CN103014005A - 双峰驼a-fabp蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。通过克隆测序获得双峰驼A-FABP基因的核苷酸序列，并对不同物种A-FABP基因的CDS序列进行同源性比较，了解和验证A-FABP基因的结构特点，为今后研究A-FABP基因与双峰驼脂类和能量代谢的关系提供基础资料。双峰驼A-FABP蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此,通过对A-FABP从基因、蛋白等多方面的研究,必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。

Description

双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty cid binding protein，A-FABP)，又称FABP4或ap2，是脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding proteins，FABPs)家族中的一员。其最早是在脂肪组织中被发现。A-FABP分布广泛，但主要是在脂肪细胞和巨噬细胞中表达。

人A-FABP基因定位于第8号染色体q21，小鼠A-FABP基因定位于第3号染色体，猪A-FABP基因定位于4号染色体。猪A-FABP基因同人、小鼠和大鼠A-FABP基因序列相比，分别有90％，83％及8l％的相似性。小鼠A-FABP基因4个外显子分别编码24，58，34和16个氨基酸，3个内含子分别为2629，840，和471 bp。鸡A-FABP基因4个外显子也分别编码24，58，34和16个氨基酸，3个内含子分别为l 240，224和l 284 bp。人A-FABP基因4个外显子亦分别编码24，58，34和16个氨基酸，3个内含子大小分别为2496，910，和498 bp。对FABPs氨基酸组成进行比较分析发现，种间同型FABP具有较高相似性，并且这种相似程度大于同种不同型FABP相似性。

A-FABP蛋白通过影响脂代谢过程中的关键酶及其受体的表达 ,参与细胞内信号转导 ,在脂类的代谢和转运中起着重要作用。A-FABP可以结合各种细胞内脂肪酸 ,可能介导细胞腔隙间的脂质转运 ,也可以与激素敏感脂肪酶形成一个 1∶ 1的复合物 ,提高脂肪酶的效率 ,从而促进脂解和脂肪酸从脂肪细胞流出。此外 , A-FABP可以调节脂肪和肌肉组织中脂肪酸的成分和利用率。动物实验表明 A -FABP是动脉粥样硬化的主要介质。Makowski和Boord等对载脂蛋白 E (APOE) 2/2 的小鼠模型的研究发现 ,不管给予小鼠高脂肪饮食还是低脂肪饮食 ,敲除 A-FABP基因几乎可以完全保护小鼠不受动脉粥样硬化的危害。但给予 1年的高脂肪的致动脉粥样硬化的饮食 , APOE2/2 A -FABP2/2 组小鼠的幸存率为 67% ,明显高于 APOE2/2 对照组 ,主要是由于动脉粥样硬化斑块的稳定性。A-FABP与各种疾病的关系主要与其调节脂质和参炎症反应有关 ,与代谢综合征 , 2型糖尿病 , 多卵巢综合征,动脉粥样硬化和肿瘤进展关系密切。但其能否成为这些疾病的预测和临床诊断指标 ,有待深入研究;另外 A-FABP与其他与代谢综合征关系密切的疾病 ,如非酒精性脂肪肝的关系也有待研究。

在动物方面A-FABP基因遗传变异方面的报道较少，至今尚未发现克隆获得双峰驼A-FABP基因编码蛋白序列以及对动物A-FABP基因进化规律研究的报道。A-FABP在能量代谢 ,炎症反应起重要调节作用 ,和某些肿瘤的临床分期及病理分化程度有较好的对应关系,因此, 通过对A-FABP从基因、蛋白质和抑制剂等多方面的研究, 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望。

双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节，驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行能量代谢研究。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，A-FABP蛋白通过影响脂代谢过程中的关键酶及其受体的表达 ,参与细胞内信号转导 ,在脂类的代谢和转运中起着重要作用，本发明克服了上述现有技术之不足，提供了一种新的双峰驼A-FABP蛋白的编码核苷酸序列，该序列是一种在能量代谢 ,炎症反应起重要调节作用的基因，通过对A-FABP从基因、A-FABP蛋白等多方面的研究, 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼A-FABP蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

上述重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；

第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。

本发明双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节，驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行能量代谢研究。本发明通过克隆测序获得双峰驼A-FABP基因的核苷酸序列，并对不同物种A-FABP基因的CDS序列进行同源性比较，了解和验证A-FABP基因的结构特点，为今后研究A-FABP基因与双峰驼脂类和能量代谢的关系提供基础资料。双峰驼A-FABP蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此, 通过对A-FABP从基因、蛋白等多方面的研究, 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。

附图说明

附图1为双峰驼A-FABP基因RT-PCR产物电泳图。

附图2为构建系统发生树所用A-FABP蛋白氨基酸同源性比较。

附图3为不同物种A-FABP氨基酸序列系统进化树

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述：

实施例1，一种双峰驼A-FABP蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。本发明中的双峰驼A-FABP蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的A-FABP蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。

可根据实际需要，对上述双峰驼A-FABP蛋白基因作进一步优化或/和改进：

双峰驼A-FABP蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为944bp，电泳结果见附图1， 其中70-72位为起始密码子ATG，823-825位为终止密码子TGA，70-825位为编码蛋白质区域（CDS）。

实施例2，一种双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。

可根据实际需要，对上述双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进：

重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。将双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA序列中的编码序列（CDS）按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。

重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

实施例3，一种双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取

1.     组织分离(Isolation)

从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于－70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。

2. 总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1) 提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜,用自来水反复冲洗,再用蒸馏水冲洗2遍,180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响,可用0.5%的SDS处理。

 Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理,即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液,室温放置过夜,高压灭菌30分钟DEPC失活。

（2）组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol（trizal reagent, invitrogen BRL, USA）的匀浆器管中匀浆。4℃ 12000g离心10分钟。吸取上清液，15-30℃温育5分钟。加0.2ml氯仿,盖上盖子,用手剧烈震荡15秒。15-30℃温育2-3分钟。4℃ 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇,混合均匀。15-30℃温育10分钟, 4℃ 12000g离心10分钟,离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清,加1ml 75%乙醇洗涤RNA, 4℃ 7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水（RNase free）中分装，-70℃保存。

（3）组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH,1mM EDTA）浸泡4－5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在10ul上样缓冲液（2×TBE，13%菲可，0.1%溴酚兰，7M 尿素）中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2－3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。

第二步，引物设计及合成 

根据GenBanK发表的牛（Accession No: NM_001192410.1）、人（Accession No: BC003672.1）、马（Accession No: XM_001489404.1）等物种的A-FABP蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼A-FABP蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3（正向）和SEQ ID NO.4（反向），序列信息如下：

SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’

SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT

第三步，RT-PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor (40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul Oligo dT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20 ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃ 变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃ 1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

第四步，蛋白基因的克隆

1、PCR扩增片段的回收：片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下： 尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入300ulS1液的比例加S1液, 50℃水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱, 10000g离心1分钟,倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液,静置1分钟后, 10000g离心15秒, 倒掉管中液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulT1液, 静置1分钟后, 10000g离心1分钟， EP管中液体即为回收的DNA。

2、回收片段同T载体的连接：连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒, 操作过程如下：在EP管中制备下列连接反应液:pMD 18-T Vector(50ng/ul) 0.5ul，DNA 20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul。将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以),产物用于转化感受态细胞。

3、质粒的转化：从—70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟。取100ul铺于LB平板上,平板含0.1%(V/V)的氨苄青霉Amp (100mg/ml)。37℃恒温培养10-15小时。

4、转化菌落的PCR鉴定与培养：用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml),37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

5、质粒的回收：质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中,4000转/分钟离心,倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulP1液,振荡悬浮。加入250ulP2液,温和摇匀,室温静置4分钟。加入350ulP3液, 温和摇匀。离心10分钟,将上清液小心移入吸附柱,离心15秒,倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1,离心15秒,倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1, 静置1分钟,离心15秒,倒掉液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中,在吸附膜中央加入25-30ulT1液, 静置1分钟后, 离心1分钟. EP管中液体即为回收的质粒。

6、质粒的酶切鉴定：为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒,采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下:根据TaKaRa pMD18-T Vector图,选择内切酶Bam HⅠ和Hin d Ⅲ.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam HⅠ1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA ≤1ul，加dH2O至 20ul。30℃反应3小时。琼脂糖凝胶电泳检测.

实施例4，重组质粒的测序： 取20ul重组质粒于EP管中,封口膜密封,交生物技术公司测序。

实施例5，双峰驼A-FABP蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建

1、双峰驼A-FABP蛋白基因编码序列同源性比较

在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等17种动物的A-FABP蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较（见附图2）。比较结果显示：SEQ ID NO.2序列与牛A-FABP蛋白氨基酸序列同源性为77.00%。

2、A-FABP蛋白基因编码序列系统发生树构建

在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等17种物种的17条A-FABP蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树（见附图3）。结果显示：双峰驼A-FABP蛋白基因同牛的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼A-FABP蛋白基因。

 

序列表：

<110> 新疆旺源驼奶实业有限公司

<120>  双峰驼A-FABP蛋白的蛋白编码序列

<160>  4     

<210>  1

<211>  944

<212>  DNA

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  1

ggtcatagca ccttcctgac agctacagct tttttctcat cttgaagata atcctagaaa        60

tctcataaaa tgtgcgatgc gtttgtgggc acctggaaac ttgtctccag tgaaaacttt       120

gatgattaca tgaaagaagt gggagtgggc tttgccacca ggaaagtggc cggcatggcc       180

aaacccaacg tgaccatcag tgtgaatggg gacgtgatca acattaaatc tgaaagtacc       240

tttaaaaata ccgagatttc cttccaactg ggccaggaat ttgatgaagt cacggcagat       300

gacaggaaag tcaagagcat cgtaacttta gaaggaggtg ccctggtcca agtgcagaag       360

tgggacggaa aatcaaccac cataaagaga aaactagtgg atgacaaact ggtggtgctt       420

tccatcatga ttgagcactt cttgggaacc tggaagctgg tctccagtga aaactttgag       480

gaatacctga aacaactggg aatgagtgtt acagaccaga accttgcagg gttagcaaag       540

ccgagaatca ccattagtgc tgacaaggag aaggttaaca tcaagacaga aagttctttc       600

aagaactttg agatctcctt caagctgggg gaagaatttg atgaaaccac agcagacaac       660

cgcaaagtga agagtatcgt aaaattagat ggtggctcaa tgattcatgt ccaaaaatgg       720

cttgacaaag agaccacaat caaaagacga attgtagatg gcaaaatggt agtggaatat       780

accatgaata atattgtcag cactcgaatc tatgaaaaag tgtgaagttt tcatcgaact       840

tctgttggat atattgccca aacatgtatt gttattttct actaattagc aagcaactaa       900

tctccctcaa actgatttta ttcaatgtga tgtgttcgtt aaat                            944

<210>  2

<211>  251

<212>  PRT

<213>  阿拉善盟双峰驼

<400>  2

MCDAFVGTWK LVSSENFDDY MKEVGVGFAT RKVAGMAKPN VTISVNGDVI NIKSESTFKN        60

TEISFQLGQE FDEVTADDRK VKSIVTLEGG ALVQVQKWDG KSTTIKRKLV DDKLVVLSIM       120

IEHFLGTWKL VSSENFEEYL KQLGMSVTDQ NLAGLAKPRI TISADKEKVN IKTESSFKNF       180

EISFKLGEEF DETTADNRKV KSIVKLDGGS MIHVQKWLDK ETTIKRRIVD GKMVVEYTMN       240

NIVSTRIYEK V                                                                       251

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  3

ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC                                          21

<210>  4

<211>  

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  4

Oligo dT

Claims (8)

1.一种双峰驼A-FABP蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的双峰驼A-FABP蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。

3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO.2所示的序列。

5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT。

8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；

第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下：

正引物，SEQ ID NO.3（正向）：5’- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，

反引物，SEQ ID NO.4（反向）：Oligo dT；

第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；

第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。

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