JP2008526187A - IL−13受容体α1に対する抗体とその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
IL−13は、主としてTh2細胞によって産生されるが、肥満細胞やNK細胞によっても産生される分泌単量体ペプチドである。IL−13の生体機能には、例えばIgE産生の調節とTh2発達の調節がある。IL−13は、IL−13受容体アルファ1(IL−13Rα1)鎖およびIL−4受容体アルファ(IL−4Rα)鎖からなる受容体複合体に結合する。IL−13が結合すると、主としてSTAT6を介する信号伝達事象が誘発される。IL−13は、単独ではIL−13Rα1に結合する親和性が低く、またIl−4Rα1には結合しない。これに反して、IL−4は、IL−4Rαに単独で結合し、IL−13Rα1には単独で結合しない。IL−13には別の受容体すなわちIL−13Rα2が報告されている。IL−13は、この受容体には高い親和性で結合するので、この受容体はおとり受容体として作用する可能性がある。
本発明は、IL−13Rα1に結合することによってIL−13の生物活性を阻害する抗体であって、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列CDR3が配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDR3配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体を含む。
軽鎖CDR:配列番号2、4、6、10のCDR1(aa24−34)、配列番号8のCDR1(aa24−35)、配列番号2、4、6、10のCDR2(aa50−56)、配列番号8のCDR2(aa51−57)および配列番号2、4、6、10のCDR3(aa89−97)、配列番号8のCDR3(aa90−97)。
a)配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDRを含む抗体重鎖
b)配列番号2、4、6、8もしくは10の軽鎖CDRを含む抗体軽鎖
ここでCDRは相互に他から独立に選択される。
a)重鎖可変領域として配列番号1および軽鎖可変領域として配列番号2、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
b)重鎖可変領域として配列番号3および軽鎖可変領域として配列番号4、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
c)重鎖可変領域として配列番号5および軽鎖可変領域として配列番号6、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
d)重鎖可変領域として配列番号7および軽鎖可変領域として配列番号8、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、または、
e)重鎖可変領域として配列番号9および軽鎖可変領域として配列番号10、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する。
a)Gly236が欠失したアミノ酸配列Pro233Val234Ala235および/またはアミノ酸配列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331、
b)アミノ酸配列Ala234Ala235、もしくは
c)アミノ酸Ala265およびAla297
を含むヒトγ1重鎖を含む。
a)配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDRを有する抗体重鎖と
b)配列番号2、4、6、8もしくは10の軽鎖CDRを有する抗体軽鎖である。
「IL−13Rα1、ネズミIL−13Rα1、IL−13、IL−13Rα2およびIL−4Rα」という用語およびそれらのドメインは、当技術分野では公知であり、たとえば、SwissProt P78552、O09030、P35225、Q14627および P24394によって定義されている。したがって、特に記載しない限り、「IL−13Rα1、IL−13、IL−13Rα2およびIL−4Rα」という用語は、ヒトポリペプチドIL−13Rα1、IL−13、IL−13Rα2およびIL−4Rαを表す。
a)配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDRを有する抗体重鎖
b)配列番号2、4、6、8もしくは10の軽鎖CDRを有する抗体軽鎖
からなる群から選択されるIL−13Rα1に結合するポリペプチドをコード化する核酸フラグメントが含まれる。
a) 配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDRを有する抗体重鎖
b) 配列番号2、4、6、8もしくは10の軽鎖CDRを有する抗体軽鎖
をコード化する核酸の発現を含む方法を提供する。
配列番号1 HuMab LC5002−002の重鎖可変ドメイン
配列番号2 HuMab LC5002−002の軽鎖可変ドメイン
配列番号3 HuMab LC5002−003の重鎖可変ドメイン
配列番号4 HuMab LC5002−003の軽鎖可変ドメイン
配列番号5 HuMab LC5002−005の重鎖可変ドメイン
配列番号6 HuMab LC5002−005の軽鎖可変ドメイン
配列番号7 HuMab LC5002−007の重鎖可変ドメイン
配列番号8 HuMab LC5002−007の軽鎖可変ドメイン
配列番号9 HuMab LC5002−0018の重鎖可変ドメイン
配列番号10 HuMab LC5002−0018の軽鎖可変ドメイン
配列番号11 κ軽鎖定常領域
配列番号12 γ1重鎖定常領域
実施例1
ハイブリドーマの作成
本発明ヒトモノクローナル抗体の産生を可能にするには、本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子をゲノムに含む形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスをヒトIL−13Rα1を発現する細胞で免疫する。次に、その動物のB細胞(例えば、脾臓B細胞など)を得て骨髄腫細胞と融合させて、IL−13Rα1に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成する。IL−13Rα1に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスの免疫系ではなくヒトの免疫系部分を担持する形質転換マウスを使用して生成することができる。本明細書で「HuMab」マウスと呼ばれるこれらの形質転換マウスは、内在するμおよびκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的突然変異とともに、重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖(定常領域遺伝子)を含む再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座(minilocus)を含む(Lonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859)。したがって、これらマウスでは、マウスIgMもしくはKの発現が低減し、免疫に応答して導入されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子がクラス変更と体細胞突然変異を受けて高親和性のヒトIgGモノクローナル抗体を生成する。IL−13Rα1に対するヒトモノクローナル抗体を十分に生成するために、HuMabマウスをLonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M, ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851およびWO98/24884に記述されている一般的方法に従って、ヒトIL−13Rα1を発現する細胞で免疫することができる。マウスは、第1回の免疫時には週齢6〜16であることが好ましい。例えば、IL−13Rα1の形質転換細胞を使用してHuMabマウスを腹腔内に免疫することができる。免疫付与プロトコルの全過程にわたって免疫応答を監視するには、眼窩後部を出血させて取得した血漿試料を使用する。血漿はELISA及び/又はFACSによってスクリーニングすることができ、十分な力価の抗IL−13Rα1ヒト免疫グロブリンを有するマウスを、対応するB細胞の不死化のために使用することができる。マウスに抗原を静脈注射し、3〜4日後に屠殺して脾臓とリンパ節を摘出する。例えば、HCo7およびHCo12系HuMabマウスに免疫することができる。HCo7マウスでは、それらの内因性軽鎖(カッパ)遺伝子(Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり)にJKDの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子(WO/14424の実施例1に記載のとおり)にCMDの欠落があり、KCo5ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子(Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり)およびHCo7ヒト重鎖導入遺伝子(US Patent No. 5,770,429に記載のとおり)を有する。HCo12マウスでは、それらの内因性軽鎖(カッパ)遺伝子(Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり)にJKDの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子(WO 01/14424の実施例1に記載のとおり)にCMDの欠落があり、KCo5ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子(Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり)およびHCo12ヒト重鎖導入遺伝子(WO01/14424の実施例2に記載のとおり)を有する。
マウスのリンパ球を単離し、標準のプロトコルに基づいてPEGを使用してマウスの骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマを作成する。次に、作成したハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。例えば、免疫マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ球の単細胞懸濁液を、50%PEGを使用してSP2/0非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC,CRL 1581)と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレートに約0.75×107でプレートし、続いて選択培地で約2週間インキュベートする。次に、個々のウェルをELISAおよび/またはFACSによってヒト抗IL−13Rα1モノクローナルIgMおよびIgG抗体についてスクリーニングする。ハイブリドーマが広範に成長したなら、抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングして、依然としてヒトIgG、抗IL−13Rα1抗体陽性である場合には、少なくとも2回、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養することにより、特徴付けのために組織培養培地で抗体を産生する。
3匹のHCo7マウス(オス3匹)、GG2201系(Medares, San Jose, CA, USA)および2匹のHCo12(オス1匹メス1匹)、GG2198系(Medares, San Jose, CA, USA)をIL−13Rα1の発現ベクターで形質転換した1×106HEK293細胞により免疫した。腹腔内(i.p.)および尾の基底の皮下(s.c.)に交互に合計8回の免疫を実施した。第1回の免疫では、100μlの1×106HEK293:IL−13Rα1細胞を100μlの完全フロイントアジュバンド(CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA)と混合した。その他の免疫では、PBS内で100μlの細胞を100μlの不完全フロイントアジュバンド(ICFA; Difco)と混合した。
抗IL−13Rα1の血清力価が十分であることが判明した段階で、マウスを融合の4および3日前に静注(i.v.)により200μlPBS中の1×106HEK293:IL−13Rα1細胞を用いてさらに2回注射した。
ELISAによる固定化IL−13Rα1に対するHuMabの結合に関する試験
本発明の抗体が、組み換えIL−13Rα1に結合する能力を判定するために、IL−13Rα1(R&D Systems, UK)の細胞外ドメインをPBS(1μg/ml)に溶解させ、4℃で終夜インキュベートし、マイクロタイタープレートに吸着させた。洗浄用緩衝液(WB=0.9 % Nacl; 0.1 % Tween(登録商標) 20)で平板を洗浄した後で、100μlのインキュベーション緩衝液(IB=PBS with 1 % crotein C および 0.1 % Tween(登録商標) 20)を添加し、室温(RT)で30分間インキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。次に、連続的に希釈したHuMabおよびコントロール抗体(100μl/ウェル;IBで希釈)を添加し、RTで1時間培養した。再度プレートを洗浄し、そしてIBで1:500に最終希釈したペルオキシターゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパ(DAKO, Denmark)と共にインキュベートすることで、結合ヒト抗体を検出した。ポリクローナルヤギ抗hIL−13Rα1抗体を、ぺルオキシターゼコンジュゲートポリクローナルロバ抗ヤギIgG(Sant Cruz;IBで1:1000希釈)で検出した。RTで1時間インキュベーションしてから洗浄した後で、プレートを暗所においてRTで既製のABTS(登録商標)溶液(Roch Diagnostics GmbH)で展開させた。もっとも高い濃度の吸収値が十分なODに到達した後で、405nmでの吸収値を測定した。
IL−13Rα1/IL−4Rα異種二量体に対するIL−13結合の阻害(ELISA)
マイクロタイタープレートを、PBS中に3μg/mlのhIL−13Rα1:hFcキメラタンパク(R&D Systems, UK) 100μlにて振とう機上に終夜4℃で被覆した。WBでプレートを洗浄した後に、連続希釈したHuMabとコントロール抗体(100μl/ウェル;IBで希釈)を添加し、RTで30分間インキュベートした。プレートを再度洗浄してから、IL−13の混合物(R&D Systems, UK;0.5μg/ml; IBで希釈)およびIL−4Rα(R&D Systems, UK;0.75μg/ml; IBで希釈)を添加し、RTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、濃度0.4μg/mlのビオチン化抗IL−13抗体(BAF213; R&D Systems, UK) 100μlを添加し、RTで1時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、結合IL−13を、IBで1:5000の希釈率にしたペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Roche Diagnostics GmbH, DE)によって検出した(RTで培養1時間)。最後にプレートを洗浄し、暗所で室温(RT)で既製のABTS(登録商標)溶液(Roche Diagnostics GmbH, DE)で展開した。45〜60分後に405nmで吸収値を測定した。
ラジオリガンド結合測定
125I−IL−13結合測定を、結合緩衝液(25mM HEPES、150mM NaCl、1mM CaCl2、5mM MgCl2および0.5%のウシ血清アルブミン、pH7.2に調整した)内でヒトIL−13Rα1とヒトIL−4Rαを発現するCHO細胞を用いて実施した。1×105細胞/ウェルを、抗体と混合させ、15分から1時間かけて前インキュベートした。0.1nM125I−IL−13を添加し、この混合物を4時間4℃でインキュベートした。測定で使用した125I−IL−13の濃度を、飽和結合分析、競合分析および細胞系との平衡結合に到達するまで投入した、125I−IL−13の定量から測定した。試料を、1%PEI/0.5%BSAで前処理したGF/Cフィルタープレート上で回収し、Packard TopCountシンチレーションカウンターでカウントした。非線形回帰曲線適合法を用いてPRISMでデータ分析を実施した(GraphPad Software, San Diego, CA)。
ヒトB細胞と単核細胞上でIL−13により誘発されるCD23の亢進をHuMabが阻害
末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll Hypaque密度勾配によって単離した。RPMIで細胞を洗浄した後、RPMI/10%FCS中で再度懸濁し、96ウェルの平底マイクロタイタープレート(Corning Incorporated Costar)内に3×105PBMC/ウェル(容積50μl)で分配した。次に、RPMI/10%FCS中で最終濃度0.5μg/mlの抗ヒトCD40抗体(Immunotech) 25μlおよび、RPMI/10%FCS中で最終濃度10μg/mlの抗ヒトIgA+IgG+IgM抗体 (Immunoresearch)25μlを添加した。次に、連続的に希釈したHuMabとコントロール抗体(50μl/ウェル;RPMI/10%のFCS希釈)を添加し、細胞を培養器中で30分間インキュベートした(37℃;5% CO2)。次に、0.67ng/mlの最終濃度の組み換えヒトIL−13(R&D Systems)を添加し(50μl/ウェル)、さらに細胞を37℃/5%CO2の条件下で72時間インキュベートした。このインキュベート後に、プレートを遠心分離にかけ、培地を吸引した。付着した細胞を分離させるために、200μlのAccutase(PAA)を添加し、細胞を37℃;5%CO2の条件下で約5分間インキュベートした。細胞を、繰り返しフラッシングすることによって分離させ、丸底プレートに移した。上清の遠心分離および吸引後に、細胞を抗CD23−PE、抗CD20−FITCおよび抗CD14−APC(すべてBD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA提供)の混合物200μlを用いてインキュベートした。細胞を4℃で30分間インキュベートし、遠心分離にかけ上清を吸引した。この洗浄工程を1回繰り返し、最終的に細胞を200μlのPBS/0.1%のヒト血清アルブミンに再度懸濁し、FACS Caliburフローサイトメーター(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)内で、CellQuestソフトウエアを用いて分析した。ほとんどの場合に10,000のイベントが取得され、光分散ゲート上に通して、生存リンパ球と単核球のみを取り込んだ。細胞を、Bリンパ球の場合CD19陽性クラスターで、もしくは単核球の場合CD14陽性クラスターで前通過させ、CD23発現についてさらに分析を行った。
刺激因子としてのIL−13もしくはIL−4に応答するTF−1の増殖測定
TF−1細胞(ATCC # CRL 2003)を、ATCC修飾RPMI、10%FBS、1Xペニシリン/ストレプトマイシン、2ng/ml GM−CSFを含有する培地で成長させた。測定を実施する1日前に細胞を無GM−CSF培地で保持した。5×103細胞/ウェルを1時間、37℃で適切な濃度の抗IL−13Rα1抗体を使用してインキュベートした。次に、細胞を2ng/mlのヒトIL−13(R&D Systems, Minneapolis, MN)もしくは0.1ng/mlのヒトIL−4(R&D Systems, Minneapolis, MN)で刺激し、48時間、37℃でインキュベートした。細胞に、0.5μCi 3H−チミジンをパルスし、16〜18時間37℃でインキュベートした。Parkin Elmar Filtermate 96ハーベスターを用いて、1%のPEI/0.25%BSAで前処理したGFCプレート上に試料を回収した。GFCプレートを、Parkin Elmar TOPカウントシンチレーションカウンター上でカウントした。非線形回帰曲線適合法を用いて(GraphPad Software, San Diego, CA)PRISMでデータ分析を行った。
IL−13に応答したヒト肺繊維芽細胞のエオタキシン産生を阻害
HFL−1細胞(Human Lung Fibroblast, ATCC # CCL-153)を使用して測定を実施した。細胞を、12ウェルのプレート内の各プレートに100,000細胞の密度でプレートし、集密に達するまで72時間、37℃でインキュベートした。次に、細胞を24時間、無血清培地で飢餓状態に置き、1時間37℃で抗IL−13Rα1抗体で処置をした。この処置の後に、細胞を48時間37℃で10ng/mlのIL−13(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて刺激した。上清を回収し、R&D Systems (Cat. No. DTX00)提供の市販のELISAを用いてエオタキシンの定量を行った。吸収値をSpectromaxマイクロプレートリーダーを用いて読み取り、PRISM(GraphPad Software, San Diego, CA)を用いてデータを分析した。
ヒト気管支平滑筋細胞におけるIL−13誘発性Stat−6リン酸化の阻害
ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC; Clonetics, Cat. No CC-2576)を製造元の指示に従って成長させた。集密するまで、細胞を12ウェルの組織培養プレートで成長させた。無血清培地で24時間、細胞を飢餓状態に置き、各種量の抗体を添加した。プレートを1時間培養した後に、2.5ng/mlのIL−13(R&D Systems)で刺激した。15分間インキュベートした後に、上澄みを取り除き、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、100μlの溶解緩衝液を添加した。氷上で短期間超音波にかけた後、さらに遠心分離にかけた。溶解液を用いてリン酸化Stat−6をウエスタンブロット検出した。等量のタンパクをSDSゲル上に付加し、流し込んで膜に移動させた。抗Stat−6抗体をSanta Cruz Biotechnology (Cat. No. SC-11762R)から入手し、ペルオキシターゼに結合した二次抗体を用いた。検出は、Amersham (Cat No RPN 2132)提供のECL Plus Systemを用いて行った。定量は、Typhoon 9400 Imagerで実施した。
抗hIL−13Rα1 HuMab可変ドメイン(κ−軽鎖およびγ1−重鎖)のクローニングと配列分析
抗hIL−13Rα1 HuMabの軽鎖可変領域VLと重鎖可変領域VHをコードするヌクレオチド配列を標準のcDNA合成/PCR手順を用いて単離した。全RNAを、GeneRacer(商標)キット(Invitrogen)を用いて1×106−1×107ハイブリドーマ細胞から調製した。ハイブリドーマ由来のRNAを、第一鎖cDNA合成およびGeneRacer(商標) Oligo-dT Primerの連結反応のためのテンプレートとして用いた。第二鎖cDNA合成およびcDNAフラグメントをコード化するVLおよびVHのさらなるPCR増幅を、それぞれκ−軽鎖およびγ1−重鎖定常領域ならびに、5’−特異的GeneRacer(商標)プライマーのヌクレオチド配列に相補的な逆軽鎖および重鎖プライマーで実施した。クローニングベクターとして、Invitrogen(商標)Life Technologies提供のTA クローニングキットおよび pCR4-TOPO(商標)TOPO(商標)を用いてクローニングした。EcoLIを用いて適切なプラスミドの制限マッピングによってクローン化されたPCR生成物を特定し、それぞれVLおよびVHに関する約740bpおよび790bpのDNAフラグメントサイズを予測/計算した。クローン化したPCRフラグメントのDNA配列を、二本鎖配列決定法によって判定した。GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン10.2とVector-NTI 8 (InforMax, Inc)を汎用データ処理に用いた。DNAおよびタンパク配列をGCGモジュールCLUSTALWを用いて整列させた。配列の整列は、GENEDOC (バージョン2.1)プログラムを用いて行った。
抗hIL−13Rα1IgG1HuMabの発現プラスミドの構築
抗hIL−13Rα1IgG1HuMabの軽鎖および重鎖をコード化する遺伝子を哺乳動物の細胞発現ベクターに別々に集合化した(assemble)。これによって、抗hIL−13Rα1 HuMab軽鎖可変領域(VL)とヒトκ軽鎖定常領域(CL, SEQ ID NO:11)をコード化する遺伝子セグメントが抗hIL−13Rα1HuMab重鎖可変領域(VH)およびヒトγ1重鎖定常領域の遺伝子セグメントと同様に連結された(CH1-Hinge-CH2-CH3, SEQ ID NO: 12)。使用されているコドンのヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., およびFoeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH publication No.91-3242に記述されている。抗hIL−13Rα1HuMabκ軽鎖の転写ユニットは下記要素で構成されている。
・ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5’−UT、
・信号配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖信号配列、
・5’末端に特異なBsmI制限部位および3’末端にスプライスドナー部位と特異なNotI制限部位を配列したクローン化抗hIL−13Rα HuMab可変軽鎖cDNA、
・イントロン2マウスIg−κエンハンサー[Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82]を含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域、および
・ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化(「ポリA」)信号配列。
・ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成5’−UT、
・信号配列イントロンを含む修飾マウス免疫グロブリン重鎖信号配列、
・5’末端に特異なBsmI制限部位および3’末端にスライスドナー部位および特異なNotl制限部位配列したクローン化抗hIL−13Rα1 HuMab可変重鎖cDNA、
・マウスIgμエンハンサー(Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378)を含む、ゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域、
・ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)信号配列。
抗hIL−13Rα1 HuMab κ軽鎖およびγ1重鎖発現カセットのほかに、これらのプラスミドには以下が含まれている。
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・Epstan−Barrウイルス(EBV)のオリジン、oriP、
・E.coliにおけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からのオリジン、
・E.coliにおけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
突然変異体(変異体)抗hIL−13Rα1IgG1の発現プラスミドの構築
突然変異抗hIL−13Rα1γ1重鎖をコード化する発現プラスミドは、Quick Change(商標)Site-Directed mutagenesisキット(Stratagene)を用いて野生型発現プラスミドの特定部位突然変異誘発によって生成することができ、表1に記載されているとおりである。アミノ酸には、EU符番法にしたがって符番されている[Edelman, G.M., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K. S., およびFoeller, C., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242]。
組み換え抗hIL−13Rα1 HuMabの産生
組み換え抗hIL−13Rα1 HuMabは、10%の超低IgGのFCS(Gibco)、2mMのグルタミン(Gibco)、1%v/vの非必須アミノ酸(Gibco)、および250μg/mlのG418 (Roche Diagnostics GmbH, DE) を補充したDMEM (Gibco) でインキュベートした付着性HEK293−EBNA細胞 (ATTC CRL−10852)の一過的形質転換によって作成した。形質転換では、Fugene(商標)6 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 形質転換試薬を3:1〜6:1の範囲のDNA(μg)に対する試薬(μl)の割合で使用した。免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、1:2〜2:1のプラスミドをコード化する重鎖に対する軽鎖のモル比を用いて2種類のプラスミドから発現させた。HuMabを含有する細胞培養上清を形質転換後4〜11日目に収穫した。
a) キメラhIL−13Rα1:hFcを用いた、HuMab LC5002−003、−005、およびー007の親和性分析
相互作用を分析するために、Biacore3000計器を用いた。操作と反応用緩衝液としてHBS−P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % ポリ界面活性剤 P, pH 7.4)を25℃で用いた。捕捉分子(ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ特異的)を、20分間、5μl/分の流速で、20μg/mlの濃度でアミン結合した。HuMabを、1μg/mlの濃度で10μl/分の流速で1分間注入した。遊離ヤギ抗ヒトIgGのFcγを遮断するために、ヒトγグロブリン500nMを30μl/分で3分間注入した。被験体(hIL-13Rα1:hFc キメラタンパク)を、5.63nM〜90nM間の5種類の濃度で2分間注入し、5分間HBS−Pで洗浄した。100nMのHClを2回それぞれ1分間ずつ注入することによって表面の再生を達成した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに反応速度データは、表2の記述に対応する。系固有のベースラインドリフトを補正しノイズ信号を減少するために、試料曲線から陰性コントロールデータ(例えば、緩衝液曲線)を差し引いた。センサーグラムの分析と親和性データの計算のため、BiaEvalationバージョン4.01を用いた。反応速度データは、1:1ラングミュアー結合モデルに反応速度データを適合させることによって計算した(表2)。
親和性分析のためBiacore 3000計器を用いた。操作と反応用緩衝は25℃のHBS−Pであった(10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.005% ポリ界面活性剤 P,pH7.4)。捕捉抗体分子(抗hFcγ)を、20分間、5μl/分の流速で、100μg/mlの濃度でアミン結合させた。HuMabを、30秒間10μl/分の流速で10μg/mlの濃度で注入した。開裂したhIL−13Rα1分子(MW40kDa)を1.56nM〜100nM間の7種類の濃度で200秒間注入し、5分間HBS−Pで洗浄した。表面の再生は、10μg/mlの流速で100mM HClの注入を2回それぞれ1分間繰り返すことによって実現した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに反応速度データは下記の表3の記述に対応する。反応速度データは、ラングミュアー結合モデルに反応速度データを、適合させることによって計算した。
これらの実験では、ハイブリドーマ由来の初代IgG1の親和性を組み換え変異体IgG1−Ala−Alaの親和性と比較した。相互作用の分析のためBiacore 3000計器を用いた。操作と反応用緩衝液は、25℃のHBS−Pであった(10mMのHEPES,150mMのNaCl,0.005%のポリ界面活性剤 P,pH7.4)。捕捉抗体分子(抗hFcγ)を、20分間、5μl/分の流速で、20μg/mlの濃度でアミン結合させた。HuMabを、1分間10μl/分の流速で10μg/mlの濃度で注入した。開裂したhIL−13Rα1分子(被験体)を1.56nM〜200nM間の8種類の濃度で5分間注入し、5分間HBS−Pで洗浄した。表面の再生は、100mM HClの注入を2回それぞれ1分間繰り返すことによって実現した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに、反応速度データは、表4の記述に対応する。反応速度データは、二価被験体結合モデルに反応速度データを適合させることによって計算した。
hIL−13Rα2およびhIL−4RαとのHuMabの交差反応のELISAによる試験
キメラタンパクhIL−13Rα2:hFcとhIL−4Rα:hFc(R&D Systems, UK)をPBS(1μg/ml)に溶解し、4℃で終夜インキュベートしてマイクロタイタープレート(NUNC Maxisorb)に吸着させた。洗浄緩衝液(WB=0.9%NaCl;0.1%Tween(登録商標)20)でプレートを洗浄後、非特異的部位を遮断するために、100μlの培養緩衝液(IB=1%Crotein C含有PBSおよび0.1%Tween(登録商標)20)を加え、室温で30分間インキュベートした。次に、連続希釈したHuMabおよびコントロール抗体(100μl/ウエル;IB中に希釈)を加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパ(DAKO、デンマーク)のIB中最終希釈1:500にてインキュベートして結合抗体を検出した。室温で1時間インキュベートし、次に洗浄し、プレートを暗所室温にて既成のABTS(登録商標)溶液(Roche Diagnostics GmbH、DE)で展開した。最高濃度の吸収値が十分なOD値に到達してから405nmで吸収値を測定した。
マウスIL−13Rα1とのHuMabの交差反応性
キメラタンパクマウスIL−13Rα1:hFc(R&D Systems, UK)をPBS(1μg/ml)に溶解し、4℃で終夜培養することによってマイクロタイタープレート(NUNC Maxisorb)に吸着させた。洗浄用緩衝液(WB=0.9%のNaCl;0.1%のTween(登録商標)20)でプレートを洗浄した後に、非特異的結合部位を遮断するために、100μlの培養緩衝液(IB=1% Crotein Cおよび0.1% Tween(登録商標) 20を含むPBS)を添加し室温(RT)で30分間インキュベートした。次に、連続希釈したHuMabとコントロール抗体(HuMab抗KLHおよびポリクロナールヤギ抗hIL−13Rα1 (R&D Systems))をウェル(100μl/ウエル;IBで希釈)に分配し、RTで1時間インキュベートした。再度プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパー(DAKO, Denmark)のIB中1:500の最終希釈にてインキュベートして結合ヒト抗体を検出した。プレートに結合したヤギ抗hIL−13Rα1抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギIgG(Santa Cruz; IB中に1:1000)によって検出した。室温で1時間インキュベートし、続いて洗浄した後に、プレートを暗所RTで既製のABTS(登録商標)溶液(Roche Diagnostics GmbH, DE)で展開した。最高濃度の吸収値が十分なODに到達した後に、405nmで吸収値を測定した(図5)。
カニクイザルIL−13Rα1とのHuMabの交差反応性
IL−13Rα1をコードする遺伝子を、カニクイザルの組織からRT−PCRによって単離し、マウス細胞系Ba/F3に形質転換した。HuMabがカニクイザルIL−13Rα1と交差反応するか否かを試験するため、安定した形質転換Ba/F3細胞と親Ba/F3細胞を、10μg/mlのHuMabとコントロール抗体とでインキュベートした。陽性コントロールとして、ポリクローナルヤギ抗hIL−13Rα1(R&D Systems)を用いた。含めた陰性コントロールは、ヒトIgG1骨髄腫タンパク(Nordic)および正常なヤギの血清であった。結合抗体をFACS分析によって検出するために、ヒトIgGに対するFITCコンジュゲート抗体を用いてHuMabを検出し、またヤギIgGに対するFITCコンジュゲート抗体を使用してヤギ抗体を検出した。親細胞系に対して形質転換Ba/F3で試験した個々の抗体について平均蛍光強度(MFI)を比較した。
IL−13Rα1 HuMabのFcγ受容体に対する結合(NK細胞上のFcγRIIIに対する結合)
本発明抗体がナチュラルキラー(NK)細胞上のFcγRIIIa(CD16)に結合できるか否かを判定するため、抹消血単核細胞(PBMC)を単離し、20μg/mlのHuMab抗体およびコントロール抗体と共に、FcγRIIIa(抗CD16、クローン3G8、RDI、Flanders、NJ)に対する遮断用マウス抗体20μg/mlの存在下または不存在下でインキュベートし、FcγRIIIaを介する結合を検証した。FcγRIIIaに結合しないヒトIgG2およびIgG4(The Binding Site)を陰性コントロールとして使用した。ヒトIgG1およびIgG3(The Binding Site)を、FcγRIIIa結合のための陽性コントロールとして含めた。NK細胞上の結合抗体をFACS分析によって検出するために、PE標識マウス抗ヒトCD56(NK細胞表面マーカー)抗体(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)をFITC標識ヤギF(ab)2抗ヒトIgG(Fc)抗体(Protos immunoresearch, Burlingame, CA)と組み合わせて使用した。試験したHuMabは20μg/ml(Bmax: MFI±標準偏差)において最大に結合することが判定された。
Claims (20)
- 抗体の可変重鎖アミノ酸配列CDR3が、配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDR3配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体。
- 該抗体の可変重鎖アミノ酸配列CDR1およびCDR2が、配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDR1配列およびCDR2配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項1記載の抗体。
- 該抗体の可変軽鎖アミノ酸配列CDR1、CDR2およびCDR3が、配列番号2、4、6、8もしくは10の可変軽鎖アミノ酸配列CDR1、CDR2およびCDR3からなる群から選択されることを特徴とする請求項1もしくは2記載の抗体。
- a)Gly236が欠失したアミノ酸配列Pro233Val234Ala235および/またはアミノ酸配列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331、
b)アミノ酸配列Ala234Ala235もしくは
c)アミノ酸Ala265およびAla297
を有するヒトγ1重鎖を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。 - ヒト抗体であることを特徴とする請求項1〜4記載の抗体。
- IL−13Rα1に結合する親和度が、10−9M(KD)以下、好ましくは10−9〜10−13Mであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
- ハイブリドーマ細胞系DSM ACC2709、DSM ACC2710、DSM ACC2711もしくはDSM ACC2712から取得した請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体。
- 重鎖可変領域として配列番号1および軽鎖可変領域として配列番号2、重鎖可変領域として配列番号3および軽鎖可変領域として配列番号4、重鎖可変領域として配列番号5および軽鎖可変領域として配列番号6、重鎖可変領域として配列番号7および軽鎖可変領域として配列番号8、または重鎖可変領域として配列番号9および軽鎖可変領域として配列番号10、を含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体。
- a)重鎖可変領域として配列番号1、軽鎖可変領域として配列番号2、κ軽鎖定常領域として配列番号11、およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
b)重鎖可変領域として配列番号3および軽鎖可変領域として配列番号4、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
c)重鎖可変領域として配列番号5および軽鎖可変領域として配列番号6、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
d)重鎖可変領域として配列番号7および軽鎖可変領域として配列番号8、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、または、
e)重鎖可変領域として配列番号9および軽鎖可変領域として配列番号10、κ軽鎖定常領域として配列番号11およびγ1重鎖定常領域として配列番号12、ただし場合によって突然変異L234AとL235AもしくはD265AとN297Aを有する、
を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体。 - 請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体の医薬組成物の製造のための使用。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体を医薬的に有効な量を含む医薬組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の組換え抗体を産生可能な組換え宿主細胞。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体を医薬的に有効な量を含む医薬組成物の製造方法。
- ポリペプチドが:
a) 配列番号1、3、5、7もしくは9の重鎖CDRを含む抗体重鎖、
b) 配列番号2、4、6、8もしくは10の軽鎖CDRを含む抗体軽鎖、
ここで、CDRは互いに独立して選択される、
のいずれかであって、それぞれ他方の抗体鎖と一緒に集合化が可能なポリペプチドをコードする核酸。 - 請求項14記載の核酸を含む発現ベクターであって、原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で該核酸を発現可能なベクター。
- 請求項15記載のベクターを含む原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞。
- IL−13Rα1に結合し、IL−13がIL−13Rα1に結合するのを阻害するポリペプチドの生産方法であって、請求項14記載の重鎖をコード化する核酸および軽鎖をコード化する核酸を原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で発現させ、該細胞から該ポリペプチドを回収することを特徴とする方法。
- 喘息治療もしくは抗アレルギー治療を必要とする患者の治療方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該患者に投与することを特徴とする方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体を組換え発現によって産生し、該抗体を回収し、かつ該抗体を医薬的に受容可能な緩衝剤および/またはアジュバントと組み合わせることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
- ハイブリドーマ細胞系DSM ACC2709、DSM ACC2710、DSM ACC2711もしくはDSM ACC2712。
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