KR102134896B1

KR102134896B1 - 소포체 스트레스 반응 조절 물질인 prkcsh 단백질의 간암 진단 표지 인자 및 치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR102134896B1
Application number: KR1020180070860A
Authority: KR
Inventors: 김균환; 신구철
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2020-07-16
Also published as: KR20190143197A

Abstract

본 발명은 소포체 스트레스 반응(Endoplasmic reticulum stress response)에서의 PRKCSH의 역할에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 소포체 스트레스 조건 하에서 PRKCSH가 IRE1α와 물리적으로 상호작용하여 UPR(Unfolding Protein Response) branch 중 IRE1α만을 선택적으로 활성화함으로써, IRE1α의 인산화 및 올리고머화를 유도하여 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호하는 작용기전을 발견하였다. 이에, 본 발명은 PRKCSH가 암 발생에 관여하는 새로운 작용기작을 제공하는 것이다.

Description

소포체 스트레스 반응 조절 물질인 PRKCSH 단백질의 간암 진단 표지 인자 및 치료제로서의 용도 {A use of PRKCSH protein regulating the endoplasmic reticulum stress response as liver cancer marker and therapeutic candidate}

본 발명은 소포체 스트레스 반응에서의 PRKCSH 단백질의 용도에 관한 것이다.

암의 발달은 종종 영양소 결핍, 산화 스트레스 및 대사 변화와 같은 세포 독성 조건과 관련된다. 이러한 조건은 세포가 스트레스에 대처하고 번역을 약화시키며, 단백질 접힘, 분비 및 분해를 촉진함으로써 정상적인 소포체의 기능을 회복시키는데 도움이 되는 UPR(unfolded protein response)을 유도한다. 장기간의 소포체 스트레스(ER stress)로 인해 세포 사멸이 발생할 수 있으나, 대부분의 종양에서는 만성 소포체 스트레스 반응이 종양의 성장과 생존에 결정적인 역할을 한다. 또한, UPR은 TNF-α, IL-8 및 VEGF와 같은 종양 성장 인자의 발현을 촉진하여 종양의 발생과 진행에 관여한다(비특허문헌 1 및 2). UPR 신호는 PERK(RNA-dependent protein kinase-like ER kinase), ATF6(activating transcription factor 6), 및 IRE1α/ERN1(inositol-requiring enzyme 1α)의 3가지 요소에 의해 독립적으로 매개된다(비특허문헌 3 내지 6). 다양한 종양은 세포 유형이나 조직기원에 따라 상이한 UPR branch의 활성화를 나타낸다; 그러나 아직 종양에 있어서 UPR branch가 활성화되는 분자기작에 대해서는 알려지지 않은 상태이다.

IRE1α는 UPR의 센서로 작용하는 ER-resident transmembrane이다(비특허문헌 7). 여러 단백질 카이네이즈 중에서 IRE1α는 종양 발달의 주된 원인으로 제시되어 왔다. 일부 암에서는 IRE1α 경로의 활성화가 스트레스 하에서 세포 생존과 종양 발달에 관련있다는 보고가 있었다. IRE1α는 몇몇 종양 촉진인자의 발현과 관련이 있는데, IRE1α는 자가인산화(autophosphorylation) 및 올리고머화(oligomerization)에 의해 활성화되어 RNase의 활성화를 유도하고, XBP1 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 유도한다. XBP-1은 ERAD(ER-associated degradation)과 단백질 접힘(folding)을 담당하는 유전자를 조절하는 독특한 전사인자이다. IRE1α의 RNase 활성을 제외하고는 IRE1α의 인산화는 소포체 스트레스 하에서 JNK 및 p38 MAPK 활성화를 촉진하기 위해 TRAF2를 모집한다. 활성화된 IRE1α는 소포체 스트레스에 대한 SH2/SH3 domain-containing adaptor Nck의 분해를 통해 ERK MAPK의 활성을 유도한다. IRE1α의 활성화는 소포체 막에서 복잡한 단백질 플랫폼인 UPRosome에 의해 조절된다(비특허문헌 8). Bax 억제제-1(BI-1)은 IRE1α의 세포질 도메인과 복합체를 형성하여 IRE1α 신호 전달을 억제한다. BAX, BAK, AIP1(ASK1-interacting protein) 및 Hsp72는 IRE1α의 세포질 도메인과 연관되어 있으며, 그 활성화를 촉진시킨다. 따라서, IRE1α의 결합 파트너는 신호 전달 경로의 선택적 활성화와 소포체 스트레스시 세포 운명을 결정하는 주요한 조절인자이다.

Protein kinase C substrate 80K-H(PRKCSH/Hepatocystin)은 일반적으로 소포체 루멘에 존재하며, 글루코시데이즈 II(glucosidase II)의 비촉매(noncatalytic) β subunit으로 작용한다(비특허문헌 9 내지 11). 이는 새로 합성된 당 단백질을 처리하고 소포체 단백질의 'quality control'에 관여하는 GIIα(glucosidase II α subunit)과 heterodimeric GII 복합체를 형성한다. PRKCSH는 소포체 막을 가로지르는 신호 서열을 포함하는 다중 도메인, N-말단 GIIα-binding domain(G2B) coild-coil segment, E/P(glutamic acid 및 proline-rich) segment, C-말단 MRH(mannose 6-phosphate receptor homology) domain을 포함하며, 이 다음에는 소포체 보존(retention)을 위한 HDEL 신호 서열이 뒤따른다.

소포체 루멘에서 GIIα의 발현과 지속, 및 최적의 GII 활성을 유지하기 위해 RPKCSH의 소포체-전좌(translocation)가 필요하다. RPKCSH의 유전적 소실은 ADPLD(autosomal dominant polycystic liver disease)에 관여한다. ADPLD의 분자 메커니즘은 PRKCSH의 결핍이 PKD2(TPR 계열의 채널)의 GII-dependent glucose trimming을 손상시키고 부적절한 접힘을 유도하는 것이다. PRKCSH 대립 유전자의 손실은 마우스나 제노푸스(xenopus laevis) 모델에서 배아에 치명적이다. 게다가 증가된 PRKCSH의 발현은 유방암에서 림프절 전이의 진행과 상관관계가 있다고 보고되었다(비특허문헌 9).

이에, 본 발명은 잠재적으로 종양 형성에 관여하는 소포체 스트레스 반응(Endoplasmic reticulum stress response)에서의 PRKCSH의 역할에 대해 제시하고자 한다.

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본 발명은 소포체 스트레스 반응에서의 PRKCSH의 작용기작을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자들은 종양 형성과 관련된 소포체 스트레스 반응(Endoplasmic reticulum stress response)에서의 PRKCSH의 작용기전에 대해 연구하던 중, PRKCSH를 넉아웃(knockout)시킴으로써 PRKCSH가 IRE1α와의 물리적 상호작용을 저해하여 종양 발생 및 발달을 조절할 수 있음을 확인하였다.

연구 결과, 본 발명은 소포체 스트레스 반응에서의 PRKCSH의 역할에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 소포체 스트레스 조건 하에서 PRKCSH가 IRE1α와 물리적으로 상호작용하여 UPR branch 중 IRE1α만을 선택적으로 활성화시킴으로써, IRE1α의 인산화 및 올리고머화를 유도하고 이를 통해 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호하는 작용기전을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본원발명은 소포체 스트레스 반응에서의 PRKCSH의 신규한 작용기전에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은,

PRKCSH 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서, “PRKCSH(protein kinase C substrate 80K-H)”는 소포체(Endoplasmic reticulum, ER)에서 N-말단에 연결된 글리칸 처리 효소인 글루코시데이스 II의 베타-서브유닛을 암호화하는 유전자를 말한다. 상기 PRKCSH는 포유동물 유래, 바람직하게는 사람 또는 사람과 동일한 계통의 PRKCSH 및 그의 돌연변이체일 수 있다. 사람과 같은 계통이라 함은 유전자 또는 mRNA가 사람의 PRKCSH 유전자 또는 이로부터 유래하는 mRNA와 80% 이상의 서열 유사성을 가진 다른 포유동물을 말하는 것으로, 구체적으로, 사람, 영장류, 설치류 등을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 PRKCSH를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 5의 염기서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서 상기 PRKCSH는 GenBank Accession No. NM_001001329, NM_001293650, NM_001289102, NM_001293651, NM_001289103, NM_008925, NM_001289104 또는 NM_002743에 공지된 서열에서 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 PRKCSH 단백질은 GenBank Accession No. NP_001280579, NP_001276031, NP_001280580, NP_001276032, NP_032951, NP_001276033 또는 NP_002734에 공지된 서열에서 선택될 수 있다.

상기 “PRKCSH 억제제”는 PRKCSH 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질을 넉아웃(knock-out)시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키거나, PRKCSH와 IRE1α의 물리적 상호작용을 방해하는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 PRKCSH 억제제는 PRKCSH 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, PRKCSH 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 PRKCSH 억제제는 SEQ ID NO: 1의 염기서열을 갖는 siRNA 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열을 갖는 siRNA 중 선택되는 siRNA일 수 있다.

본 명세서에서, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.

상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “벡터”는 폴리펩타이드를 코딩하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

또한, 상기 안티센스는 PRKCSH 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 PRKCSH 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 생쥐상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 항체는 c-FLIP 단백질에 대한 다클론 항체, 단클론 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 “Fab” 단편, 및 그 나머지인 “Fc” 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유 동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역 보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 면역 보강제는 포유 동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al. Nature, 256:495(1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 문헌(Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581-597(1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 “키메라” 항체를 포함한다(Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)).

비-인간(예컨대, 쥐과 동물) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)).

상기 약학 조성물은 PRKCSH 억제제를 통해 PRKCSH를 넉아웃시킴으로써, 종양 형성을 조절할 수 있다. 하기 실시예에서는, 간 세포에 siRNA을 처리하여 PRKCSH를 억제시킴으로써, PRKCSH가 소포체 스트레스 하에서 IRE1α와 물리적 상호작용을 나타내는 메커니즘을 새로이 밝혔다. 구체적으로, PRKCSH는 3가지 UPR branch(IRE1α, PERK 및 ATF6) 중 IRE1α만을 선택적으로 활성화시키고 이와 물리적으로 상호작용함으로써 세포 사멸(apoptosis)로부터 종양 세포를 보호하는 것을 확인하였다. 또한, PRKCSH의 E/P 도메인이 IRE1α와의 물리적 결합에서 필수적인 요소임을 확인하였다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화 나트륨 및 아연염), 교질성실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적하반 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 c-FLIP 억제제를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 성인의 경우, 본 발명의 PRKCSH 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1 ng/kg ~ 10 g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체인 경우 0.1 ng/kg ~ 10 g/kg, 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA일 경우 0.01 ng/kg ~ 10 g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명에서, “치료”는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 간암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명은 간암 환자로부터 분리한 생물학적 시료와 후보물질을 접촉시킨 후, 접촉 전과 비교하여 후보물질이 PRKCSH와 IRE1α의 상호작용을 촉진하는지 또는 억제하는지 판단하는 것을 포함하는 간암 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 간암 환자로부터 채취한 생물학적 시료와 후보물질을 접촉시키는 단계를 수행할 수 있다.

상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 PRKCSH 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 PRKCSH 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제, 넉아웃(knockout)시키는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나, PRKCSH와 IRE1α의 상호작용을 방해하거나 소포체 스트레스 하에서 IRE1α의 인산화 및/또는 올리고머화를 억제하는 물질 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

상기 생물학적 시료로는 간으로부터 분리한 세포 또는 조직일 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 시료에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양, 단백질의 활성 또는 IRE1α와의 결합 여부를 측정 또는 확인할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되거나, IRE1α와의 결합 여부가 확인되면 상기 후보물질은 간암을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기 후보물질이 소포체 스트레스 하에서 IRE1α의 인산화 및 올리고머화를 유도하지 못하게 함으로써 소포체 스트레스 하에서 IRE1α가 종양 세포를 보호하는 것을 저해함으로써 세포사멸을 유도할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 후보물질은 PRKCSH 유전자의 발현을 억제시키는 siRNA일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, PRKCSH 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 후보물질은 간암 치료제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 상기 간암 치료제 후보물질은 이후의 간암 치료제 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 PRKCSH 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 억제시키는 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 간암 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

또한, 본 발명은 PRKCSH의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에 있어서, 상기 진단은 간암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에 있어서, “간암(liver cancer)”은 원발성(primary) 간암 또는 전이성(metastatic) 간암을 모두 포함하는 것이나, 전이성 간암일 수 있다. 또한, 상기 간암은 간세포암종(hepatocellular carcinoma) 또는 담관암(cholagiocarcinoma)을 모두 포함하는 것이나, 간세포암종일 수 있다. 또한, 상기 간암은 초기 간암, 진행성 간암 또는 말기 간암일 수 있다.

본 발명에서는, 종양 세포에서 PRKCSH가 상향 발현되어 있으며, 소포체 스트레스 하에서 PRKCSH와 IRE1α가 물리적 상호작용을 통해 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호하는 것을 확인함으로써, 소포체 스트레스 하에서 PRKCSH가 과발현되어 있는 경우 상기 PRKCSH를 간암의 마커로써 사용할 수 있음을 밝혔다.

본 발명에 있어서, “간암의 진단용 마커”란 간암이 발병됨을 확인할 수 있는 물질로, 정상 개체에 비해 간암 개체의 조직(생물학적 시료)에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 상기 유기 생체 분자로는, 예컨대 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 간암 진단용 마커는 ER 스트레스 조건 하에서 특이적으로 과량 발현하는 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산일 수 있다.

본 발명의 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단은 생물학적 시료 중 본 발명의 마커 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 확인함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 마커 단백질의 발현 수준은 당업계에 공지된 다양한 분석 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 수준은 PRKCSH에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대, PRKCSH mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브나; PRKCSH 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 전자 중재 증폭 (TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholmet al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노 퓨린을 포함할 수 있다.

상기 PRKCSH에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유 결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌(Clacksonet al., Nature,352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).

상기 PRKCSH의 발현 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

예컨대, 상기 방법에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예컨대 유전자의 발현 수준 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), RNase 보호 분석법, 노던 블랏, 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이 경우, 생물학적 시료 내의 PRKCSH 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

상기 생물학적 시료는 간암이 의심되는 개체로부터 얻은 시료를 말하며, 상기 시료로는 개체로부터 분리한 세포 또는 조직일 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통해, 대조군의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양 또는 간암이 의심되는 개체에서의 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 진단 마커를 검출할 수 있다. 즉, PRKCSH의 발현 수준이 증가한 경우, 간암임을 알 수 있는 것이다.

본 발명의 간암 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속 이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 간암 진단용 조성물은 진단용 키트, 마이크로어레이 및 DNA 칩의 형태로 제공 될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등이 있다.

또한, 본 발명은 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 PRKCSH의 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 간암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 정보 제공 방법에 있어서, PRKCSH의 발현 정도를 확인하기 위한 방법, 생물학적 시료 등의 모든 내용은 앞서 기술한 모든 내용을 그대로 적용할 수 있다.

또한, 본 발명은 치료상 유효량의 PRKCSH 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 간암의 치료 방법을 제공한다.

여기서 사용된 용어 “대상체”는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기서 사용된 용어 “치료상 유효량”은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 치료방법에서 PRKCSH 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 골수내, 심장내 또는 국소 투여 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 소포체 스트레스 반응에서의 PRKCSH의 역할에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 소포체 스트레스 조건 하에서 PRKCSH가 IRE1α와 물리적으로 상호작용하여 UPR(Unfolding protein response) branch 중 IRE1α만을 선택적으로 활성화함으로써, IRE1α의 인산화 및 올리고머화를 유도하여 세포 사멸로부터 종양 세포를 보호하는 작용기전을 발견하였다. 이에, 본 발명은 PRKCSH가 암 발생에 관여하는 새로운 작용기작을 제공하는 것이다.

도 1은 암 조직에서의 PRKCSH의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 간세포암종 조직에 대한 면역조직화학검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상 간 세포주와 간암 세포주에서의 PRKCSH의 발현 수준을 면역탁본법을 통해 확인한 결과(왼쪽), PRKCSH의 발현과 임상병리학적 매개 변수 사이의 관계를 분석한 결과(가운데) 및 57명의 간암 환자에서 PRKCSH mRNA 발현 수준과 환자의 생존율간의 연관성을 분석한 결과이다(오른쪽).
도 4a는 튜니카마이신(TM)으로 처리했을 때의 PRK 세포와 Mock 세포의 XBP1 mRNA, 스플라이싱된 XBP1 mRNA의 발현 수준을; b는 스플라이싱된 XBP1 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5a는 포도당 고갈 조건에서의 스플라이싱된 XBP1 단백질의 발현 수준; b와 c는 각각 포도당 고갈 조건에서 PRK KO 세포의 스플라이싱된 XBP1 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6a는 PRK 세포에서의 ERK1/2 및 JNK1/2의 활성화 정도를; b는 TM 처리시 PRK KO 세포에서의 ERK1/2 및 JNK1/2의 활성화 정도를 나타낸 것이다.
도 7a는 포도당 고갈 조건에서 PRK KO 세포에서의 ERK1/2 및 JNK1/2의 활성화 정도를; b는 TM 처리 조건에서의 XBP1 표적 유전자인 ERDJ4, GRP78, Sec61A1 및 p58IPK의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 TM 처리 조건에서의 PRKCSH-넉다운 HepG2 세포의 스플라이싱된 XBP1 mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 9는 PRKCSH-넉다운 Huh-7 세포의 스플라이싱된 XBP1 mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 10a는 TM 처리 조건에서 siRNA를 처리한 HepG2 세포의 XBP1 mRNA의 발현 수준을; b는 siRNA를 처리한 Huh-7 세포의 XBP1 mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 11a는 siRNA를 처리한 HepG2 세포의 ERK1/2 및 JNK1/2 MAPKs의 활성화 정도를; b는 siRNA를 처리한 Huh-7 세포의 ERK1/2 및 JNK1/2 MAPKs의 활성화 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 간암 조직에서의 XBP1 표적 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 13은 폐암 조직에서의 XBP1 표적 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 14a는 TM 처리 조건에서 PRK 세포의 IRE1α의 인산화 수준을; b는 PRK KO 세포의 IRE1α의 인산화 수준을 나타낸 것이다.
도 15a는 포도당 고갈 조건에서 PRK KO 세포의 IRE1α의 인산화 수준을; b는 TM 처리 조건에서 siRNA를 처리한 HepG2 세포의 IRE1α의 인산화 수준을 나타낸 것이다.
도 16a는 TM 처리 조건에서 siRNA를 처리한 Huh-7 세포의 IRE1α의 인산화 수준을; b는 Flag 및 Venus-태그된 형광 인간 IRE1α 융합 구조체(IRE1α-FV)를 형질감염시킨 세포의 foci 형성 정도를 확인하여 IRE1α의 올리고머화를 확인한 결과이다.
도 17은 Flag 및 Venus-태그된 형광 인간 IRE1α 융합 구조체(IRE1α-FV)를 형질감염시킨 Huh-7 간암 세포에서 IRE1α의 올리고머화 정도를 나타낸 것이다.
도 18a와 b는 L02 세포(정상 간 세포)에서 각각 TM 처리 조건과 포도당 고갈 조건에서 PRKCSH와 IRE1α가 물리적으로 상호작용하는지 공동면역침전법을 통해 확인한 결과이다.
도 19a와 b는 TM 처리 조건에서 각각 HepG2 세포와 Huh-7 세포에서 PRKCSH와 IRE1α가 물리적으로 상호작용하는지 공동면역침전법을 통해 확인한 결과이다.
도 20a와 b는 TM 처리 조건에서 각각 Flag-태그된 PRKCSH 구조체(PRK-Flag)와 IRE1α-FV로 형질감염시킨 L02 세포에서 PRKCSH와 IRE1α가 물리적으로 상호작용하는지 공동면역침전법을 통해 확인한 결과이다.
도 21 및 22는 GST-PRKCSH 결실 돌연변이체와 정제된 IRE1α로 pull-down assay를 수행한 결과이다.
도 23 및 24는 WT형 PRKCSH와 ΔE/P 돌연변이체로 형질전환시킨 L02 세포에서 IRE1α의 인산화, XBP-1 스플라이싱, 및 ERK 활성화 수준을 면역블랏 분석을 통해 평가한 결과이다.
도 25a, b는 TG 및 TM 처리 조건에서 L02 세포의 ER 스트레스에 따른 세포 사멸 및 PARP1 절단을 모니터링한 결과를 나타낸 것이다.
도 26a는 siRNA를 처리한 Huh-7 세포에서 ER 스트레스에 따른 세포 사멸을; b는 Huh-7 세포에서 PARP1의 절단 정도를 확인한 결과이다.
도 27a는 TG 및 TM 처리 조건에서 Huh-7 세포의 세포 사멸 정도를; b는 PARP1의 절단 정도를 확인한 결과이다.
도 28a는 PRKCSH의 과발현에 따른 TNF-α, IL-8 및 VEGF의 발현 수준을; b는 HepG2 세포 및 Huh-7 세포에서 siRNA 처리에 따른 TNF-α, IL-8 및 VEGF의 발현 수준을; c는 PRK 세포의 ER 스트레스에 따른 세포 사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 29a는 IRE1α-넉다운 세포에서 ER 스트레스에 따른 PARP1 절단 정도를; b는 PRK 세포에서 IRE1α에 대한 siRNA를 처리한 후 TNF-α, IL-8 및 VEGF의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명에서 밝힌 UPR 신호 전달 경로에서의 PRKCSH의 역할을 도식화한 것으로, 휴지기에서 PRKCSH는 글루코시다아제 II의 비 촉매적 β 서브유닛으로서 폴딩된 당 단백질을 분비하거나 ERAD 경로에 의한 분해를 위해 미스폴딩된 당 단백질을 표적화하는 작용으로 알려져 있으나, ER 스트레스 조건 하에서 PRKCSH는 E/P 도메인을 통해 IRE1α와 물리적으로 결합하여 IRE1α의 자가 인산화 및 올리고머화를 유도하여 IRE1α를 선택적으로 활성화시키는 작용을 한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 실험재료 및 방법

<1-1> 플라스미드 제작

인간 PRKCSH 유전자(Genbank No. NM_001001329)를 간암 세포주 Huh-7 세포의 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다. 태그되지 않은 PRKCSH cDNA는 pcDNA 3.1 벡터의 BamH I/Xba I 부위에 삽입하였다. 전장(Full-length) WT형 PRKCSH와 C-말단에 Flag-태그된 결실(deletion) 돌연변이체(ΔG2B, ΔE/P, MRH, G2B)는 pcDNA 3.1 벡터의 BamH I/Xba I 부위에 삽입하였다.

<1-2> 세포 배양 및 형질전환( transfection )

HepG2(HB-8065), Chang liver(CCL-13), Huh-7 및 L02 세포는 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum), 100U/mL의 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Welgene, LM001-05) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. PRKCSH를 안정적으로 발현하는 세포(이하, PRK 세포라 함)는 태그되지 않은 PRKCSH 구조체로 L02 세포를 형질감염시켜 제작하였다. PRK 세포는 G418(200㎍/mL)(InvivoGen, ant-gn-1)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 글루코시데이즈 II 이중 니카제(Glucosidase II double nickase) 플라스미드 또는 대조군 이중 니카제(control double nickase) 플라스미드는 L02 세포에 형질감염시켰다. 퓨로마이신(puromycin)(Santa Cruz Biotechnology, sc-205821) 500ng/mL을 첨가한 배지에서 안정한 넉아웃(knockout) 세포를 선택하고 PRKCSH 면역탁본(immunoblotting) 분석을 수행하였다.

<1-3> siRNA 처리를 통한 유전자 발현 억제(silencing)

모든 siRNA 이중가닥은 ST Pharm Co.(서울, 대한민국)에서 합성하였다. 본 실험에서는 PRKCSH를 표적으로 하는 2개의 siRNA(SEQ ID NO: 1(siPRK#1), SEQ ID NO: 2(siPRK#2))를 사용하였다. IRE1α를 표적으로 하는 siRNA는 SEQ ID NO: 3의 염기서열을 갖는 siRNA(siIRE1α#2)를 사용하였다. 대조군으로는 scrambled control siRNA를 사용하였다(표 1). 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific, 11668-019)을 사용하여 siRNA(최종 농도 40nM)로 세포를 형질감염시켰다. 형질 도입 48시간 후, 표적 유전자의 발현을 확인하기 위해 세포를 면역탁본 분석하였다.

서열번호	염기서열(5'->3 ')
SEQ ID NO: 1( siPRK #1)	GGA AGA AGU CUC UGG AAG ATT
SEQ ID NO: 2( siPRK #2)	GGA AGA AGA GGC UGA AGA ATT
SEQ ID NO: 3( siIRE1α #2)	GAA UCC UCU ACA UGG GUA AAA AGC ATT
SEQ ID NO: 4( siCon )	AUG AAC GUG AAU UGU UCA ATT

<1-4> 소포체 스트레스 처리

각각의 PRKCSH 구조체와 siRNA는 Lipofectamine 2000을 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에, 세포는 지정된 시간에 (최종 농도가) 1μM인 탑시가르긴(thapsigargin, TG)와 10㎍/mL인 튜니카마이신(tuniamycin, TM)을 각각 처리하였다. 안정한 세포주(PRKCSH 과발현 및 PRKCSH 넉아웃 세포)는 ER 스트레스 요인을 처리하기 전에 G418과 퓨로마이신이 없는 DMEM 배지에서 7일동안 배양한 다음, 2x10⁵ cells/mL를 6-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 배지를 TG 또는 TM이 함유된 배지로 교체하였다. 포도당 고갈(deprivation)은 지정된 시간동안 10% 투석된 우태아혈청(dialyzed fetal bovine serum)(Welgene, S001-08)이 첨가된 포도당이 없는 DMEM 배지로 교체함으로써 유도하였다.

<1-5> 암 조직에서의 유전자 발현 및 생존 분석

간암(GSE25097 및 GSE20140), 대장암(GSE10950), 위암(GSE13862), 유방암(GSE24124) 및 폐암(GSE27262)의 유전자 발현 데이터 세트는 National Center for Biotechnolohy Information Gene Expression Omnibus(GEO)에서 다운로드하였다. 프로파일 그래프는 ID 칼럼과 대응되는 식별자를 입력하여 특정 유전자의 발현 값을 추출하였다. 간암 환자의 생존 분석을 위해 European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI)의 ArrayExpress에서 간세포 암종 샘플(E-TABM-36)에 대한 유전자 발현 데이터 세트를 다운로드하였다. 상기 자료를 이용하여 PRKCSH 유전자의 발현 값 및 임상 데이터를 추출하였다.

<1-6> 간 조직의 면역조직화학 분석( immunohistochemical analysis)

슬라이드에는 비-종양(CSN3, 59 cases)과 종양(CS3, 58 cases) 간 조직이 포함되어 있는 간 조직 배열 슬라이드를 SuperBioChips Laboratories에서 구입하였다. 슬라이드는 60℃에서 30분동안 열처리하고, 자이렌(xylene)으로 탈파라핀화한 후 에탄올로 탈수하였다. 슬라이드는 비특이적인 항체 결합을 방지하기 위해 블로킹 용액으로 항온 배양한 후, 항-PRKCSH 항체와 4℃에서 밤새 배양하였다. 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색한 후, 슬라이드를 탈수하고 마운팅하였다. PRKCSH 염색 강도는 IHC Profiler plugin을 이용하여 NIH ImageJ software로 측정하였다(http://rsb.info.nig.gov/ij/). PRKCSH-양성은 강함(3+), 중간(2+), 약함(1+) 및 음성(0)으로 분류하였다.

<1-7> 면역탁본 분석( immunoblot analysis)

면역탁본 분석은 참고문헌 1 및 2에 기술된 내용에 따라 수행하였다. 간략하게 설명하면, 세포를 protease inhibitor cocktail(ThermoFisher Scientific, 78411)이 첨가된 SDS 용해 버퍼(100mM Tris-HCl pH 6.8, 10% 글리세롤 및 1% SDS)으로 용해시켰다. BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific, 23225)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 세포 용해물은 1X 샘플 버퍼(10mM Tris-HCl pH 6.8, 1% SDS, 5% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 및 1% β-머캅토에탄올)에서 5분간 열처리를 하였다. 단백질은 SDS-PAGE에서 분리하고, immobilon-P 막(Merck, IPVH00010)에 전자 전달(eletrotransfer)하였다. 제조사의 지시에 따라 1차 항체로 면역탁본 검사를 수행하였다. LAS-4000 Luminescent Image Analyzer(GE Healthcare Bio-Sciences)를 사용하여 신호를 검출하고 Multi Gauge Software(Fujifilm, JP)를 이용하여 농도를 측정하였다. 각 단백질 신호의 강도는 총 단백질 또는 GAPDH 강도로 정규화하였다(normalized).

참고문헌1: Shin, G. C et al. Hepatocystin contributes to interferon-mediated antiviral response to hepatitis B virus by regulating hepatocyte nuclear factor 4α. Biochim . Biophys . Acta . 1842, 1648-1657(2014).

참고문헌2: Shin, G. C., Kang, H. S., Lee, A. R. & Kim, K. H. Hepatitis B virus-triggered autophagy targets TNFRSF10B/death receptor 5 for degradation to limit TNFSF10/TRAIL response. Autophagy 12, 2451-2466(2016).

<1-8> RNA 추출 및 정량(quantitative) PCR 분석

Trizol 시약(Sigma-Aldrich, T9242)을 사용하여 총 RNA를 분리하고, M-MLV 역전사 효소(Intron Biotechnolohy, 27032) 및 Oligo-dT 프라이머를 제조사의 지시에 따라 역전사하였다. cDNA를 XP Thermal Cycler System(BIOER Technolohy, Hangzhou, China)에서 반정량 PCR(semi-quantitative PCR)에 적용하였다. qPCR은 제조사의 지시에 따라 SYBR Green PCR Master Mix(ThermoFisher Scientific, 4309155)로 7500 real-time PCR system(Applied Biosystems)에서 수행되었다.

<1-9> IRE1α foci 관찰

IRE1α의 올리고머화(Oligomerization) 수준을 관찰하기 위해, IRE1α-FV로 형질감염된 세포에서의 IRE1α foci를 참고문헌 3에 기재된 내용에 따라 면역형광 현미경으로 관찰하였다. PRKCSH의 고갈(silencing)을 위해, 세포는 siPRK와 siCon으로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 커버슬립에서 성장한 세포를 IRE1α-FV로 형질감염시켰다. 두번째 형질 감염 24시간 후, 세포를 독시사이클린(5㎍/mL)으로 24시간동안 처리하여 IRE1α-FV를 유도한 후, TM으로 4시간동안 처리하였다. Carl Zeiss Axiovert 200 형광 현미경을 사용하여 IRE1α의 세포 내 위치를 관찰하고 제조사(Carl Zeiss)가 제공한 소프트웨어로 분석하였다. 세포당 IRE1α foci의 수는 형광 IRE1α로 100개 이상의 세포를 계수하여 결정하였다. 형광 IRE1α를 갖는 모든 세포 중에서 IRE1α foci를 갖는 세포의 백분율로 데이터를 나타내었다.

참고문헌3: Aragon, T. et al. Messenger RNA targeting to endoplasmic reticulum stress signaling sites. Nature 457, 736-740(2009).

<1-10> 면역세포화학( immunocytochemistry ) 분석

세포를 커버슬립에 시딩하고 siPRK와 siCon로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 실온에서 15분동안 3.7% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 그런 다음 PBS로 세척하고, 세포를 항-PRKCSH 항체로 4℃에서 밤새 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 실온에서 40분동안 Alexa Fluor 546-conjugated anti-mouse IgG 2차 항체와 함께 배양하였다. Carl Zeiss Axiovert 200 현미경을 사용하여 형광 이미지를 얻었고, 제조사의 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

<1-11> 공동-면역침전법(co- immunoprecipitation assay)

비-형질감염 세포와 형질감염된 각각의 구조체는 면역침전 용해 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.2, 10mM NaCl, 1% NP-40(Sigma-Aldrich, NP40S), 및 protease inhibitor cocktail(ThermoFisher Scientific, 78441))로 용해시켰다. 세포 용해물은 4℃에서 1시간동안 protein A agarose(Sigma-Aldrich, 11134515001)로 씻어내고, 4℃에서 항-IRE1α와 항-Flag M2 항체와 밤새 배양한 다음, protein A agarose로 4시간 동안 4℃에서 배양하였다. 아가로스는 용해 버퍼로 3회 세척하고, 1X 샘플 버퍼에서 열처리하였다. 가열된 샘플로 면역탁본 분석을 수행하였다.

<1-12> GST affinity 분리법

GST affinity 분리는 참고문헌 4에 기재된 방법으로 수행하였다. N-말단 GST-태그된 RPKCSH(LifeSpan BioSciences, LS-G22189)와 C-말단 GST-태그된 PRKCSH(Abnova, H00005589-P02)는 Glutathione-Sepharose 4B Beads(GE Healthcare Bio-Sciences, 17-0756-01) 상에 고정시켰다. 재조합 인간 IRE1α(OriGene Technologies, TP315023)은 TEN 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 200mM NaCl, 1mM EDTA 및 protease inhibitor cocktails)에 고정된 GST-PRKCSH 단백질과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 비드는 TEN 버퍼로 4회 세척하였고, SDS-PAGE 샘플 버퍼로 용출시켰으며, 각 단백질에 대한 항체로 면역탁본 분석을 수행하였다.

참고문헌4: Einarson, M. B., Pugacheva, E. N. & Orlinick, J. R. Idenfitication of protein-protein interactions with glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins. CSH . Protoc . 10.1101/pdb.top11 (2007).

<1-13> 소포체 스트레스-매개 세포사멸 분석

사멸세포 집단은 PI 유세포 분석기로 저이배수성(hypodiploid) 세포의 DNA 농도를 평가하여 결정하였다. 세포는 시딩(seeding)하여 48시간동안 각각의 siRNA로 형질감염시켰다. 세포는 TM과 TG로 각각 48시간, 72시간동안 처리하였다. 그런 다음, 차가운 70% 에탄올로 세포를 고정시키고, 제조사의 지시에 따라 PI/RNase 염색용액으로 처리하였다. 처리된 세포는 FACS Calibur 유세포 분석기(BD Biosciences)로 분석하고, 세포 DNA 농도와 전방 산란(forward scatter)을 FCS Express 6 Plus software(De Novo Software)로 분석하였다. PARP1 분열(cleavage)을 결정하기 위해, 항-PARP1 항체로 면역탁본 분석을 수행하였다.

실시예 2: 결과

<2-1> 종양 발달, 진행에 대한 PRKCSH 발현의 영향

PRKCSH와 종양 형성과의 연관성을 확인하기 위해, 다양한 인간 암 조직에서의 PRKCSH의 발현을 분석하였다. 암 조직은 NCBI Gene Expression Omnibus(GEO) 데이터베이스(간암, accession number GSE25097과 GSE20140; 대장암, GSE10950; 위암, GSE13862; 유방암, GSE24124; 폐암, GSE27262)를 이용하였다. 그 결과, PRKCSH 유전자는 비종양 조직과 비교하여 간암에서 유의하게 상향 조절되는 것을 확인할 수 있었다(도 1). 이와 유사하게, PRKCSH는 대장암, 위암, 유방암 및 폐암 조직에서도 과발현되는 것을 확인하였다. 간세포암종 조직에 대한 면역조직화학검사(immunohistochemical; IHC) 결과에서도 PRKCSH의 발현 수준은 비종양 조직(양성 샘플 59 case 중 10 case; 16.9%)에서 보다 종양 조직(양성 샘플 58 case 중 48 case; 77.5%)에서 높게 발현되었다(도 2). 면역탁본 분석 결과 역시, PRKCSH의 발현 수준이 정상 간 세포주(CCL-13 및 L02)와 비교하여 간암 세포주(HepG2 및 Huh-7)에서 증가되어 있는 것을 볼 수 있었다(도 3). 이는 증가된 PRKCSH의 발현 수준이 종양 형성에 관여함을 의미한다. 이에, 동일한 IHC 데이터 세트를 사용하여 PRKCSH의 발현과 임상병리학적 매개 변수 사이의 관계를 추가로 분석하였다. 그 결과, PRKCSH의 발현은 성별, 연령, 종양 크기, 암의 진행 정도, 림프관 침투(invasion)와는 상관없이 간외의 전이(extrahepatic metastasis)(P = 0.029) 및 악성 종양 병기의 TNM 분류(P = 0.028)와 유의한 상관관계가 있었다(도 3).

57명의 간암 환자(EMBL-EBI, ArrayExpress, accession number E-TABM-36)에서 PRKCSH mRNA 발현 수준과 환자 생존의 연관성을 분석한 결과, PRKCSH를 높은 수준으로 발현하는 환자는 생존율이 낮게 나타났다(P = 0.0464)(도 3). 이러한 결과는 PRKCSH의 잠재적 기능이 간암 형성 및 진행과 밀접하게 관련 있음을 시사하는 것이다.

<2-2> 소포체 스트레스 조건 하에서의 IRE1α - XBP1 및 MAPK 경로 조절

UPR의 조절에서 PRKCSH의 역할을 알아보기 위해, 정상 간세포에서 PRKCSH의 과발현(PRK)과 넉아웃(PRK KO)을 사용하여 IRE1α-XBP1 경로에서의 PRKCSH의 역할을 확인하였다. 소포체 스트레스 유도제인 튜니카마이신(tunicamycin; TM)으로 처리했을 때, PRK 세포에서 스플라이싱된 XBP1 mRNA의 발현 수준은 대조군 세포(Mock)에 비해 증가했으나, 총 XBP1 mRNA의 발현 수준은 대조군 세포와 비슷했다(도 4a). 이 결과는 스플라이싱된 XBP1 단백질의 발현 수준과 유사하다(도 4b). 포도당 고갈시(다른 소포체 스트레스 유도 조건), 스플라이싱된 XBP1 단백질의 발현 수준도 대조군 세포(Mock) 보다 높게 나타났다(도 5a). 이와 반대로, 스플라이싱된 XBP1 mRNA와 이의 단백질의 발현 수준은 소포체 스트레스 조건에서 PRK KO 세포에서 약화되었다(도 5b, c).

이후, MAPKs의 소포체 스트레스-매개 활성화에서 PRKCSH의 역할을 확인하였다. ERK1/2 및 JNK1/2의 활성화는 대조군 세포(Mock)와 비교하여 PRK 세포에서 증가했으나(도 6a), PRK KO 세포에서는 TM 처리시(도 6b)와 포도당 결핍시(도 7a)에 약화되었다.

마지막으로, XBP1 표적 유전자인 ERDJ4, GRP78, Sec61A1 및 p58IPK의 발현에 PRKCSH가 미치는 영향을 분석하였다. 상기 유전자들의 발현은 TM 처리시 대조군 세포보다 PRK 세포에서 유의하게 높았다(도 7b). 전반적으로, 이러한 결과는 RPKCSH가 소포체 스트레스 조건 하에서 IRE1α-XBP1 및 -MAPK 경로 조절에 기여한다는 것을 나타낸다.

<2-3> 종양 세포에서 IRE1α의 선택적 활성화

HCC 세포 모델에서, 소포체 스트레스의 반응 조절에서의 PRKCSH의 역할을 알아보기 위해, PRKCSH가 억제된 세포와 대조군 간암 세포의 스플라이싱된 XBP1과 활성화된 MAPKs의 발현 수준을 비교하였다.

그 결과, 스플라이싱된 XBP1 mRNA는 TM을 처리한 대조군 세포와 비교하여 PRKCSH-넉다운 HepG2 세포에서 현저하게 하향 조절된 반면, 총 XBP1 mRNA의 발현은 이들 세포간에 차이가 없었다(도 8). Huh-7 간암 세포에서도 이와 유사한 결과가 관찰되었다(도 9). 두 간암 세포주에서 PRKCSH를 억제하면 스플라이싱된 XBP1 단백질의 수준이 감소되었다(도 10a, b). 또한, TM 처리시 ERK1/2 및 JNK1/2 MAPKs의 활성화는 HepG2 세포에서의 PRKCSH 억제에 의해 감소되었다(도 11a). 더욱이, IRE1α-XBP1 표적 유전자의 발현 수준 역시 간암 세포에서 PRKCSH 억제에 의해 감소되었다(도 11b).

마지막으로, PRKCSH mRNA의 발현 수준이 다른 암 조직에서도 증가되었기 때문에, XBP1 표적 유전자의 발현 수준이 간, 대장, 폐암에서도 증가하는지 확인하였다. 실험한 모든 XBP1 표적 유전자는 비종양 조직에 비해 종양 조직에서 상향 조절되는 것을 발견하였다. 각각의 XBP1 표적 유전자의 발현 수준은 PRKCSH mRNA의 발현 수준과 상관관계가 있었다(도 12). 이러한 결과는 PRKCSH의 상향 조절이 종양 형성 과정에서 IRE1α 경로의 활성화에 기여한다는 것을 시사한다.

다음으로, 다른 UPR branch인 PERK 및 ATF6 경로의 활성화에 대한 PRKCSH의 영향을 살펴보았다. PRKCSH의 억제나 과발현은 표적 유전자의 발현에 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 4, 5, 8, 9). 종합해보면, 상기 결과는 PRKCSH가 소포체 스트레스 반응에서 IRE1α 경로의 조절에 특정한 역할을 함을 나타낸다.

<2-4> 소포체 스트레스 조건 하에서의 IRE1α의 활성화

소포체 스트레스 조건 하에서, IRE1α는 링커 영역(Ser551 및 Ser562), 카이네이즈 활성화 도메인(Ser724, Ser726 및 Ser729) 및 RNase 도메인(Thr973)에서 인산화될 수 있다. 카이네이즈 도메인의 인산화는 IRE1α의 하류 MAPK 및 RNase 도메인을 활성화시킨다; 링커 영역 또는 RNase 도메인의 인산화는 IRE1α의 활성을 증가시키지 않는다. 따라서, PRKCSH가 IRE1α 경로를 활성화시키는 메커니즘을 정의하기 위해, Ser724 인산화를 검출하는 특정 항체를 사용하여 IRE1α의 인산화를 결정하였다. TM 처리시, IRE1α 인산화 수준은 Mock 세포보다 PRK 세포에서 더 높게 나타났다(도 14a). 이와는 대조적으로, RPK KO 세포는 TM 처리시와 포도당 결핍 후에 WT 세포와 비교하여 감소된 수준의 IRE1α 인산화를 나타냈다(도 14a, 15a). HepG2 및 Huh-7 세포에서 PRKCSH 억제는 TM 처리시 IRE1α의 인산화를 감소시켰다(도 15b, 16a).

IRE1α 올리고머화(oligomerization)가 UPRosome 형성과 XBP-1의 스플라이싱을 위한 핵심 단계이므로, 소포체 스트레스 조건 하에서 IRE1α 올리고머화에 PRKCSH가 미치는 영향을 조사하였다. IRE1α의 올리고머화는 Flag 및 Venus-태그된 형광 인간 IRE1α 융합 구조체(IRE1α-FV)로 형질감염된 세포에서 foci의 형성으로 관찰하였다. TM 처리시, IRE1α 올리고머화는 Mock 세포(42% foci-positive cells) 보다 PRK 세포(최대 64% foci-positive cells)에서 더 높았다(도 16b). Huh-7 간암 세포에서 IRE1α의 올리고머화는 TM 처리시 현저히 증가하는 반면(최대 65% foci-positive cells), PRKCSH 억제시 소포체 스트레스 조건 하에서 상당히 감소한 결과를 볼 수 있다(30% foci-positive cells)(도 17). 이러한 결과는 PRKCSH가 소포체 스트레스 하에서 IRE1α를 직접 활성화시킨다는 것을 나타낸다.

<2-5> 소포체 스트레스의 PRKCSH - IRE1α 복합체 형성 유도

소포체 스트레스 조건 하에서 PRKCSH가 IRE1α를 어떻게 활성화시키는지를 결정하기 위해, L02 세포(정상 간 세포)의 용해물을 공동면역침전 하여 두 단백질이 물리적으로 상호작용하는지 확인하였다. PRKCSH와 IRE1α 사이의 연관성은 휴식 상태에서는 매우 약했다. 그러나, TM 처리 60분 후에 IRE1α로부터 GRP78의 해리와 함께 강하게 증가하였다(도 18a). IRE1α로부터 GRP78의 해리가 지속되었지만 TM 처리 120분 후에는 회복되었다. 이와 유사한 결과가 포도당 결핍 하에서 관찰되었다(도 18b). 또한, TM 처리는 HepG2 세포와 Huh-7 세포에서 내인성 RPKCSH와 IRE1α 사이의 연관성을 증가시켰다(도 19a 및 19b). 흥미롭게도 이 상호작용은 휴지기의 HCC 세포에서도 관찰되었으며, L02 세포보다 더 지속되었다.

PRKCSH와 IRE1α의 상호작용을 확인하기 위해, Flag-tagged PRKCSH 구조체(PRK-Flag)로 형질감염시킨 L02 세포의 용해물을 사용하여 공동면역침전법(co-immunoprecipitation)을 수행하였다. PRK-Flag와 내인성 IRE1α는 TM 처리시 상호작용하지만, TM이 처리되지 않은 대조군 세포에서는 상호작용하지 않았다(도 20a). IRE1α-FV로 형질감염시킨 L02 세포의 용해물을 사용하여 상기 상호작용에 대해 더 조사한 결과, 내인성 PRKCSH와 IRE1α--FV와의 연관성은 휴지기 세포에서는 거의 없었으나, TM 처리시 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 20b). 상기 결과는 소포체 스트레스가 PRKCSH와 IRE1α 사이의 물리적 연관성이 있다는 것을 보여준다.

<2-6> IRE1α와의 복합체 형성과 활성화에 필수적인 PRKCSH의 E/P 도메인

PRKCSH와 IRE1α 사이의 상호작용이 직접적으로 일어나는 것인지 확인하기 위해, GST-PRKCSH 결실 돌연변이체와 정제된 IRE1α로 in vitro pull-down assay를 수행하였다.

그 결과, IRE1α는 RPKCSH의 C-말단 도메인과 상호작용을 보였으나, N-말단 도메인과는 상호작용을 보이지 않았다(도 21). 이는 PRKCSH가 IRE1α와 직접 상호작용함을 나타낸다. IRE1α와의 관계에 관여하는 RPKCSH의 부위를 추가로 알아보기 위해, Flag-tagged PRKCSH 돌연변이체로 형질감염시킨 세포의 용해물을 사용하여 공동면역침전법(co-immunoprecipitation)을 수행하였다.

공동면역침전 분석 결과, 내부의 E/P 도메인이 소포체 스트레스에 대한 IRE1α와의 상호작용에 필수적이라는 것을 알 수 있었다(도 22). 흥미롭게도 G2B 영역의 결실은 WT형 PRKCSH와 비교하여 IRE1α에 대한 결합을 증가시켰다. IRE1α에 대한 PRKCSH 결합에 대한 G2B 도메인의 억제 효과는 소포체 스트레스가 존재할 때 RPKCSH의 IRE1α에 대한 특이적 결합을 조절한다는 것을 의미한다. 그러나 소포체 스트레스 조건 하에서 어떻게 G2B 도메인의 억제 기능이 상실되는지는 확인하지 못했다.

IRE1α 활성화에 대한 E/P 도메인의 효과를 확인하기 위해, WT형 PRKCSH와 ΔE/P 돌연변이체로 형질전환시킨 L02 세포에서 IRE1α의 인산화, XBP-1 스플라이싱, 및 ERK 활성화 수준을 평가하였다.

그 결과, WT형 PRKCSH의 발현은 IRE1α의 소포체 스트레스-유도된 인산화를 증가시키는 반면, ΔE/P 돌연변이를 발현하는 세포에서의 수준은 대조군 세포 수준과 유사하였다(도 23a). 이와 마찬가지로, 스플라이싱된 XBP-1 단백질 및 ERK 활성화 수준은 WT형 PRKCSH로 형질감염된 세포에서 증가되었으나, ΔE/P 돌연변이체에서는 증가하지 않았다(도 23b, 24a). 이러한 결과는 PRKCSH의 E/P 도메인이 IRE1α와 직접 상호작용하고, 소포체 스트레스에 대한 하류 신호 전달의 활성화에 필수적임을 나타낸다(도 24b).

<2-7> 소포체 스트레스 조건 하에서 종양 세포의 생존에 결정적인 RPKCSH -IRE1α 신호

IRE1α 신호 branch는 ER 스트레스 매개 세포 사멸에 대한 종양 저항성과 종양 촉진 인자의 발현 조절에 관여한다. PRKCSH의 생리 효과를 알아보기 위해, PRKCSH 과발현 및 억제된 세포에서 소포체 스트레스에 의해 유도된 세포 사멸 및 PARP1 절단을 모니터링하였다. PRKCSH의 과발현은 TM, 다른 소포체 스트레스 인자인 TG 및 PARP1 절단으로 처리시 소포체 스트레스에 의해 유발된 세포사멸에 강한 저항성이 있는 것으로 나타났다(도 25a, b). Huh-7 세포에서의 PRKCSH 억제는 TM 또는 TG 처리시 소포체 스트레스에 의해 유발되는 세포 사멸(도 26a, 27a) 및 PARP1 절단(도 26b, 27b)에 유의하게 민감하였다.

다음으로, 종양 촉진 인자의 소포체 스트레스 매개된 발현 조절에 PRKCSH가 미치는 영향에 대해 알아보았다. PRKCSH의 과발현은 TM 처리시 TNF-α, IL-8 및 VEGF mRNA의 수준을 증가시켰다(도 28a). 반대로, HepG2 및 Huh-7 간암 세포에서의 PRKCSH 억제는 TM-유도된 이들 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰다(도 28b).

마지막으로, 소포체 스트레스 하에서 PRKCSH 매개된 세포 생존 및 종양 촉진 사이토카인의 발현에 IRE1α가 필요한지의 여부를 확인하였다. IRE1α 억제는 소포체 스트레스에 의해 유발된 세포 사멸에 대한 PRK 세포의 저항성을 감소시켰다(도 28c). 이 효과는 IRE1α-넉다운 세포에서 소포체 스트레스 유발 PARP1 절단의 증가에 의해 확인되었다(도 29a). 또한, PRK 세포에서 종양 촉진 인자의 상향 발현은 IRE1α 억제에 의해 감소되었다(도 29b). 이러한 결과는 PRKCSH-IRE1α 신호 전달이 종양 세포를 소포체 스트레스에 적응시키는데 중요하다는 것을 의미한다.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> A use of PRKCSH protein regulating the endoplasmic reticulum stress response as liver cancer marker and therapeutic candidate <130> P18U10C0197 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siPRK#1 <400> 1 ggaagaaguc ucuggaagat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siPRK#2 <400> 2 ggaagaagag gcugaagaat t 21 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SiIRE1a#2 <400> 3 gaauccucua cauggguaaa aagcatt 27 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCon <400> 4 augaacguga auuguucaat t 21 <210> 5 <211> 2458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRKCSH_NUCLEOTIDE <400> 5 atagaggggc ggtcccaaca gtgggcgggg tagagccgcg ccgcaggacg gagggtctgg 60 acactttggg gtcacgtgct cattccgttt ccctacctcc cccaacctta tcccgcccct 120 gggggttcgc gggcattttt caggaacttt ctttccggct tgagaagccg ccactcccaa 180 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Ser Gly Asp Thr Gln Thr Asp Ala Thr Ser Phe Tyr Asp Arg Val 260 265 270 Trp Ala Ala Ile Arg Asp Lys Tyr Arg Ser Glu Ala Leu Pro Thr Asp 275 280 285 Leu Pro Ala Pro Ser Ala Pro Asp Leu Thr Glu Pro Lys Glu Glu Gln 290 295 300 Pro Pro Val Pro Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 305 310 315 320 Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Glu 325 330 335 Val Gln Gly Glu Gln Pro Lys Pro Ala Ser Pro Ala Glu Glu Asp Lys 340 345 350 Met Pro Pro Tyr Asp Glu Gln Thr Gln Ala Phe Ile Asp Ala Ala Gln 355 360 365 Glu Ala Arg Asn Lys Phe Glu Glu Ala Glu Arg Ser Leu Lys Asp Met 370 375 380 Glu Glu Ser Ile Arg Asn Leu Glu Gln Glu Ile Ser Phe Asp Phe Gly 385 390 395 400 Pro Asn Gly Glu Phe Ala Tyr Leu Tyr Ser Gln Cys Tyr Glu Leu Thr 405 410 415 Thr Asn Glu Tyr Val Tyr Arg Leu Cys Pro Phe Lys Leu Val Ser Gln 420 425 430 Lys Pro Lys Leu Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Gly Thr Trp Gly Ser 435 440 445 Trp Ile Gly Pro Asp His Asp Lys Phe Ser Ala Met Lys Tyr Glu Gln 450 455 460 Gly Thr Gly Cys Trp Gln Gly Pro Asn Arg Ser Thr Thr Val Arg Leu 465 470 475 480 Leu Cys Gly Lys Glu Thr Met Val Thr Ser Thr Thr Glu Pro Ser Arg 485 490 495 Cys Glu Tyr Leu Met Glu Leu Met Thr Pro Ala Ala Cys Pro Glu Pro 500 505 510 Pro Pro Glu Ala Pro Thr Glu Asp Asp His Asp Glu Leu 515 520 525

Claims

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생물학적 시료와 후보물질을 접촉시킨 후, 접촉 전과 비교하여, 후보물질이 PRKCSH와 IRE1α의 상호작용을 촉진하는지 또는 억제하는지 판단하는 것을 포함하는 간암 치료용 약물의 스크리닝 방법.
제4항에 있어서,
후보물질이 PRKCSH와 IRE1α의 상호작용을 저해시키면 간암의 치료제로 판정하는 간암 치료용 약물의 스크리닝 방법.
제4항에 있어서,
생물학적 시료는 간암 세포 또는 간암 조직인 간암 치료용 약물의 스크리닝 방법.
제4항에 있어서,
상기 후보물질은 PRKCSH 유전자의 발현을 억제시키는 siRNA인 간암 치료용 약물의 스크리닝 방법.
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