TW200902555A - Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof - Google Patents

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200902555 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗IL-13受體al(IL-13Ra(alpha)l)之人類抗 體、其製備方法及用途。 【先前技術】 IL-13係一種主要由Th2細胞但亦可由肥大細胞及1^1(：細 胞產生之分泌型單體肽。IL-13之生物學功能包括調節igE 生成及調介Th2發育。IL-13可與—由IL-13受體al(iL_ 13Ral)鏈及IL-4受體a(IL-4Ra)鏈構成之受體複合體結合。 IL-13結合主要係通過STAT6觸發信號轉導事件。江_13可 以低親和力與IL-13 Ra 1單獨結合但不會與iL-4Ral結合。 與此相反，IL-4可與IL-4Ra單獨結合但不會與iL-i3Rai單 獨結合。有人曾闡述過IL-13之另一受體，即lL-13Ra2。 IL-13可以高親和力與此受體結合。此受體可充當一誘铸 受體。 IL-13在轉基因小鼠中之誘導型超量表現可引起一具有 許多哮喘患者特徵之表現型。該等小鼠出現黏液化生、巨 噬細胞炎症、淋巴細胞炎症及嗜酸性粒細胞富集炎症、蛋 白激酶（如]VIMP-9、-12、-13、-2及-14，組織蛋白酶B、 Η、K及S)之上調且彼等亦出現表皮下纖維化。剔除IL_ i 3 之小鼠由於Th2發育缺陷而出現Th2細胞因子生成的明顯減 少。儘管存在嗜酸性粒細胞炎症但此等小鼠不會發展成氣 道高反應（AHR)。藉由投與IL-13可恢復AHR，表明IL-13 對於誘發小鼠AHR而言既係必要條件亦係充分條件。與哮 134936.doc 200902555 喘相關之IL_13的其他重要生物學功能包括誘發杯狀細胞 化生及黏液生成。其直接作用於氣道上皮細胞、成纖維細 胞及氣道平滑肌細胞並在每—此等細胞_巾誘發不同的 轉錄程序。令人感興趣的是，IL_n可降低平滑肌細胞中 之α腎上腺素此反應，從而造成氣道狹窄。il_i3啟動子多 態現象係與過敏性哮喘之高風險性相關。江_13基因中之 多態現象係與高水平之企清1非相關。基因間 之基因間序列中單核苷酸多態現象係與特應性哮喘相關。 IL-13拮抗劑曾用於若干動物模型中。舉例而言，曾使 用過一可溶性小鼠IL_i3Ra2_IgGFc融合蛋白質，其顯示出 完全逆轉卵清蛋白誘發之AHR及含黏液細胞之數目的效 月b。即使在表現型完全出現以後給予該治療亦可獲得此逆 轉。除此之外，使用IL-13融合細胞毒素分子治療小鼠可 達成慢性真菌誘發之過敏性炎症中所有氣道疾病特徵的減 輕。總之’ IL-1 3係一過敏反應效應臂之關鍵介體。 IL-13Ral係一造血素受體超家族（丨型細胞因子受體家族） 之成員並在 Obiri N. I 等人，J. Biol. Chem·，270(1995) 8797-8804)及WO 96/29417中加以鑒定及闡述。IL-13Ral係 一由427個胺基酸（包含信號序列）構成之蛋白質。其dnA 及蛋白質序列闡述於^0 97/15663及8\¥丨33?1*〇1第？785 52號 中。IL-13RaH系一以低親和力結合IL-13之糖基化蛋白質， 然而’當與IL-4Ra連接形成一異二聚體時，IL-13Ral可以 高親和力結合IL-13。此複合體亦係一 IL-4之受體。

可自下列瞭解抗IL-13Ral之抗體：WO 96/29417、WO 134936.doc 200902555 97/15663、WO 03/080675、Graber P 等人之 Eur. J· Immunol, 28(1998) 4286-4298、Poudrier J.等人之 J·

Immunol, 163(1999) 1 153-1 161、Poudrier J 等人之 Eur. J. Immunol, 30(2000) 3157-3164、Aikawa M.等人之 Cytokine， 13(2001) 75-84。抗 IL-13R(xl 之抗體可自 R&D Systems 公司 (USA)購得。 【發明内容】 本發明包括一種可結合IL-13Ral並抑制IL-1 3生物活性之 抗體，其特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序列CDR3係 選自由SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR3序列組成 之群。 該抗體較佳係一人類抗體。 較佳地，該抗體之特徵在於其與IL-13Ral結合之親和力 係10_9 M(KD)或更低，較佳為10·9至10·13 Μ。 較佳地，該抗體之特徵在於其重鏈CDR1、CDR2及 CDR3序列係選自由SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之重鏈 CDR1、CDR2及CDR3序列組成之群。 較佳地，該抗體之特徵在於該抗體之可變輕鏈胺基酸序 列 CDR1、CDR2及 CDR3 係選自由 SEQ ID NO : 2、4、6、8 或10之輕鏈CDR序列組成之群。 較佳地，該抗體之特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序 列 CDR1、CDR2及 CDR3 係選自由 SEQ ID NO : 1、3、5、7 或9之重鏈CDR序列組成之群，而該抗體之可變輕鏈胺基 酸序列 CDR1、CDR2及 CDR3係選自由 SEQ ID NO : 2、4、 134936.doc 200902555 6、8或10之輕鏈CDR序列組成之群。 該等CDR序列較佳係相互獨立地加以選擇且由FR區（構 架區）分開。 較佳地，該抗體之特徵在於包括作為重鏈CDR之SEQ ID NO : 1的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 2的CDR、作 為重鏈CDR之SEQ ID NO : 3的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 4 的 CDR、作為重鏈 CDR之 SEQ ID NO : 5 的 CDR 及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 6的CDR、作為重鏈CDR之 SEQ ID NO : 7的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 8的 CDR或作為重鏈CDR之SEQ ID NO : 9的CDR及作為輕鏈 CDR之 SEQIDNO: 10 的 CDR。 CDR序列係根據 Kabat 等人之 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中之標 準定義確定。在此基礎上，SEQ ID NO : 1至8之互補決定 區（CDR)具有以下序列： 重鏈 CDR : SEQ ID NO : 1、3、5、7、9之 CDR1(胺基酸 31 至 35) ; SEQ ID NO : 1、3、5、7、9之 CDR2(胺基酸 50 至 66) ; SEQ ID NO : 1、3、9之 CDR3(胺基酸 99 至 108); SEQ ID NO ： 5 之 CDR3(胺基酸 99至 107) ; SEQ ID NO : 7 之CDR3(胺基酸99至112); 輕鏈 CDR : SEQ ID NO : 2、4、6、10 之 CDR1(胺基酸 24 至 34 ) ; SEQ ID NO : 8之 CDR1(胺基酸 24 至 35) ; SEQ ID NO : 2、4、6、10 之 CDR2(胺基酸 50 至 56) ; SEQ ID NO : 134936.doc -10- 200902555 8 之 CDR2(胺基酸 51 至 57)及 SEQ ID NO : 2、4、6、10 之 CDR3(胺基酸 89至 97); SEQ ID NO: 8之 CDR3(胺基酸 90 至 97)。 較佳地，本發明提供一抗體，該抗體包括作為互補決定 區（CDR)的下列序列： a) 一包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體 重鍵； b) —包括SEQ ID NO : 2、4、6、8或10之輕鏈CDR的抗 體輕鏈， 其中該等CDR係相互獨立地加以選擇。 較佳地，該抗體特徵在於包括作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 1及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 2、作為重鏈可變 區之SEQ ID NO : 3及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 4、 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 5及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 6、作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作為輕鏈 可變區之SEQ ID NO : 8或作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO: 10。 較佳地，該抗體特徵在於包括： a) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 1、作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 2、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A 及 Ν297Α 的 SEQ ID NO : 12， b) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 3及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 4，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 134936.doc -11 - 200902555 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A 及Ν297Α的 SEQ ID NO : 12， c) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 5及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 6，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A 及 Ν297Α 的 SEQ ID NO : 12， d) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 8，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A 及Ν297Α的 SEQ ID NO : 12，或 e) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 10，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265 A 及N297A的SEQIDNO··12。 較佳地，該抗體特徵在於可與抗體LC5002-002、 LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 / 或 LC5002-018 競爭結合IL-13Ral。較佳地，該抗體特徵在於包括作為可 變區之LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002· 007或LC5002-018的可變區。此等抗體之可變區示於SEQ ID NO : 1至1 〇中。此項技術領域中熟知該等可用恆定區。 實例示於SEQ ID NO: 11至12中。 該抗體較佳係一單株抗體或一以重組方式產生之抗體。 在一本發明實施例中，該抗體係一經類別轉換之人類抗 體。 134936.doc -12- 200902555 在一本發明較佳實施例中，該抗體包含一包括下列之人 類γΐ重鏈： a) 胺基酸序列Pr〇233Val234Ala235(缺失Gly236)及/或胺基酸 序列 Gly327Leu328Pro329Ser33〇Ser331， b) 胺基酸序列Ala234Ala235或 C)胺基酸 Ala265 及 Ala297。 較佳地，本發明之抗體以一 6 nM或更低之IC5Q值抑制IL-13誘發之Stat-6磷酸化，以一20 nM或更低之IC5〇值抑制IL-13誘發之嗜伊紅趨化因子生成及/或以一 1〇 nM或更低（IL-13)及60 nM或更低（IL-4)之IC5〇值抑制IL-13或IL-4誘發之 細胞增殖（較佳為TF-1細胞（ATCC CRL 2003)之細胞增 殖）。根據實例6至8測定IL-13誘發之Stat-6構酸化、嗜伊紅 趨化因子生成及細胞增殖之誘發。 本發明抗體較佳不與變性IL_13Ral結合（結合親和力之 KD係1〇·6 Μ或更高）。較佳地，該抗體之特徵在於顯示實 質不具有與IL-13Ra2及IL-4Ra結合之交又反應性（結合親 和力之KD係1〇_6 Μ或更高）。 本發明進一步提供可產生抗IL_13Ral之單株拮抗抗體的 雜交瘤細胞系。 本發明進一步提供編碼作為本發明抗體鏈之多肽的核 酉夂’包括該等核酸之表現载體；及用於重組產生此等抗體 之伤主細胞。本發明進—步提供以重組方式製備該等抗體 之方法。 由本發明核酸編碼之多肽係 134936.doc 13 200902555 7或9之重鏈CDR的抗體 a) —包括 SEQ ID NO : 1、3、5、 重鏈；及 8或10之輕鏈CDR的抗體 b) —包括 SEQ ID NO : 2、4、6、 輕鏈 體 此等多肽能夠與相應的其他抗體鏈組裝在一起產生一 抗 本發明抗體對需要皮f類固醇治療之患者很有益處。本 發明之抗體具有能夠對患有哮喘或過敏性疾病之患者產生 一益處的新穎性質及創造性性質。 本發明進一步提供用於治療哮喘及過敏性疾病之方法。 本發明進-步包括本發明抗體於治療哮喘及於製備一本 發明醫藥組合物中之用《。此外，本發明包括一製備本發 明醫藥組合物之方法。 本發明進一步包括一醫藥組合物，其包括一醫藥有效量 之本發明抗體’視情況連同一對調配用於醫藥目的之抗體 有用之缓衝劑及/或佐劑。 本發明進-步提供包括存於一醫藥上可接受之載劑中之 此等抗體的醫藥組合物。在—實施例令，醫藥組合物可包 含在一種製品或套組中。 本發明進-步包括一含有本發明核酸之載體，其能夠在 原核或真核宿主細胞中表現該核酸。 本發明進-步包括一含有本發明载體之原核或真核宿主 細胞。 本發明進-步包括-製備本發明重組人類抗體之方法， I34936.doc -14- 200902555 其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表現本發明之核酸， 並自該細胞中回收該抗體。本發明進一步包括可以此重組 方法獲得之抗體。 本發明進一步包括一種用於製備一醫藥組合物之方法， 其特徵在於以一不含該抗體之此種分析作為對照自複數個 抗IL-13Ral之抗體中選擇出一抗IL_13Rai之抗體，藉由重 組表現產生該抗體，回收該抗體並使該抗體與一醫藥上可 接乂之緩衝劑及/或佐劑相組合。較佳地，該抗體具有一 或多種上述額外性質。 【實施方式】 術語"IL-13R〇a、鼠類 mRod、IL-13、IL-13Ra2 及 IL- 4Ra”及其結構域為此項技術領域所熟知且由（例 如）SwissProt P78552、009030、P35225、Q14627 及 P24394界定。因此，除非另有說明，否則術語，,江_ 13Ral、IL-13、IL-13Ra2 及 IL-4Rcx” 係指人類多肽 IL_ 13Ral、IL-13、IL-13Ra2及 IL-4Ra。 本文所用術s吾”人類抗體"包括具有可歸為確定之人類種 系免疫球蛋白序列（因其與此等種系序列具有高度序列相 似性或一致性）之可變區及恆定區（結構域）的抗體。人類抗 體已為當前技術領域所熟知（van Dijk，M A.，及van扑

Winkel，J.G., Curr. 〇pin. chem. Biol. 5(2001)368-374)。亦 可在轉基因動物（例如，小鼠）中產生人類抗體，該等動物 月包夠在免疫後在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生一整 組人類抗體或經選擇之人類抗體。將人類種系免疫球蛋白 134936.doc 15 200902555 基因陣列轉移至此種系突變小鼠中可在抗原攻擊後導致人 類抗體的產生（參見例如，Jakobovits, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 ; Jakobovits，A.等人， Nature 362(1993)255-258 ; Bruggemann，M.等人，Year

Immunol. 7(1993)33-40)。亦可在噬菌體展示文庫中產生人 類抗體（Hoogenboom，H.R.及 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227(1992) 381-388 ; Marks，J.D.等人，J. Mol. Biol. 222(1991)581- 597)。亦可使用Cole等人及Boerner等人之 技術製備人類單株抗體（Cole等人，Momoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第 77 頁（1985);及 Boerner，P.等人，J_ Immunol. 147(1991)86-95)。一 人類抗 體涵蓋各種形式的抗體，較佳為單株抗體，包括但不限於 全抗體、抗體片段、經類別轉換之抗體及基因工程抗體 (變體或犬變抗體）’只要此等保留本發明之特徵性質即 可。尤佳者係重組人類抗體。本文所用術語”單株抗體"係 指所有具有大致相同胺基酸序列之抗體分子製備物。 本文所用術語”重組人類抗體”擬包括可藉由重組方法製 備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如分離自一宿 主細胞（例如NS0或CHO細胞）或分離自一人類免疫球蛋白 基因之轉基因動物（例如，一小鼠）的抗體、或使用一轉染 入此一宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。此等重= 人類抗體具有呈重排形式之可變區及恆定區。該等本發明 重組人類抗體已經受活體内體細胞超突變。因此，重組抗 體VH及VL區之胺基酸序列可為經定義之人類種系^及 134936.doc 200902555 VL序列但不必天然存在於整個人類抗體種系活體内。 術語"經類別轉換之抗體"係指一包括一來自一個來源或 種系之可變區（即結合區）及至少一可與源自一不同來源或 種系之抗體恆定區相匹配之恆定區的一部分的單株抗體 (較佳為人類抗體），該單株抗體通常可藉由重組DnA技術 製備。此等經類別轉換之抗體非天然產生者，因此，無法 直接自異種移植小鼠獲得。本發明所涵蓋之”經類別轉換 之抗體”形式係彼等其中恆定區與野生型恆定區序列存在 差異的抗體形式，該等差異可產生一具有本發明性質（尤 其在Clq結合及/或Fc受體（FcR)結合方面）之抗體，即藉由 Fc改變或突變產生。經類別變換之抗體係包括編碼免疫球 蛋白可變區之DNA片段及編碼免疫球蛋白恆定區之dna片 段的經表現之免疫球蛋白基因的產物。用於產生經類別變 換之抗體的方法已為業内所熟知，該等方法涉及習用重組 DNA技術及基因轉染技術（參見，例如，M〇rris〇n, S L•等 人，Proc· Natl· Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855 ;美國 專利案第5,202,238號及第5,2〇4,244號）。 本文所用"可變區”（輕鏈之可變區（VL)、重鏈之可變區 (VH))表示每一直接參與抗體-抗原結合之輕鏈與重鏈對。 可變人類輕鏈及重鏈結構域具有相同之通用結構，且每一 結構域包含四個其序列高度保守之構架（FR)區，該等fr區 經由三個”超變區或互補決定區，CDR)連接。構架區採 用-P_a)-折疊構t，而⑽則可形成能連接卜折疊結構 之回環（loop)。每一鏈中之CDR係藉由構架區來保持其三 134936.doc 17 200902555 維結構，並與另一鍵中之⑽―起形成抗原結合位點。抗 體重鍵及輕鍵之CDR3(較佳為重鏈CDR3)區在本發明抗體 之結合專一性/親和力方面具有特別重要的作用，且其藉 此可提供本發明之另一目的。 本文所用術語”超變區”或”一抗體之抗原結合部分”意指 抗體中負貝與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含"互 補決定區"或”CDR”之胺基酸殘基。”構架”或，,FR"區係彼等 除本文所定義的超變區殘基以外之可變結構域區。因此， 一抗體之輕鏈及重鏈自N_端至c_端包含結構域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。CDR及 FR 區係 根據 Kabat 等人之 Sequences of Proteins 〇f Immunological

Interest，第 5版，Public Health Service，National Institutes of Health ’ Bethesda ’ MD(1991)中之標準定義確定。 "恆定結構域並不直接參與一抗體至一抗原之結合，而 係展現各種效應物功能。端視其重鏈恆定區之胺基酸序列 而定’抗體或免疫球蛋白可分為下列類別：IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM ’且可將此等中之若干類別進一步分為亞 類（同型物），例如 IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4、IgAl 及 IgA2。將對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定區分別稱 作μ、δ、γ、α及ε。本發明抗體較佳屬於igG丨類型。 一抗體之Fc部分直接參與補體活化、c 1 q結合、C3活化 及Fc受體結合。與Clq之結合係由確定之Fc部分結合位點 引起。此等結合位點為此項技術領域所知且闡述於下列文 獻及專利中：（例如）Lukas, T.J.等人，j Immun〇1 134936.doc -18- 200902555 127(1981) 2555-2560; Brunhouse，R·及 Cebra，J.J.，Mol.

Immunol. 16(1979)907-917 ; Burton, D_R·等人，Nature 288(1980) 338-344 ; Thommesen，J.E·等人，Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等人，J. Immunol. 164(2000)4178- 4184 ; Hezareh，M.等人，J. Virol. 75(2001)12161-12168 ; Morgan，A.等人，Immunology 86(1995)319-324 ;以及歐洲專利第〇 307 434號。此等結合 位點係（例如）L234、L235、D270、N297、E318、K320、 K322、P331及P329(根據Kabat EU索引編號，參見下文）。 IgGl、IgG2及IgG3亞類抗體通常會顯示補體活化、Clq結 合及C3活化等功能，而IgG4不會活化補體系統、不會結合 C 1 q且不會活化C3。本文所用術語"源自人類來源之Fc部分 "係指較佳具有一經修飾後檢測不到Clq結合、C3活化及/ 或FcR結合或與一人類IgGl抗體相比結合程度至少降低 50%(較佳降低70%)之人類IgGl亞類抗體Fc部分之胺基酸序 列的Fc部分。"一抗體之Fc部分"係一為熟習此項技術者所 熟知之術語，且係根據抗體之木瓜蛋白酶解離來定義。本 發明抗體包含一較佳具有一源自人類來源之Fc部分胺基酸 序列且較佳具有該等人類恆定區之所有其他部分之Fc部 分。較佳地，Fc部分係一來自人類IgGl亞類之經突變人類 Fc部分。最佳者係包括一 γΐ-重鏈怪定區（一實例示於SEQ ID NO : 11中）之具有突變L234A及L235A或D265A及 N297A(WO 99/51642)的 Fc部分。 人類恆定鏈（例如’ γ 1 -重鏈）詳細闡述於Kabat等人之 134936.doc •19- 200902555 χ in in u a u 1 υ g 1 c a i sequences ot rroteins

Public Health Service，National Institutes of Health， Bethesda，MD.(1991)及Briiggemann，M等人之J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361 ; Love，T.W等人之 Methods Enzymol. 178(1989) 515-527中。本發明之較佳恆定結構域不提供補 體結合。本文所用"可變區"（輕鏈之可變區（VL)、重鏈之可 變區（VH))表示輕鏈與重鏈對中每一直接參與抗體_抗原結 合之鍵。

本文所用術語"核酸或核酸分子"擬包括DNA分子及RNA 分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳係雙鏈DNA。 ，當核酸放置在另一核酸序列之功能關係中時，該核酸係 為"以可操作方式連接的’、例如，若前序列或分泌前導序 列之舰被表現為參與多肽分泌之前蛋自，制前序列或 分泌前導序列之DNA係以可操作方式連接至該多狀之臟 上；啟動子或增強子若可影響編碼序列之轉錄，則該啟動 子或增強子係以可操作方式連接至該編碼序列上；或若核 糖體結合位點經定位後可促進轉譯，則該核糖體結合位點 係以可操作方式連接至該编 。 心伐芏通、.扁碼序列上。一般而言，，，以可 操作方式連接的”意指經速技 一？曰、灰連接之DNA序列係順式的，且在 / 刀泌前導序狀情形中，其既鄰接亦處於_框中。然 而，增強子則無需是連續的。 接八γ + A ϋ 轉由在各知限制酶位點處之

成連接。若該等限制酶位點不存在，則可根攄習 知操作使用合成性寡核_頭_子。據S 如本文所用表現”細胞"、II細胞系"及"細胞培養物”可互 I34936.doc -20. 200902555 換使用且所有此等表述皆包括其子代。因此，詞語"轉化 子"及"轉化細胞"包括原代受試細胞及源自其之培養物而 不考慮轉移次數。亦應瞭解’所有子代之DNA含量皆可能 因特意或無意突變而不精確相同。亦包括同最初轉化細胞 中所篩選者具有相同功能或生物學活性之變異子代。當擬 使用不同名稱時’可根據上下文而明瞭。 本文所用術語"與IL-13Red之結合”意指在一體外分析中 (較佳在一其中抗體與一表面結合且藉由表面電漿共振 (SPR)量測與IL-13Rcx1之結合的結合分析中）抗體與IL_ 13Ral之結合。”結合”意指一 1〇·8 μ或更低，較佳為ι〇-!3至 10 Μ之結合親和力（kd)。'’無結合"意指一 1 μ或更高之 Kd °本發明之抗體與人類IL-13Ral(且較佳亦可為小鼠iL-13Ral)之胞外結構域結合。 可藉由 BIAcore分析（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala，

Sweden )研究與lL_13Ral之結合。結合親和力係藉由術語 ka(與抗體/抗原複合物中之抗體締合之速率常數）、kd(解 離速率）及KD(kd/ka)界定。 IL-13與IL-13R_al之結合可由本發明抗體抑制。在一用於 測定IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異二聚體之結合的elisa中量 測以ICso表示之抑制作用。為實施此一分析’對IL-13Ral 實施固定化並加入IL-13與IL-4Ra。本發明抗體之IC5〇值 (對於IL-13與IL-13Ral之結合）係不大於6 nM。IC5Q值係作 為至少三個獨立的測量之平均值或中值加以量測。個別 IC5〇值可能會超出範圍。 134936.doc -21- 200902555 較佳地，本發明之抗體顯示可與一選自由抗體LC5002- 002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 或 LC5002-0 1 8組成之群的抗體在IL-1 3Ral之相同抗原決定部位與其 結合，或在與IL-13Ral結合時因彼等抗體結合引起之空間 位阻而受到抑制。藉由一 SPR分析使用一選自由抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 或 LC5 002-01 8組成之群的固定化抗體及濃度為20至50 nM之 IL-13Ral及濃度為100 nM之待檢測抗體來檢測結合抑制作 用。一 50%或以上之信號減少表明該抗體與一選自由抗體 LC5002- 002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 或 LC5002-018組成之群的抗體產生競爭。術語"抗原決定部 位”意指一能夠特異結合至一抗體之蛋白質決定子。抗原 決定部位通常由分子之化學活性表面基團（例如，胺基酸 或糖之側鏈）組成，且其通常具有特異性的三維結構特徵 以及特異電荷特徵。構象及非構象抗原決定部位之不同之 處在於當存在變性溶劑時，與構象抗原決定部位之結合會 喪失，而與非構象抗原決定部位之結合則不會喪失。本發 明亦包括可與IL-13Ral結合並抑制IL-13Ral生物活性之人 類抗體’其特徵在於與IL-13Ral結合之親和力係10_9 M(KD)或更低’較佳為1〇·9至1〇·13 μ且與鼠類IL-13Ral結合 之親和力係10-7 M(KD)或更低，較佳為1〇·8至1〇·9 Μ。 在一本發明較佳實施例中，本發明抗體進一步由一或多 種選自由下列組成之群的特徵來表徵：結合參數ka、kd及 KD，與一選自由抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002- 134936.doc -22- 200902555 005、LC5(H)2_()()7或LC5G㈣！ 8組成之群的抗體結合至同 一抗原決定部位上。 本發明之抗體較佳係由重組方式產生。此等方法廣泛為 此項技術領域中已知且包括於原核及真核細胞中表現蛋白 質以及隨後分離抗體多肽且通常將其純化至醫藥上可接受 之純度。為表現蛋白質，藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈 之核酸或其片段插入至表現載體中。在諸如CH〇細胞、 NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、C0S細胞、酵母或 大腸桿菌細胞等適宜原核或真核宿主細胞中實施該表現， 並自該等細胞（上清液或裂解後之細胞）回收抗體。 以重組方法製備抗體已為此項技術領域所熟知且闡述 於’舉例而言 ’ Makrides, S.C.，Protein Expi·. Purif, 17(1999) 183-202、Geisse，S.等人，Protein Expr· Purif, 8(1996) 271- 282、Kaufman，R.J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-161 > Werner, R.G. > Drug Res. 48(1998) 870-8 8 0等評論性文章中。 抗體可以完整細胞、細胞裂解物或一經部分純化或實質 純之形式存在。藉由標準技術（包括鹼/SDS處理、CsCl分 離紋帶法、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法及其他業内熟 知方法）實施純化以去除其他細胞組份或其他雜質，例如 其他細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel，F.等人編寫之 Current Protocols in Molecular Biology > Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。 於NS0細胞中之表現闡述於（例如）Barnes，L.M.等人之 134936.doc -23- 200902555

Cytotechnology 32(2000)109-123 中及 Barnes, L.M.等人之 Biotech，Bioeng. 73(2001)261-270 中。瞬時表現闡述於（例 如）Durocher，Y 等人之 Nucl. Acids. Res.30(2002) E9中。可 變結構域之選殖闡述於Orlandi，R.等人之Proc. Natl. Acad Sci. USA 86(1989) 3833-3837 ; Carter, P等人之proc. Natl Ac ad. S c i. U S A 8 9 (19 92) 4 2 8 5-42 8 9 ;及 Norderhaug，L 等人 之 J. Immunol· Methods 204(1997) 77-87 中。一較佳瞬時表 現系統（HEK 293)闡述於 Schlaeger，E.-J.及 Christensen，K 之 Cytotechnology 30(1999) 71-83 以及 Schlaeger，E.-J,之 J· Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中。 例如，適於原核生物的控制序列包括一啟動子、視情況 包括一操縱序列及一核糖體結合位點◎已知真核細胞可利 用啟動子 '增強子及聚腺苷酸化信號。 適於藉由習用免疫球蛋白純化程序（例如，蛋白A_瓊脂 糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析 法）自培養基中分離出單株抗體。使用習用程序易於分離 並定序編碼單株抗體之DNA及RNA。雜交瘤細胞可作為此 DNA及RNA之來源.一旦分離，即可將該DNA插入至表現 載體甲，然後將該等載體轉染至不以其他方式產生免疫球 蛋白之宿主細胞（例如CHO細胞、HEK 293細胞、或骨髓瘤 細胞）中，以便在宿主細胞中達成重組單株抗體之合成。 另外，本發明抗體包括彼等具有”保守序列修飾”（核苷酸 及胺基酸序列修飾）之抗體，該等修飾不影響或改變本發 月抗體之上述特徵。可藉由諸如定點誘變及pcR介導之誘 134936.doc •24- 200902555 變等業内已知標準技術來引入修飾。保守胺基酸取代包括 其中胺基酸殘基由一具有類似側鏈之胺基酸殘基取代的取 代。業内已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家 族包括具有驗性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、 酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、無電荷之極性側鏈 (例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺 酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如，丙 胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、 甲硫胺酸）、β-分支側鏈（例如’蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺 酸）以及芳香族側鏈（例如’酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、 組胺酸）之胺基酸。因此，人類抗_几_1311〇11抗體中預期之 非必需胺基酸殘基較佳可用相同側鏈家族中之另一胺基酸 殘基取代。 胺基酸取代可以 Riechmann，L·等人（Nature 332(1988)

323-327)及 Queen，C.等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989) 10029-1003 3)所述之分子模型為基礎之突變作用 達成。 藉由將適當核苷酸改變引入至該抗體DNA中，或藉由肽 合成作用可製備出人類IL-13Ral抗體之胺基酸序列變體。 :、、；而’僅可在極有限的範圍（例如，如上所述者）内實施此 等修飾作用。舉例而言，儘管該等修飾作用不會改變上述 抗體特徵’例如，IgG同型物及抗原決定部位之結合，但 其可提高重組產物之產率、蛋白質穩定性或促進純化。 ^何不參與維持抗-IL-13Ral抗體之正確構象之半胱胺酸 134936.doc •25- 200902555 殘基亦可經取代（一般使用絲胺酸取代），以提高分子之氧 化穩定性並阻止異常父聯。相反地’可將半胱胺酸鍵結添 加於抗體中以提高其穩定性，特別係在該抗體係一抗體片 段（例如，Fv片段）之情形中。 另一類抗體之胺基酸變體係改變抗體之原初糖基化形 式。改變思指刪除一或多個存在於抗體中之碳水化合物 部分，及/或增加一或多個在抗體中原本不存在之糖基化 位點。抗體之糖基化通常係與N連接的。”與n連接的"係指 碳水化合物部分與一天門冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序 列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺_χ_蘇胺酸（其中χ係除脯 胺酸外之任何胺基酸）係該碳水化合物部分與該天冬醯胺 側鏈酶促連接之識別序列。故’多肽中存在任一種該等三 狀序列均可產生潛在性糖基化位點.通常，藉由改變胺基 酸序列以使抗體中含有一或多個上述三肽序列（對於與Ν— 連接的糖基化位點）來完成將糖基化位點輕易地加入至抗 體中。 可藉由各種業内已知方法製備編碼抗_江_1311〇11抗體胺基 酸序列變體之核酸分子。此等方法包括但不限於自天然來 源分離（對於天然存在之胺基酸序列變體之情形）或藉由對 早期製備之抗-IL-13Ral抗體變體或非變體形式實施寡核苷 酸介導之（或定點）誘變、PCR誘變及序列盒誘變來製備。 另一類型<共價修飾作用涉及以化學方式或酶促方式將 糖皆偶聯至抗體上。該等程序恨有益處，因其不需要在具 有N-或0-連接糖基化作用之糖基化能力之宿主細胞中產生 134936.doc -26- 200902555 抗體。鳊視所用偶聯模式而定，糖類可結合至（a)精胺酸及 組胺酸、（b)游離竣基、（c)游離疏基（例如彼等半胱胺酸之 巯基）、（d)游離羥基（例如彼等絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸 之羥基）、（e)芳族殘基（例如彼等苯丙胺酸、酪胺酸或色胺 酸之芳族殘基）或（f)穀胺醯胺之醯胺基上。該等方法闡述 於 WO 87/05330及 Aplin，J.D.與 Wriston，J.C. Jr.，CRC Crit· Rev. Biochem. (1981) 259-306 中。 移除任何存在於抗體中之碳水化合物部分可以化學或酶 促方法完成。以化學方法實施去糖基化作用需要將抗體暴 露於化合物二氟甲磺酸或一等效化合物中。此處理會切除 連接糖（N-乙醯胺基葡萄糖或N_乙醯半乳糖胺）以外的大部 分或全部糖類，而保留完整的抗體。以化學方法實施去糖 基化作用闡述於 Sojahr，H.T.及 Bahl，O.P.(ArCh. Bioehem.

Biophys. 259(1987) 52_57)及 Edge，A s 等人

Biochem. 118(1981) 131_137)中。以酶促方法切除抗體上 碳水化合物部分則可藉由使用各種如Th〇takura，n r及

Bahl, O.P.(Meth· Enzymol. 138(1987) 350-359)所述之内切 及外切糖苷酶來達成。 抗體之另一類型共價修飾作用包括將該抗體以美國專利 案第 4,640,835 號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之 法連接至各種非蛋白質聚合物之任一種上，例如，聚乙 醇、聚丙二醇或聚氧化烯烴。 在又一態樣中，本發明提供自表現本發明人類浐 134936.doc -27- 200902555 13 R (x 1Ί几體的非人類麵^其田缸ι 貝轉基因動物（例如轉基因小鼠）中分離之 b細胞。較佳地’該等經分_細胞系自―已由—^则 抗原及/或表現IL_13Ral之細胞的純化或富集製備物免疫之 非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）得到。較佳地，該非 人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）具有_包括可編媽本發 明抗體全部或一部分之人击自舌· A* # m 刀之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因 之基因組。然後使經分離B細胞永生化以提供—人類抗_ IL- 13Ral抗體之來源（例如雜交瘤）。目此，本發明亦提1 一種能夠產生本發明人類單株抗體之雜交瘤。在一實施例 中，該雜交瘤包括一自一非人類轉基因動物（例如轉基因 小鼠）得到的B細胞，該轉基因動物具有一融合至一永生化 細胞之基因組，該基因組包括可編碼本發明抗體之全部或 一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因。 在一特定實施例中，非人類轉基因動物係一轉基因小 鼠，其具有一包括可編碼一本發明抗體之全部或一部分之 人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組。可用一 13RaI抗原及/或表現iL-i3Ral之細胞的純化或富集製備物 來免疫該非人類轉基因動物。較佳地，該非人類轉基因動 物（例如轉基因小鼠）能夠產生針對IL -1 3Ral之人類單株抗 體的IgGl同型物。 可藉由使用IL-13Ral抗原及/或表現iL-13Ral之細胞的純 化或畐集製備物免疫具有一包括可編碼一本發明抗體之全 部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組 的非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）來產生本發明人類 134936.doc -28- 200902555 單株抗體。隨後得到該動物之B細胞（例如脾臟B細胞）並將 其與骨髓瘤細胞融合以形成可分泌抗IL-13Ral之人類單株 抗體的永生雜交瘤細胞。 在一較佳實施例中，可·使用攜帶部分人類免疫系統而非 小鼠系統之轉基因小鼠來產生直接針對IL-13Ral之人類單 株抗體。此等轉基因小鼠（本文中稱為"HuMab”小鼠）含有 一編碼未重排人類免疫球蛋白基因（其包括重（μ及γ)鍵及κ 輕鏈）（恆定區基因）之人類免疫球蛋白基因微小基因座，以 及使内源μ及κ鏈基因座失活之革巴標突變（Lonberg，Ν.等 人，Nature 368(1994)856-859)。因此，該等小鼠展現出小 鼠IgM或K之表現的降低，且所誘導之人類重鏈及輕鏈轉 基因響應免疫而經受類別轉換及體細胞突變進而產生高親 和力人類IgG單株抗體（Lonberg, N.等人，Nature 368(1994) 856-859 ;論述於 Lonberg，N. * Handbook of Experimental Pharmacology 1 13(1994)49-101 中；Lonberg, N.及 Huszar， D·，Intern· Rev. Immunol. 25(1995)65-93 ;及 Harding，F. 及 Lonberg，N.，Ann. N. Acad. Sci. 764(1995)536-546)° HuMab小鼠之製備闡述於Taylor，L.等人之Nucleic Acids Research 20(1992) 6287-6295 ; Chen, J.等人之 International Immunology 5(1993) 647-656 ; Tuaillon, N.等人之 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(1993) 3720-3724 ; Choi，T.K.等人 之 Nature Genetics 4(1993) 1 17-123 ; Chen，J.等人之 EMBO J. 12(1993) 821-830 ; Tuaillon, N 等人之 Immunol 152(1994) 2912-2920 ; Lonberg，N 等人之 Nature 368(1994) 134936.doc -29- 200902555 856-859 ； Lonberg, N.，Handbook of Experimental

Pharmacology 1 13( 1 994) 49-101 ; Taylor，L 等人之 Int. Immunol. 6( 1994) 579-591 ; Lonberg，N.及 Huszar，D·， Intern. Rev· Immunol· 25(1995) 65-93 ; Harding, F 及 Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764(1995) 536-546 ； Fishwild，D.M.等人之 Nat· Biotechnol. 14(1996) 845-851， 所有該等參考文獻之全部内容以引用方式併入本文中。進 一步參閱，美國專利案第5,545,806號；第5,569,825號；第 5,625,126 號；第 5,633,425 號；第 5,789,650 號；第 5,877,397 號；第 5,661,016 號；第 5,814,318 號；第 5,874,299 號；第 5,545,807 號；第 5,770,429 號；WO 98/24884 ； WO 94/25585 ； WO 93/1227 ； WO 92/22645 以 及 WO 92/03918。 為產生針對IL-13Ral之完整人類單株抗體，可根據通用 方法用一 IL-13Rtxl抗原及/或表現IL-13Rcxl之細胞的純化或 富集製備物免疫HuMab小鼠，如Lonberg, N.等人在Nature 368(1994)856-859 中；Fishwild，D.M.等人在 Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851中及WO 98/24884中所述。較佳地，該等 小鼠在經第一次免疫時為6至16週齡。舉例而言，可使用 一可溶性IL-13Ral抗原之純化或富集製備物（例如自表現 IL-13Ral之細胞純化而得）經腹膜腔内免疫HuMab小鼠。若 使用一 IL-13Ral抗原之純化或富集製備物免疫未產生抗 體，則亦可使用表現IL-1 3Ral之細胞（例如一腫瘤細胞系） 來免疫小鼠以促進免疫應答。有關各種抗原之累積經驗已 134936.doc -30- 200902555 表明，當初始时子於完全Freund氏佐劑之抗原經腹膜腔 (π·)免疫且隨後每隔-周用存於不完全F_d氏佐劑之抗 原交替進行i.P.或s.c.免疫（例如，直至總共6次）時，仙祕 轉基因小鼠反應最佳。可用藉由使㈣窩後放血得到之血 聚樣品監控整個免疫程序過程中之免疫應答。可藉由 ELISA篩選血漿，且可使用具有足夠抗類免疫 球蛋白滴度的小鼠來使相應B細胞永生化。可在宰殺及切 除脾臟及淋巴結前3至4天用抗原經靜脈對小鼠加強免疫。 預計對於每一抗原可能需要實施2至3次融合。對於每一種 抗原需免疫若干小鼠《例如，可總共免疫5至丨2只hc〇7及 HCol2係之HuMab小鼠。 HCo7小鼠在其内源輕鏈（κ)基因中具有一 JKD破壞（如

Chen，J.等人在 EMBO J· 12(1993)821-830 中所述）、在其内 源重鏈基因中具有一 CMD破壞（如WO 01/14424實例1中所 述）、一 KCo5人類κ輕鍵轉基因（如Fishwild，D.M.等人在 Nat· Biotechnol. 14(1996)845-851 中所述）以及一 HCo7 人類 重鏈轉基因（如美國專利案第5,770,429號中所述）。 HCo 12小鼠在其内源輕鍵（κ)基因中具有一 JKD破壞（如 Chen, J.等人在 EMBO J. 12(1993)821-830 中所述）、在其内 源重鏈基因中具有一 CMD破壞（如WO 0W14424實例1中所 述）、一 KCo5人類κ輕鏈轉基因（如Fishwild，D.M.等人在

Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851 中所述）以及一 HCo12 人 類重鏈轉基因（如W0 01/14424實例2中所述）。 可分離小鼠淋巴細胞並根據產生雜交瘤之標準程序使用 134936.doc -31 - 200902555 PEG使其與一小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後筛選所得到之 雜交瘤以用於產生抗原專一性抗體。例如，用50% PEG使 來自經免疫小鼠之源於脾臟與淋巴結之淋巴細胞的單—、細 胞懸浮液與1/6量之SP 2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC，CRL 1 58 1)融合。以約2X1 05個細胞之量將該等細 胞鋪板於平底微量滴定板中，隨後在選擇培養基t培育約 2周。 隨後藉由ELISA篩選各孔以選出人類抗IL_13Rai單株 r 4厘及抗體。一旦出現大量雜交瘤生長，即分析培養 基，此通常係在10至14天之後。將分泌抗體之雜交瘤重新 鋪板並再次篩選，若仍對人類IgG、抗比_1311〇11單株抗體 呈陽性’則可藉由限制稀釋將其至少亞選殖2次。然後在 活體外培養穩定的亞係以在組織培養基中產生抗體以供定 性。 由於CDR序列負貴抗體_抗原相互作用，因此有可能藉 由在來自一不同人類抗體之構架序列上構建包含本發明 CDR序列的表現載體來表現本發明重組抗體（參見例如，

Riechmann，L·等人，Nature 332(1998)323-327 ; J0nes，P. 等人，Nature 321(1986)522-525 ;及Queen，C.等人，Pr〇c

Natl. Acad.參見 U.S.A. 86(1989)10029-10033)。可自包括 種系人類抗體基因序列之公共D N A資料庫獲得此等構架序 歹J此等種系序列將不同於成熟抗體基因序列，原因在於 其不包括完整組裝之可變基因（其在B細胞成熟期間藉由 V(D)J連接而形成）。種系基因序列在各個均勻交又可變區 134936.doc -32- 200902555 處亦將不同於一高親和力次級完整抗體之序列。 本發明較佳包括一編碼一與IL_13Ral結合之多肽的核酸 片段’該多肽可藉此抑制之結合，該片段 選自由下列組成之群： a) —包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體 重鏈； b) 包括SEQ IDNO:2、4、6'8或10之輕鏈CDR的抗體 輕鏈， 將重新構建之重鏈及輕鏈可變區與啟動子、轉譯起始 區、怔定區、3’非轉譯區、聚腺苷酸化作用序列及轉錄終 止區之序列相組合，以形成表現載體構建體。重鏈及輕鏈 表現構建體可組合至單一載體中，經共轉染、連續轉染或 分別轉染至宿主細胞中，然後將該等宿主細胞融合成可表 現兩條鏈之單一宿主細胞。 因此，本發明提供一種用於製備本發明重組人類抗體之 方法’其特徵在於表現一編碼下列之核酸： % a) 一包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體 重鏈； b) —包括SEQ ID NO : 2、4、6、8或10之輕鏈CDR的抗體 輕鏈。 本發明進一步包括本發明抗體在活體外鑒定iL_i3Ral之 用途，較佳地係以免疫分析法測定樣品之IL_丨3R〇a與本發 明抗體間之結合。 在另一態樣中，本發明提供一種組合物（例如，一種醫 134936.doc •33· 200902555 藥組合物），其含有與一醫藥上可接受之載劑調配在一起 的本發明人類單株抗體的一種或其組合或其抗原結合部 分。 本文所用"醫藥上可接受之載劑"包括任何及所有生理上 兼容之溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細g劑及抗真菌劑、 等滲劑及吸收延遲劑以及諸如此類。載劑較佳適於經靜脈 内、經肌内、經皮下、非經腸、經脊髓或經表皮施用（例 如，經注射或經輸注施用）。 ”醫藥上可接受n指可保留抗體所需生物活性且不 帶來任何不良之毒理學效應之鹽（例如，參見β，，請 等人].Pharm. Sci. 66(1977) 1-19卜該等鹽涵蓋於本發 明中。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽 包括彼等衍生自無毒性無機酸者，例如氫氯酸鹽。 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之组人 物。熟習技術者將明瞭，投與途徑及/或方式將端視期望 結果而變化。 為以某些投藥路徑投與本發明化合物，可能需 — 材料塗覆該化合物或將該化合物與該材料共投與，以避免 ^發明化合物失去活性。舉例而言，該化合物可於合適載 ㈣（例如，脂質體或稀釋劑）中投與患者。醫藥上可接受之 稀釋劑包括鹽水及水性緩衝溶液。 液及臨時配 用於醫藥活 醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或$ 製無菌注射用溶液或分散液所用之無菌粉^ 性物質的該等介質及試劑之用途已為業内0 134936.doc •34- 200902555 本文所用短語•，非經腸投與”及”以非經腸方式投與”意指 除經腸及局部投與以外之其他投與方式’通常係注射方 式’且其包括(不受限制)經靜脈内 ' 經肌内、經動脈内、 經勒内、經囊內、仓& 襄内厶眼窩内、級心臟内、經皮内、經腹膜 腔内、經氣管、經皮下、經表皮下、經關節内、經囊下、 經蛛網膜下、經脊柱内、硬膜外及經胸骨内注射及輸注。 。等、且口物亦可包含佐劑’例如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑及刀放^。藉由上述滅菌程序及藉由引入各種抗細菌劑 及抗真菌劑（例如，對氧苯甲酸、氣丁醇、苯紛、山梨酸 及類似物）二者可確保防止微生物的存在。該組合物中亦 可此需要加人等渗劑，例如糖類、氯化鈉及類似物。另 外，藉由加入能延緩吸收之試劑（例如’單硬脂酸紹及明 膠)可達成可注射醫藥形式之長效吸收。 ::選擇何種投與路徑，皆可藉由已為彼等熟習此項技 Γ所知^方法將可以適當水合形式使用之本發明化 型。 +赞月醫樂組合物調配成醫藥上可接受之劑 本發明醫藥組合物中活性土、a >齒 性成份之實際劑量水平可加以變 化，以獲得針對一特定串各 至⑽、“ 肖疋患者、組合物及施用方式可有效達 至J期望/ 口療效果且不伸串去 、 〜 令·^之活性成份量。所選擇之 劑量水平端視各種醫筚動 擇 亩樂m力學因素而定，該等因 發明所用特定組合物或其酯、苴越 ’、 路徑、投與時間、所：广其酿版之活性、投與 時門…」 合物之排泄速率、治療持續 時間、其他與所用特定組合物一起使用之藥 134936.doc -35· 200902555 :料n療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、健 μ狀况及先則病史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。 該、且口物必須係無菌的，且具有可以注射器遞送該組合 物mu。除水外’載劑可為等滲緩衝鹽水溶液、乙 醇、多元醇（舉例而言，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及 類似物）及其合適之混合物。 牛例而„，可藉由使用塗佈劑（例如卵磷酯）、在分散狀 況下維持所需粒度及使用表面活性劑維持適當之流動性。 在許多狀況下，較佳者係在組合物中加入等滲劑（例如糖 =)、多元醇（例如甘露醇或山梨醇）及氯化鈉。可藉由在組 5物中加入此延緩吸收之藥劑（例如單硬脂酸鋁或明膠） 來達成對可注射組合物之長期吸收。 ^供下列實例、參考文獻、序列表及圖示係用於幫助理 解本發明，本發明之真實範圍於隨附申請專利範圍中闡 明。應瞭解，可對所列程序實施多種修改，此並不偏離本 發明之精神。 實例 實例1 雜交瘤之生成 精由使用表現人類IL-13Ra丨之細胞免疫·一具有一包括可 編碼全部或一部分本發明抗體之人類重鏈轉基因及人類輕 鏈轉基因之基因組的非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠） 來製備本發明之人類單株抗體。然後得到該動物之B細胞 (例如脾臟B細胞）並將其與骨髓瘤細胞融合以形成可分泌 134936.doc -36· 200902555 抗IL-13Ral之人類單株抗體的永生雜交瘤細胞。可使用攜 帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉基因小鼠來產生直 接針對人類IL-13Ral之人類單株抗體。此等轉基因小鼠（本 文中稱為"HuMab”小鼠）含有一編碼未重排人類免疫球蛋白 基因（其包括重（μ及γ)鏈及κ輕鏈）（恆定區基因）之人類免疫 球蛋白基因微小基因座，以及使内源κ鏈基因座失活之 革巴才示突變（Lonberg，Ν.等人，Nature 368(1994)856-859)。 因此’ s亥等小鼠展現小鼠IgM或κ之表現降低，且所誘導之 人類重鏈及輕鏈轉基因響應免疫而經受類別轉換及體細胞 突變進而產生高親和力人類IgG單株抗體。為完全產生針 對人類IL-13Ral之人類單株抗體’可根據通用方法用表現 人類IL-13Ral之細胞免疫HuMab小鼠，如Lonberg，N.等人 在 Nature 368(1994)856-859 中；Fishwild，D.M·等人在 Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851 中及 WO 98/24884 中所述。較 佳地’此等小鼠在經第一次免疫時為6至16週齡。舉例而 言，可使用經IL-13Ral轉染細胞經腹膜腔内免疫HuMab小 鼠。可用藉由眼窩後放血得到之血漿樣品監控整個免疫程 序過程中之免疫應答。可藉由ELISA及/或FACS來篩選血 漿。可使用具有足夠抗-人類IL-13Ral人類免疫球蛋白滴度 的小鼠來永生化相應B細胞。可在宰殺及切除脾臟及淋巴 結剞3至4天用抗原經靜脈對小鼠加強免疫。舉例而言，可 免疫HCo7或HCol2係HuMab小鼠。HCo7小鼠在其内源輕鏈 (κ)基因中具有一 JKD破壞（如Chen等人在（1993) EMBO J. 12: 821-830中所述），在其内源重鏈基因中具有一 cmD破 134936.doc -37- 200902555 壞（如WO 01/14424之實例1所述）並具有一 KCo5人類κ輕鏈 轉基因（如 Fishwild， D.Μ.專人在（1996) Nature Biotechnology 14:845-851中所述）及一 HCo7人類重鍵轉基 因（如美國專利第5,770,429號所述）。HCol2小鼠在其内源 輕鏈（κ)基因内具有一 JKD破壞（如Chen, J.等人在EMBO J. 12(1993)821-830中所述）、在其内源重鏈基因中具有一 。]^10破壞（如\^0 01/14424實例1中所述）並具有一1<：(：〇5人 類κ輕鏈轉基因（如Fishwild，D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851中所述）以及一 HCol2人類重鏈轉基因（如 W0 01/14424實例2中所述）。可分離小鼠淋巴細胞並根據 產生雜交瘤之標準程序使用PEG使其與一小鼠骨髓瘤細胞 系融合。隨後篩選所得到之雜交瘤以用於產生抗原專一性 抗體。例如，用5〇% PEG使來自經免疫小鼠之源於脾臟與 淋巴結之淋巴細胞的單一細胞懸浮液與Sp 2/〇非分泌型小 鼠骨髓瘤細胞（八丁(：<：，€1^15 81)融合。以約〇.75\107個細 胞之量將該等細胞鋪板於平底微量滴定板中，繼而在選擇 培養基中培育約2周。隨後藉由ELISA及/或FACS來篩選各 孔以選出人類抗_化-1311〇11單株IgM及IgG抗體。一旦出現 大量雜交瘤生長，則將分泌抗體之雜交瘤重新鋪板並再次 師選’若仍對人類IgG、抗iL-13Ral單株抗體呈陽性，則 可藉由限制稀釋將其至少亞選殖2次。然後在活體外培養 穩定的亞係以在組織培養基中產生抗體以供定性。 轉基因小鼠之免疫程序 使用1χ1〇δ個經一 IL-13Rctl之表現載體轉染的HEK293細 134936.doc •38- 200902555 胞免疫3只HCo7小鼠（GG2201係）（3只皆為雄性小 鼠）（Medarex，San Jose, CA，USA)及 2只 HCol2小鼠（GG2198 係）（1 只雄性及 1 只雌性）（Medarex，San Jose, CA，USA)。以 腹膜腔内（i.p.)及尾基部皮下（s.c.)注射之方式交替實施總 共8次的免疫。對於第一次免疫，將100微升lx 106個 HEK293:IL-13Ral細胞與100微升完全Freund氏佐劑（CFA ; Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對於其他所有免 疫，將存於PBS中之100微升細胞與100微升不完全Freund 氏佐劑（ICFA ; Difco)混合。 小鼠之加強免疫 當觀察到抗-IL-13Ral之血清滴度已足夠時，在融合前4 及3天額外用存於200微升PBS之lxlO6個HEK 293:IL-13Ral 細胞經靜脈内（i.v.)對小鼠實施2次加強免疫。 實例2 藉由ELISA測試HuMab與固定化IL-13Ral的結合 為測定本發明抗體與重組IL-13Ral結合之能力，將IL-13Ral之胞外結構域（R&D Systems，UK)溶於PBS中（1微克/ 毫升）並藉由在4°C下培育過夜來使其吸附於微量滴定板 (NUNC Maxisorb)上。使用洗滌緩衝液（WB=0.90/〇 NaCl ; 0.1°/。Tween® 20)洗滌該等滴定板後，藉由添加100微升培 育緩衝液（IB =附有 1% crotein C 及 0.1% Tween® 20 之 PBS) 並於室溫（RT)下培育3 0分鐘來封阻非專一性結合位點。隨 後添加經連續稀釋之HuMab及對照抗體（100微升/孔；存於 IB之稀釋液）並於RT下培育1小時。重新洗滌該等滴定板並 134936.doc •39- 200902555 藉由使用過氧化物酶偶聯的兔抗-人類k(DAKO，Denmark) 抗體在一存於IB之1:500最終稀釋液中檢測已結合之人類 抗體。使用過氧化物酶偶聯的多株驢抗-山羊IgG抗體 (Santa Cruz;存於IB之1:1000稀釋液）來檢測多株山羊抗-hlL- 13Ral抗體。在室溫下培育1小時並實施一後續洗滌步 驟後，於RT下使用即用ABTS®溶液（Roche Diagnostics GmbH)在暗處顯色該等滴定板。在最高濃度吸光率達到一 足夠OD值後量測405奈米處吸光率。 經測試之全部抗IL-13Ral抗體皆能夠與固定化人類IL-13Rctl胞外結構域相結合。對於經測試之各種LC抗體，測 得EC50值係介於0.5至2nM之間。陰性對照HuMab抗-KLH 未與固定化IL-13Ral胞外結構域結合。所加入作為陽性對 照之多株山羊-抗人類IL-13Ral抗體亦可有效結合固定化 IL-13Rotl胞外結構域（圖1)。 實例3 IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異二聚體（ELISA)之結合的抑制 在一振盪器上於4°C下使用存於PBS中之100微升濃度為 3微克/毫升之hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質（R&D Systems， UK)塗覆微量滴定板。使用WB洗滌滴定板之後，添加經連 續稀釋之HuMab及對照抗體（100微升/孔；存於IB之稀釋 液）並於RT下培育30分鐘。重新洗滌該等滴定板且隨後加 入一 IL-13(R&D Systems，UK; 0.5微克/毫升；經IB稀釋之 稀釋液）與 IL-4Rtx(R&D Systems，UK; 0.75 微克 / 毫升；經 IB稀釋之稀釋液）之混合物並於RT下培育1小時。洗滌該等 134936.doc •40- 200902555 滴定板之後，加入濃度為0.4微克/毫升之100微升經生物素 化之抗 IL-13 抗體（BAF213 ; R&D Systems，UK)並於 RT 下 培育1小時。洗滌該等滴定板之後，藉由過氧化物酶偶聯 的鏈黴抗生素蛋白（Roche Diagnostics GmbH, DE)之存於IB 中的1:5000稀釋液（在RT下培育，時間為1小時）來檢測已 結合之IL-13。最後，洗滌該等滴定板並在室溫下（RT)用 即用ABTS®溶液（Roche)於暗處顯色。45至60分鐘後量測 405奈米處之吸光率。 抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007及LC5002-018能夠以介於約50%至80-85%間之最大抑 制值抑制IL-13與異二聚體受體之結合。陽性對照係 AF 1 52(多株兔抗體）。如所預計，陰性對照抗-KLH未抑制 IL-13與異二聚體受體之結合。對於LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-018 所獲得 IC50 值係介於1.5 nM至10.1 nM之間（圖2)。 實例4 放射性配體結合分析 使用表現人類IL-13Ral及人類IL-4Ra之CHO細胞在結合 緩衝液（25 mM HEPES、150 mM NaCM、1 mM CaCl2、5 瓜％^^(：12及0.5%牛血清白蛋白，調整至口117.2)中實施1251 IL-13結合分析。使每孔的lxlO5個細胞與抗體混合並預先 培育15分鐘至1小時。加入0.1 nM 125I-IL-13並在4°C下將 該混合物培育4小時。由飽和結合分析、競爭分析及1251 IL- 13與細胞系結合達到平衡時125I IL-1 3輸入量之測定來 134936.doc -41 - 200902555 確定試驗中所用125I-IL-13之濃度。將樣品收集至一經1% PEI/0.5% BSA預處理之GF/C濾板上並使用Packard TopCount Scintillation計數器計數。藉由非線性回歸曲線 擬合用PRISM實施數據分析（GraphPad Software，San Diego, CA) ° 測得所有抗IL-13Ral之抗體皆會阻斷經標記IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra複合體之結合。計算得抗體LC5002-002、 LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-01 8 之 IC5〇值係介於0.09 nM至0.32 nM之間且AF152之IC5〇值係 84·8 nM(圖 3)。 實例5

HuMab對人類B細胞及單核細胞上之IL-13誘發之CD23上 調的抑制 藉由一 Ficoll Hypaque密度梯度分離末梢血單核細胞 (PBMC)。使用RPMI洗滌之後，將該等細胞懸浮於 RPMI/10% FCS中並以3xl05 PBMC/孔（體積為50微升）分佈 於96孔平底微量滴定板（Corning Incorporated Costar)中。 隨後加入最終濃度為〇·5微克/毫升（存於RPMI/10% FCS中） 之25微升抗-人類CD40抗體（Immunotech)及最終濃度為10 微克/毫升（存於RPMI/100/。FCS中）之25微升抗-人類 IgA+IgG+IgM抗體（Immunoresearch)。然後加入經連續稀 釋之HuMab及對照抗體（50微升/孔；存於RPMI/10% FCS中 之稀釋液）並在培養箱（37°C ; 5% C02)中培育該等細胞30 分鐘。隨後加入最終濃度為0.67毫微克/毫升之重組人類 134936.doc •42· 200902555 IL-13(R&D Systems)(50 微升/孔）並在 37°C/5% C02 下培育 該等細胞72小時。經此培育後，離心該等滴定板並抽吸出 培養基。為分離黏壁細胞，加入200微升Accutase(PAA)並 在3 7°C，5% C02下培育該等細胞約5分鐘。藉由重複沖洗 分離該等細胞並轉移至一圓底滴定板中。離心並抽吸出上 清液以後，使用一抗-CD23-PE抗體、抗-CD20-FITC抗體 及抗-CD14-APC抗體（全部皆來自BD Biosciences Pharmingen，San Diego, CA)之200微升混合物培育該等細 胞。於4°C下，培育此等細胞30分鐘，隨後離心並抽吸出 上清液。重複此洗滌步驟一次且最後將該等細胞重新懸浮 於200微升PBS/0.1%人類血清白蛋白中並使用CellQuest軟 體在一 FACS Calibur 流式細胞儀（BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)中分析。在大多數情況下，獲 得10,000個事件並使用一光散射儀閘道對其進行門控以便 僅包括成活淋巴細胞及單核細胞。使用一針對B淋巴細胞 之CD19陽性簇或一針對單核細胞之CD14陽性簇來預門控 此等細胞並進一步對其進行CD23表現分析。 抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007及LC5002-018抑制B-淋巴細胞上CD 23上調之IC5〇值經 觀測係介於〇_5 nM至>70 nM之間且對於AF152該IC50係 13.6 nM。人們亦發現，對IL-13在人類單核細胞上誘發的 CD23上調之抑制具有一類似特性。在單核細胞上，抗體 LC5002- 002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007及 LC5002-018之IC5〇值係介於0.1 nM至62.8 nM之間且對於 134936.doc -43 - 200902555 AF152該 IC5。係 62.9 nM。 實例6 TF-1響應於IL-13或IL-4刺激之增殖分析 使TF-1細胞（ATCC#CRL 2003)生長於含有經ATCC修飾 之RPMI、10% FBS、lx青黴素/鏈黴素、2毫微克/毫升GM-CSF之培養基中。在分析之前1天，在無GM-CSF培養基中 培育該等細胞。使用適當濃度之抗-IL-13R(xl抗體在37°C 下培育5x103個細胞/孔1小時。隨後使用2毫微克/毫升人類 IL-13(R&D Systems, Minneapolis，MN)或 0.1毫微克/毫升人 類IL-4(R&D Systems，Minneapolis, MN)刺激該等細胞並於 37°C下培育48小時。使用0.5μ(：ί 3H-胸苷對該等細胞施加 規律刺激並在37°C下培育16至18小時。使用Perkin Elmer Filtermate 96收集器將樣品收集到經1% PEI/0.25% BSA預 處理之 GFC板上。使用一 Perkin Elmer Top count Scintillation計 數器計數該等GFC板。藉由非線性回歸曲線擬合（GraphPad Software，San Diego，CA )用 PRISM實施數據分析。 在此試驗中，抗-KLH抗體未顯示出任何抑制作用。在 此試驗中，LC5002-007亦未顯示出任何抑制作用。其他全 部抗體皆抑制該響應，但與其他抗體相比，LC5002-007以 更高之1C值抑制該響應。所測得不同抗體之IC5〇值係： 13.50 nM(AF152) 、 9.21 nM(LC5002-002) 、 3.07 nM(LC5002-003)及 0.39 nM(LC5002-005)。經發現IL-4-誘 發之TF-1細胞增殖具有一類似特性，然而，與IL-13-誘發 之響應相比，該等抗體之效能較低。IL-4-誘發之增殖之 134936.doc • 44 - 200902555 IC5〇值係 0.02 nM(抗-IL4R 抗體）、74.37 nM(AF152)且對於 抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-018，該 IC5〇 值係介於 4.68 nM 至 60 nM 之 間。 實例7 人類肺成纖維細胞馨應於IL-13之嗜伊紅趨化因子生成抑制 使用HFL-1細胞（人類肺成纖維細胞，ATCC# CCL-153)實 施此分析。以100,000個細胞/孔之密度將細胞鋪板於一 12-孔板中並在37°C下培育72小時至達到鋪滿狀態。隨後在不 含血清之培養基中使此等細胞饑餓24小時並用抗-IL-13Ral 抗體在37°C下處理1小時。在此處理之後，使用1〇毫微克/ 毫升 IL-13(R&D Systems, Minneapolis，MN)在 37°C 下刺激 細胞48小時。收集上清液並使用自R&D Systems賭得之 ELISA(目錄編號DTX00)實施嗜伊紅趨化因子測定。使用 Spectromax微量板讀數器讀出吸光率並使用PRISM (GraphPad Software，San Diego, CA )分析數據。 所測試抗體呈現不同程度之抑制嗜伊紅趨化因子釋放的 能力。除LC5002-007之外，所測試其他全部抗體皆呈現某 種程度之抑制。自3至4個不同實驗計算得到之平均IC50值 對於 AF152 為 11.5 nM 且對於抗體1^5002-002、1^5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-018 係介於 2.45 nM至19.8 nM之間。 實例8 人類支氣管平滑肌細胞中IL-13-誘發之Stat-6磷酸化之抑制 134936.doc -45- 200902555 根據製造商說明書培養人類支氣管平滑肌細胞（BSMC ; Clonetics,目錄編號CC-2576)。使細胞生長於12-孔組織培 養板中直至其達到鋪滿狀態。在不含企清之培養基中使細 胞饑餓24小時並加入不同數量的抗體。培育該等培養板1 小時且隨後使用2.5毫微克/毫升IL-13(R&D System)刺激。 培育15分鐘後，去除上清液，使用磷酸鹽緩衝液洗滌細胞 並加入100微升溶胞缓衝液。在冰上短暫超聲處理該混合 物並離心。溶胞產物用於填酸化Stat-6之西方點潰分析檢 測。將等量蛋白質上樣至一 SDS-凝膠上，電泳並轉移至一 膜上。抗-Stat-6抗體係購自 Santa Cruz Biotechnology(目 錄編號SC- 1 1 762R)並使用一過氧化物酶偶聯的二級抗 體。使用講自Amersham之ECL Plus System(目錄編號RPN 2132)實施檢測。在一Typhoon 9400成像儀中進行定量。 在此分析中，經測試之兩種HuMab(LC50002-003及 LC5002-005)皆可抑制IL-13-誘發之Stat-6磷酸化。此分析 中測得之效能與其他功能性分析之效能相類似。經計算對 於 AF152 IC50值係 18·64 nM，對於 LC5002-003 係 5·98 nM且 對於LC5002-005係 1.18 nM。 實例9 抗-hIL-13Ral HuMab可變結構域（κ-輕鏈及γΐ-重鏈）之選殖 及序列分析 藉由標準cDNA合成/PCR程序來分離編碼抗-hIL-13Ral HuMab之輕鏈可變區VL及重鏈可變區VH之核苷酸序列。使 用 GeneRacerTM套組（Invitrogen)自 lxlO6至 ΙχΙΟ7個雜交瘤細 134936.doc -46- 200902555 胞中製備總RNA。將源自雜交瘤之RNA作為用來合成第一 鏈cDNA及連接GeneRacerTM Oligo-dT引物之模板。分別用 互補於κ-輕鏈及γ 1 -重鏈恒·定區之核皆酸序列的反向輕鏈和 重鏈引物及5'-專一性GeneRacerTM引物來實施第二鏈cDNA 合成及VL與VH編碼cDNA片段之進一步PCR擴增。使用購 自 InvitrogenTM Life Technologies之 TOPOtmTA選殖套組並 以pCR4-TOPOTM作為選殖載體來選殖PCR產物。藉由使用 EcoRI消化之適宜質粒的限制性酶切圖譜來鑑別經選殖的 PCR產物且VL及VH之預期/計算DNA片段大小分別為約740 及790 bp。藉由雙鏈定序來確定經選殖PCR片段之DNA序 列。使用 GCG(Genetics Computer Group，Madison， Wisconsin)軟體包（版本 10.2)及 Vector-NTI 8(InforMax 公 司）進行總體數據處理。使用GCG模組CLUSTALW比對 DNA及蛋白質序列。使用程式GENEDOC(版本2.1)來實施 序列比對。 實例10 一抗-hIL-13Ra丨IgGl HuMab之表現質粒的構建 分別在哺乳動物細胞表現載體中組裝抗-hIL-13Ral HuMab輕鍵及重鍵編碼基因。由此可將編碼抗-hIL-13Ral HuMab輕鏈可變區（VL)及人類κ-輕鏈·)·互定區（Cl，SEQ ID NO : 1 1)之基因片段與抗-hIL-13Ral HuMab重鏈可變區 (Vh)及人類γΐ-重鍵怪定區（Chi -欽鍵-Ch2_Ch3，SEQ ID NO : 12)之基因片段連在一起。關於人類輕鏈及重鏈之核 苷酸序列的一般資訊在Kabat，E. A.，Wu, T. T.，Perry，H. 134936.doc -47- 200902555 M·，Gottesman，K. S.及 Foeller, C.，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號第 9 1-3242號中給出，其中亦給出了關於密碼子使用的資 訊。抗-hIL-13Ral HuMab κ輕鏈之轉錄單位係由以下元件 構成： • 來自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟動 子， • 一包含一 Kozak序列之合成5'-UT， •一包含信號序列内含子之鼠類免疫球蛋白重鏈信號序 列， • 經選殖之抗hIL-13Rtxl HuMab可變輕鏈cDNA，其在5'末 端排列有一唯一 BsmI限制酶切位點且在3'末端排列有一剪 接供體位點及一唯一 Notl限制酶切位點， • 人類基因組κ-基因恆定區，其包含内含子2小鼠Ig-κ增 強子[Picard，D.及 Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82]及 • 人類免疫球蛋白κ-聚腺苷酸化（"poly A")信號序列。 抗hIL-13Ral HuMab γΐ-重鏈抗體之轉錄單元由下列元件 構成： • 來自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟動 子’ • 一包含一 Kozak序列之合成5'-UT， •一包含信號序列内含子之經修飾鼠類免疫球蛋白重鏈 信號序列， • 經選殖之抗hIL-13Rtxl HuMab可變重鏈cDNA，其在5'末 134936.doc -48- 200902555 端排列有一唯一 BsmI限制酶切位點且在3'末端排列有—剪 接供體位點及一唯一 Notl限制酶切位點， •人類基因組γΐ-重鏈基因恆定區，其包含小鼠Ig μ_增強 子（Neuberger，M.S.，EMBO J· 2(1983)1373-1378)， •人類γ1_免疫球蛋白聚腺苷酸化（"poly Α")信號序列。 抗-hIL-13Rcxl HuMab κ-輕鏈及γΐ-重鏈表現質粒之功能元 件： 除抗-1111^-13尺€1111111^^1)1^輕鏈或了1-重鏈表現盒之外，此 荨質粒亦包含 •一潮黴素抗性基因 • 一 Epstein-Barr病毒（EBV)複製起始點-oriP， •來自載體pUC 1 8之複製起始點，其允許此質粒在大腸桿 菌中複製，及 •可在大腸桿菌中賦予氨苄青黴素抗性之内醯胺酶基 因。 實例11 突變（變體）抗-hIL-13Ral IgGl之表現質粒的構建 藉由使用QuickChangeTM定點誘變套組（stratagene)定點 誘變野生型表現質粒可生成編碼突變體抗_hIL_丨3Ral γ1_重 鏈之表現質粒且闡述於表1中。根據EU編號方式編碼胺基 酸[Edelman，G.M.等人，proc· Natl. Acad. Sci. USA 63(1969) 78-85 ； Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, Η. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of

Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號第 134936.doc -49- 200902555 91-3242號]° 表1 突變 說明 PVA-236 ;用 E233P 表 示之 GLPSS331 ； L234V ； L235A ； AG236; 使用人類γ2-重鏈之胺基酸序列pr〇233Val234Ala235取代人類γΐ-重鍵之 fe 基酸序列 Glll233LeU234LeU235Gly236 A327G ； A330S ； P331S 使用人類γ4-重鏈之胺基酸序列Gry327Leu328Pr〇329Ser330Ser33i 取代人類γΐ-重鍵之胺基酸序列Ala327LeU328Pr〇329Ala33〇Pr〇33i L234A ； L235A 使用胺基酸序列AIa234Ala235取代人類γΐ-重鏈之胺基酸序列 LeU234LeU23 5 實例12 重組抗-hIL-13Ral HuMab之產生 藉由瞬時轉染培養於補充有10%超低IgG FCS(Gibco)、2 mM麵胺酿胺（Gibco)、1% v/v非必需胺基酸（Gibco)及250 微克 / 毫升 G418(Roche Diagnostic GmbH，DE)之 DMEM(Gibco)中的 HEK293-EBNA 貼壁細胞（ATTC CRL-10852)來產生重組HuMab。為進行轉染，以介於3:1至6:1 之間的試劑（微升）與DNA(微克）比例使用Fugene™ 6(Roche Diagnostics GmbH，DE)轉染試劑。使用一自1:2至2:1之輕 鏈編碼質粒與重鏈編碼質粒的莫耳比自兩種不同質粒表現 免疫球蛋白輕鏈及重鏈。在轉染後第4天至第丨1天時，收 集含有HuMab之細胞培養上清液。 有關人類抗體在（例如）HEK293中重組表現之一般資訊於 Meissner，P·等人之 Biotechnol. Bioeng. 75(2001)197-203 中 給出。 實例13 134936.doc -50- 200902555 a)使用嵌合 hIL-13Ral:hFc 實施之 HuMab LC5002-003、_ 005及_〇〇7的親和力分析

為進行相互作用分析’使用Biacore 3000儀器。使用25 °C之運行及反應緩衝液HBS_P(1〇 HEPES，15〇 mM

NaC卜0.005%高分子表面活性劑p，ρΗ 7 4) β以5微升/分 鐘之流速及20微克/毫升之濃度對捕捉分子（山羊抗_人類· IgG抗體，具Fey專一性）實施20分鐘胺偶聯。以1〇微升/分 鐘之流速及1微克/毫升之濃度注射HuMab 1分鐘。藉由以 30微升/分鐘流速注射500 nM人類γ球蛋白3分鐘來達成對 游離山羊抗人類IgG、FcY的阻斷。以介於5.63 11厘至9〇 ηΜ 之間的5個濃度注射分析物（hIL_13Ral:hFc嵌合蛋白質）兩 分鐘，並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2次1〇〇 mM HC1(每次1分鐘）來完成表面再生。芯片、分析形式及注射 順序以及動力學數據示於表2中。自樣品曲線減去陰性對 照數據（例如，缓衝液曲線）以校正系統内部基線漂移及降 低干擾信號。使用BiaEvaluation版本4.01來分析感應圖譜 及計算親和力數據。藉由將動力學數據擬合於1:1 Langmuir結合模型計算動力學數據（表2)。 表2: 使用hIL-13Ra丨：hFc實施之HuMab親和力分析（基於1:1 Langmuir結合模型之數據分析） 芯片 捕捉分子 配體 分析物 ka(_l/Ms) kd(l/s) KD(M)— CM5 抗-hFey LC5002-003 hIL-13 RahhFc 2.1x1ο5 1.4xl〇·6 <6.5xl0'12 抗-hFey LC5002-005 hIL-13 RalrhFc 1.73χ105 3.12x1ο·0 1.8x10'" 134936.doc -51 - 200902555 [^15 I抗-hFq ILC5002-Q07 |hIL-13 Ral:hFc |1.19><103 [lxlO'0 |<8.4xl0'lz b)使用裂解自hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質胞外結構域之hIL-13Ral胞外結構域實施的 HuMab LC5002-003、-005 及-007 之親和力分析 使用Biacore 3000儀器進行相互作用分析。運行及反應 緩衝液係 25°C 之 HBS-P(i〇 mM HEPES，150 mM NaCl， 0,005°/〇高分子表面活性劑p，pH 7.4)。以5微升/分鐘流速 ’ 及100微克/毫升之濃度對捕獲抗體分子（抗-hFcy)實施20分 鐘胺偶聯。以10微升/分鐘之流速注射濃度為1〇微克/毫升 之HuMab達30秒。以介於1.56 nM與100 nM之間的7個濃度 注射裂解hIL-13Rctl分子（Mw40kDa)200秒並用HBS-P洗滌5 分鐘。藉由以10微克/毫升之流速注射2次100 mM HC1(每 次1分鐘）來完成表面再生。芯片、分析形式及注射順序及 動力學數據對應於下表3中之說明。藉由將動力學數據擬 合於1:1 Langmuir結合模型計算動力學數據。 134936.doc •52· 200902555 表3 怎片 捕捉分子 配體 分析物 ka(l/Ms) kd(l/s) K〇(M) C1 抗-hFcy LC5002-002 ML-13Ral 1.1 xlO6 6.5xl0'4 6.2x10-1() C1 抗-hFcy LC5002-003 hIL-13Ral 1.3xl06 5.1xl〇·4 3.9xl0'lu C1 抗-hFcy LC5002-005 hIL-13Ral 1.4xl06 3_0xl(T4 2.2xl〇·10 C1 抗-hFcy LC5002-007 hIL-13Ral 1.9x10s 8.3xl0·4 4.4xl〇·9 C1 抗，hFcy LC5002-005，突變 體L234A; L235A hIL-13Ral 1.4xl06 2.9xl0'4 2.1xl〇·10 c)使用裂解自hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質胞外結構域之hlL-13Ral的胞外結構域實施的LC5002-005之重組變體的親和 力比較分析 在此等實驗中，將對源自雜交瘤之原始IgGl之親和力與 重組變體IgG 1-Ala-Ala之親和力加以比較。對於相互作用 分析，使用Biacore 3000儀器。運行及反應緩衝液係25°C 之 HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005% 高分子表面 活性劑P, pH 7.4)。以5微升/分鐘之流速及20微克/毫升之 濃度對捕獲抗體分子（抗-hFcY)實施20分鐘胺偶聯。以10微 升/分鐘之流速注射濃度為10微克/毫升之HuMab達1分鐘。 以介於1.56 nM至200 nM之間的8個濃度注射裂解hIL-13 Ral分子（分析物）5分鐘並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2 次100 mM HC1(每次1分鐘）來完成表面再生。芯片、分析 形式及注射順序及動力學數據對應於表4中之說明。藉由 將動力學數據擬合於一二價分析物結合模型計算動力學數 據。 134936.doc -53- 200902555 表4 芯片 捕捉分子 配體 分析物 kal (1/Ms) Kd, 1/s) Ka2 il/RUs) Kd2 (1/s) Kd(M) CM5 抗-hFcy LC5002-005 hIL-13Ral 1.33x10' 3.6xl0'4 5.8xl〇·3 0.06 2.7x10』 CM5 抗-hFcY IgGl ala-ala LC5002-005 hIL-13 Ral 1.53xl05 4.2X10·4 4.1xl0_3 0.04 2.8xl0*9 實例14 藉由ELISA測試HuMab與hIL-13Ra2及hIL-4Ra之交又反 應性8 將嵌合蛋白質 hIL-13Ra2:hFc 及 hIL-4Rtx:hFc(R&D Systems，UK)溶於PBS(1微克/毫升）並藉由於4°C下培育過 夜來使其吸附於微量滴定板（NUNC Maxisorb)上。使用洗 滌緩衝液（WB = 0.9% NaCl ; 0.1% Tween® 20)洗滌該等滴定 板後，藉由添加1 〇〇微升培育緩衝液（IB =附有1% crotein C 及0.1% Tween® 20之PBS)並於室溫（RT)下培育30分鐘來封 阻非專一性結合位點。隨後添加經連續稀釋之HuMab及對 照抗體（1〇〇微升/孔；經IB稀釋之稀釋液）並於RT下培育1 小時。重新洗滌滴定板並用過氧化物酶偶聯的兔抗-人類κ 抗體（DAKO，Denmark)在一存於IB之1:500的最終稀釋液 中培育，藉此來檢測已結合抗體。於RT下培育1小時並實 施一後續洗滌步驟之後，使用即用ABTS®溶液（Roche Diagnostics GmbH，DE)於RT下在暗處顯色滴定板。在最高 濃度吸光率達到一足夠OD值後量測405奈米處吸光率。 所測試之全部抗IL-13Ral抗體皆能夠與人類IL-13Ral之 固定化胞外結構域結合，但其不能與hIL-13Ra2或hIL-4Ra 結合（圖4)。 134936.doc -54- 200902555 實例15

HuMab與鼠類IL_13Ral之交叉反應性 將嵌合蛋白質鼠類IL-13Ral:hFc(R&D Systems，UK)溶 於PBS(1微克/毫升）並藉由於4°C下培育過夜來使其吸附於 微量滴定板（NUNC Maxisorb)上。使用洗滌緩衝液 (WB = 0.9% NaCl ; 0.1% Tween® 20)洗滌該等滴定板後，藉 由添加100微升培育緩衝液（IB =附有1% Crotein C及0.1% Tween® 20之PBS)並於室溫（RT)下培育30分鐘來封阻非專 一性結合位點。隨後向該等孔（100微升/孔；經IB稀釋之稀 釋液）中添加經連續稀釋之HuMab及對照抗體（HuMab抗-KLH抗體及多株山羊抗-hIL-13Ral抗體（R&D Systems))並 於RT下培育1小時。重新洗滌滴定板並用過氧化物酶偶聯 的兔抗-人類κ抗體（DAKO，Denmark)在一存於IB之1:500 的最終稀釋液中培育，藉此來檢測已結合之人類抗體。藉 由過氧化物酶偶聯的驢抗-山羊IgG抗體（Santa Cruz ;存於 IB之1:1000稀釋液）檢測已結合至該等滴定板之山羊抗-hIL- 13Ral抗體。於RT下培育1小時並實施一後續洗滌步 驟之後，於RT下使用即用ABTS®溶液（Roche Diagnostics GmbH，DE)在暗處顯色滴定板。在最高濃度吸光率達到足 夠OD值後量測405奈米處吸光率（圖5)。 實例16

HuMab與獼猴IL-13Ral之交叉反應性 藉由RT-PCR自獼猴組織分離編碼IL-13Ral之基因並轉 染至鼠類細胞系Ba/F3中。為測試HuMab是否會與獮猴IL- 134936.doc -55· 200902555 13Ral交叉反應，使用10微克/毫升HuMab及對照抗體培育 經穩定轉染之Ba/F3細胞以及親代Ba/F3細胞。使用一多株 山羊·抗人類hIL-13Ral抗體（R&D Systems)作為陽性對 照。所加入陰性對照係：一人類IgGl骨髓瘤蛋白（Nordic) 及正常山羊血清。藉由FACS分析使用一直接針對與FITC 偶聯之人類IgG的抗體（用以檢測HuMab)及一直接針對與 FITC偶聯之山羊IgG的抗體（用以檢測山羊抗體）檢測已結 合抗體。對在經轉染之Ba/F3細胞系與母體細胞系上測試 r 之各個抗體之平均螢光強度（MFI)加以比較。 本發明之全部HuMab皆能夠與經轉染Ba/F3細胞中表現 之獼猴IL-13Ral相結合。如根據人類和獼猴IL-13Ral之間 的近源性所預計的，多株AF152抗體亦可與獼猴IL-13Ral 結合。當用經轉染之Ba/F3細胞系測試時，陰性對照抗體 僅顯示MFI之少量增加（表5)。 表5 抗體 MFI Ba/F3 MFIBa/F3 Cyno IL-13Ral 一 存在 Cyno_IL-13Ral 時， MFI之增加倍數 HuMab LC5002-002 3.9 83.7 79.8 LC5002-003 3.4 82.4 79.0 LC5002-005 14.8 101.5 86.7 LC5002-007 4.1 19 14.9 對照 AF152 3.2 21.2 18.0 正常山羊IgG 3.3 5.7 2.4 正常人類 IgGl (Nordic) 3.5 10.2 6.7 134936.doc -56- 200902555 僅有抗-人類 IgG-FITC 3.3 5.5 2.2 實例17 IL_13Ral HuMab與Fey受體之結合（結合NK細胞上 FcyRIIIa) 為測定本發明抗體結合天然殺傷（NK)細胞上 FcyRIIIa(CD16)之能力，分離末稍血單核細胞（PBMC)，並 在存在或不存在20微克/毫升針對FqRllla之封阻小鼠抗體 (抗- CD16 ’ 選殖 3G8，RDI，Flanders，NJ)下與 20 微克 / 毫 升HuMab抗體及對照抗體一起培育以驗證經由FcyRIIIa之 結合。將不結合FcyRIIIa之人類IgG2及IgG4(The Binding Site)用作陰性對照。將人類IgGl及IgG3(The Binding Site) 用作FcyRIIIa結合之陽性對照。藉由FACS分析使用經PE標 記之小鼠抗人類CD56(NK-細胞表面標記物）抗體（BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)以及一經FITC標 記之山羊F(ab)2抗人類IgG(Fc)抗體（Protos immunoresearch，Burlingame，CA)來檢測已結合於 NK 細 胞上之抗體。測定所測試HuMab在20微克/毫升（Bmax:MFI 土st.dev)下之最大結合。 如由 580.6±245.8 之 Bmax(MFI)值所顯示，LC5002-005 能 夠有效結合FcyRIIIa(與對照IgGl抗體相當）。添加一針對 FcyRIIIa之阻斷抗體顯著降低LC5002-005與NK細胞之結 合，（Bmax(MFI)值為260.4士95.90)表明可特異結合 FcyRIIIa。 134936.doc -57· 200902555 【參考文獻列表】

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Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 WO 87/05330 WO 92/22645 WO 92/03918 WO 93/1227 WO 94/25585 WO 96/29417 WO 97/15663 WO 98/24884 WO 01/14424 WO 03/080675 134936.doc -60- 200902555 [序列表說明] SEQ ID NO : 1 HuMab LC5002-002之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 2 HuMab LC5002-002之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 3 HuMab LC5002-003之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 4 HuMab LC5002-003之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 5 HuMab LC5002-005之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 6 HuMab LC5002-005之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 7 HuMab LC5002-007之重鏈可變結構域 SEQ ID N〇：8 HuMab LC5002-007之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO ·· 9 HuMab LC5002-018之重鏈可變結構域 SEQIDNO: 10 HuMab LC5002-018之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO ： 11 κ輕鏈恆定區 SEQ ID NO ： 12 γΐ重鏈恆定區 【圖式簡單說明】 圖1展示抗-IL-13Ral抗體與固定化重組人類IL-13Ral多 肽之結合。包括多株兔-抗-人類IL-13Ral抗體AF152(R&D 系統）及作為一陰性對照HuMab之抗-KLH抗體。 圖2展示抗-IL-13Ral抗體對IL-13與固定化IL-13Ral/ IL-4Ra受體之結合的抑制。 圖3展示抗-IL-13Ral抗體對IL-13與CHO細胞（表現IL-13Ral及IL-4Ra2)之結合的阻斷。包括一作為一陽性對照 之市售多株抗-IL-13Ral 抗體（AF152，R&D Systems, Minneapolis，MN)。 圖4展示抗-IL-13Ral抗體與hIL-13Ral之結合及其與功能 134936.doc -61 - 200902555 相關受體hIL-13Ra2及hIL-4Ra之結合性質。 圖5展示抗-IL-13Ral抗體結合固定化重組鼠類IL-13Ral 多肽之能力。包括多株山羊-抗-人類IL-13Ral抗體AF152 (R&D系統）及作為一陰性對照HuMab之抗-KLH抗體。 134936.doc •62-

Claims (1)

1. 200902555 十、申請專利範圍： 1. 一種抗體，其特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序列 CDR3係選自由seQ ID NO : 1、3、7或9之重鏈CDR3序 列組成之群。 2. 如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體之可變重鏈胺基 ^ 酸序列CDR1及CDR2係選自由SEQ ID NO : 1、3、7或9 之重鏈CDR1及CDR2序列組成之群。 3. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於該抗體之可變輕鏈胺 气 基酸序列CDR1、CDR2及CDR3係選自由SEQ ID NO : 2、4、8或1〇之可變輕鏈胺基酸序列CDR1、CDR2及 CDR3組成之群。 4，如凊求項1或2之抗體’其特徵在於包含一包括下列之人 類γ 1 -重鏈： a) 缺失Glyu6之胺基酸序列Pr〇233Vai234Ala235及/或胺基 酸序列 Gly327Leu328Pro329Ser33〇Ser331， b) 胺基酸序列Ala>234Ala235，或 、，： c)胺基酸 Ala265及 Ala297。 如β求項1或2之抗體’其特徵在於其係一人類抗體。 6. 如請求項之抗體，其特徵在於其與IL_13Ral結合之 親和力係1〇-9 M(KD)或更低。 7. 如請求項6之抗體，其特徵在於其與IL_13R〇a結合之親和 力係1 0_9至I 〇-丨3 Μ。 士 μ求項1或2之抗體，其特徵在於包括作為重鏈可變區 之SEQ id NO : 1及作為輕鏈可變區之SEq ID Ν〇 : 2、 134936.doc 200902555 作為重鏈可變區之SEQ ID NO: 3及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 4、作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作 為輕鏈可變區之SEQ ID NO: 8或作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 1〇。 9_如請求項1或2之抗體，其特徵在於包括： a) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 1、作為輕鏈可變區 之SEQ ID NO : 2、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變1234八及 L235A或 D265A及 Ν297Α之 SEQ ID NO : 12 ’ b) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 3及作為輕鏈可變區 之SEQ ID NO : 4、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及 L235A或 D265A及 N297A之 SEQ ID NO : 12， c) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作為輕鏈可變區 之SEQ ID NO : 8、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γΐ重鍵丨亙定區之視情沉具有犬變L234A及 L235A或 D265A及 Ν297Α之 SEQ ID NO : 12 ’ 或 d) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作為輕鏈可變區 之SEQ ID NO : 10、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γ 1重鏈恆定區之視情況具有突變L234A 及L235A或D265A及N297A之SEQIDNO:12° 10. —種如請求項1至9中任一項之抗體於製備醫藥組合物的 用途。 11. 一種醫藥組合物，其包括醫藥有效量之如請求項1至9中 134936.doc 200902555 任一項之抗體。 12, 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19, 種重組宿主細胞’其可產生如請求項1至9中任一項之 重組抗體。 一種製備醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包括醫藥有 效量之如請求項1至9中任一項之抗體。 一種核酸，其可編碼能夠分別與如下所定義的另一抗體 鏈組裝在一起之多肽，而該多肽係如下兩者之一： a) 包括SEQ ID NO : 1、3、7或9之重鏈CDR的抗體重 鏈； b) 一包括SEQ ID NO : 2、4、8或1〇之輕鏈CDR的抗體 輕鏈， 其中該等CDR可相互獨立地加以選擇。 一種表現載體，其包含如請求項14之核酸，能夠在原核 或真核宿主細胞中表現該核酸。 一種原核或真核宿主細胞，其包含如請求項15之載體。 一種製備結合IL-13Ral且抑制IL-13與IL-13Ral結合之多 肽的方法，其特徵在於在一原核或真核宿主細胞中表現 如睛求項14之編碼一重鏈之核酸及編碼—輕鏈之核酸， 並自該細胞回收該多肽。 —種如請求項1至9中任一項之抗體於製備用於治療有治 療哮喘或抗過敏需要之患者之藥物的用途。 —種製備醫藥組合物之方法，其特徵在於藉由重組表現 方法產生如請求項丨至9中任一項之抗體，回收該抗體並 使該抗體與醫藥上可接受之緩衝劑及/或佐劑相組合。 134936.doc