspoloženja ili sna ili njegov simptom; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

24. Metoda za liječenje subjekta koji pati od raka, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da liječi rak; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

25. Metoda za liječenje subjekta koji pati od srčane bolesti ili hipertenzije, naznačena time, da metoda sadrži: a) određivanje u subjektu prisutnosti ili odsutnosti alela GHR gena, u čemu se alel korelira s vjerojatnošću da ima povećani ili smanjeni pozitivni odgovor na agens sposoban da popravi rečenu srčanu bolest ili hipertenziju ili njihov simptom; i b) odabir ili određivanje učinkovite količine rečenog agensa za davanje rečenom subjektu.

26. Metoda prema bilo kojem od patentnih zahtjeva 16 do 25, naznačena time, da nadalje sadrži davanje rečene učinkovite količine rečenog agensa rečenom subjektu.

27. Metoda prema bilo kojem od gornjih patentnih zahtjeva, naznačena time, da metoda uključuje determiniranje, da li DNA subjekta kodira GHR polipeptid koji ima deleciju u eksonu 3.

28. Metoda prema bilo kojem od gornjih patentnih zahtjeva, naznačena time, da metoda uključuje determiniranje u subjektu prisustva ili odsustva GHRd3 alela.

29. Metoda prema patentnim zahtjevima 27 ili 28, naznačena time, da metoda uključuje determiniranje, da li je subjekt heterozigot ili homozigot za GHRd3 alel.

30. Metoda prema patentnim zahtjevima 27 do 29, naznačena time, da rečeni korak određivanja uključuje detektiranje GHRd3 nukleinske kiseline u uzorku.

31. Metoda prema patentnom zahtjevu 30, naznačena time, da rečeni korak određivanja nadalje uključuje izvođenje pokusa hibridizacije.

32. Metoda prema patentnim zahtjevima 27 do 29, naznačena time, da rečeno određivanje uključuje detektiranje GHRd3 polipeptida u uzorku.

33. Metoda prema patentnom zahtjevu 32, naznačena time, da rečeni korak određivanja uključuje detektiranje vezivanja antitijela uz GHRd3 polipeptid u uzorku.

34. Metoda prema bilo kojem od gornjih patentnih zahtjeva, naznačena time, da subjekt, jest ljudski subjekt.

35. Metoda prema patentnom zahtjevu 16, naznačena time, da subjekt ima ISS.

36. Metoda prema patentnom zahtjevu 16, naznačena time, da subjekt ima visinu manju od oko 2 standardne devijacije ispod normale za dob i spol.

37. Metoda prema patentnom zahtjevu 16 ili 26, naznačena time, da nadalje uključuje detektiranje, da li subjekt ima visinu manju od oko 2 standardne devijacije ispod normale za dob i spol.

38. Metoda prema bilo kojem od gornjih patentnih zahtjeva, naznačena time, da rečeni agens jest rekombinantni polipeptid hormona rasta, ili njegov fragment ili njegova varijanta.

39. Metoda prema patentnom zahtjevu 38, naznačena time, da je učinkovita količina GH veća od oko 0,2 mg/kg/tjedan.

40. Metoda prema patentnom zahtjevu 38, naznačena time, da je učinkovita količina GH veća od oko 0,25 mg/kg/tjedan.

41. Metoda prema patentnom zahtjevu 38, naznačena time, da je učinkovita količina GH veća ili jednaka od oko 0,3 mg/kg/tjedan.

42. Metoda prema patentnom zahtjevu 38, naznačena time, da je učinkovita količina GH između oko 0,01 mg/kg/dan i oko 0,2 mg/kg/dan.

43. Metoda prema patentnom zahtjevu 38, naznačena time, da je učinkovita količina GH između oko 0,01 mg/kg/dan i oko 0,1 mg/kg/dan.