JP5804599B2 - 内臓脂肪型肥満の検査薬およびその利用 - Google Patents

内臓脂肪型肥満の検査薬およびその利用 Download PDF

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Description

本発明は、内臓脂肪型肥満の診断に有用な、内臓脂肪型肥満の検査薬に関する。より詳細には、本発明は、被験者について内臓脂肪型肥満であるか否かを判断し内臓脂肪型肥満者を検出するためのツールとして有用な検査薬、および当該検査薬を利用した内臓脂肪型肥満の検出方法（診断方法）に関する。また、本発明は、内臓脂肪型肥満を改善し、またそれに起因して発症するメタボリックシンドローム等の代謝性疾患や心血管疾患を予防するために有効な医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の有効成分を探索するための方法（スクリーニング方法）に関する。
さらに、本発明は肝臓からの糖放出を抑制することにより糖尿病を改善し、またそれに起因して発症する糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症を予防するために有効な医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の有効成分を探索するための方法（スクリーニング方法）に関する。
近年、内臓脂肪型肥満を基盤とするメタボリックシンドローム（以下、単に「ＭＳ」ともいう）の増加が社会的問題となっている。ＭＳは、内臓脂肪型肥満に加え耐糖能異常、脂質異常症、高血圧などが程度は軽くとも一個人に集積した状態をいい、動脈硬化性疾患発症の背景として重要であることが明らかとなってきている。国際的に受け入れられつつある米国のNational Cholesterol Education Program (NCEP) のAdult Treatment Panel III (ATP III)で発表されたＭＳ診断基準によれば、(1)臍周囲径で診断する内臓脂肪、(2)高中性脂肪血症、(3)低HDLコレステロール血症、(4)高血圧、および(5)耐糖能異常のうち３個以上該当した場合にＭＳと判断される（非特許文献１）。また、日本人におけるＭＳ診断は2005年に日本内科学会誌に発表された基準に基づいており、内臓脂肪型肥満を必須項目とし、高血圧、脂質代謝異常（高トリグリセリド血症かつ/または低HDL-コレステロール血症）、および空腹時高血糖のうち２項目以上該当した場合にＭＳと判断される（非特許文献２）。
このＭＳの必須条件として位置付けられている内臓脂肪型肥満の判断基準としては、（a）コンピューター断層撮影（CT）での内臓脂肪面積100cm2以上、あるいは（ｂ）腹囲長測定で、腹囲長が男性85cm以上、女性90cm以上が提唱されている（非特許文献３）。ＣＴで内臓脂肪面積を測定することができる施設は限られており、コストおよび被爆の問題もあるため、多くの施設では腹囲長を測定することにより内臓脂肪型肥満の判定が行われている。
しかし、この腹囲長測定は簡便ではあるものの、測定誤差や正確性の点で必ずしも十分であると言えないため（非特許文献４および５）、新たな診断基準の策定が期待されている。
ＭＳと遺伝的要因との関連については、従来からもいくつか報告されている（非特許文献６および７、特許文献１〜４など）。非特許文献６では、ＭＳと関連する染色体上の部位が紹介されている。また特許文献１には、ＭＳになる可能性を判定する方法として、Klotho遺伝子中の特定の多型を検出する方法が、特許文献２にはアンギオポエチン−１遺伝子中の特定の多型を検出する方法が、特許文献３にはMcKusick-Kaufman syndrome遺伝子中の特定の多型を検出する方法が、さらに特許文献４にはミオシンIXA（MY09A）遺伝子中の特定の多型を検出する方法がそれぞれ記載されている。しかしながら、Coiled-coil domain containing protein 3（以下、「CCDC3」という）遺伝子との関連性については知られていない。
なお、特許文献５において、CCDC3遺伝子と同一の配列を有するFARS1遺伝子が報告されており、マウスにおいて摂餌量の増加によって体重が増加するとともにFARS1のmRNA量が増加することが報告されている。
ところで、肝臓はその解剖学的位置関係より、膵臓から分泌されたインスリンの最初の標的臓器であると同時に、消化管より吸収され門脈内に入った糖の最初の利用器官でもある。さらに、摂食時には糖を取り込んでグリコーゲン合成をおこない、絶食時にはグリコーゲンの分解および糖新生により糖を産生・放出するという、相反する機能を備えており、これらをコントロールすることで糖代謝の恒常性維持が図られている。また、肝臓での糖産生調節は、高血糖状態ではインスリンによるグリコーゲン合成の活性化、低血糖状態ではグルカゴン、カテコラミン、コルチゾールなどの作用によるグリコーゲン分解および糖新生の活性化によって行われていることが知られている。
このように肝臓において糖の産生や放出がコントロールされているが、糖代謝異常疾患である糖尿病症例では、肝糖放出量が増大することが報告されている。具体的には、糖尿病モデル動物db/dbマウスでは、約2倍の糖新生亢進および肝糖放出量の増大が確認されており（非特許文献８）、ヒトにおいても糖尿病患者で約1.9倍の肝糖放出量の増大が確認されている。また、健常者では、肝糖放出量の70％がグリコーゲン分解、30％が糖新生に由来するが、糖尿病患者では、56％が糖新生に由来することが明らかとなっており、糖新生系の亢進による肝糖放出量の増大が糖尿病の高血糖状態に関与していることが強く示唆されている（非特許文献９）。これらのことから、肝糖放出量をコントロールすることは、糖尿病の治療を考えるうえで重要になり得る。
特公表2003-514513号公報 特開2007-54002号公報 特開2009-27985号公報 特開2009-27986号公報 米国出願公開公報20030113889号
Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults : Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation,and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 285 : 2486-2497, 2001. メタボリックシンドローム診断基準検討委員会：メタボリックシンドロームの定義と診断基準．日本内科学会雑誌 94: 794-809, 2005 The Examination Committee of Criteria for 'Obesity Disease' in Japan, Japan Society for the Study of Obesity : New criteria for 'obesity disease' in Japan. Circ J 66 : 987-992, 2002. S Yamada, Y Tsukamoto, J Irie : Waist circumference in metabolic syndrome. Lancet 370 : 1541-42, 2007. S Yamamoto, T Nakagawa, S Kusano, M Takamura, K Hattori, M Irokawa : CTによる内臓脂肪面積自動診断ソフトの開発と初期使用経験MEDIX 41 : 15-20, 2004 Nat Clin Pract Cardiovasc Med 3:482-489 (2006) Obesity Research 13:381-490 (2005) Aoki et al : Dehydroepiandrosterone decreases elevated hepatic glucose production in C57BL/KsJ-db/db mice. Life Sciences 74 : 3075-3084, 2004 Consoli et al : Predominant Role of Gluconeogenesis in Increased Hepatic Glucose Production in NIDDM. Diabetes 38 : 550-557, 1989
前述するように、心筋梗塞などの心血管疾患の発症頻度が高まるメタボリックシンドローム（MS）では、内臓脂肪型肥満が病態成因基盤として存在することが示唆されている。そこで内臓脂肪型肥満を適確に診断し早期に改善策をとることで、ＭＳ、ひいては心血管疾患の発症を予防する必要性が強く唱えられている。しかしながら、従来の内臓脂肪型肥満の診断は煩雑あるいは不正確であるという問題があり、このため、内臓脂肪型肥満を正確かつ簡便に判別するための検出マーカーが求められている。また、内臓脂肪型肥満を改善するために有効な医薬組成物が必要であり、さらに、内臓脂肪型肥満によって惹起される糖尿病を改善して糖尿病合併症を予防する有効な医薬組成物も求められている。
本発明は、かかる課題に鑑みて、内臓脂肪型肥満を特異的に反映して、内臓脂肪型肥満を正確に判別することができる内臓脂肪型肥満の検査薬を提供することを目的とする。また、当該検査薬を用いた内臓脂肪型肥満の検出方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、内臓脂肪型肥満または糖尿病を改善し、ＭＳ、心血管疾患の発症または糖尿病合併症を予防するために有効な医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の有効成分となりえる物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねていたところ、内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織に、内臓脂肪型肥満者に特異的に発現が上昇する遺伝子（Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）遺伝子）が存在すること、また当該遺伝子は内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪に特異的に発現上昇が認められるものの、皮下脂肪では発現上昇が認められないことを見出し、当該遺伝子が内臓脂肪型肥満と密接に関連する遺伝子（内臓脂肪型肥満関連遺伝子）であることを確認した。さらに、当該遺伝子によってコードされるタンパク質は、内臓肥満時に内臓脂肪細胞での発現が特異的に上昇し、細胞外に分泌される分泌タンパク質であることから、CCDC3遺伝子およびそのタンパク質（以下、遺伝子と区別するために「CCDC3タンパク」という）は、内臓脂肪型肥満を検出するための検出マーカーとして、特にCCDC3タンパクは血液を被験試料とした場合の検出マーカーとして有用であることを確認した。
また、本発明者らは、CCDC3タンパクの刺激により肝細胞からの糖放出が増加すること、またCCDC3タンパクの刺激により糖新生の律速酵素であるglucose-6-phosphatase（以下、「G6Pase」という）およびphosphoenolpyruvate carboxykinase（以下、「PEPCK」という）のmRNA発現量が有意に増加することを見出し、CCDC3タンパクが肝臓からの糖放出を促進する作用を有することを確認した。さらに、本発明者らは、CCDC3遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し、CCDC3 mRNAが過剰発現することによってマウスにおいて体重上昇及び血糖値上昇が引き起こされることを見出した。このことは、CCDC3（以下、「CCDC3遺伝子及びCCDC3タンパク」の総称として使用する。）が内臓脂肪型肥満およびそれに起因するメタボリックシンドローム（MS）、特に糖尿病およびその合併症の発症に深く関与していることを示唆している。
これらの知見から、本発明者らは、CCDC3遺伝子が内臓脂肪型肥満やそれに起因するＭＳや心血管疾患に深く関わる内臓脂肪型肥満関連遺伝子であり、内臓脂肪型肥満を改善し、ＭＳや心血管疾患を予防するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となることを確信した。このことから、CCDC3遺伝子の発現を抑制したり、CCDC3タンパクの機能（活性）を抑制する作用を有する物質が、内臓脂肪型肥満を改善し、ＭＳや心血管疾患を予防するための有効成分となりえること、また糖尿病を改善し、その進行による糖尿病合併症を予防するための有効成分となりえると考えられた。またこれらを指標としたスクリーニング系は、新たなメカニズムに基づく内臓脂肪型肥満の改善、ＭＳ等の代謝性疾患や心血管疾患の予防に有効な医薬組成物、また糖尿病の改善や糖尿病合併症の予防に有効な医薬組成物の開発に有効であるとの確信を得た。
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有するものである。
（Ｉ）内臓脂肪型肥満の検査薬およびその使用
（I-1）(1) CCDC3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または(2)CCDC3遺伝子の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドのいずれかを含む、内臓脂肪型肥満の検査薬。
（I-2）CCDC3タンパクを認識する抗体を有する、内臓脂肪型肥満の検査薬。
（I-3）上記CCDC3タンパクを認識する抗体が下記（i）〜(vi)のいずれかに記載する抗体である、（I-2）に記載する内臓脂肪型肥満の検査薬：
（i）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３５、３６及び３７で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４３、４３及び４５で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
（iii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４７、４８及び４９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号５１、５２及び５３で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
（iv）重鎖可変領域が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む（i）に記載の抗体、
（v）重鎖可変領域が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む（ii）に記載の抗体、及び
（vi）重鎖可変領域が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む（iii）に記載の抗体。
（II）内臓脂肪型肥満の検出方法
（II-1）被験者から採取した被験試料におけるCCDC3のmRNA発現量またはCCDC3タンパク産生量を指標とすることを特徴とする、内臓脂肪型肥満の検出方法。
（II-2）（１）被験者から採取した被験試料におけるCCDC3のmRNA発現量またはCCDC3タンパク産生量を測定する工程、
（２）上記で測定したCCDC3のmRNA発現量（被験発現量）またはCCDC3タンパク産生量（被験産生量）を、非内臓脂肪型肥満者から採取した対照試料におけるCCDC3のmRNA発現量（対照発現量）またはCCDC3タンパク産生量（対照産生量）と対比する工程、
を有し、
（３）対照発現量または対照産生量に比して被験発現量または被験産生量が高いことを、被験者が内臓脂肪型肥満であるとの判断指標とする、（II-1）に記載する内臓脂肪型肥満の検出方法。
（II-3）前記CCDC3のmRNA発現量を（I-1）に記載する検査薬を用いて測定する、（II-1）または（II-2）に記載する内臓脂肪型肥満の検出方法。
（II-4）前記CCDC3産生量（被験産生量）を（I-2）または（I-3）に記載する検査薬を用いて測定する、（II-1）または（II-2）に記載する内臓脂肪型肥満の検出方法。
（III）内臓脂肪型肥満改善剤または内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患予防剤
（III-1）CCDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体を有効成分として含む、内臓脂肪型肥満改善剤または内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患の予防剤（以下、これらを総称して「抗内臓脂肪型肥満剤」という）。
（III-2）前記CCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸が、CCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（III -1）に記載の抗内臓脂肪型肥満剤。
（III-3）内臓脂肪型肥満の改善、または内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患の予防のために用いられる、CDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体。
（III-4）CCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（III -3）に記載するCCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸。
（III-5）内臓脂肪型肥満を有する患者に対して、CDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体を投与する工程を有する、内臓脂肪型肥満の改善、または内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患の予防方法。
（III-6）上記CCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸が、CCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（III -5）に記載する方法。
（IV）糖尿病治療剤または糖尿病合併症の予防剤
（IV-1）CCDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体を有効成分として含む、糖尿病治療剤または糖尿病合併症の予防剤（以下、これらを総称して「抗糖尿病剤」という）。
（IV-2）前記CCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸がCCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（IV-1）に記載の抗糖尿病剤。
（IV-3）糖尿病の治療または糖尿病合併症の予防のために用いられる、CDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体。
（IV-4）CCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（IV -3）に記載するCCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸。
（IV-5）糖尿病患者に対して、CDC3遺伝子の発現若しくはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸、またはCCDC3タンパクに対する中和抗体を投与する工程を有する、糖尿病を治療または糖尿病合併症を予防する方法。
（IV-6）上記CCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの機能を抑制する核酸が、CCDC3遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAである、（IV -5）に記載する方法。
（V）内臓脂肪型肥満および糖尿病の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
（V-1）下記の工程を有する、CCDC3遺伝子の発現またはCCDC3タンパクの産生を抑制する物質のスクリーニング方法：
（１）被験物質とCCDC3遺伝子を発現可能な細胞またはCCDC3タンパクを産生可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のCCDC3遺伝子の発現量またはCCDC3タンパクの産生量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のCCDC3遺伝子の発現量またはCCDC3タンパクの産生量よりも小さい場合の被験物質を選択する工程。
（V-2）CCDC3遺伝子を発現可能な細胞またはCCDC3タンパクを産生可能な細胞が、内臓脂肪細胞である（V-1）に記載のスクリーニング方法。
（V-3）下記の工程を有する、CCDC3タンパクの機能または活性を抑制する物質のスクリーニング方法：
（１’）被験物質、CCDC3タンパクに反応する細胞、およびCCDC3タンパクを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞のCCDC3タンパクの機能または活性を測定する工程、及び
（３’）上記測定したCCDC3タンパクの機能または活性が、被験物質を接触させることなくCCDC3タンパクと接触させた対照細胞のCCDC3タンパクの機能または活性よりも低い場合の被験物質を選択する工程。
（V-4）CCDC3タンパクに反応する細胞が肝臓由来の細胞である（V-3）に記載のスクリーニング方法。
（V-5）CCDC3タンパクの機能または活性が、糖放出の促進作用である（V-3）または（V-4）に記載のスクリーニング方法。
（V-6）CCDC3タンパクの機能または活性が、糖新生の律速酵素遺伝子のmRNA量を増加させる作用である（V-3）または（V-4）に記載のスクリーニング方法。
（V-7）内臓脂肪型肥満を改善するか、または内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患を予防するための有効成分を探索するための方法である、（V-1）乃至（V-6）のいずれかに記載するスクリーニング方法。
（V-8）糖尿病を改善するか、または糖尿病合併症を予防するための有効成分を探索するための方法である、（V-1）乃至（V-6）のいずれかに記載するスクリーニング方法。
（V-9）下記の工程を有する、内臓脂肪型肥満の改善若しくは内臓脂肪型肥満に起因して発症する疾患を予防するための、または糖尿病の改善若しくは糖尿病合併症を予防するための有効成分をスクリーニングする方法：
（a）CCDC3遺伝子を過剰発現するCCDC3トランスジェニックマウスに被験物質を投与する工程、
（b）被験物質を投与したCCDC3トランスジェニックマウスの体重（被験体重）または血糖値（被験血糖値）を経時的に測定し、被験物質を投与しないCCDC3トランスジェニックマウスの経時的体重（対照体重）または血糖値（対照血糖値）と対比する工程、
（c）上記被験体重または被験血糖値が、対照体重または対照血糖値に比して低下する場合の被験物質を内臓脂肪型肥満または糖尿病を改善する有効成分として選択する工程。
（VI）CCDC3タンパクを認識する抗体
（VI-1）下記（i）〜（iii）からなる群から選択されるいずれかのCCDC3タンパクを認識する抗体：
（i）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３５、３６及び３７で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４３、４４及び４５で示されるアミノ酸配列を含む抗体、及び
（iii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４７、４８及び４９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号５１、５２及び５３で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
（VI-2）上記抗体が、下記（iv）〜（vi）からなる群から選択されるいずれかの抗体である（VI-1）に記載する抗体：
（iv）重鎖可変領域が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
（v）重鎖可変領域が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む抗体、及び
（vi）重鎖可変領域が配列番号４６で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
（VI-3）上記（VI-1）または（VI-2）に記載する抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
本発明が提供する検査薬および検査方法によれば、従来のコンピューター断層撮影による内臓脂肪面積測定や腹囲測定などといった煩雑または不正確な測定方法によらず、被験者が内臓脂肪型肥満であるか否かをin vitro試験で正確に検出することが可能になる。また本発明の検査薬の使用および本発明の検出方法によれば、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に被験者について内臓脂肪型肥満であるか否かを検出することが可能になる。
本発明の方法によって内臓脂肪型肥満であることが判明した被験者（内臓脂肪型肥満患者）に対しては、その旨を告知することにより、当該被験者は、内臓脂肪型肥満を改善し解消するための適確な対策を講じることができる。従って、本発明は、内臓脂肪型肥満を早期に改善解消し、内臓脂肪型肥満からメタボリックシンドローム（ＭＳ）等の代謝性疾患ならびに心血管疾患への進展を予防するための検査方法として極めて有用である。
また本発明が提供する抗内臓脂肪型肥満剤は、内臓脂肪型肥満を改善し、その結果、内臓脂肪型肥満に起因して生じるＭＳ等の代謝性疾患ならびに心血管疾患への進展を予防するために有効な医薬組成物として有効に使用することができる。また本発明が提供する抗糖尿病剤は、肝糖放出を抑制することにより高血糖状態を改善し、その結果、糖尿病の進展ならびに糖尿病合併症を予防するために有効な医薬組成物として有効に使用することができる。
さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、内臓脂肪型肥満を改善し、またその進行によって生じるＭＳ等の代謝性疾患ならびに心血管疾患への進展を予防するために有効な成分、または高血糖状態を改善し、糖尿病ならびその進行によって生じる糖尿病合併症を予防するために有効な成分を取得することが可能になる。すなわち当該方法は、内臓脂肪型肥満の改善および代謝性疾患や心血管疾患の予防、ならびに糖尿病の改善および糖尿病合併症の予防に有効な新規薬剤の開発に有効に利用することができる。
非内臓脂肪型肥満者（5例）および内臓脂肪型肥満者（5例）の内臓脂肪組織および皮下脂肪組織において、CCDC3遺伝子（mRNA）の発現量を対比した結果を示す。内臓脂肪型肥満者におけるCCDC3遺伝子の発現量は、非内臓脂肪型肥満者の当該発現量を1として、その相対比として示す。その結果、内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪におけるCCDC3遺伝子の発現量は、非内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織での当該発現量と比較して3.2倍上昇していることが確認された（実施例１）。 肥満モデルマウス（db/dbマウス）とdb/mマウス（対照群）について、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織および副睾丸周囲脂肪組織におけるCCDC3遺伝子（mRNA）の発現量を対比した結果を示す。肥満モデルマウス（db/dbマウス）におけるCCDC3遺伝子の発現量は、対照群の当該発現量を1として、その相対比として示す。その結果、肥満モデルマウスの腸間膜脂肪組織でのCCDC3遺伝子の発現量は、対照群の腸間膜脂肪組織での当該発現量と比較してで2.1倍上昇していることが確認された（実施例２）。 HEK293T細胞にヒトCCDC3過剰発現ベクターpReceiver-CCDC3を導入し、培地中に分泌されたCCDC3タンパクをウェスタンブロッティング法により検出した結果を示す。培地（Medium）中にCCDC3タンパクのシグナルが認められたことから、CCDC3タンパクは分泌タンパクであることが示唆された（実施例３）。 ラットから単離した肝細胞を用いて、100nM ヒトリコンビナントCCDC3タンパク刺激の有無による糖放出への影響を検討した結果を示す。100nM CCDC3タンパク刺激により糖放出の増加が確認された（CCDC3 0nM vs 100nM 1.2倍 n=6 p<0.01）（実施例５(2)）。 糖新生の律速酵素であるglucose-6-phosphatase（G6Pase）およびphosphoenolpyruvate carboxykinase（PEPCK）を対象として、100nM CCDC3タンパク刺激によるこれらの遺伝子の発現に対する影響を検討した結果を示す。100nM CCDC3タンパク刺激により糖新生律速酵素G6PaseおよびPEPCK mRNAの有意な発現増加が確認された(CCDC3 0nM vs 100nM G6Pase 2.6倍、PEPCK 2.2倍 n=5 いずれもp<0.01)（実験例５(3)）。 ３種類のCCDC3 siRNA（QIAGEN、HP GenomeWide siRNA（#1、#2、#3））を導入してCCDC3遺伝子（mRNA）の発現の抑制を調べた結果を示す。その結果、siRNA導入により80%以上のCCDC3遺伝子の発現抑制が確認された（実施例６）。 CCDC3遺伝子の発現量が4倍以上のトランスジェニックマウス（CCDC3 Tgマウス）と対照区のマウスについて、高脂肪食（HFD）摂取による体重の経時的変化を示す（実施例７）。 CCDC3 Tgマウスと対照区のマウスについて、HFD摂取から52日目に採取した血液の血糖値（mg/dl）を示す（実施例７）。 ヒト抗CCDC3抗体（6G12, 3H6, 11E10）とビオチン標識ヒトリコンビナントCCDC3タンパクの結合に対するヒトリコンビナントCCDC３タンパクによる置換曲線を示す（実施例８）。 ヒト抗CCDC3抗体（6G12, 3H6, 11E10）のヒトリコンビナントCCDC3タンパクに対する反応性を示すウエンスタンブロッティング結果である（実施例９）。なお、CCDC3タンパクの推定分子量から、図中、30kDa及び60kDaに位置するタンパク質は、それぞれCCDC3タンパクの単量体及び二量体に相当するものと考えられる（図１２においても同じ）。 マウス抗CCDC3抗体（13A8,13D4, 24F6）と免疫原ペプチドもしくはビオチン標識マウスリコンビナントCCDC3タンパクの結合に対するマウスリコンビナントCCDC３タンパクによる置換曲線を示す（実施例１１）。 マウス抗CCDC3抗体（13A8,13D4）のマウスリコンビナントCCDC3タンパクに対する反応性を示すウエンスタンブロッティング結果である（実施例１２）。 ヒト抗CCDC3抗体の2種類の組合せ（6G12-11E10,3H6-11E10）を用いたCCDC3タンパクの免疫学的測定における検量線を示す（実施例１３）。 内臓脂肪面積100cm2未満の非内臓脂肪型肥満者群と、内臓脂肪面積100cm2以上の内臓脂肪型肥満者群とで、血漿中CCDC3タンパク濃度を比較した結果を示す（実施例１４）。 長期血糖値を反映する指標であるHbA1cが5.8％以下の正常値群と、5.8％より高いHbA1c値を示す群とで、血漿中CCDC3タンパク濃度を比較した結果を示す（実施例１４）。 対照群マウス（Lean）及びDIOマウス（DIO）の腸間膜脂肪、および皮下脂肪におけるCCDC3タンパクの免疫染色像を示す（実施例１５）。
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
本発明において「CCDC3遺伝子」とは、配列番号１に示されるヒト由来のCCDC3遺伝子だけでなく、ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子など、ヒト由来のタンパク質（CCDC3タンパク）と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体(ホモログやスプライスバリアントなど)、変異体及び誘導体）をコードする「遺伝子」が含まれる。例えばヒト由来のCCDC3タンパクのホモログをコードする遺伝子としては、当該CCDC3タンパクをコードするヒトCCDC3遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定ヒト遺伝子名（CCDC3遺伝子）や塩基配列のアクセション番号（GenBank Accession No. NM_031455）をLocusLink（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/）の検索にかけて該当するヒト遺伝子データを見いだす。そのデータのリンクメニューにあるHomoloGeneにアクセスして表示された他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、ヒトCCDC3遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子を遺伝子（ホモログ）として選抜することができる。具体的には、ヒトCCDC3遺伝子(GenBank Accession No. NM_031455)（配列番号１）のマウスホモログとして、配列番号２に記載するマウスCCDC3遺伝子（GenBank Accession No. NM_028804）を例示することができる。
また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
本発明において「ＤＮＡ」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡや合成ＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる。本明細書中において「ＲＮＡ」とは、特に言及しない限り、１本鎖ＲＮＡのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡ、さらにはそれらから構成される２本鎖ＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。当該ＲＮＡには、total ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの合成ＲＮＡが含まれる。
また、本発明において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
本発明において「CCDC3タンパク」とは、配列番号３に示されるヒト由来のCCDC3タンパクだけでなく、ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子からの翻訳産物である「タンパク質」、ならびに当該「タンパク質」と生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのCCDC3タンパク（配列番号３）に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/)により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、アミノ酸配列において少なくとも70％、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上が同一なものを挙げることができる。上記ヒトCCDC3タンパクに対するマウスホモログとして、配列番号４に記載するマウスCCDC3タンパクを挙げることができる。なお、前述するCCDC3遺伝子と上記CCDC3タンパクとを区別することなく総称する場合には「CCDC3」という用語を使用する場合がある。
本発明でいう「CCDC3遺伝子の発現を抑制する核酸」とは、CCDC3遺伝子のmRNAの発現又はCCDC3のｍRNAからのCCDC3タンパクへの翻訳を抑制する作用を有する核酸のことを意味し、CCDC3遺伝子に対するsiRNAのみならず、miRNA、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、リボザイムおよびデコイなどが包含される。
また本発明でいう「CCDC3タンパクの機能を抑制する核酸」とは、CCDC3タンパクの機能を抑制する作用を有する核酸のことを意味し、CCDC3タンパクに対するアプタマーなどが含まれる。
本発明でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
肥満には、内臓およびその周りに脂肪が多くたまる内臓脂肪型肥満と、皮下脂肪が多く内臓脂肪が少ない皮下脂肪型肥満の2つのタイプがある。本発明において「内臓脂肪型肥満」とは、前者の内臓およびその周りに脂肪が多く蓄積することを特徴とした肥満を指す。当該内臓脂肪型肥満の診断基準はCTを用いた測定で臍高の内臓脂肪面積が100cm2以上であるかどうかで判定される。
本発明において「メタボリックシンドローム（ＭＳ）」とは、内臓脂肪型肥満を基盤とし、「高血圧」、「糖代謝異常」または「脂質代謝異常」などの状態にあることをいう。従来法によれば、腹囲（ウエスト周囲径）が 男性85ｃｍ以上 女性90ｃｍ以上を（内臓脂肪面積100cm2以上に相当）に当てはまる人の中で、(1) 血清脂質異常（トリグリセリド値150mg/dL以上、またはHDLコレステロール値40mg/dL未満）、(2) 血圧高値（最高血圧130mmHg以上、または最低血圧85mmHg以上）、(3) 高血糖（空腹時血糖値110mg/dL）の３項目のうち、２項目以上が該当する場合にメタボリックシンドロームであると判断されている。
本発明において「心血管疾患」とは、心血管の何らかの異常により心臓における血液の流れが悪くなる、あるいは心機能が低下したり、障害を受けた状態を意味し、具体的には狭心症、心筋梗塞、心不全等の疾患を例示することができる。また本発明において「代謝性疾患」とは、先天的もしくは後天的な原因が働いて代謝経路の種々の段階で障害が起こり、血液や特定の臓器に代謝産物が過剰蓄積あるいは不足することによって起こる体の障害を意味し、具体的には上記ＭＳのほか、高脂血症、糖尿病、肥満症等の疾患を例示することができる。
本発明において「糖尿病合併症」とは、糖尿病そのものを原因として発症する病気や症状を意味し、具体的には糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害等の疾患を例示することができる。
さらに本発明において「検査薬」とは、内臓脂肪型肥満の有無、またはその程度を診断するために、また内臓脂肪型肥満の改善またはその進展予防に有効な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、内臓脂肪型肥満に関連して生体内、特に内臓脂肪組織において発現が上昇する遺伝子であるCCDC3遺伝子またはその発現産物（CCDC3タンパク）を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体組織や細胞内などで発現した上記CCDC3遺伝子及びCCDC3タンパクを、生体内外で検出するためのプローブとして、また（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
本発明において診断対象となる「生体組織」および「生体試料」には、内臓脂肪型肥満に伴い、本発明のCCDC3遺伝子（mRNA）の発現が上昇する組織、および当該遺伝子の発現産物（CCDC3タンパク）が生成するか若しくは分泌される組織（血液を含む）が含まれる。好ましくは内臓脂肪組織および血液を挙げることができる。
以下、CCDC3遺伝子（ポリヌクレオチド）、並びにこの発現産物（CCDC3タンパク）およびそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
２．内臓脂肪型肥満の検査薬
本発明は、被験者について内臓脂肪型肥満であるか否かを検出するために好適に使用される検査薬を提供する。当該検査薬は、後述するスクリーニング方法において、内臓脂肪型肥満の改善剤またはＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患の予防剤（抗内臓脂肪型肥満剤）の有効成分（候補物質）を探索するためにも、また、糖尿病の改善剤またはその進行や糖尿病合併症を予防するための製剤（抗糖尿病剤）の有効成分（候補物質）を探索するためにも使用される。
（1）ポリ（又はオリゴ）ヌクレオチド
本発明において内臓脂肪型肥満の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に内臓脂肪組織等におけるCCDC3遺伝子（mRNA）の発現上昇の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、本発明の検査薬は、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
本発明の検査薬は、CCDC3遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、CCDC3遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、CCDC3遺伝子またはこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においてはCCDC3遺伝子またはこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がCCDC3遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
すなわち、本発明の検査薬は、CCDC3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とする。ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、CCDC3遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
本発明の検査薬は、例えば配列番号１で示されるヒト由来のCCDC3遺伝子の塩基配列をもとに、例えばベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記CCDC3遺伝子の塩基配列をベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明の検査薬は、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的には検査薬の用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
本発明の検査薬は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によって被験者の内臓脂肪組織中におけるCCDC3遺伝子の発現上昇の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
測定対象試料（生体試料）としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の内臓脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくは血液等を採取し、そこから常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
本発明の検査薬を、内臓脂肪型肥満の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、CCDC3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドとして、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
本発明の検査薬（プローブまたはプライマー）には、CCDC3遺伝子検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
またプローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化したDNAチップ、cDNAマイクロアレイ、オリゴDNAアレイ、メンブレンフィルター等。以下「DNAチップ等」と総称する。）の形態として提供することができる。
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
本発明の検査薬（プローブ）を固定化したDNAチップ等によれば、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識DNAまたはRNAとの複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出することにより、生体組織中でのCCDC3遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
上記DNAチップ等は、CCDC3遺伝子と結合し得る1種または2種以上の本発明検査薬（プローブ）を含んでいれば良い。複数の検査薬（プローブ）を含むDNAチップ等の利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
本発明の検査薬は、被験者について内臓脂肪型肥満の検出（肥満の有無やその程度の診断）に有用である。具体的には、該検査薬を利用した内臓脂肪型肥満の診断は、被験者の生体組織と正常者（非内臓脂肪型肥満者）の生体組織または生体試料におけるCCDC3遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、具体的にはCCDC3遺伝子は内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪において発現が上昇しているので、被験者の生体組織または生体試料で当該遺伝子（mRNA）の発現が上昇しており、当該発現量が正常者（非内臓脂肪型肥満者）の生体組織または生体試料の発現量と比べて50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していれば、被験者が内臓脂肪型肥満である可能性が高くなる。
（2）抗体
本発明は、検査薬として、CCDC3タンパクを特異的に認識することのできる抗体を提供する。当該抗体として、具体的には、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒト由来のCCDCタンパクを特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。
本発明は、前述するように、内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織においてCCDC3遺伝子の発現が特異的に上昇しているという知見をもとに、被験者についてCCDC3タンパク産生増加の有無やその程度を検出することによって、当該被験者が内臓脂肪型肥満であるか否か、またその程度を特異的に検出することができるという発想に基づくものである。
従って、上記抗体は、被験者における上記CCDC3タンパク産生増加の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が内臓脂肪型肥満であるか否かまたはその程度を診断することのできるツール(検査薬)として使用される。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、CCDC3タンパクを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに当該CCDC3のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したCCDC3タンパクを用いて、あるいは常法に従って当該CCDC3タンパクの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したCCDC3、あるいはタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
抗体の作製に免疫抗原として使用されるCCDC3タンパクは、本発明により提供される遺伝子の配列情報（例えば配列番号１または２）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
具体的には、CCDC3タンパクをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。またCCDC3タンパクの部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号３、４）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
なお、本発明のCCDC3タンパクには、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号３または配列番号４で示されるタンパク質と免疫学的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで同等の免疫学的活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつCCDC3タンパクに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がCCDC3タンパクと同等の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
また本発明の抗体は、CCDC3タンパクの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、CCDC3タンパクと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つCCDC3タンパクのアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
本発明が対象とするCCDC3タンパクを認識する抗体には、制限はされないが、下記（i）〜（iii）に記載する抗体が含まれる：
（i）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３５、３６及び３７で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
制限されないが、当該抗体として、好ましくは配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を有する抗体を挙げることができる。
（ii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４３、４４及び４５で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
制限されないが、当該抗体として、好ましくは配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を有する抗体を挙げることができる。
（iii）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４７、４８及び４９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号５１、５２及び５３で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
制限されないが、当該抗体として、好ましくは配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を有する抗体を挙げることができる。
さらに本発明が対象とするCCDC3タンパクを認識する抗体には、上記（i）〜（iii）で示される抗体が結合するエピトープに結合する抗体も含まれる。
本発明の抗体はCCDC3タンパクに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現したCCDC3タンパクまたは血液中に分泌されたCCDC3タンパクを特異的に検出することができる。即ち、当該抗体は被験者の生体組織または生体試料（血液を含む）中のCCDC3タンパクの有無およびその程度を検出するためのプローブとして有用である。
具体的には、被験者の内臓脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは血液などを採取し、そこから常法に従って調製した組織抽出物やタンパク質を用いて、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、CCDC3タンパクを検出することができる。
内臓脂肪型肥満の診断に際しては、被験者の生体組織または生体試料におけるCCDC3タンパクと正常者（非内臓脂肪型肥満）の生体組織または生体試料におけるCCDC3タンパクとの量の違いを判定すればよい。この場合、具体的には、CCDC3遺伝子は、内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織において、正常者（非内臓脂肪型肥満）の内臓脂肪組織と比較して発現が上昇しているので、被験者の前記生体組織またはCCDC3タンパクが分泌される生体試料（血液など）において、CCDC3タンパクの量が、正常者（非内臓脂肪型肥満）の生体組織または生体試料中のCCDC3量と比べて50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していることが判定されれば、内臓脂肪型肥満が疑われる。
（3）検査薬キット
本発明は、上記検査薬を含む、内臓脂肪型肥満の検出や診断に使用する検査薬キットを提供するものでもある。当該検出キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）または上記抗体を少なくとも１つ含むものである。本発明の検査薬は上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
３．内臓脂肪型肥満の検出方法（診断方法）
本発明は、前述する本発明の検査薬を利用した内臓脂肪型肥満の検出方法（診断方法）を提供する。
具体的には、本発明の検出方法（診断方法）は、被験者から採取した生体試料に含まれる内臓脂肪型肥満に関連するCCDC3遺伝子の遺伝子（mRNA）発現レベル、およびこの遺伝子に由来するタンパク質（CCDC3タンパク）を検出し、そのmRNA発現量またはそのタンパク産生量を測定することにより、被験者について内臓脂肪型肥満の有無またはその程度を検出（診断）するものである。
本発明の検出方法は次の（１）および（２）の工程を含む：
（１）被験者から採取した生体試料（被験試料）におけるCCDC3のmRNA発現量またはCCDC3タンパク産生量を測定する工程、
（２）上記で測定したCCDC3のmRNA発現量（被験発現量）またはCCDC3タンパク産生量（被験産生量）を、非内臓脂肪型肥満者から採取した生体試料（対照試料）におけるCCDC3のmRNA発現量（対照発現量）またはCCDC3タンパク産生量（対照産生量）と対比する工程。
かかる方法において得られた対照発現量または対照産生量に比して被験発現量または被験産生量が高い場合には、被験者は内臓脂肪型肥満であると判断することができる。
ここで用いられる生体試料としては、被験者から採取された生体組織（内臓脂肪組織など）や血液から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。かかるRNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、被験者の内臓脂肪組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは血液を採取し、そこから常法に従って調製することができる。
本発明の検出方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
(1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、内臓脂肪型肥満の検出は、具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料（被験試料）から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の検査薬（ポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該検査薬に結合した被験試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記検査薬を指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果（被験結果）を、非内臓脂肪型肥満者由来の生体試料（対照試料）に対して同様に(a)および(b)の工程から得られる結果（対照結果）と対比する工程。
当該検出方法（診断方法）は、該RNA中のCCDC3遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の検査薬（ポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記検査薬をプローブとして用いることによって、RNA中のCCDC3遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の検査薬（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された検査薬（DNA）とRNAとの二重鎖を、検査薬の標識物（RI若しくは蛍光物質などの標識物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って検査薬（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせ後、検査薬の標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記検査薬をプライマーとして用いることによって、RNA中のCCDC3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のCCDC3遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の検査薬から調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した検査薬をプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記検査薬をDNAプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の検査薬から調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、CCDC3遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なDNAチップを用いることもできる。
(2) 測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の内臓脂肪型肥満の検出方法（診断方法）は、生体試料中のCCDC3タンパクを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料（被験試料）中のCCDC3タンパクを、抗体に関する本発明の検査薬（CCDC3タンパクを認識する抗体）と結合させる工程、
(b)該検査薬に結合した被験試料中のCCDC3タンパクを、上記検査薬を指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果（被験結果）を、非内臓脂肪型肥満者由来の生体試料（対照試料）に対して同様に(a)および(b)の工程から得られる結果（対照結果）と対比する工程。
より具体的には、本発明の検査薬として抗体（CCDC3タンパクを認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知の方法で、CCDC3タンパクを検出、定量する方法を挙げることができる。
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の検査薬を用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などの標識物質に由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の検査薬を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
なお、上記において測定対象とするCCDC3タンパクは、後述する実施例５に示すように、肝細胞での糖放出作用、糖新生の律速酵素遺伝子の発現を増加させる作用を有している。当該タンパク質の量とこれらの機能または活性とは一定の相関関係を有している。従って、上記CCDC3タンパクの産生量の測定に代えて、当該タンパクの機能または活性の測定を行うことによっても、本発明の内臓脂肪型肥満の検出（診断）を実施することができる。すなわち本発明の検出方法には、CCDC3タンパクの機能または活性を指標として、本願に開示の測定方法に従って測定、評価することからなる、内臓脂肪型肥満の検出（診断）方法も含まれる。
(3)内臓脂肪型肥満の有無の判別（診断）
内臓脂肪型肥満の診断は、被験者の生体組織（内臓脂肪組織や血液など）におけるCCDC3遺伝子の遺伝子（mRNA）発現レベル、もしくはこの遺伝子の発現産物であるタンパク質（CCDC3タンパク）の産生量、機能若しくは活性（以下、これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、正常者（非内臓脂肪型肥満者）の生体組織（内臓脂肪組織や血液など）における当該遺伝子発現レベル（mRNA発現量）または当該タンパク質レベル（CCDC3タンパク産生量）と比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
この場合、正常者（非内臓脂肪型肥満者）の生体組織から採取調製した生体試料（RNAまたはタンパク質）が必要であるが、これらは内臓脂肪型肥満でない人の生体組織（内臓脂肪組織や血液など）を生検や採血等で採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「内臓脂肪型肥満でない人」とは、少なくとも従来の検査方法、例えばコンピューター断層撮影（CT）での内臓脂肪面積測定や腹囲長測定の結果、内臓脂肪型肥満ではないと診断された人をいう。なお、当該「内臓脂肪型肥満でない人」を、本明細書では単に正常者または非内臓脂肪型肥満者という場合もある。
被験者の生体組織と正常者の生体組織との遺伝子発現レベル（mRNA発現量）またはタンパク質の量（CCDC3タンパク産生量）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な生体組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたCCDC3遺伝子の遺伝子発現レベル（mRNA発現量）、若しくは遺伝子の発現産物であるタンパク質の量（CCDC3タンパク産生量）（レベル）の平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベル（mRNA発現量）若しくはタンパク質の量（CCDC3タンパク産生量）として、比較に用いることができる。
被験者が内臓脂肪型肥満であるかどうかの判断は、該被験者の生体組織におけるCCDC3遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるCCDC3タンパクのタンパク質レベルが、正常者のレベルと比較して有意に多ければ、該被験者は内臓脂肪型肥満であると判断できるか、該肥満が疑われる。具体的には、正常者のレベルと比較して50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していることを指標として行うことができる。
４．内臓脂肪型肥満あるいは糖尿病の改善に有効な成分をスクリーニングする方法
実施例で示すように、本発明者らは、内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪において特異的にCCDC3遺伝子の発現が上昇していること、およびCCDC3タンパクが、肝糖放出を増加させ、また糖新生の律速酵素の発現を増加させることから、内臓脂肪型肥満やその進行に深く関わっていることを見出した。このことから、CCDC3タンパクが内臓脂肪型肥満および糖尿病の発症やその進行に関わっており、CCDC3遺伝子の発現（mRNA発現）やCCDC3タンパクの機能を抑制させて、肝糖放出や糖新生を抑制しえる物質は、内臓脂肪型肥満もしくは糖尿病を改善する有効な成分として、また内臓脂肪型肥満の進行によるＭＳや心血管疾患あるいは糖尿病合併症を予防する有効成分として有用であると考えられる。
下記に説明する本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から、（3-1）CCDC3遺伝子の発現（mRNA発現）抑制、（3-2）CCDC3タンパクの産生量の低下、または（3-3）CCDC3タンパクが有する作用の低下、を指標として、これらのいずれかを示す物質を探索することによって、内臓脂肪型肥満の改善剤またはその進行によって生じるＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患の予防剤（抗内臓脂肪型肥満剤）の有効成分、または糖尿病の改善剤またはその進行によって生じる糖尿病合併症の予防剤（抗糖尿病剤）の有効成分を取得しようとするものである。
なお、抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤の有効成分となりえる候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物、高分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質を含む試料を対象として実施することができる（これらを総称して「被験物質」という）。ここで、候補物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、および菌体成分などが含まれる。
(1) CCDC3遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、CCDC3遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を、CCDC3 mRNAの発現量を指標として探索し、抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤の有効成分として取得する方法である。
当該方法は、具体的には下記の工程（１）〜（３）を行うことによって実施することができる。
（１）被験物質とCCDC3遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のCCDC3遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のCCDC3遺伝子の発現量（対照発現量）よりも小さい被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性または外来性の別を問わず、CCDC3遺伝子を発現し得る細胞であればよい。なおCCDC3遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来のCCDC3遺伝子（配列番号１）であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のCCDC3遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、CCDC3遺伝子を有する内臓脂肪組織細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された内臓脂肪組織細胞の初代培養細胞を挙げることができる。また、定法に従って、CCDC3遺伝子のcDNAを有する発現ベクターを導入してCCDC3 mRNAを発現可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
本発明のスクリーニング方法の工程（１）において、被験物質とCCDC3遺伝子発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つCCDC3遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とCCDC3遺伝子発現可能細胞とを接触させて、CCDC3遺伝子の発現を抑制させてそのmRNAの発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でCCDC3遺伝子発現可能細胞を培養した場合のCCDC3 mRNAの発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するCCDC3遺伝子発現可能細胞を培養した場合に得られるCCDC3 mRNAの発現量（対照発現量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を「CCDC3遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質」、または抗内臓脂肪型肥満剤若しくは抗糖尿病剤の有効成分の候補物質として選別することができる。
CCDC3 mRNAの発現量の測定（検出、定量）は、CCDC3遺伝子発現可能細胞のCCDC3 mRNAの発現量を、当該CCDC3 mRNAの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（前述する本発明の検査薬）などを利用したノーザンブロット法やRT-PCR法、リアルタイム定量PCR法などの公知の方法、またはDNAアレイを利用した測定方法を実施することなどにより行うことができる。
またCCDC3遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、CCDC3遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本発明のCCDC3遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において、本発明のスクリーニング方法で使用するに記載する「CCDC3遺伝子」の概念には、CCDC3遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。融合遺伝子の作製、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
かかる本発明のスクリーニング方法により選別される物質は、CCDC3遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、CCDC3遺伝子（mRNA）の発現を抑制することによって、内臓脂肪型肥満を改善する薬物、またその進行を抑制してＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患への進展を予防する薬物の有力な候補物質となる。また、これらの物質は、CCDC3遺伝子（mRNA）の発現を抑制して、高血糖状態を改善することにより、糖尿病を改善する薬物、またその進行を抑制して糖尿病合併症の進展を予防する薬物の有力な候補物質となる。
(2) CCDC3の産生を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、CCDC3タンパクの産生を低下させる作用を有する物質を、CCDC3タンパクの産生量の低下を指標として探索し、抗内臓脂肪型肥満剤 または抗糖尿病剤の有効成分として取得する方法である。
当該方法は、具体的には下記の工程（1’）〜（3’）を行うことによって実施することができる。
（1’）被験物質とCCDC3タンパクを産生可能な細胞とを接触させる工程、
（2’）被験物質を接触させた細胞のCCDC3タンパクの産生量を測定する工程、及び
（3’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞（CCDC3を産生可能な細胞）のCCDC3の産生量（対照産生量）よりも小さい被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞（対照細胞を含む）としては、内在性または外来性の別を問わず、CCDC3遺伝子が発現してCCDC3タンパクを産生し得る細胞であればよい。なおCCDC3遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のCCDC3遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、CCDC3遺伝子を有する内臓脂肪組織細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された内臓脂肪組織細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
また、定法に従って、CCDC3遺伝子のcDNAを有する発現ベクターを導入してCCDC3タンパクを産生可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
本発明のスクリーニング方法（3-2）の工程（1’）において、被験物質とCCDC3タンパク産生可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つCCDC3遺伝子が発現し且つCCDC3タンパクが産生し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とCCDC3タンパク産生可能細胞とを接触させて、CCDC3タンパクの産生量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でCCDC3タンパク産生可能細胞を培養した場合のCCDC3タンパク産生量が、被験物質非存在下で上記に対応するCCDC3タンパク産生可能細胞を培養した場合に得られるCCDC3の産生量（対照産生量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を「CCDC3タンパクの産生を低下させる作用を有する物質」、または抗内臓脂肪型肥満剤若しくは抗糖尿病剤の候補物質として選別することができる。
CCDC3タンパク産生量の測定（検出、定量）は、CCDC3タンパク産生可能細胞から得られるCCDC3タンパクの量を、当該CCDC3タンパクに対する抗体（抗CCDC3抗体）（前述する本発明の検査薬）を利用してウエスタンブロット法や免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を行うことによって実施することができる。具体的には、ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の検査薬を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製など)、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の検査薬を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
かかる本発明のスクリーニング方法により選別される物質は、CCDC3タンパクの産生抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、CCDC3タンパクの産生を抑制することによって、内臓脂肪型肥満を改善する薬物、またその進行を抑制して、ＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患への進展を予防する薬物の有力な候補物質となる。
(3) CCDC3タンパクの機能または活性を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、CCDC3タンパクの機能または活性を低下させる作用を有する物質を、CCDC3タンパクの作用低下を指標として探索し、抗内臓脂肪型肥満剤又は抗糖尿病剤の有効成分として取得する方法である。
当該方法は、具体的には下記の工程（1”）〜（3”）を行うことによって実施することができる。
（1”）被験物質、CCDC3タンパクに反応する細胞、及びCCDC3タンパクを接触させる工程、
（2”）前記細胞のCCDC3タンパクの機能または活性を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した機能または活性が、被験物質を接触させることなくCCDC3タンパクを接触させた対照細胞（CCDC3タンパクに反応する細胞）のCCDC3タンパクの機能または活性よりも低い被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられるCCDC3タンパクに反応する細胞としては、CCDC3タンパクと接触させる事によって何らかの生物活性を示す細胞であればよい。かかる細胞として、具体的には、肝臓由来の細胞株や単離調製された肝臓の初代培養細胞を挙げることができる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
候補物質の選別は、上記条件で被験物質とCCDC3タンパクと反応する細胞またはその細胞画分とを接触させて、CCDC3タンパクの作用を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下で、CCDC3タンパクに反応する細胞をCCDC3タンパクとともに培養した場合に生じるCCDC3タンパクの機能または活性が、被験物質非存在下で上記に対応するCCDC3タンパクに反応する細胞をCCDC3タンパクとともに培養した場合に得られるCCDC3タンパクの機能または活性（対照機能または活性）よりも低いことを指標として、当該被験物質を「CCDC3タンパクの機能または活性を低下させる作用を有する物質」、または抗内臓脂肪型肥満剤若しくは抗糖尿病剤の有効成分の候補物質として選別することができる。
ここで、CCDC3タンパクの機能または活性としては、CCDC3タンパクを肝細胞に添加することにより、肝細胞からの糖放出を促進する作用および、糖新生の律速酵素であるglucose-6-phosphatase（G6Pase）およびphosphoenolpyruvate carboxykinase（PEPCK）のmRNA発現量を増加させる作用を挙げることができる。かかる機能または活性は、実施例５に記載の方法により測定することができる。
(4) CCDC3トランスジェニックマウスを用いたスクリーニング方法
当該スクリーニングは、CCDC3 mRNAを高発現し、CCDC3タンパクを高産生するように形質転換されたCCDC3トランスジェニックマウス（CCDC3 Tgマウス）を用いて、体重低下または血糖値低下を指標として、被験物質の中から抗内臓脂肪型肥満剤又は抗糖尿病剤の有効成分となりえる物質（候補物質）を取得する方法である。
当該方法は、具体的には下記の工程（a）〜（c）を行うことによって実施することができる。
（a）CCDC3 Tgマウスに被験物質を投与する工程、
（b）被験物質を投与したCCDC3 Tgマウスの体重（被験体重）または血糖値（被験血糖値）を経時的に測定し、被験物質を投与しないCCDC3 Tgマウスの経時的体重（対照体重）または血糖値（対照血糖値）と対比する工程、
（c）上記被験体重または被験血糖値が、対照体重または対照血糖値に比して低下する場合の被験物質を内臓脂肪型肥満または糖尿病を改善する有効成分として選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられるCCDC3 Tgマウスは、CCDC3 mRNAを高発現するように人為的に形質転換されたマウスであり、受精卵前核へのDNAマイクロインジェクションによる方法、胚性幹細胞にDNAを導入した後キメラマウスを作製する方法などで作製できる（マウスラボマニュアル第2版、東京都臨床医学総合研究所実験動物研究部門編集、Springer Japan(2005)）。また、後述する実施例７に記載する方法に従っても作製することができる。当該マウスは、同一の食餌を与えた場合でも、正常なマウスに比して有意に体重が増加し、また血糖値が高いことを特徴とする（図７および８）。
候補物質の選別は、被験物質を投与するCCDC3 Tgマウス（被験マウス）と、被験物質を投与しないCCDC3 Tgマウス（対照マウス）とを、同一の環境下で飼育し、経時的に体重と血糖値を測定することによって行うことができ、対照マウスに比して、被験マウスの体重を有意に低下させる場合の被験物質を、内臓脂肪型肥満を改善する有効成分として選択することができる。また対照マウスに比して、被験マウスの血糖値を有意に低下させる場合の被験物質を、糖尿病を改善する有効成分として選択することができる。
上記(1)〜（４）のスクリーニング方法で選別された物質は、内臓脂肪組織細胞においてCCDC3遺伝子の発現増加（亢進）を抑制して、肝糖放出や糖新生を抑制する作用を有するものであり、よって内臓脂肪型肥満の改善やその進行によるＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患を予防する組成物（抗内臓脂肪型肥満剤）の有効成分として、また糖尿病の改善やその進行（糖尿病合併症の発症を含む）を予防する組成物（抗糖尿病剤）の有効成分として、使用することが可能である。
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに内臓脂肪型肥満を有する病態非ヒト動物またはＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患、または糖尿病を有する病態非ヒト動物を用いてスクリーニングにかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに内臓脂肪型肥満または糖尿病を有する病態非ヒト動物、またはＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに内臓脂肪型肥満者（ヒト）、その前状態にある者（ヒト）もしくはその状態がさらに進行したＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患を有する者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な抗内臓脂肪型肥満剤や抗糖尿病剤の有効成分を選別取得することができる。
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤の調製に使用することができる。
５．抗内臓脂肪型肥満剤、抗糖尿病剤
後述する実施例６に示すように、CCDC3遺伝子のsiRNAによると、CCDC3遺伝子を導入した細胞におけるCCDC3 mRNAの発現が抑制される。当該siRNAは、内臓脂肪型肥満の改善剤またはその進行によるＭＳなどの代謝性疾患や心血管疾患などの進展を予防する薬剤（抗内臓脂肪型肥満剤）の有効成分として、また糖尿病の改善剤またはその進行による糖尿病合併症の進展を予防する薬剤（抗糖尿病剤）の有効成分として、使用することができる。
ゆえに本発明は、CCDC3遺伝子の発現を抑制するsiRNA を有効成分とする抗内臓脂肪型肥満剤を提供する。また本発明は、CCDC3遺伝子の発現を抑制するsiRNA を有効成分とする抗糖尿病剤を提供する。
本発明が対象とするsiRNA は、二本鎖であり、CCDC3遺伝子の標的配列に相補的な配列であるセンス鎖と該センス鎖に相補的な配列であるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなっている。上記二本鎖は、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（shRNA）であってもよい。かかるsiRNAは、CCDC3遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されない。例えば、マウスCCDC3遺伝子のsiRNAとしては、マウスCCDC3遺伝子の塩基配列（配列番号２）の2236-2256領域をターゲット配列とするsiRNA #1：センス鎖r(gacacaugauacugauaaa)dTdT（配列番号５）、アンチセンス鎖r(uuuaucaguaucauguguc)dTdG（配列番号６）、1506-1526領域をターゲット配列とするsiRNA #2：センス鎖r(gaaagauguuaagacuuaa)dTdT（配列番号７）、アンチセンス鎖r(uuaagucuuaacaucuuuc)dAdG（配列番号８）、2011-2131領域をターゲット配列とするsiRNA #3：センス鎖r(gaaguauuugcauaacaaa)dTdT（配列番号９）、アンチセンス鎖r(uuuguuaugcaaauacuuc)dTdA（配列番号１０）を挙げることができる。ヒトCCDC3遺伝子のsiRNAも同様にして構築することができる。
またCCDC3遺伝子の発現を抑制するsiRNAに限らず、CCDC3遺伝子を抑制する核酸も本発明の抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤の有効成分として使用することができる。かかる核酸として、CCDC3遺伝子に対するmiRNA、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、リボザイム、アプタマーおよびデコイなどを挙げることができる。ここでアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは、CCDC3遺伝子の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するものであり、CCDC3遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることによって、該ＲＮＡの合成または機能を阻害するか、あるいは該ＲＮＡとの相互作用を介してCCDC3遺伝子の発現を調節・制御する作用を有するものである。アンチセンスポリヌクレオチドには、上記作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドであってもよく、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどが含まれる。
アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは通常、10〜1000個程度、好ましくは15〜500個程度、更に好ましくは16〜30個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
さらにCCDC3遺伝子を抑制する核酸に限らず、CCDC3タンパクの機能を抑制する作用を有するものも本発明の抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤の有効成分として使用することができる。かかる作用を有するものとして、CCDC3タンパクに対する抗体、特に中和抗体を挙げることができる。
ここで中和抗体とは、抗原に結合することによりその抗原が本来有していた機能又は活性を阻害する性質を有する抗体を意味する。CCDC3タンパクに対する中和抗体とは、CCDC3タンパクに結合することによりCCDC3タンパクが有する機能又は活性を阻害する性質を有する抗体を言う。
本発明の抗内臓脂肪型肥満剤または抗糖尿病剤は、上記のCCDC3遺伝子の発現を抑制したり、またその機能を抑制する有効成分（siRNA、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、抗体など） に加え、任意の担体や添加剤、例えば医薬上許容される担体および添加剤を含むことができる。
医薬上許容される担体および添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤；クエン酸、メントール等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤；ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、非経口的な投与製剤としては、他に水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
本発明の予防または治療剤の投与量は、投与対象となる被験者の体重や年齢、並びに病気の重篤度等によって異なり、一概に設定することはできないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として数mg〜数十mg／kg体重を挙げることができ、これを１日１回〜数回に分けて投与することができる。
上記の有効成分がDNAによりコードされるものである場合は、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分がアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press),Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)等に記載された方法を用いた。
実施例１ ヒト脂肪組織を用いたマイクロアレイ解析
（１）ＤＮＡマイクロアレイ解析に用いた肥満者脂肪組織
滋賀医科大学附属病院にて外科手術を受ける患者にあらかじめ本研究内容を説明し同意を得た後、腹部内臓脂肪組織および腹部皮下脂肪組織を提供してもらった。対象とした患者は55歳から75歳の男性合計10名で、腹囲長85 cm未満を示す非内臓脂肪型肥満者（耐糖能正常）（5例、平均腹囲長78.5cm±2.5cm）および腹囲長85 cm以上を示す内臓脂肪型肥満者（耐糖能正常）（5例、平均腹囲長90.7cm±3.6cm）に分類した。
（２）肥満者の内臓脂肪組織特異的に発現が変動する遺伝子の検索
非内臓脂肪型肥満者5例および内臓脂肪型肥満者5例の凍結内臓脂肪組織および凍結皮下脂肪組織を、それぞれ5 mm角程度に細切し、QIAzol Lysis Reagent（Qiagen）中にて、TissueLyser（Qiagen)を用いてホモジナイズした。得られたホモジネートにクロロホルムを添加して混和し、遠心分離により水層を回収した。得られた水層から、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（Qiagen）を用い、当該Kitに添付のプロトコールに従い、全RNAを単離・精製した。精製した全RNAは260 nmの吸光度にて定量を行うとともに、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies）を用いてRNA分解がないことを確認した。
次に標識cRNAの合成を、Low RNA Input Linear Amplification Kit（Agilent Technologies）を用いて、当該Kitに添付の1色法の実験プロトコールに準じて実施した。精製した500 ngの全RNAを使用して、T7 promoterが5’側に付加されたoligo-dT primerを用いて逆転写反応によりcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型として、Cy3標識UTP（PerkinElmer）存在下でT7 RNA Polymeraseを用いてin vitro transcriptionを行い、標識cRNAを合成した。得られた標識cRNAはRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて精製し、その収量を260 nmの吸光度により定量した。
Cy3標識cRNAを断片化した後、Whole Human Genome Oligo Microarray（Agilent Technologies）を用いて65℃にて17時間ハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイを洗浄・乾燥した後、DNA microarray scanner（Agilent Technologies）を使用してCy3の波長の蛍光画像を取得した。続いてFeature Extraction Software（Agilent Technologies）を使用して、各プローブの蛍光シグナルを定量化した。なお、そのデータ解析はGeneSpring version 7.0（Agilent Technologies）を用いて実施した。マイクロアレイ間のノーマライゼーションは、アレイ上に存在する全プローブのシグナルの中央値を揃えることにより行った。
解析の結果、非内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織に比較して内臓脂肪型肥満者の内臓脂肪組織内で3.2倍発現が上昇している遺伝子として、Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）遺伝子が見出された（図１左側）。これに対して、CCDC3遺伝子は、内臓脂肪型肥満者の皮下脂肪組織では、非内臓脂肪型肥満者の皮下脂肪組織に比較してわずかな発現上昇しか認められなかった（図１右側）。このことから、当該遺伝子の発現上昇は内臓脂肪組織に特異的な現象であることが明らかとなった。
実施例２ 肥満モデルdb/dbマウスにおけるCCDC3発現解析
（１）肥満者の内臓脂肪で発現上昇が確認されたCCDC3遺伝子が、肥満の病態モデルマウス（db/dbマウス）の脂肪組織で発現変動しているかをreal-time PCRを実施することにより検討した。db/dbマウス（日本クレア）は15週齢のオスを解析に用い、対照群には、db/mマウス（日本クレア）を用いた。
上記各群のマウス5匹ずつから内臓脂肪組織である腸間膜脂肪組織、並びに比較のため皮下脂肪組織および副睾丸周囲脂肪組織を採取し、RNAを調製した。調製した各群5匹分のRNAをプールし、マイクロアレイ解析実施のための全RNAサンプルとした。RNA調製方法、cDNA合成、マイクロアレイ解析および検出方法に関しては、実施例１(2)と同様の方法を用いた。但し、マイクロアレイはマウス用のWhole Mouse Genome Oligo Microarray（Agilent Technologies）を用いた。解析の結果、肥満モデルマウス（db/dbマウス）は、対照群に比べて、腸間膜脂肪におけるCCDC3遺伝子の発現が2.1倍上昇していることが確認された（図2）。
以上のヒトおよび肥満モデルマウスのマイクロアレイ解析結果より、CCDC3遺伝子の発現量を指標にして肥満、特に内臓脂肪型肥満が判定可能であることが示唆された。
（２）また、肥満の病態モデルであるDIO（Diet-induced obese）マウス20週齢について、腸間膜脂肪および副睾丸周囲脂肪における発現上昇遺伝子（2倍以上、vs CE-2摂餌マウス）、発現低下遺伝子（0.5倍以下、vs CE-2摂餌マウス）を比較する実験を行った。なお、DIOマウスは、C57BL/6J Jclマウス（日本クレア）の7週齢オスに高脂肪食（HFD）である58Y1DIO P.D. 60%Energy From Fat-Blue（日本エスエルシー）を13週間摂餌させることで作製した。対照群には、C57BL/6J Jclマウス（日本クレア）の7週齢オスにCLEA Rodent Diet CE-2（日本クレア）を13週間摂餌させて作製したマウスを用いた。調査したところ、高脂肪食負荷により発現変動している遺伝子数は、表１に示すように、腸間膜脂肪で1241遺伝子（発現上昇遺伝子数338＋229=567遺伝子、発現低下遺伝子数360＋314＝674遺伝子）、副睾丸周囲脂肪で3205遺伝子（発現上昇遺伝子数1349＋229=1578遺伝子、発現低下遺伝子数1313＋314＝1627遺伝子）であり、副睾丸周囲脂肪においてより多くの遺伝子が発現変動していることが明らかとなった。しかしながら、これら遺伝子の中で腸間膜脂肪と副睾丸周囲脂肪の両脂肪組織で発現変動している遺伝子は少なく（発現上昇遺伝子数229遺伝子、発現低下遺伝子数314遺伝子）、両脂肪組織はいずれも白色脂肪組織ではあるが、異なる遺伝子発現変動を示すことが明らかとなった（表１参照）。
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実施例３ 分泌タンパクであることの確認
アミノ酸配列中のシグナル配列部位とその切断部位を予測するウェブツールであるSignalP 3.0の、Neural Network (NN)およびHidden Markov Model (HMM)という二つのアルゴリズムを用いてCCDC3タンパクのアミノ酸配列を解析した。その結果、両アルゴリズム共にCCDC3タンパクがシグナル配列を有するタンパク質である可能性を示唆し、その切断部位は21アミノ酸残基と22アミノ酸残基の間であることが推察された。
これを確認するために、HEK293T細胞にヒトCCDC3過剰発現ベクターpReceiver-CCDC3を導入し、培地中に分泌されたCCDC3タンパクをウェスタンブロッティング法により検出した。具体的には、10cmシャーレで約80％コンフルエントまで培養したHEK293T細胞にCCDC3発現ベクターpReceiver-CCDC3をLipofectamine2000（Invitrogen）を用いて添付のマニュアルに従って導入した。導入48時間後、培養液および1mLのLysis buffer（0.1 mol/L NaCl，1% Triton X-100およびプロテインインヒビターを含む25 mmol/L Tris-HCl（pH8））で溶解した細胞抽出液を回収し、それぞれ10μLおよび0.8μL用いてウェスタンブロッティングをおこなった（還元状態）。検出にはanti-FLAG M2-HRP抗体(SIGMA) およびECL plus（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。結果を図３に示す。
解析の結果、培養液（Medium）中にCCDC3タンパクのシグナルが認められ、このことからCCDC3タンパクは分泌タンパクであることが示唆された。
実施例４ ヒトCCDC3リコンビナントタンパクの精製
C末端側に3×Flagタグを融合したヒトCCDC3発現ベクターpReceiver-M14-humam CCDC3をGeneCopoeia社より購入した。このヒトCCDC3発現ベクターを鋳型とし、3×Flagタグ切断用のスロンビン特異的な切断アミノ酸認識配列をコードする塩基配列を挿入したプラスミドを構築し、蛋白質発現精製に使用した。ヒトCCDC3発現ベクターは、293fectin (Invitorogen)を用いて定法に従い、Freestyle293細胞にトランスフェクションした。同細胞をFreestyle293 expression medium（Gibco）中で37℃、 2日間振とう培養した後、遠心分離にて培養上清を回収した。得られた培養上清を、あらかじめ0.5 M NaCl を含む20 mM HEPES-Na, pH 7.5緩衝液にて平衡化したANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma)カラムにアプライし、3×Flagタグ融合CCDC3タンパクを吸着させた。5カラム体積分の同緩衝液で洗浄した後、0.1 mg/ml 3×FLAG Peptide (Sigma)を含む同緩衝液でCCDC3タンパクを溶出させた。溶出画分をSDS-PAGE電気泳動することにより分子量34 kDaの3×Flagタグ融合CCDC3タンパクを確認した。CCDC3タンパクを含む画分をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10k MWCO（Millipore）にて濃縮し、CCDC3タンパク約10 μgに対して、1 unitのスロンビン（Sigma, T7513-100u）を添加し室温にて15時間処理して3×Flagタグを切断した。切断処理後、Benzamidine Sepharose 6Bレジンにアプライしてスロンビンを除去した。最終精製として前記緩衝液にて平衡化したSuperdex200 16/60カラム (GE healthcare)にアプライし、溶出画分をSDS-PAGE電気泳動することにより分子量31kDaのCCDC3タンパクを回収し、ヒトCCDC3リコンビナントタンパクの精製標品とした。
実施例５ ヒトCCDC3リコンビナントタンパク刺激による肝糖放出への影響
（１）ラット肝細胞単離
Wistar rat（10週齢、雄）をペントバルビタール麻酔の後、カニュレーションを実施し2％ペニシリンストレプトマイシンを含む約350mL のLiver Perfusion Medium（Invitrogen 17701-038）で肝臓を灌流した。その後、引き続きLiver Digest Medium（Invitrogen 17703-034）で約10分間灌流した。灌流後の肝臓を15cmシャーレに取り、1%FBS（GIBCO）および1％ペニシリンストレプトマイシン（GIBCO）入りHepatocyte Wash Medium（Invitrogen 17704-024）中で揺らすことにより細胞を解きほぐした。Hepatocyte Wash Medium中に懸濁された肝細胞をガーゼ（４重）でろ過し、50mlファルコンチューブに回収した。400rpm、1分、4℃の遠心操作の後、上清を捨て、沈殿した肝細胞を新たなHepatocyte Wash Mediumで懸濁した後、400rpm、1min、4℃の遠心操作を実施した。上清除去後、回収した肝細胞を、氷冷した10％ FBS、1％ ペニシリンストレプトマイシン入りHepatocyte Wash Mediumで懸濁した後、遠心(400rpm, 2min, 4℃)した。この洗浄操作を2回実施した。得られた肝細胞を約10 mLの10％ FBS Hepatocyte Wash Mediumに懸濁し、トリパンブルーで染色し細胞数を計測した。10％ FBS William's E Medium(SIGMA-ALDRICH, W4128)に適宜希釈し、下記の実験に供した。
（２）肝細胞糖放出測定
上述の方法で単離した肝細胞を2.5×105/wellで24well コラーゲンplate（BIOCOAT）に撒き、4時間培養した後、0.5％ BSA（SIGMA）および100nM dexamethasone（SIGMA）を含むWilliam’s medium Eで一晩培養した。翌日、glucose free DMEM（SIGMA,D5030）に糖新生基質（2mM lactate(SIGMA-ALDRICH, L-1750), 0.2mM pyruvate（Nacalai tesque)）を添加した培地に交換し、実施例４で調製した100nM ヒトリコンビナントCCDC3タンパク刺激の有無による糖放出への影響を検討した。
肝糖放出増加の陽性コントロールとして3nM glucagon（PEPTIDE研、4098-s）を用いた。培地交換後、37℃で4時間培養した後、上清を回収すると共に、肝細胞をPBS(−)で洗浄した後、0.25N NaOH 250μlにより溶解した。上清中のグルコース濃度は、グルコースC-II-テストワコー（WAKO, 437-90902）を用いて、またタンパク量はBCA protein assay kit（PIERCE 23225）を用いて定量した。グルコース濃度は肝細胞のタンパク量で補正した。結果を図４に示す。その結果、図４に示すように、100nM CCDC3タンパクによる刺激により糖放出が増加することが確認された（CCDC3タンパク 0nM vs 100nM 1.2倍 n=6 p<0.01）。
（３）糖新生系遺伝子発現測定
上述した4時間培養後のラット肝細胞から、RNeasy mini kit（QIAGEN）を用い添付のマニュアルに従いRNAを調製した。得られた全RNA 500ngよりHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosystems）を用いて添付マニュアルに従い、cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型とし、糖新生の律速酵素であるglucose-6-phosphatase（G6Pase）およびphosphoenolpyruvate carboxykinase（PEPCK）のmRNA発現量をリアルタイム定量PCRにより検討した。補正用遺伝子には、ribosomal protein S18 （Rps18）を用いた。タカラバイオ社で合成したラットG6PaseおよびラットRps18リアルタイム定量PCR用プライマー（G6Pase用；Forward primer：5’-TGCGTGCCATAGGACTCATCA-3’（配列番号８）、 Reverse primer：5’-AGCAAACAATTGCCCACCGTA-3’（配列番号９）、Rps18用；Forward primer：5’-AAGTTTCAGCACATCCTGCGAGTA-3’ （配列番号１０）、Reverse primer：5’-TTGGTGAGGTCAATGTCTGCTTTC-3’（配列番号１１））を用いて、SYBR Green Iを用いたリアルタイム定量PCRをおこなうことでmRNA量を定量した。反応試薬としては、POWER SYBR GREEN PCR MASTER MIX（Applied Biosystems）を使用し、50℃2分、95℃で10分間反応した後、95℃で15秒、60℃で60秒の反応を40サイクルおこなって定量した。PCRおよび蛍光測定は、7500 Real time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。ラットPEPCKについてはAppliedBiosystems社製のTaqman probe Rn01529009_g1を用いてリアルタイム定量PCRを行った。反応試薬としては、Taqman Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を使用し、50℃で2分、95℃で10分間反応した後、95℃で15秒、60℃で1分の反応を40サイクル行なって定量した。PCR、及び蛍光測定は、7500 Real time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。
結果を図５に示す。図５に示すように、解析の結果、100nM CCDC3タンパクによる刺激により糖新生律速酵素G6Pase mRNAおよびPEPCK mRNAの有意な発現増加が確認された(CCDC3タンパク 0nM vs 100nM: G6Pase 2.6倍、PEPCK 2.2倍、n=5 いずれもp<0.01)。以上の結果より、CCDC3タンパクは糖新生系を亢進させることにより肝糖放出を増大させることが示唆された。
実施例６ CCDC3に対するsiRNA導入による発現抑制
（１）3T3-L1（マウス前駆脂肪細胞）培養 3T3-L1細胞（マウス前駆脂肪細胞）を10cmシャーレ（Biocoat CollagenI Cellware 100mm Dish, BD Biosciences）で培養しコンフルエントにした後、分化培地D-MEM(+10% FBS、+1% PenicillinG/Streptomycin、5μg/ml insulin、0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin、1μM dexamethasone)に交換することにより分化を誘導した。分化誘導後2日目には、D-MEM(+10% FBS、+1% PenicillinG/Streptomycin)に培地を交換し、分化誘導後5日目まで培養した。
（２）Nucleofector（AMAXA）を用いたCCDC3 siRNA導入
上記で分化させた3T3-L1細胞を、トリプシン（GIBCO）を用いてシャーレから剥がし、D-MEM培地に懸濁した後、チューブに回収した。500rpm、5分間遠心した後、D-MEM培地を取り除き、Cell Line Nucleofector Kit L（AMAXA）に付属のNucleofector Solution（200μl/100mmシャーレ）に緩やかに懸濁した。1.5mlチューブに調製した細胞懸濁液100μlを分注し、そこへ200pmol CCDC3 siRNA（QIAGEN、HP GenomeWide siRNA（siRNA #1：センス鎖r(gacacaugauacugauaaa)dTdT（配列番号５）、アンチセンス鎖r(uuuaucaguaucauguguc)dTdG（配列番号６）；siRNA #2：センス鎖r(gaaagauguuaagacuuaa)dTdT（配列番号７）、アンチセンス鎖r(uuaagucuuaacaucuuuc)dAdG（配列番号８）；siRNA #3：センス鎖r(gaaguauuugcauaacaaa)dTdT（配列番号９）、アンチセンス鎖r(uuuguuaugcaaauacuuc)dTdA（配列番号１０））、あるいはコントロールsiRNA（QIAGEN、AllStars RNAi Controls）を添加し軽く懸濁した後、付属のキュベットへ移した。なお、上記CCDC3 siRNAの#1、#2および#3は、それぞれマウスCCDC3遺伝子の塩基配列の2236-2256領域、1506-1526領域、および2011-2131領域をターゲット配列とするsiRNAである。キュベットをNucleofector本体にセットし、エレクトロポレーションを実施後、500μlのD-MEM(+10% FBS, +1% PenicillinG/Streptomycin)をキュベットに添加し、付属のスポイトで軽く懸濁した。この細胞懸濁液を、6-well plate（Biocoat CollagenI Cellware 6-well plate、BD Biosciences）中で予め1.5mlのD-MEM（+10% FBS、+1% PenicillinG/Streptomycin)をプレインキュベーションしておいたところへ播き込み、2日間培養した後、RNAを調製した。
（３）RNA調製およびCCDC3発現解析
上述したCCDC3 siRNA導入細胞から、RNeasy mini kit（QIAGEN）を用い添付のマニュアルに従いRNAを調製した。得られた全RNAよりSuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いて添付マニュアルに従いcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型とし、CCDC3のmRNA発現量をリアルタイム定量PCRにより検討した。補正用遺伝子には、36B4を用いた。タカラバイオ社で合成したマウスCCDC3リアルタイム定量PCR用プライマー（Forward primer：5’-TGGTTCATCGCCTCTAATGGTG-3’（配列番号１５）、 Reverseprimer：5’-TGGAATGGGTTCTAGGTGGTCAA-3’（配列番号１６））およびマウス36B4リアルタイム定量ＰＣＲ用プライマー（Forward primer:5’-CAACGGCAGCATTTATAACCC-3’（配列番号１７）、Reverse primer:5’-CCCATTGATGATGGAGTGTGG-3’（配列番号１８））を用いて、SYBR Green Iを用いたリアルタイム定量PCRをおこなうことでmRNA量を定量した。反応試薬としては、POWER SYBR GREEN PCR MASTER MIX（Applied Biosystems）を使用し、50℃で2分、95℃で10分間反応した後、95℃で15秒、60℃で60秒の反応を40サイクルおこなって定量した。PCRおよび蛍光測定は、7500 Real time PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。
結果を図６に示す。図６に示すように、解析の結果、3種のCCDC3 siRNA導入により80％以上のCCDC3 mRNAの発現が抑制されることが確認された。
実施例７ レンチウイルスを用いたトランスジェニック（Tg）マウス作製および解析
（１）CCDC3レンチウイルスベクター作製用プラスミドの構築 野生型C57BL/6系雄性マウスより採取した脂肪組織よりTRIzol Reagent（インビトロジェン社）を用いてトータルRNAを精製し、SuperScript III Reverse transcriptase（インビトロジェン社）を用いて、Oligo dTプライマーによりcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型にして下記に示す塩基配列からなる特異プライマーを用い、KOD FX（東洋紡）を用いてPCRを行うことにより、EcoRIとBamHI制限酵素部位を導入した増幅断片を得た。
CCDC3 EcoRI−F3プライマー：gcgaattctagccgtgcacccagctctccggag（配列番号１９）
CCDC3 BamHI−R3プライマー：gcggatcctagagcttgcggttgttctcagtcagc（配列番号２０）。
得られたDNA増幅断片を、EcoRIとBamHIで制限酵素処理し、pBluescript KS（Stratagene社）のEcoRIとBamHI切断部位に挿入して連結したプラスミドを得た後、シークエンスによりその配列を確認した。その後、得られたプラスミドを鋳型に、下記に示す塩基配列からなる特異プライマーを用い、同様にPCRを行うことにより、kozakコンセンサス配列およびSTOPコドンを付加したCCDC3遺伝子のORF配列を得た。
CCDC3 Kozak−Fプライマー：gcgaattccaccatgccgctcccgctgctgctc（配列番号２１）
CCDC3 STOP−Rプライマー：gcggatccctacccatgcagatagggggc（配列番号２２）。
得られたDNA増幅断片を、EcoRIとBamHIで制限酵素処理し、pCDH1-MCS1（System Biosciences社）のEcoRIとBamHI部位に挿入することでウイルス作製用プラスミドpCDH1-CMV-CCDC3を作製した。得られたウイルス作製用プラスミドpCDH1-CMV-CCDC3は、シークエンスによりその配列を確認した。
（２）CCDC3レンチウイルスベクターの調製
10％FCS（ウシ胎仔血清）を含有するDMEM（高グルコース）を用い、5％CO２、37℃の条件下で293FT細胞（インビトロジェン社）を培養した。その後、FuGENE6（ロシュ社）を用いて、添付のプロトコールに従いトランスフェクションを行い、pCDH1-CMV-CCDC3プラスミドをpPACKH1 Lentivector Packaging Kit（System Biosciences社）のパッケージングプラスミド（pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G）と共導入した。トランスフェクションを行ってから72時間後に、培養上清を回収し0.45μmフィルター（ミリポア社）で濾過した後、超遠心（ベックマン社SW32Tiローターで19400rpm、4℃、2時間）で濃縮した。上清を注意深く捨て、PBSに懸濁した後、スクロース密度勾配法による精製（ベックマン社SW55Tiローターで21000ｒｐｍ、4℃、2時間）を行い、最終的にPBSで懸濁することにより、トランスジェニックマウス作製用の濃縮レンチウイルスベクターを調製した。調製したウイルスベクターの物理的力価（粒子数）はp24 Antigen ELIZA kit（ZeptoMetrix社）を用いて測定した。
（３）レンチウイルスベクターによるトランスジェニックマウスの作製
常法に従い、BDF1雌マウスにPMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）を51U、その48時間後にhCG（胎盤性性腺刺激ホルモン）を51U腹腔内投与することで過排卵を誘発し、BDF1雄マウスと交配した。交配翌日に膣栓を確認できた雌マウスの卵管を、交配後約40時間で採取し、0.4％BSAを含有した生理食塩水で灌流した。回収できた2細胞期胚はKSOM培地（アークリソース社）中で短期間培養した後、1分から2分程度、酸性タイロード（アークリソース社）処理することで胚の透明体を融解、除去した。首尾よく透明帯が除去された胚は、KSOM培地中で洗浄し、ウイルス感染まで同培地中で培養した。胚へのウイルス感染は、ウイルス粒子数を約100pg/μl、333pg/μlまたは1000pg/μl含むように希釈したKSOM培地のドロップ（6μl／スポット）にて、透明帯を除去した胚を2日間培養することにより行った。胚の培養は、全て5％CO２、37℃の条件下で行った。ウイルス感染後に、胚盤胞期もしくは桑実胚期まで発生した胚を、膣栓確認後2.5日の偽妊娠マウス子宮内へ移植し、移植17日後に自然分娩もしくは帝王切開により産仔を得た。
（４）CCDC3トランスジェニックマウスの選抜
生後3週齢で採取した産仔の尾端より、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを精製した。精製したDNAをテンプレートとして下記に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてPCRを行うことで遺伝子型判定を行った。
CCDC3−F1プライマー：ggagagggagggctcttcta（配列番号２３）
CCDC3−R1プライマー：gttctcctgggtgtctggaa（配列番号２４）。
生後4週から5週齢で、PCR法により選抜したトランスジェニックマウスの尾端より、 RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）を用いてトータルRNAを精製した。精製したRNAを鋳型とし、下記に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いたCCDC3遺伝子発現解析を、Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit（QIAGEN）により行った。発現解析の内在性コントロール遺伝子にはmGAPDH遺伝子を用い、対照群と比較しCCDC3遺伝子発現量が４倍以上のトランスジェニックマウス（CCDC3 Tgマウス）を選抜し、表現型解析に供した。
CCDC3−QPCR−Fプライマー：gctcaaccttactggtctgggcta（配列番号２５）
CCDC3−QPCR−Rプライマー：catcttggaaattgactccgtgtg（配列番号２６）
mGAPDH−QPCR−Fプライマー：aaatggtgaaggtcggtgtg（配列番号２７）
mGAPDH−QPCR−R プライマー：tgaaggggtcgttgatgg（配列番号２８）。
（５）CCDC3トランスジェニックマウスの表現型解析
生後8週齢のCCDC3 Tgマウスおよびウイルス感染対照区に、高脂肪食（HFD）である58Y1 DIO P.D. 60%Energy From Fat-Blue（日本エスエルシー）を摂餌させ、経時的に体重測定を実施した（図７）。また、HFD摂餌開始後52日目に随時血糖値を測定した（図８）。随時血糖値は、尾静脈をカミソリで切開することで採取した微量の血液を用いて、グルコカードダイアメーターα（アークレイ）で測定した。今回、ウイルス感染対照区には、pCDH1-CMV-loxP-stop-loxP-EGFPプラスミドを用いてpCDH1-CMV-CCDC3と同様の方法で作製したレンチウイルスベクターを用いた。
解析の結果、図７に示すように、HFDを摂餌させたCCDC3 Tgマウスでは、対照区に比し、体重増加が認められた。また、図８に示すように、CCDC3 Tgマウスは、対照区に比し、HFD摂餌開始後52日目に測定した随時血糖値の増加が認められた。これらの結果から、CCDC3は、体重および血糖値に影響を及ぼす作用を有している可能性が示唆された。
実施例８ ヒトCCDC3タンパクを認識するモノクローナル抗体の調製
下記に詳述するように、Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications)に記載されている方法に準じて、CCDC3を認識する抗体としてヒトCCDC3モノクローナル抗体を調製した。
（１）抗原の選定
CCDC3を認識する抗体を獲得するために、上記実施例で調製したヒトリコンビナントCCDC3及びそれをKLH（keyhole limpet hemocyanin）にコンジュゲートしたものを免疫原とした。ヒトCCDC3の立体構造は明らかにされていないため、立体構造の表面に露出している可能性が高いヒトCCDC3の259〜270位のアミノ酸配列からなるC末端ペプチドを免疫原として選定した。
（２）免疫原の調製
ヒトCCDC3タンパクのＣ末端部分ペプチド（259-270、12アミノ酸残基、ARGPVRPPYLRG：配列番号２９）を合成し、その1.5mgを含む0.1M リン酸緩衝液（pH 7.1）に10倍モル量のsulfo-SMCC水溶液を加え、逆相ＨＰＬＣ（カラム：YMC-pack ODS-A、6.0ｘ150mm、移動相：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸水溶液）を行って、マレイミド化ペプチド画分1.4mgを分取した。マレイミド化ペプチド画分は凍結乾燥して後記のコンジュゲーションに供した。一方、Mariculture keyhole limpet hemocyanin（KLH, Thermo scientific社製）20 mgを含む0.1 Mリン酸緩衝化生理食塩水（pH 7.2）2mLに700倍モル量のSulfo-SPDP（Thermo scientific社製）水溶液を加え、４℃で16時間静置したのち、0.1 Mメルカプトエチルアミン水溶液0.2mLを加え、室温で30分間静置した。これを5mM EDTA含有0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.0）で平衡化したPD-10カラム（GEヘルスケア社製）を用いてゲルろ過を行い、SH基導入KLHを分取した。このSH基導入KLH 10mgを含む5 mM EDTA含有 0.1 Mリン酸緩衝液（pH 6.0）に、上記のマレイミド化Ｃ末端ペプチドの凍結乾燥末1.2mgを加え、室温で１時間、さらに４℃で一晩反応させた。反応液を精製水に対して透析した後に、凍結乾燥し、免疫原とした（抗原１）。
また、実施例４で精製した1.1mgのヒトリコンビンナントCCDC3に、5倍モル比のSulfo-EMCS（Thermo scientific社製）を添加し、室温で３時間反応させ、マレイミドヒトCCDC3を調製した。次に、20 mgのMariculture keyhole limpet hemocyanin（KLH, Thermo scientific社製）に3.75μM sulfo-LC-SPDS（Thermo scientific社製）を添加し、室温で３時間反応させ、SH基導入KLHを調製した。1 mgのマレイミドヒトCCDC3及び８mgのSH基導入KLHを混合し、４℃で一晩反応させた。反応液を10 mM PB(pH 7.5)，0.5 M NaClに透析後、-80℃保存し、免疫原とした（抗原２）。
上述で調製した２種の免疫原及びヒトリコンビナントCCDC3（抗原３）の合計３種類の免疫原について、各100μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢 Balb/c雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、21日後及び42日後、63日後、84日後に免疫原100μgをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに104日後に免疫原100μgを10 mM PB(pH 7.5)，0.5 M NaCl 0.1mLに懸濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
（３）ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（p3×63‐Ag8．U1、東京腫瘤研究所）を50％のポリエチレングリコール4000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
（４）ヒトCCDC3タンパクＣ末端領域のペプチドのビオチン標識
ヒトCCDC3タンパクのＣ末端領域のペプチド（259−270、12アミノ酸残基）のＮ末端にCys残基を付加した13merペプチド0.4 mgを含む5 mM EDTA含有0.1 M リン酸緩衝液（pH 6.0）に、等モル（160μg）のPEO-Maleimide acetivated biotin（PIERCE社製）を含む水溶液 32μlを加えて室温で２時間静置したのち、逆相ＨＰＬＣ（カラム：YMC-pack ODS-A、6.0ｘ150mm、移動相：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸水溶液）によりビオチン標識されたヒトCCDC3タンパクのＣ末端領域のペプチドを精製した。
（５）リコンビナントヒトCCDC3タンパクのビオチン標識
0.31mgのヒトリコンビナントCCDC3タンパクを0.31mlの10mM リン酸緩衝液（pH 7.2）、0.5M NaCl、0.01％ Tween 20 に溶解したものと、20mM PEO- Maleimide acetivated biotin（PIERCE社製）水溶液を4.1μl添加し、４℃で一晩反応した。その後に、10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)、0.5 M NaClで平衡化したSuperdex 75（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いたゲルろ過に供し、標識されたヒトCCDC3を精製した。
（６）ヒトCCDC3モノクローナル抗体の選定
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたELISAは以下の通りである。384穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに、0.35μgの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（50mM Tris-HCl、ｐH 7.5）を35μl加えて４℃で16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液（0.01％ Tween 20を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を200μl加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスIgG抗体固相化プレート）。各ウェルを90μlの洗浄液で１回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清と10μlの緩衝液Ａ（0.5％ ウシ血清アルブミン、0.01％Tween 80、0.05％ Proclin 150、0.5 M NaClを含む50 mMトリス緩衝液、pH 7.4）を加えた。免疫原がペプチド−KLH複合体の場合、0.02 ngのBiotin-ヒトCCDC3タンパクのＣ末端領域のペプチドと、2 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ａを加え、免疫原がヒトリコンビナントCCDC3タンパク、あるいはそのKLH複合体の場合、1 ngのBiotin-ヒトリコンビナントCCDC3タンパクと4 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ａを加え、４℃で16時間反応させた。次に各ウェルを90μlの洗浄液で３回洗浄した後に、25μｌのTMB＋ Substrate-Chromogen（DAKO社製）を添加して室温で30分間発色させた後に、25μlの0.5 Mの硫酸を添加し反応を停止し、450 nmにおける吸光度を測定した。
スクリーニングの結果から、ヒトリコンビナントCCDC3タンパクと強い親和性を示す３種類のクローン（3H6，6G12，11E10）を得た。なお、３Ｈ６抗体は抗原１で免疫したマウス由来のハイブリドーマより、６Ｇ１２抗体は抗原３で免疫したマウス由来のハイブリドーマより，また１１Ｅ１０抗体は抗原２で免疫したマウス由来のハイブリドーマより得られた。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングELISAキット（BDバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、３Ｈ６及び１１Ｅ１０抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ｂであり、６Ｇ１２抗体はＩｇＧ１であった。
（７）ＥＬＩＳＡによる抗体親和性評価
上述した抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートに、10μlのCCDC3抗体を含む緩衝液Ａを加え、10μlの0.01〜100 nMのヒトリコンビナントCCDC3を加えた。そして、1 ngのBiotin-ヒトリコンビナントCCDC3タンパクと4 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ａを加え、4℃で16時間反応させた。次に各ウェルを90μlの洗浄液で3回洗浄した後に、25μlのTMB＋Substrate-Chromogen（DAKO社製）を添加して室温で30分間発色させた後に、25μlの0.5 M の硫酸を添加し反応を停止し、450 nmにおける吸光度を測定した。結果を図９に示す。
この結果からわかるように、ヒトCCDC3タンパクに対する各抗体のIC５０は、３Ｈ６抗体が9.4 nM、６Ｇ１２抗体が3.2 nM、１１Ｅ１０抗体が0.10 nMであった。
実施例９ ウェスタンブロッティングによる抗体のヒトCCDC3タンパクへの結合評価
３Ｈ６抗体、６Ｇ１２抗体および１１Ｅ１０抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。50 ngのヒトリコンビナントCCDC3タンパクをSDS-PAGEに供した（還元状態）。検出にはanti-mouse IgG-HRP抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社) およびECL advance（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。結果を図１０に示す。この結果から、いずれの抗体もウェスタンブロッティングで陽性を示し、ヒトリコンビナントCCDC3タンパクに結合することが判明した。
実施例１０ 抗体の配列決定
実施例８で取得した３Ｈ６抗体、６Ｇ１２抗体および１１Ｅ１０抗体について、常法を用いて重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を決定した。
（１）３Ｈ６抗体
・重鎖可変領域
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMIWVKQAPGKDLKWMAWINTYSGEPTCADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARDDGYYGYFDYWGQGTTLTVSS（配列番号３０）
なお、当該重鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）からCDR1（配列番号３１）、CDR2（配列番号３２）およびCDR3（配列番号３３）に相当する領域である。
・軽鎖可変領域
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSDGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPTFGGGTKLEIKRA（配列番号３４）
なお、当該軽鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）からCDR1（配列番号３５）、CDR2（配列番号３６）およびCDR3（配列番号３７）に相当する領域である。
（２）６Ｇ１２抗体
・重鎖可変領域
QVQLQQPGAELVRPGASVKMSCKASGYTFSSYLMDWVKQRPGQGFECIGNINPNTGSTIYNERFKGKAKLTVDKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCAADGYYAPFTYWGQGTLVTVSA（配列番号３８）
なお、当該重鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）左からCDR1（配列番号３９）、CDR2（配列番号４０）およびCDR3（配列番号４１）に相当する領域である。
・軽鎖可変領域
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHNNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKRA（配列番号４２）
なお、当該軽鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）左からCDR1（配列番号４３）、CDR2（配列番号４４）およびCDR3（配列番号４５）に相当する領域である。
（３）１１Ｅ１０抗体
・重鎖可変領域
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFRSYYIHWMKQSPGQGLEWIAWIYPGGGKIYYNDNEKFKDKVTLTADTSSSTAYMQLTGLTSEDSAVYFCARWGGYYVGSILDYWGQGTSVTVSS（配列番号４６）
なお、当該重鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）左からCDR1（配列番号４７）、CDR2（配列番号４８）およびCDR3（配列番号４９）に相当する領域である。
・軽鎖可変領域
DGDIVMTQSQKFLSTSVGDRVSVTCKASQNVDNNVAWYQQRPGQSPKPLIYLTSSRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYKTYPLTFSVGTKLELKRA（配列番号５０）
なお、当該軽鎖可変領域において下線部で示す領域が、Ｎ端側（左）左からCDR1（配列番号５１）、CDR2（配列番号５２）およびCDR3（配列番号５３）に相当する領域である。
実施例１１ マウスCCDC3タンパクを認識する抗体の調製
（１）抗原の選定
上述で調製したヒトリコンビンナントCCDC3タンパクと同様に調製したマウスリコンビンナントCCDC3タンパクをKLHにコンジュゲートしたものを免疫原とした。また、マウスCCDC3の262〜273位のアミノ酸配列からなるＣ末端領域のペプチドを免疫原として選定した。
（２）免疫原の調製
マウスCCDC3タンパクのＣ末端領域のペプチド（262〜273位の領域）のＣ末端にシステインを導入したペプチド（13アミノ酸）を合成した（スクラム社製）。当該合成ペプチド2.9 mgを0.29 mLの5 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸緩衝液（PH 6.0）に溶解し、10 mgのImject Maleimide activated mariculture keyhole limpet hemocyanin (Thermo scientic社製）を含む水溶液１mLを加え、室温にて１時間、さらに、４℃で一晩反応させた。反応液を精製水に対して透析した後に凍結乾燥し、免疫原とした。
また、ヒトCCDC3タンパクと同様にして精製した1.1 mgのマウスリコンビンナントCCDC3に５倍モル比のSulfo-EMCS（Thermo scientic社製）を添加し、室温で３時間反応させ、マレイミドマウスCCDC3を調製した。次に、20 mgのMariculture keyhole limpet hemocyanin (Thermo scientic社製）に3.75μM sulfo-LC-SPDS（Thermo scientic社製）を添加し、室温で３時間反応させ、SH基導入KLHを調製した。1 mgのマレイミドマウスCCDC3および8 mgのSH基導入KLHを混合し、4℃で一晩反応させた。反応液を10 mM PB(PH 7.5)，0.15 M NaClに透析後、-80 ℃で保存し、免疫原とした。
上述で調製した２種の免疫原各100μgをフロイント完全アジュバントと共に４週齢 Balb／c雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、21日後及び42日後、63日後、84日後に免疫原100μgをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに104日後に免疫原100μgを生理食塩水0.1 mLに懸濁した溶液を腹腔内投与し、最終免疫とした。
（３）ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（p3×63‐Ag8．U1、東京腫瘤研究所）を50％のポリエチレングリコール40000を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
（４）マウスCCDC3タンパクのＣ端領域の部分ペプチドのビオチン標識
マウスCCDC3タンパクのＣ端領域の部分ペプチド（262−273位のアミノ酸配列）のＣ末端にCys残基を導入したペプチド（13アミノ酸）を0.5 mgを含む5 mM EDTA含有0.1 M リン酸緩衝液（pH 6.0）に、等モル（200μg）のPEO-Maleimide activated biotin（PIERCE社製）を含む水溶液40μlを加えて室温で２時間静置したのち、逆相ＨＰＬＣ（カラム：YMC-pack ODS-A、6.0ｘ150mm、移動相：アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸水溶液）によりビオチン標識されたヒトCCDC3タンパクのＣ末端領域の部分ペプチドを精製した。
（５）マウスリコンビナントCCDC3タンパクのビオチン標識
0.22mgのマウスリコンビナントCCDC3タンパクを0.20 mLの10 mM リン酸緩衝液（pH 7.2）、0.5 M NaCl、0.01％ Tween 20に溶解したものと、20 mM PEO-Maleimide activated biotin（PIERCE社製）水溶液を3.2μl添加し、４℃で一晩反応した。その後に、10 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)、0.5 M NaClで平衡化したSuperdex 75（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いたゲルろ過に供し、標識されたヒトCCDC3を精製した。
（６）抗CCCD3抗体の選定
細胞融合10日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたELISAは以下の通りである。384穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに0.35μgの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（50 mM Tris-HCl、pH7.5）を35μl加えて４℃で16時間固定した。これらのウェルを90μlの洗浄液（0.01％ Tween 20を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を200μl加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを90μlの洗浄液で１回洗浄した後、15μlのハイブリドーマ培養上清と10μlの緩衝液Ｂ（0.5％ ウシ血清アルブミン、0.01％Tween 80、0.05％ Proclin 150、0.15 M NaClを含む50 mMトリス緩衝液、pH 7.4）を加えた。免疫原がペプチド−KLH複合体の場合、0.02 ngのBiotin‐マウスCCDC3タンパクのＣ端領域の部分ペプチドと2 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ｂを加え、免疫原がマウスリコンビナントCCDC3タンパク−KLH複合体の場合、1 ngのBiotin‐マウスリコンビナントCCDC3タンパクと4 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ｂを加え、４℃で16時間反応させた。次に各ウェルを90μlの洗浄液で３回洗浄した後に、25μlのTMB＋ Substrate-Chromogen (DAKO社製）を添加して室温で30分間発色させた後に、25μlの0.05 Mの硫酸を添加し反応を停止し、450nmにおける吸光度を測定した。
スクリーニングの結果から、マウスリコンビナントCCDC3タンパクと強い親和性を示すクローン（13A8，24F6）を得た。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングELISAキット（BDバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１３Ａ８抗体のアイソタイプはＩｇＧ１であり、１３Ｄ４抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ａ、２４Ｆ６抗体のアイソタイプはＩｇＭであった。
（７）ＥＬＩＳＡによる抗体親和性評価
上述した抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートに、上記で選定した抗CCDC3抗体を10μl含む緩衝液Ａを加え、10μlの0.01〜100 nM のマウスリコンビナントCCDC3タンパクを加えた。そして、１３Ａ８抗体については1 ngのBiotin-マウスリコンビナントCCDC3タンパクのC端領域部分ペプチドと4 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ｂを加え、１３Ｄ４及び２４Ｆ６抗体については、0.02 ngのBiotin‐マウスリコンビナントCCDC3タンパクと2 ngのStreptavidin-HRP（PIERCE社製）を含む10μlの緩衝液Ｂを加え、４℃で16時間反応させた。次に各ウェルを90μlの洗浄液で３回洗浄した後に、25μlのTMB＋ Substrate‐Chromogen（DAKO社製）を添加して室温で30分間発色させた後に、25μlの0.05 M の硫酸を添加し反応を停止し、450 nmにおける吸光度を測定した。結果を図１１に示す。これからわかるように、各抗体のマウスCCDC3タンパクに対するIC５０は、１３Ａ８抗体が7.4 nM、１３Ｄ４抗体が17 nM、２４Ｆ６抗体が2.6 nMであった。
実施例１２ ウェスタンブロッティングによる抗体のマウスCCDC3タンパクへの結合評価
１３Ａ８抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。50 ngのマウスリコンビナントCCDC3タンパクをSDS-PAGEに供した（還元状態）。検出には、anti-mouse IgG-HRP抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社) およびECL advance（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いた。結果を図１２に示す。この結果から、いずれの抗体もウェスタンブロッティングで陽性を示し、マウスリコンビナントCCDC3タンパクに結合することが判明した（図１２）。
実施例１３ 化学発光検出サンドイッチELISA法によるヒト血漿中CCDC3濃度測定法の設定
固相抗体として、ヒトCCDC3タンパクに対する抗体である6G12抗体、及びヒトCCDC3タンパクのC末端部分ペプチドに対する抗体である3H6抗体を、また検出抗体として、ヒトCCDC3タンパクに対する抗体である11E10抗体を用いて、2種類のサンドイッチELISA法を設定した。
（１）6G12及び3H6のビオチン標識体の調製
6G12抗体または3H6抗体のIgG画分を、0.1Mリン酸緩衝液中、モル比で10倍量のNHS-PEO-biotin（PIERCE社）と反応させ、50 mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.5）で平衡化したPD-10カラム（GEヘルスケア社製）によるゲルろ過を行って、ビオチン化6G12または3H6画分を分取した。サンドイッチELISAでは、ヤギ抗ビオチン抗体を予め固相化した96穴マイクロタイタープレートにビオチン化6G12抗体または3H6抗体を固定化して用いた。
（２）アルカリフォスファターゼ標識11E10 Fab’抗体の調製
検出抗体は、11E10抗体のFab’画分をアルカリフォスファターゼ（ALP、Roche社製、リコンビナント）で標識したもので、以下の手順で調製した。前記の11E10抗体のIgG画分を含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）に、ペプシン（Roche社、ブタ胃粘膜由来）をIgG1 1mgあたり40 μg加え、37℃で16時間インキュベーションしたのち、高速ゲルろ過（5mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液、pH 6.0で平衡化したTSK-GEL G3000カラム（東ソー社製）を付属したLC-6Aシステム（島津製作所製））を行ってF(ab’)2画分を分取した。次いで、F(ab’)2画分に0.1Mメルカプトエチルアミン水溶液をF(ab’)2溶液の1/10容量を加えて37℃で1.5時間反応したのち、高速ゲルろ過を行ってFab’画分を分取した。一方、ALP を含む1mM MgCl2及び0.1 mM ZnCl2含有0.05Mホウ酸緩衝液（pH 7.6）0.2 mLに、ALPの5倍モル量のsulfo-SMCC（PIERCE社製）を加えて30℃で30分反応したのち、1.0mM MgCl2及び0.1mM ZnCl2含有0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH 6.8）で平衡化したPD-10カラム（GEヘルスケア社製）によるゲルろ過を行って、マレイミド化ALP画分を回収した。このマレイミド化ALP画分と上記の11E10 Fab’画分をモル比で1：3の割合で混合し、4℃で一夜反応したのち、高速ゲルろ過を行って、目的のALP標識11E10 Fab’画分を分取した。
（３）化学発光検出サンドイッチELISA法
標準物質には前記のヒトリコンビナントCCDC3タンパクを緩衝液Ａ（1.0％ ウシ血清アルブミン、0.1％ Tween80、0.05％ アジ化ナトリウム、0.5M NaCl、1mM MgCl2及び0.1mM ZnCl2を含む50mM トリス緩衝液、pH 7.5）で薄めて用いた。96穴白色マイクロタイタープレート（NUNC社製、Maxi-Sorp）の各ウェルに1.0 μgのヤギ抗ビオチン抗体（Bethyl社）を含むトリス緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 7.5）100 μLを加えて4℃で16時間静置して固定化した。これらのウェルを250 μLの洗浄液（0.01% Tween20を含む生理食塩水）で1回洗浄したのち、ブロックエース（大日本製薬社製）150 μLを加えて室温で2時間静置して、ブロッキングを行なった。各ウェルを250 μLの洗浄液で1回洗浄したのち、ビオチン化6G12抗体または3H6抗体を各100 ng含む緩衝液Ａを加え、室温で1〜2時間静置した。各ウェルを洗浄液で3回洗浄後、1 - 500pM標準ヒトリコンビナントCCDC3タンパク溶液または生体液試料50 μL及び緩衝液Ａ 50 μLを加え混和後、4℃で16−24時間静置した。各ウェルを洗浄液で3回洗浄したのち、ALP標識11E10 Fab’画分10 ngを含む緩衝液Ａ 100 μLを加えて室温で2−3時間静置した。各ウェルを洗浄液で3回洗浄したのち、発光基質CDP-Star（登録商標）/EmeraldII（アプライドバイオシステムズ社製）100 μLを添加して室温で静置した。基質添加20分後、マルチラベルカウンタARVO（登録商標）（パーキンエルマー社製）で発光強度を計測した。
その結果、図１３に示すように、標準ヒトCCDC3タンパク1 - 500 pMの範囲で良好な検量線が得られ、その最小検出限界は1 pMであった。このことから、ヒト血漿試料など、ヒトの生体液中のCCDC3タンパクが特異的かつ高感度に測定することができる。
実施例１４ ヒト血漿中CCDC3濃度と肥満度との相関解析
（１）ヒト血漿の調製
本実験に対して同意を得た85名の血液提供者より採血を実施した。
全ての血液サンプルについて、血漿中CCDC3タンパク濃度の測定と同時に、ヘモグロビンA1c (HbA1c)についても測定を行った。採取した血液は、血漿分離用スピッツ（EDTA・2Na採血管）に採り、3000回転/分、4℃、30分間の遠心分離後、上清を血漿として試験に供した。
血漿中CCDC3タンパク濃度の測定は、実施例１３（３）に記載する化学発光検出サンドイッチELISA法に準じて、3H6抗体と11E10抗体を組合せて構築したELISA法を用いて行った。
また、上記85名のうち25名については、CT（computed tomography）を用い内臓脂肪面積（臍レベル腹部断面での内臓脂肪面積）の測定を別途行った。25名中、内臓脂肪面積100cm2未満の非内臓脂肪型肥満者は8名、内臓脂肪面積が100 cm2 以上の内臓脂肪型肥満者は17名であった。
（２）ヒト血漿中CCDC3タンパク濃度の測定および肥満度との相関解析
上記血漿中CCDC3タンパク濃度を測定した結果、内臓脂肪面積100cm2未満の非内臓脂肪型肥満者群（8名）に比べて、内臓脂肪面積100cm2以上の内臓脂肪型肥満者群（17名）の方が、血漿中のCCDC3タンパク濃度が高いことが分かった（図１４）。また、長期血糖値を反映する指標であるHbA1cが5.8％以下の正常値である被験群（64名）と、5.8％より高いHbA1c値を示す被験群（21名）との間で血漿中CCDC3タンパク濃度を比較すると、図１５に示すように、HbA1c＞5.8％の被験群のほうが、HbA1c≦5.8％の被験群よりもCCDC3タンパクの血漿中濃度が高いことが分かった。
実施例１５ 免疫染色法を用いた、肥満モデルDIOマウス脂肪組織におけるCCDC3発現解析
（１）マウス脂肪組織環流固定
DIOマウスは、C57BL/6J Jclマウス（日本クレア）の7週齢オスに、高脂肪食（HFD）である58Y1 DIO P.D. 60％ Energy From Fat-Blue（日本エスエルシー）を31週間摂餌させることで作製した。対照群のマウスには、CLEA Rodent Diet CE-2（日本クレア）を43週間摂餌させたマウスを用いた。各マウスをハロセン麻酔下で開腹し、心臓の左心室からaorta近傍にシリンジを挿入し、右心房突起の右心耳の先端を切除した後、phosphate buffer saline（ロンザ社）を還流させることで洗浄を実施、続いて、4％ パラホルムアルデヒド（TAAB社）を環流させることで組織固定をおこなった。その後、内臓脂肪組織である腸間膜脂肪組織、および皮下脂肪組織を採取し、パラホルムアルデヒド液中で組織固定した。
（２）免疫染色
採取した各種脂肪組織から、−35〜−40℃の条件で凍結切片薄切（10μm厚）を作製した。これらをリン酸緩衝液に浸し組織を湿潤状態になじませ、Avidin blocking液（Avidin/Biotin Blocking Kit(VECTOR)）に15分間浸した後、リン酸緩衝液に3分間漬けて洗浄した。次いでBiotin blocking液（Avidin/Biotin Blocking Kit(VECTOR)） に15分間浸した後、リン酸緩衝液に3分間漬けて洗浄した。続いて切片スライド湿箱中に置きM.O.M Mouse IgG Blocking Reagent（M.O.M. Immunodetection Kit(VECTOR)）液で60分間反応させた。次に同じく湿箱中にてM.O.M. dilient液で10μg/mLの濃度に希釈した一次抗体（mouse monoclonal 13D4）を常温で30分間浸した。その後、リン酸緩衝液で５分間３回洗浄後、M.O.M. Biotinylated Anti-Mouse(horse)IgG Reagentを二次抗体として10分間処理した。リン酸緩衝液で５分間３回洗浄した後、Vectastain ABC-AP Reagent（ABC-AP Universal Kit(VECTOR)）を5分間反応させた。リン酸緩衝液で５分間３回洗浄後、Levamisol を添加したAlkaline Phosphatase基質溶液（BCIP/NBT溶液(VECTOR)）（pH 9.5）を処理し約５分間発色させた。リン酸緩衝液で軽く洗浄しAqua Poly/Mount (BioSciences)で水性封入して標本化した。
作製した標本を顕微鏡で観察した結果を図１６に示す。その結果、対照群マウスの腸間膜脂肪に比べてDIOマウスの腸間膜脂肪では、CCDC3タンパクの発現産生を示す青黒く染まった細胞が明らかに多いことが観察され、対照群に比べてDIOマウスの腸間膜脂肪でCCDC3タンパクの発現産生が増強していることが分かった。一方、皮下脂肪では、免疫染色像において対照群マウスとDIOマウスとで差異が見られず、CCDC3タンパクの発現産生量に差がないことが分かった。この結果から、肥満マウスにおける脂肪組織でのCCDC3タンパクの発現産生の上昇は、内臓脂肪組織（腸間膜脂肪組織）に特異的であることが明らかとなった。
配列番号５〜１０は本発明が対象とするCCDC3遺伝子のsiRNAの塩基配列；配列番号１１および１２はラットG6Paseリアルタイム定量PCR用プライマー（Forward primer、Reverse primer）の塩基配列；配列番号１３および１４はラットRps18リアルタイム定量PCR用プライマー（Forward primer、Reverse primer）の塩基配列；配列番号１５および１６はマウスCCDC3リアルタイム定量PCR用プライマー（Forward primer、Reverse primer）の塩基配列；配列番号１７および１８はマウス36B4リアルタイム定量ＰＣＲ用プライマー（Forward primer、Reverse primer）の塩基配列；配列番号１９はCCDC3 EcoRI−F3プライマーの塩基配列；配列番号２０は CCDC3 BamHI−R3プライマーの塩基配列；配列番号２１はCCDC3 Kozak−Fプライマーの塩基配列；配列番号２２はCCDC3 STOP−Rプライマーの塩基配列；配列番号２３はCCDC3−F1プライマーの塩基配列；配列番号２４はCCDC3−R1プライマーの塩基配列；配列番号２５はCCDC3−QPCR−Fプライマーの塩基配列；配列番号２６はCCDC3−QPCR−Rプライマーの塩基配列；配列番号２７はmGAPDH−QPCR−Fプライマーの塩基配列；配列番号２８はmGAPDH−QPCR−R プライマーの塩基配列；配列番号２９はヒトCCDC3タンパクのＣ末端部分ペプチド（259-270番目の領域）のアミノ酸配列；配列番号３０は3H6抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号３１は3H6抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号３２は3H6抗体の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号３３は3H6抗体の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列；配列番号３４は3H6抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号３５は3H6抗体の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号３６は3H6抗体の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号３７は3H6抗体の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列； 配列番号３８は6G12抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号３９は6G12抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号４０は6G12抗体の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号４１は6G12抗体の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列；配列番号４２は6G12抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号４３は6G12抗体の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号４４は6G12体の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号４５は6G12抗体の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列；配列番号４６は11E10抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号４７は11E10抗体の重鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号４８は11E10抗体の重鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号４９は11E10抗体の重鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列；配列番号５０は11E10抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列；配列番号５１は11E10抗体の軽鎖可変領域のCDR1のアミノ酸配列；配列番号５２は11E10体の軽鎖可変領域のCDR2のアミノ酸配列；配列番号５３は11E10抗体の軽鎖可変領域のCDR3のアミノ酸配列；をそれぞれ示す。

Claims (8)

  1. （１）被験者から採取した被験試料におけるCoiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）のmRNA発現量またはCCDC3タンパク産生量を測定する工程、
    （２）上記で測定したCCDC3のmRNA発現量（被験発現量）またはCCDC3タンパク産生量（被験産生量）を、非内臓脂肪型肥満者由来の対照試料におけるCCDC3のmRNA発現量（対照発現量）またはCCDC3タンパク産生量（対照産生量）と対比する工程、
    を有し、
    （３）対照発現量または対照産生量に比して被験発現量または被験産生量が高いことを、被験者が内臓脂肪型肥満であるとの判断指標とすることを特徴とする、内臓脂肪型肥満の検出方法。
  2. Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであって、CCDC3遺伝子若しくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを特異的に認識するポリヌクレオチド、
    を含む、内臓脂肪型肥満の検査薬。
  3. Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）タンパクを認識する抗体を含む、内臓脂肪型肥満の検査薬。
  4. 下記（１）〜（６）からなる群より選択される、Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）タンパクを認識する抗体を用いて測定する、請求項１記載の内臓脂肪型肥満の検出方法：
    （１）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３５、３６及び３７で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （２）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４３、４４及び４５で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （３）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４７、４８及び４９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号５１、５２及び５３で示されるアミノ酸配列を含む抗体
    （４）重鎖可変領域が配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （５）重鎖可変領域が配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体、並びに
    （６）重鎖可変領域が配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体。
  5. 下記（１）〜（６）からなる群より選択される、Coiled-coil domain containing protein 3（CCDC3）タンパクを認識する抗体を含む、請求項３記載の検査薬：
    （１）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３１、３２及び３３で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３５、３６及び３７で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （２）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４３、４４及び４５で示されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （３）重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号４７、４８及び４９で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号５１、５２及び５３で示されるアミノ酸配列を含む抗体
    （４）重鎖可変領域が配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （５）重鎖可変領域が配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む抗体、並びに
    （６）重鎖可変領域が配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体。
  6. 下記の工程を有する、抗内臓脂肪型肥満剤若しくは抗糖尿病剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法：
    （１）被験物質とCCDC3遺伝子を発現可能な細胞又はCCDC3タンパクを産生可能な細胞とを接触させる工程、
    （２）被験物質を接触させた細胞のCCDC3遺伝子の発現量又はCCDC3タンパクの産生量を測定する工程、及び
    （３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のCCDC3遺伝子の発現量又はCCDC3タンパクの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
  7. 下記の工程を有する、抗内臓脂肪型肥満剤若しくは抗糖尿病剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法：
    （1”）被験物質、CCDC3タンパクに反応する細胞、及びCCDC3タンパクを接触させる工程、
    （2”）前記細胞のCCDC3タンパクの機能または活性を検出する工程、及び
    （3”）上記で検出した機能または活性が、被験物質を接触させることなくCCDC3タンパクと接触させた対照細胞のCCDC3タンパクの機能または活性よりも低い被験物質を選択する工程。
  8. 下記の工程を有する、内臓脂肪型肥満または糖尿病を改善する有効成分のスクリーニング方法：
    （a）CCDC3遺伝子を過剰発現するCCDC3トランスジェニックマウスに被験物質を投与する工程、
    （b）被験物質を投与したCCDC3トランスジェニックマウスの体重（被験体重）または血糖値（被験血糖値）を経時的に測定し、被験物質を投与しないCCDC3トランスジェニックマウスの経時的体重（対照体重）または血糖値（対照血糖値）と対比する工程、
    （c）上記被験体重または被験血糖値が、対照体重または対照血糖値に比して低下する場合の被験物質を内臓脂肪型肥満または糖尿病を改善する有効成分として選択する工程。
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