KR100934894B1

KR100934894B1 - Ｉｌ-13 수용체 알파1 에 대한 항체 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR100934894B1
Application number: KR1020077015296A
Authority: KR
Inventors: 요제프 엔들; 마리아 푸엔테스; 이보 그라우스; 아델베르트 그로스만; 제바슈티안 노이만; 파울 파렌; 프랑크 레버스; 요에르크 레굴라; 랄프 슈마허; 슈테판 제버; 얀 슈트라케; 카이-구나 슈투벤라우흐; 데 빙켈 얀 판; 푸트 마르티네 판; 잔드라 페레켄-페르플뢰겐
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2005-01-03
Filing date: 2006-01-02
Publication date: 2010-01-07
Also published as: AU2006204480A1; CA2592614A1; TWI306862B; WO2006072564A1; US7807158B2; BRPI0606368A2; NZ556126A; EP1836226B1; CR9209A; HK1112006A1; RU2413736C2; US20060263356A1; AR051888A1; AU2006204480B2; KR20070091180A; TW200635945A; NO20073655L; RU2007129676A; MA29226B1; CA2592614C

Abstract

IL-13Rα1 에 결합하여 IL-13 생체활성을 저해하고 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 항체로서, 상기 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열 CDR3 이 서열번호: 1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR3 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체가 천식 및 알레르기성 질환의 치료에 유용하다.

IL-13, IL-4Rα, 항체, 천식, 알레르기성 질환

Description

ＩＬ-13 수용체 알파1 에 대한 항체 및 이들의 용도 {ANTIBODIES AGAINST IL-13 RECEPTOR ALPHA1 AND USES THEREOF}

본 발명은 IL-13 수용체 알파1 (IL-13Rα(알파)1) 에 대한 인간 항체, 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

IL-13 은 주로 Th2 세포에 의해 생성되나 비만 세포 및 NK 세포에서도 생성되는 분비되는 단량체성 펩티드이다. IL-13 의 생물학적 기능으로는, IgE 생성의 조절 및 Th2 발달의 조정을 들 수 있다. IL-13 은 IL-13 수용체 알파1 (IL-13Rα1) 사슬 및 IL-4 수용체 알파 (IL-4Rα) 사슬로 이루어진 수용체 복합체에 결합한다. IL-13 결합은 주로 STAT6 을 통해 신호전달을 일으킨다. IL-13 은 IL-13 Rα1 에 단독으로 낮은 친화력으로 결합하며 IL-4Rα1 에는 결합하지 않는다. 이와 반대로, IL-4 는 IL-4Rα에 단독으로 결합하고 IL-13Rα1 에는 단독으로 결합하지 않는다. IL-13 에 대한 또 다른 수용체가 기재되었는데, 바로 IL-13Rα2 이다. IL-13 은 이 수용체에 높은 친화력으로 결합한다. 이 수용체는 유인 (decoy) 수용체로 작용하는 듯하다.

유전자도입 (transgenic) 마우스에서 IL-13 을 유도성 과발현시키면, 천식 환자들의 특성을 많이 가진 표현형이 나타난다. 이들은 점액성 화생 (mucus metaplasia), 대식세포, 림프구 및 호산구-풍부 염증, MMP-9, -12, -13, -2 및 -14, 카텝신 B, H, K 및 S 와 같은 프로테아제들의 상향조절을 나타내며, 이들은 또한 상피하 섬유증 (subepithelial fibrosis) 을 나타낸다. IL-13 에 대한 녹아웃 (Knockout) 마우스에서는 Th2 발달의 장애로 인해 Th2 시토카인 제조가 현저히 감소된 것으로 나타난다. 이들 마우스에서는 호산구 염증의 존재에도 불구하고 기도 과민성 (airway hyperreactivity, AHR) 이 발달하지 않는다. AHR 은 IL-13 의 투여로 회복되었는데, 이는 IL-13 이 마우스에서의 AHR 의 유도에 필수적이고 충분한 것임을 나타낸다. 천식과 관련한 IL-13 의 기타 중요한 생물학적 기능으로는 배상 세포 화생 및 점액 생성의 유도가 있다. 이는 기도 상피 세포, 섬유아세포 및 기도 평활근 세포에 직접 작용하여, 상기 세포 형태들 각각에서 상이한 전사 프로그램을 유도한다. 흥미롭게도, IL-13 은 평활근 세포에서 알파-아드레날린 반응을 감소시켜, 기도 협착에 기여한다. IL-13 프로모터 다형성은 알레르기성 천식의 위험성 증가와 관련되어 있다. IL-13 유전자에 있어서의 다형성은 고수준의 혈청 IgE 와 관련된다. IL-4 및 IL-13 유전자들 간의 유전자간 (intergene) 서열에서의 단일 뉴클레오티드 다형성은 아토피성 천식과 관련된다.

IL-13 길항제가 동물 모델들에서 이용되어 왔다. 예를 들어 가용성 마우스 IL-13Rα2-IgGFc 융합 단백질은 난백알부민-유도성 AHR 및 점액 함유 세포의 수를 완전히 역전시키는데 효능을 나타내도록 사용되었다. 표현형이 완전히 발달한 후에 치료하더라도 상기 역전이 획득되었다. 또한, 마우스를 IL-13 융합 세 포독소 분자로 처치한 결과, 진균-유도성 만성 알레르기성 염증에서의 기도 질환의 모든 특징이 감소되었다. 결론적으로, IL-13 은 알레르기성 반응의 효과기 팔의 중요한 매개체이다.

IL-13Rα1 은 조혈소 (hemapoietin) 수용체 수퍼패밀리 (1 형 시토카인 수용체 패밀리) 의 일원으로서, Obiri N. I., 등에 의해 동정되어, 문헌 [J. Biol. Chem., 270 (1995) 8797-8804)] 및 WO 96/29417 에 기재되었다. 이는 신호 서열을 포함하는 427 개 아미노산의 단백질이다. 이의 DNA 및 단백질 서열은 WO 97/15663 및 SwissProt No. P78552 에 기재되어 있다. IL-13Rα1 은 IL-13 에 낮은 친화력으로 결합하는 글리코실화 단백질이나, IL-4Rα와 함께 이형이량체 (heterodimer) 로 연결될 때, 이는 IL-13 에 높은 친화력으로 결합한다. 상기 복합체는 또한 IL-4 에 대한 수용체이다.

IL-13Rα1 에 대한 항체들은 WO 96/29417, WO 97/15663, WO 03/080675, 문헌 [Graber P., 등, Eur. J. Immunol., 28 (1998) 4286-4298]; 문헌 [Poudrier J., 등, J. Immunol., 163 (1999) 1153-1161]; 문헌 [Poudrier J., 등, Eur. J. Immunol., 30 (2000) 3157-3164]; 문헌 [Aikawa M., 등, Cytokine, 13 (2001) 75-84] 로부터 공지되어 있다. IL-13Rα1 에 대한 항체들은 R&D Systems Inc. (USA) 로부터 시중에서 구매가능하다.

발명의 개요

본 발명은, IL-13Rα1 에 결합하여 IL-13 생체활성을 저해하는 항체로서 이의 가변 중쇄 아미노산 서열 CDR3 이 서열번호: 1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR3 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다.

상기 항체는 바람직하게는 인간 항체이다.

상기 항체는 바람직하게는 IL-13Rα1 에의 결합에 대한 친화력이 10^-9 M (K_D) 이하, 바람직하게는 10^-9 내지 10^-13 M 인 것을 특징으로 한다.

바람직하게는 상기 항체는 그의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 서열번호: 1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 항체는 바람직하게는 그의 가변 경쇄 아미노산 서열들인 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 서열번호: 2, 4, 6, 8 또는 10 의 경쇄 CDR 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 항체는 바람직하게는 그의 가변 중쇄 아미노산 서열들인 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 서열번호: 1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR 서열들로 이루어진 군에서 선택되고 그의 가변 경쇄 아미노산 서열들인 CDR1, CDR2 및 CDR3 이 서열번호: 2, 4, 6, 8 또는 10 의 경쇄 CDR 서열들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 CDR 서열들은 바람직하게는 서로 독립적으로 선택되고, FR (framework, 골격) 영역에 의해 분리된다.

상기 항체는 바람직하게는 중쇄 CDR 로서 서열번호: 1 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 서열번호: 2 의 CDR 을, 중쇄 CDR 로서 서열번호: 3 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 서열번호: 4 의 CDR 을, 중쇄 CDR 로서 서열번호: 5 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 서열번호: 6 의 CDR 을, 중쇄 CDR 로서 서열번호: 7 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 서열번호: 8 의 CDR 을, 또는 중쇄 CDR 로서 서열번호: 9 의 CDR 및 경쇄 CDR 로서 서열번호: 10 의 CDR 을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 CDR 서열들은 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정될 수 있다. 이를 기초로, 서열번호: 1-8 의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR) 은 하기 서열들을 갖는다:

중쇄 CDR: 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 의 CDR1 (aa 31-35), 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9 의 CDR2 (aa 50-66), 서열번호: 1, 3, 9 의 CDR3 (aa 99-108), 서열번호: 5 의 CDR3 (aa 99-107), 서열번호: 7 의 CDR3 (aa 99-112);

경쇄 CDR: 서열번호: 2, 4, 6, 10 의 CDR1 (aa 24-34), 서열번호: 8 의 CDR1 (aa 24-35), 서열번호: 2, 4, 6, 10 의 CDR2 (aa 50-56), 서열번호:8 의 CDR2 (aa 51-57) 및 서열번호: 2, 4, 6, 10 의 CDR3 (aa 89-97), 서열번호: 8 의 CDR3 (aa 90-97).

바람직하게는, 본 발명은 상보성 결정 영역 (CDR) 으로서 하기 서열들을 포함하는 항체를 제공한다:

a) 서열번호:1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR 을 포함하는 항체 중쇄;

b) 서열번호:2, 4, 6, 8 또는 10 의 경쇄 CDR 을 포함하는 항체 경쇄;

이 때, CDR 들은 서로 독립적으로 선택됨.

상기 항체는 바람직하게는 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 1 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 2 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 3 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 4 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 5 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 6 을, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 7 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 8 을, 또는 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 9 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 10 을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 항체는 바람직하게는 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

a) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 1, 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 2, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

b) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 3 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 4, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

c) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 5 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 6, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

d) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 7 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 8, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12, 또는

e) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 9 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 10, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12.

바람직하게는 상기 항체는 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및/또는 LC5002-018 과 경쟁하여 IL-13Rα1 에 결합하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 항체는 가변 영역으로서 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 또는 LC5002-018 의 가변 영역들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이들 항체들의 가변 영역은 서열번호: 1-10 에 나타나 있다. 유용한 불변 영역은 당업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있다. 이의 예는 서열번호: 11-12 에 나타나 있다.

상기 항체는 바람직하게는 단일클론 또는 재조합으로 제조된 항체이다.

본 발명의 한 가지 구현예에서 상기 항체는 클래스-변경 인간 항체이다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서 상기 항체는 하기를 포함하는 인간 γ1 중쇄를 포함한다:

a) Gly₂₃₆ 이 결실된 아미노산 서열 Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅ 및/또는 아미노산 서열 Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁,

b) 아미노산 서열 Ala₂₃₄Ala₂₃₅ 또는

c) 아미노산 Ala₂₆₅ 및 Ala₂₉₇.

바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 6 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 IL-13 유도성의 Stat-6 인산화를 저해하며, 20 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 IL-13 유도성의 이오탁신 (eotaxin) 생성을 저해하고/저해하거나 10 nM 이하 (IL-13) 및 60 nM 이하 (IL-4) 의 IC₅₀ 값으로 IL-13 또는 IL-4 유도성의 세포 증식, 바람직하게는 TF-1 세포 (ATCC CRL 2003) 의 증식을 저해한다. IL-13 유도성의 Stat-6 인산화, 이오탁신 생성 및 세포 증식의 유도는 실시예 6 내지 8 에 따라 측정된다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 변성된 IL-13Rα1 에 결합하지 않는다(결합 친화력에 대한 K_D 가 10^-6 M 이상임). 상기 항체는 바람직하게는 IL-13Rα2 및 IL-4Rα 와는 교차반응성을 실질적으로 나타내지 않는 것을 특징으로 한다(결합 친화력에 대한 K_D 가 10^-6 M 이상임).

본 발명은 또한 IL-13Rα1 에 대한 길항제성 단일클론 항체들을 생성하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명에 따른 바람직한 하이브리도마 세포주들 (hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-002 (DSM ACC2709), hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-003 (DSM ACC2710), hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-005 (DSM ACC2711), hu-MAB<h-IL-13R alpha>LC.5002-007 (DSM ACC2712)) 은 2005년 01월 13일자로 독일 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 에 기탁되었다.

상기 세포주들로부터 수득가능한 항체들이 본 발명의 구현예들이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체들을 이루는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함한 발현 벡터, 및 이러한 항체들의 재조합 제조를 위한 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체들의 재조합 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 핵산으로 인코딩되는 폴리펩티드는 하기이다:

a) 서열번호: NO:1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR 들을 포함하는 항체 중쇄 및

b) 서열번호: 2, 4, 6, 8 또는 10 의 경쇄 CDR 들을 포함하는 항체 경쇄.

이들 폴리펩티드는 각자 다른 항체 사슬과 함께 회합하여 항체를 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 항체들은 코르티코스테로이드 요법을 필요로 하는 환자들에 대하여 유익을 나타낸다. 본 발명에 따른 항체들은 천식 또는 알레르기성 질환을 앓는 환자에 유익을 가져다 주는 새롭고 독창적인 특성들을 갖는다.

본 발명은 또한 천식 및 알레르기성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 천식 치료 및 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체를, 임의로는 약학 용도를 위한 항체 제형물에 유용한 완충액 및/또는 어주번트 (adjuvant) 와 함께, 약학적으로 유효한 양으로 포함하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 이러한 항체들을 약학적으로 허용가능한 담체 중에 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 상기 약학 조성물은 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현할 수 있는, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현시키고 상기 세포로부터 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 상기와 같은 재조합 방법으로 수득가능한 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 항체가 부재하는 상기와 같은 검정과 비교하여 IL-13Rα1 에 대한 복수의 항체들로부터 IL-13Rα1 에 대한 항체를 선별하고, 재조합 발현에 의해 상기 항체를 생성시키고, 상기 항체를 회수한 후, 상기 항체를 약학상 허용가능한 완충액 및/또는 어주번트와 배합하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다. 바람직하게는 상기 항체는 상기 언급한 추가적인 특징 중 하나 이상을 갖는다.

발명의 상세한 설명

용어 "IL-13Rα1, 쥣과(科)의 IL-13Rα1, IL-13, IL-13Rα2 및 IL-4Rα" 및 이들의 도메인들은 당업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있는 것들이며, 예컨대, SwissProt P78552, O09030, P35225, Q14627 및 P24394 에 의해 정의되어 있다. 다른 언급이 없는 한, "IL-13Rα1, IL-13, IL-13Rα2 및 IL-4Rα"라는 용어들은 따라서 인간 폴리펩티드들인 IL-13Rα1, IL-13, IL-13Rα2 및 IL-4Rα를 나타낸다.

본원에 사용된 "인간 항체" 라는 용어에는, 규명된 인간 배선 (germ line) 면역글로불린 서열들에 대한 서열 유사성 또는 동일성이 높아 이들 배선 서열들에 해당될 수 있는 가변 및 불변 영역들 (도메인들) 을 가진 항체가 포함된다. 인간 항체는 당업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있다(van Dijk, M.A. 및 van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화시에 내인성 면역글로불린 제조의 부재 하에 전체 레퍼토리의 또는 선별된 인간 항체를 생성할 수 있는 유전자도입 동물 (예컨대, 마우스) 에서 제조될 수도 있다. 이러한 배선 돌연변이 마우스에 인간 배선 면역글로불린 유전자 배열을 이동시키면 항원 투여시 인간 항체가 제조된다(참조: 예컨대, Jakobovits, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., 등, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., 등, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). 인간 항체는 또한 파아지 발현 라이브러리에서도 제조될 수 있다(Hoogenboom, H.R., 및 Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., 등, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole 등 및 Boerner 등의 방법들 또한 인간 단일클론 항체의 제조에 이용가능하다(Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., 등, J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 인간 항체로는 본 발명에 따른 특징적 특성들이 보유되는 한 다양한 형태의 항체, 바람직하게는 단일클론 항체가 포함되는데, 여기에는 이들에 제한되는 것은 아니나 전체 항체, 항체 단편, 클래스-변경 항체 및 유전자 조작된 항체 (변형 또는 변이 항체) 가 포함된다. 특히 바람직한 것은 재조합 인간 항체이다. 본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 모두 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 분자들의 조제물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는, 재조합 방법으로 제조, 발현, 생성 또는 분리한 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도되었는데, 예컨대, 상기와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대하여 유전자도입된 동물 (예컨대, 마우스) 또는 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 분리한 항체가 있다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태의 가변 및 불변 영역을 갖고 있다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체들은 생체내 체세포 과변이되었다. 즉, 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은 규명된 인간 배선 VH 및 VL 서열에 해당될 수 있는, 그러나 생체내에서 천연적으로는 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 존재하지 않을 수 있는 서열들이다.

용어 "클래스-변경 항체"는 하나의 원천 또는 배선으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 보통 재조합 DNA 기술로 제조된, 상이한 원천 또는 배선으로부터의 항체의 불변 영역과 매치되는 한 부분 이상의 불변 영역을 포함하는 단일클론 항체, 바람직하게는 인간 항체를 지칭한다. 이러한 클래스-변경 항체는 천연적으로 발생하는 것이 아니며, 따라서 이종이식 (xenograft) 마우스로부터 직접 입수가능하지 않다. 본 발명에 포함되는 "클래스-변경 항체"의 형태는 그의 불변 영역이 야생형 불변 영역 서열과는 다른 것들로서, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합의 관점에서, 즉 Fc 의 변화 또는 돌연변이에 의해 본 발명에 따른 상이한 특성들을 갖는 항체를 생성하는 것들이다. 클래스-변경 항체는 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 절편 및 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 클래스-변경 항체의 제조 방법에는, 당업계에 잘 알려진 통상의 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 방법이 관련된다(참조: 예컨대, Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238 및 5,204,244).

본원에 사용된 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항체의 항원에의 결합에 직접 연루된 경쇄 및 중쇄 쌍의 각 부분을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인들은 일반적 구조가 동일하며, 각 도메인은 서열이 광범위하게 보존된 4 개의 골격 (FR) 영역 및 이들을 연결하는 3 개의 "과가변 (hypervariable) 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 을 포함한다. 상기 골격 영역은 β(베타)-시트 형태를 취하며, 상기 CDR 들은 β-시트 구조를 연결하는 루프 (loop) 를 형성할 수 있다. 각 사슬 내의 CDR 은 상기 골격 영역에 의해 그의 3차원 구조를 유지하며, 나머지 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역, 바람직하게는 중쇄 CDR3 는 본 발명에 따른 항체들의 결합 특이성/친화력에 있어서 특히 중요한 역할을 하며, 따라서 본 발명의 또 다른 목적을 제공한다.

"과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분"이라는 용어들은 본원에서 사용될 때 항원-결합을 일으키는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기들을 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 여기서 정의된 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. CDR 및 FR 영역은 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.

"불변 도메인"은 항체의 항원에의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스들로 나뉘며, 이들 중 몇몇은, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2 와 같은 하위클래스 (아형(isotype)) 로 더 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린들에 대응하는 중쇄 불변 영역들은 각각 μ, δ, γ, α 및 ε 으로 불린다. 본 발명에 따른 항체들은 바람직하게는 IgG1 형이다.

항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접 관여한다. C1q 에의 결합은 Fc 부분 내의 한정된 결합 부위에 의해 유발된다. 이러한 결합 부위는 당업계의 기술 수준에서 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌 [Lukas, T.J., 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560]; [Brunhouse, R., 및 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917]; [Burton, D.R., 등, Nature 288 (1980) 338-344]; [Thommesen, J.E., 등, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004]; [Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]; [Hezareh, M., 등, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168]; [Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 0 307 434 에 기재되어 있다. 이러한 결합 부위는 예컨대, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 지표에 따라 번호부여함, 하기 참조) 이다. 하위클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체들은 보통 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4 항체는 보체 시스템을 활성화하지 않고, C1q 를 결합시키지 않고, C3 를 활성화하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "인간 기원에서 유래한 Fc 부분"은 바람직하게는 C1q 결합, C3 활성화 및/또는 FcR 결합을 전혀 검출할 수 없거나 또는 결합이 인간 IgG1 항체와 비교하여 적어도 50%, 바람직하게는 70% 감소되도록 변형된, 하위클래스 IgG1 의 인간 항체의 Fc 부분의 아미노산 서열을 가진 Fc 부분을 나타낸다. "항체의 Fc 부분"은 항체에 대한 파파인 절단을 기초로 정의된, 당업계의 숙련된 자들에게는 잘 알려진 용어이다. 본 발명에 따른 항체들은 Fc 부분으로서 바람직하게는 인간 기원 유래의 Fc 부분의 아미노산 서열 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 기타 모든 부분들을 포함한다. 바람직하게는 상기 Fc 부분은 인간 IgG1 하위클래스로부터의 돌연변이된 인간 Fc 부분이다. 가장 바람직한 것은 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 가진 γ1-중쇄 불변 영역 (예는 서열번호: 11 에 나타나 있음) 을 포함한 Fc 부분들이다(WO99/51642).

인간 불변 사슬, 예컨대, γ1-중쇄는 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및 [Bruggemann, M., 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361]; [Love, T.W., 등, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527] 에 상세히 기재되어 있다. 본 발명에서 바람직한 불변 도메인은 보체 결합을 제공하지 않는다. 본원에 사용된 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항체의 항원에의 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄 쌍 각각을 나타낸다.

본원에 사용된 핵산 또는 핵산 분자라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된 것이다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으나, 이중가닥 DNA 가 바람직하다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전구서열 (presequence) 또는 분비 선도자 (secretory leader) 에 대한 DNA 가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질 (preprotein) 로 발현되는 경우, 이는 상기 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면 상기 프로모터 또는 인핸서는 상기 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치된 경우 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결되었다"는 것은 연결된 DNA 서열들이 시스(cis)이고, 분비 선도자의 경우 인접해 있고 해독틀 (reading frame) 내에 있는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 편리한 제한효소 부위에서의 결찰에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (adaptor) 또는 링커 (linker) 를 관행에 따라 사용한다.

본원에 사용된 "세포," "세포주," 및 "세포 배양물"이라는 표현들은 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 모든 표기들에는 자손 (progeny) 이 포함된다. 즉, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어들에는 주된 대상 세포 및 이로부터 유래한 배양물 (계대의 횟수와는 무관함) 이 포함된다. 또한, 모든 자손은 인위적이거나 또는 의도하지 않은 돌연변이들로 인하여 DNA 내용물이 정확히 동일하지 않을 수 있음을 이해하여야 한다. 최초의 형질전환된 세포에서 탐색된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변형 자손이 포함된다. 다른 지정이 의도된 경우, 이는 문맥에서 명백할 것이다.

본원에서 사용된 "IL-13Rα1 에의 결합"이라는 용어는 시험관내 검정에서의, 바람직하게는 상기 항체를 표면에 결합시키고 Surface Plasmon Resonance (SPR) 에 의해 IL-13Rα1 의 결합을 측정하는 결합 검정에서의 상기 항체의 IL-13Rα1 에의 결합을 의미한다. 결합은 10^-8 M 이하, 바람직하게는 10^-13 내지 10^-9 M 의 결합 친화력 (K_D) 을 의미한다. "결합 없음"은 10^-6 M 이상의 K_D 를 의미한다. 본 발명에 따른 항체들은 인간 IL-13Rα1 및 또한 바람직하게는 마우스 IL-13Rα1 의 세포외 도메인에 결합한다.

IL-13Rα1 에의 결합은 BIAcore 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, 스웨덴) 으로 조사할 수 있다. 결합 친화력은 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), kd (해리 속도) 및 K_D (kd/ka) 라는 용어들로 정의된다.

IL-13 의 IL-13Rα1 에의 결합은 본 발명에 따른 항체들에 의해 저해된다. 상기 저해는 IL-13 의 IL-13Rα1/IL-4Rα 이형이량체에의 결합에 대한 ELISA 에서의 IC₅₀ 으로서 측정된다. 이러한 검정을 수행하기 위해서, IL-13Rα1 을 고정시키고, IL-13 및 IL-4Rα 를 첨가한다. IL-13 의 IL-13Rα1 에의 결합에 대한 본 발명에 따른 항체들의 IC₅₀ 값은 6 nM 이하이다. IC₅₀ 값은 3 개 이상의 독립적 측정의 평균 또는 중앙값으로 측정된다. 단일 IC₅₀ 값들은 범위 밖에 있을 수 있다.

본 발명에 따른 항체들은 바람직하게는 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 또는 LC5002-018 로 이루어진 군에서 선택되는 항체와 동일한 IL-13Rα1 상의 에피토프에의 결합을 나타내거나 또는 이들 항체들에 의한 결합의 입체 장애로 인해 IL-13Rα1 에 결합하는 것이 저해된다. 결합 저해는, 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 또는 LC5002-018 로 이루어진 군에서 선택되는 고정 항체 및 20-50 nM 농도의 IL-13Rα1 및 100 nM 농도의 검출 대상 항체를 사용하여 SPR 검정으로 검출할 수 있다. 50% 이상의 신호 감소는 상기 항체가 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 또는 LC5002-018 로 이루어진 군에서 선택되는 항체와 경쟁함을 나타낸다. "에피토프"라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹들로 이루어져 있으며, 보통 특이적 3차원 구조 특성, 및 특이적 전하 특성을 갖는다. 구조형 (conformational) 및 비구조형 (nonconformational) 에피토프는, 변성 용매의 존재하에서 후자에의 결합은 그렇지 않으나 전자에의 결합이 소실되는 점에서 구별된다. 본 발명은 또한, IL-13Rα1 에 결합하여 IL-13 생체활성을 저해하는 인간 항체로서 IL-13Rα1 에의 결합에 대한 친화력이 10^-9 M (K_D) 이하, 바람직하게는 10^-9 내지 10^-13 M 이고 쥣과 IL-13Rα1 에의 결합에 대한 친화력이 10^-7 M (K_D) 이하, 바람직하게는 10^-8 내지 10^-9 M 인 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체들은 또한, 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 또는 LC5002-018 로 이루어진 군에서 선택되는 항체가 결합하는 동일한 에피토프에 대한 결합에 있어서, 결합 매개변수들인 ka, kd 및 K_D 로부터 선택되는 군에서 선택되는 특성들 중 하나 이상을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체들은 바람직하게는 재조합 방법으로 제조된다. 이러한 방법들은 당업계의 기술 수준에서 널리 공지되어 있으며, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현 및 그후의 항체 폴리펩티드의 단리 및 보통 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 이들의 단편을 인코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현은, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 대장균 (E.coli) 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행하며, 상기 항체는 상기 세포들로부터 회수된다(세포 용해 후의 상청액 또는 세포).

항체의 재조합 제조는 당업계의 기술 수준에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; [Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; [Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; [Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 들의 종설 (review article) 에 기재되어 있다.

항체는 완전한 세포 내, 세포 용해물 내, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 다른 세포성 성분 또는 기타 오염물, 예컨대, 기타 세포성 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행되는데, 알칼라인/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로오스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 알려진 것들을 비롯한 표준 방법들로 수행된다. 문헌 [Ausubel, F., 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조.

NS0 세포에서의 발현은 예컨대, 문헌 [Barnes, L.M., 등, Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; 및 [Barnes, L.M., 등, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270] 에 기재되어 있다. 일시적 발현은 예컨대, 문헌 [Durocher, Y., 등, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9] 에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌 [Orlandi, R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; [Carter, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 [Norderhaug, L., 등, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87] 에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 문헌 [Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 [Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199] 에 기재되어 있다.

원핵생물에 적당한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 임의로는 작동유전자 (operator) 서열 및 리보솜 결합 부위가 있다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.

단일클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-Sepharose, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 상기 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상의 방법들을 사용하면 용이하게 분리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서 작용할 수 있다. DNA 가 일단 분리되면, 이를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있는데, 이를 그 후, 다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포, HEK 293 세포 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션하여, 숙주 세포 내에서 재조합 단일클론 항체를 합성한다.

본 발명에 따른 항체들로서는, 또한, 상기 언급한 본 발명에 따른 항체의 특성들에 영향을 미치거나 이들을 변경하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형인 "보존성 (conservative) 서열 변형"을 갖는 항체들이 포함된다. 변형은 위치지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술들에 의해 도입할 수 있다. 보존성 아미노산 치환에는, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 것이 포함된다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되었다. 이들 패밀리들로는, 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하성 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 이 있다. 즉, 인간 항-IL-13Rα1 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기를 바람직하게는 동일 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있다.

아미노산 치환은 문헌 [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327] 및 [Queen, C., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)10029-10033] 에 기재된 바와 같은 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이유발에 의해 수행할 수 있다.

인간 IL-13Rα1 항체의 아미노산 서열 변형체는, 항체 DNA 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 이러한 변형은 예컨대, 상기 기재한 바와 같이 매우 한정된 범위에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 IgG 아형 및 에피토프 결합과 같은 상기 언급된 항체 특성을 변경하지 않지만, 재조합 제조의 수율, 단백질 안정성을 향상시키거나 또는 정제를 용이하게 할 수 있다.

항-IL-13Rα1 항체의 적절한 형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기 또한, 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 비정상적 가교를 방지하기 위해 치환할 수 있는데, 일반적으로는 세린으로 치환한다. 반대로, (특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우) 항체의 안정성을 향상시키기 위해 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 가할 수 있다.

또 다른 유형의 항체의 아미노산 변형은 항체의 본래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 변경시킨다는 것은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 제거하고/하거나 상기 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 부분이 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열들인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (이 때, X 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임) 은 탄수화물 부분이 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착된 것에 대한 인식 서열이다. 즉, 폴리펩티드 내에 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 존재하면, 잠재적 글리코실화 부위가 생성된다. 상기 항체에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은 상기 아미노산 서열을 상기 기재한 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위용) 중 하나 이상을 포함하도록 변경함으로써 간편하게 수행된다.

항-IL-13Rα1 항체의 아미노산 서열 변형체를 인코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이들 방법으로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 천연 공급원으로부터의 분리 (자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변형체의 경우), 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 항-IL-13Rα1 항체에 대한 미리 준비한 변형체 또는 비-변형 버전의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 있다.

또 다른 유형의 공유적 변형에는, 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 상기 항체에 커플링시키는 것이 관여된다. 이들 방법은 이들이 N- 또는 O-연결 글리코실화를 할 수 있는 글리코실화 능력을 가진 숙주 세포 내에서 항체를 제조할 필요가 없다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 양식에 따라, (복수의) 당을 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것들과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것들과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것들과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착시킬 수 있다. 이들 방법은 WO 87/05330, 및 문헌 [Aplin, J.D., 및 Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306] 에 기재되어 있다.

상기 항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 부분은 화학적으로 또는 효소적으로 제거할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 (deglycosylation) 는 항체를 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가의 화합물에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 처리에 의해 항체는 온전히 남겨지면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민) 을 제외한 대부분의 또는 모든 당이 절단된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Sojahr, H.T., 및 Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57] 및 [Edge, A.S., 등 Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137] 에 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 부분에 대한 효소적 절단은 [Thotakura, N.R., 및 Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359] 에 기재된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용함으로써 수행될 수 있다.

항체에 대한 또 다른 유형의 공유적 변형은 상기 항체를 US 특허 제 4,640,835 호; 4,496,689 호; 4,301,144 호; 4,670,417 호; 4,791,192 호 또는 4,179,337 호에 개시된 방식으로 다양한 비(非)단백질성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌류 중 하나에 연결하는 것을 포함한다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 본 발명에 따른 인간 항-IL-13Rα1 항체들을 발현하는 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스로부터 분리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 분리된 B 세포를, 정제된 또는 농축된 IL-13Rα1 항원 조제물 및/또는 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화된 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스로부터 수득한다. 바람직하게는, 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스는 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 전이유전자 (transgene) 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 그 후 상기 분리된 B-세포를 불멸화하여 인간 항-IL-13Rα1 항체의 공급원 (예컨대, 하이브리도마) 을 생성한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체들을 생성할 수 있는 하이브리도마를 제공한다. 한 가지 구현예에서, 상기 하이브리도마에는, 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스로부터 수득한 B 세포로서 불멸화 세포에 융합된 B 세포가 포함된다.

특정 구현예에서, 유전자도입 비-인간 동물은 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자도입 마우스이다. 상기 유전자도입 비-인간 동물을 정제 또는 농축된 IL-13Rα1 항원 조제물 및/또는 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스는 IL-13Rα1 에 대한 인간 단일클론 항체의 IgG1 아형을 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체들은, 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대, 유전자도입 마우스를 IL-13Rα1 항원의 정제 또는 농축 조제물 및/또는 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화하여 제조할 수 있다. 그 후, 상기 동물의 B 세포 (예컨대, 비장의 B 세포) 를 수득하고 이를 골수종 세포와 융합시켜, IL-13Rα1 에 대한 인간 단일클론 항체들을 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성시킨다.

바람직한 구현예에서, IL-13Rα1 을 대항하도록 한 인간 단일클론 항체를, 마우스 체계 보다는 인간 면역 체계의 부분들을 가진 유전자도입 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 본원에서 "HuMab" 마우스로서 지칭되는 이들 유전자도입 마우스들은, 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 (불변 영역 유전자들) 가 포함된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자들을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소(小)좌위 (miniloci) 를 갖고 있다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859). 따라서, 상기 마우스들은 마우스 IgM 또는 K 에 대한 발현 감소를 나타내며, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 전이유전자들은 면역화에 반응하여, 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐, 고친화성 인간 IgG 단일클론 항체를 생성한다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859; reviewed in Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., 및 Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; 및 Harding, F., 및 Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546). HuMab 마우스의 제조는 문헌 [Taylor, L., 등, Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295]; [Chen, J., 등, International Immunology 5 (1993) 647-656]; [Tuaillon, N., 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724]; [Choi, T.K., 등, Nature Genetics 4 (1993) 117-123]; [Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830]; [Tuaillon, N., 등, Immunol. 152 (1994) 2912-2920]; [Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859]; [Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101]; [Taylor, L., 등, Int. Immunol. 6 (1994) 579-591]; [Lonberg, N., 및 Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93]; [Harding, F., 및 Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546]; [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기재되어 있으며, 이들의 전문은 본원에 참조병합된다. 추가로, US 특허 제 5,545,806 호; 5,569,825 호; 5,625,126 호; 5,633,425 호; 5,789,650 호; 5,877,397 호; 5,661,016 호; 5,814,318 호; 5,874,299 호; 5,545,807 호; 5,770,429 호; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; 및 WO 92/03918 호 참조.

IL-13Rα1 에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해서, HuMab 마우스를, 문헌 [Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859]; [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 및 WO 98/24884 에 기재된 바와 같은 일반적인 방법에 따라 IL-13Rα1 항원의 정제 또는 농축 조제물 및/또는 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 최초의 면역화 시에 6-16 주령된 것일 것이다. 예를 들어, 가용성 IL-13Rα1 항원 (예컨대, IL-13Rα1 발현 세포로부터 정제한 것) 의 정제 또는 농축 조제물을 사용하여 HuMab 마우스를 복강내로 면역화할 수 있다. IL-13Rα1 항원의 정제 또는 농축 조제물을 사용한 면역화에 의해 항체가 생성되지 않는 경우에는, 마우스를 또한 IL-13Rα1 을 발현하는 세포, 예컨대, 종양 세포주로 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수도 있다. 다양한 항원을 이용한 누적 경험에 따르면, HuMab 유전자도입 마우스는, 처음에 완전 프로인트 (Freund's) 어주번트 중의 항원으로 복강내로 (i.p.) 면역화하고, 그 후 불완전 프로인트 어주번트 중의 항원으로 격주로 교대로 i.p. 또는 s.c. 면역화 (예를 들어, 총 6 회까지) 할 때 가장 잘 반응하는 것으로 나타났다. 안와후부 (retroorbital) 출혈에 의해 수득한 혈장 시료를 이용하여 상기 면역화 프로토콜의 과정에 따라 상기 면역 반응을 모니터할 수 있다. 상기 혈장을 ELISA 로 스크리닝할 수 있고, 충분한 역가의 항-IL-13Rα1 인간 면역글로불린을 가진 마우스를 대응 B 세포의 불멸화를 위해 사용할 수 있다. 마우스를 희생시키고 그의 비장 및 림프절을 꺼내기 3 내지 4 일 전에, 항원을 그의 정맥내로 접종할 수 있다. 각 항원에 대한 2-3 회의 융합이 수행될 필요가 있을 수 있을 것으로 예상된다. 각 항원에 대하여 여러 마리의 마우스를 면역화한다. 예를 들어, 총 5 내지 12 마리의 HCo7 및 HCo12 계통의 HuMab 마우스를 면역화할 수 있다.

HCo7 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자들 중에 JKD 파괴 (문헌 [Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에 기재됨) 를, 그의 내인성 중쇄 유전자들 중에 CMD 파괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에 기재됨) 를 가지며, KCo5 인간 카파 경쇄 전이유전자 (문헌 [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기재됨) 및 HCo7 인간 중쇄 전이유전자 (US 특허 제 5,770,429 호에 기재됨) 를 갖는다.

HCo12 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자들 중에 JKD 파괴 (문헌 [Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에 기재됨) 를, 그의 내인성 중쇄 유전자들 중에 CMD 파괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에 기재됨) 를 가지며, KCo5 인간 카파 경쇄 전이유전자 (문헌 [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기재됨) 및 HCo12 인간 중쇄 전이유전자 (WO 01/14424 의 실시예 2 에 기재됨) 를 갖는다.

상기 마우스의 림프구를 분리한 후, 이를 표준 프로토콜을 기초로 하여 PEG 를 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 그 후 생성된 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 항체를 제조하는 것을 선별한다. 예를 들어, 면역화된 마우스의 비장 및 림프절-유래 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG 를 이용하여 SP 2/0 비(非)분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581) 의 수의 1/6 에 융합시킨다. 세포를 편평 바닥 마이크로티터 플레이트에 대략 2 x 10⁵ 로 플레이팅한 후, 선택 배지 내에서 약 2 주간 인큐베이션한다.

개별 웰들을 그 후 ELISA 로 스크리닝하여 인간 항-IL-13Rα1 단일클론 IgM 및 IgG 항체를 선별한다. 대규모의 하이브리도마 성장이 일어나면 배지를 분석하는데, 보통 10-14 일 후에 한다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 재플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 여전히 인간 IgG, 항-IL-13Rα1 단일클론 항체에 대해 양성이면, 한계 희석으로 2 회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후 안정한 서브클론들을 특징 분석을 위해 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에서 항체를 생성시킨다.

CDR 서열이 항체-항원 상호작용을 일으키기 때문에, 본 발명에 따른 CDR 서열이 포함된 발현 벡터를 상이한 인간 항체의 골격 서열 상에 구축함으로써 본 발명에 따른 재조합 항체들을 발현시킬 수 있다(참조: 예컨대, Riechmann, L., 등, Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., 등, Nature 321 (1986) 522-525; 및 Queen, C., 등, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86 (1989)10029-10033). 이러한 골격 서열들은 생식세포 인간 항체 유전자 서열들이 포함된 공개 DNA 데이터베이스로부터 수득가능하다. 이들 생식세포 서열들은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자들을 포함하지 않을 것이므로, 성숙 항체 유전자 서열과 상이할 것이다. 생식세포 유전자 서열들은 또한 각각 가변 영역 전체에 걸쳐 고르게 고친화성 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다.

본 발명은 바람직하게는 하기로 이루어진 군에서 선택되는, IL-13Rα1 에 결합하여 IL-13 의 IL-13Rα1 에의 결합을 저해하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 단편을 포함한다:

a) 서열번호: 1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR 들을 포함하는 항체 중쇄;

재구축된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화 및 전사 종결의 서열들과 조합하여 발현 벡터 구축물을 형성한다. 상기 중쇄 및 경쇄 발현 구축물을 단일 벡터 내로 조합하고, 숙주 세포내로 공동-트랜스펙션, 순차 트랜스펙션 또는 개별 트랜스펙션할 수 있는데, 그 후 상기 숙주 세포들을 융합하여 양 사슬을 모두 발현하는 단일 숙주세포를 형성시킨다.

따라서, 본 발명은 하기를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 제공한다:

a) 서열번호:1, 3, 5, 7 또는 9 의 중쇄 CDR 들을 포함하는 항체 중쇄;

본 발명은 또한 시험관내, 바람직하게는 시료의 IL-13Rα1 및 본 발명에 따른 항체 간의 결합을 측정하는 면역학적 검정에 의한 IL-13Rα1 검출에 있어서의 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 본 발명의 인간 단일클론 항체들 중 하나 또는 이들의 조합, 또는 이들의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물, 예컨대, 약학 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"에는, 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예컨대, 주사 또는 주입에 의한 것) 에 적당한 것이 바람직하다.

"약학적으로 허용가능한 염"은 상기 항체의 목적하는 생물학적 활성을 유지시키고 원하지 않는 임의의 독물학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(참조: 예컨대, Berge, S.M., 등, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19). 이러한 염은 본 발명에 포함된다. 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 있다. 산 부가염에는, 비독성 무기산에서 유래한 것들, 예컨대 염산염이 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여가능하다. 숙련된 당업자라면 인식할 것이지만, 투여 경로 및/또는 양식은 목적하는 결과에 따라 다를 것이다.

본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해서는, 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 또는 상기 물질을 상기 화합물과 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 적절한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 중에 포함시켜 대상체에 투여할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제로는 식염수 및 완충 수용액이 있다.

약학적으로 허용가능한 담체로서는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 조제용 멸균 분말이 있다. 약학적 활성 물질용으로 이러한 배지 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구 투여함"이라는 어구는, 보통은 주사에 의한, 장내 및 국소 투여를 제외한 투여 양식을 의미하며, 여기에는 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하 (subcuticular), 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 (intrasternal) 주사 및 주입이 포함된다.

이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어주번트를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 방지하는 것은 상기의 멸균 방법들 및 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등을 포함시키는 것 둘 다에 의해 확고히 할 수 있다. 또한, 상기 조성물에 당류, 염화나트륨 등의 등장화제를 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 덧붙여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써, 주사가능한 약학적 형태가 지속적으로 흡수되게 할 수도 있다.

선택된 투여 경로와 관계없이, 적당한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학 조성물을 당업계의 숙련된 자들에 공지된 통상의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화한다.

본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분들의 실제 투여 수준은 환자에 대해 독성이 없으면서, 특정 환자, 조성 및 투여 양식에 대하여 목적하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 가변적일 수 있다. 선택된 투여 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 이용되는 특정 조성물과 병용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 대상 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 의학적 병력, 및 의학 분야에 공지된 유사한 인자들을 포함하는 각종 약동학적 인자에 의해 좌우될 것이다.

조성물은 반드시 멸균성이어야 하며 주사기에 의해 조성물이 전달가능한 정도로 유동적이어야 한다. 물에 더하여, 담체는 등장성 완충 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다.

적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 이용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 계면활성제의 이용으로 유지될 수 있다. 많은 경우, 상기 조성물 중에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 가능해질 수 있다.

하기의 실시예, 참고문헌, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 제시된다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않으면서 개시된 과정 중에 변형이 가해질 수 있음이 이해될 것이다.

서열 목록에 대한 설명

서열번호:1 HuMab LC5002-002 의 중쇄 가변 도메인

서열번호:2 HuMab LC5002-002 의 경쇄 가변 도메인

서열번호:3 HuMab LC5002-003 의 중쇄 가변 도메인

서열번호:4 HuMab LC5002-003 의 경쇄 가변 도메인

서열번호:5 HuMab LC5002-005 의 중쇄 가변 도메인

서열번호:6 HuMab LC5002-005 의 경쇄 가변 도메인

서열번호:7 HuMab LC5002-007 의 중쇄 가변 도메인

서열번호:8 HuMab LC5002-007 의 경쇄 가변 도메인

서열번호:9 HuMab LC5002-018 의 중쇄 가변 도메인

서열번호:10 HuMab LC5002-018 의 경쇄 가변 도메인

서열번호:11 κ 경쇄 불변 영역

서열번호:12 γ1 중쇄 불변 영역

도 1 은 항-IL-13Rα1 항체의 고정화 재조합 인간 IL-13Rα1 폴리펩티드에의 결합을 나타낸다. 음성 대조군 HuMab 로서 항-KLH 및 다클론 토끼-항-인간 IL-13Rα1 항체 AF152 (R&D systems) 가 포함되어 있다.

도 2 는 항-IL-13Rα1 항체에 의한 고정화 IL-13Rα1/IL-4Rα 수용체에 대한 IL-13 결합의 저해를 나타낸다.

도 3 은 항-IL-13Rα1 항체에 의한 (IL-13R알파1 및 IL-4Rα2 를 발현하는) CHO 세포에 대한 IL-13 결합의 차단을 나타낸다. 양성 대조군으로서, 시판중인 다클론 항-IL-13Rα1 항체 (AF152, R&D Systems, Minneapolis, MN) 가 포함되었다.

도 4 는 항-IL-13Rα1 항체의 hIL-13Rα1 에의 결합 및 기능적으로 관련된 수용체들인 hIL-13Rα2 및 hIL-4Rα 에 대한 결합 특성을 나타낸다.

도 5 는 고정화 재조합 쥣과 IL-13Rα1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항-IL-13Rα1 항체의 능력을 나타낸다. 음성 대조군 HuMab 로서 항-KLH 및 다클론 염소-항- 인간 IL-13Rα1 항체 AF152 (R&D Systems) 가 포함되어 있다.

실시예 1

하이브리도마의 생성

본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 전이유전자 및 인간 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 가진 유전자도입 비-인간 동물, 예컨대 유전자도입 마우스를 인간 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화함으로써 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체들을 제조할 수 있다. 그 후 상기 동물의 B 세포 (예컨대, 비장 B 세포) 를 수득하여, 골수종 세포와 융합시켜, IL-13Rα1 에 대한 인 간 단일클론 항체들을 분비하는 불멸성의 하이브리도마 세포를 형성시킨다. 마우스 체계 보다는 인간 면역 체계의 부분들을 가진 유전자도입 마우스를 사용하여 인간 IL-13Rα1 에 대항하도록 한 인간 단일클론 항체를 생성시킬 수 있다. 본원에서 "HuMab" 마우스로 지칭되는 이들 유전자도입 마우스는, 내인성 μ 및 카파 사슬 좌위를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ (카파) 경쇄 (불변 영역 유전자들) 가 포함된 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 유전자들을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소(小)좌위를 갖는다(Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859). 따라서, 상기 마우스들은 마우스 IgM 또는 κ 에 대한 발현 감소를 나타내며, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 전이유전자들은 면역화에 반응하여, 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 거쳐, 고친화성 인간 IgG 단일클론 항체를 생성한다. IL-13Rα1 에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해서, HuMab 마우스를, 문헌 [Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859]; [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 및 WO 98/24884 에 기재된 바와 같은 일반적인 방법에 따라 인간 IL-13Rα1 을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 최초의 면역화 시에 6-16 주령된 것일 것이다. 예를 들어, IL-13Rα1 트랜스펙션된 세포를 복강내로 사용하여 HuMab 마우스를 면역화할 수 있다. 안와후부 출혈에 의해 수득한 혈장 시료를 이용하여 상기 면역화 프로토콜의 과정에 따라 상기 면역 반응을 모니터할 수 있다. 상기 혈장을 ELISA 및/또는 FACS 로 스크리닝할 수 있다. 충분한 역가의 항-인간 IL-13Rα1 인간 면역글로불린을 가진 마우스를 대응 B 세포의 불멸화 를 위해 사용할 수 있다. 마우스를 희생시키고 그의 비장 및 림프절을 꺼내기 3 내지 4 일 전에, 항원을 상기 마우스의 정맥내로 접종할 수 있다. 예를 들어, HCo7 또는 HCo12 계통의 HuMab 마우스를 면역화할 수 있다. HCo7 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자들 중에 JKD 파괴 (문헌 [Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에 기재됨) 를, 그의 내인성 중쇄 유전자들 중에 CMD 파괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에 기재됨) 를 가지며, KCo5 인간 카파 경쇄 전이유전자 (문헌 [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기재됨) 및 HCo7 인간 중쇄 전이유전자 (US 특허 제 5,770,429 호에 기재됨) 를 갖는다. HCo12 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자들 중에 JKD 파괴 (문헌 [Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에 기재됨) 를, 그의 내인성 중쇄 유전자들 중에 CMD 파괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에 기재됨) 를 가지며, KCo5 인간 카파 경쇄 전이유전자 (문헌 [Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기재됨) 및 HCo12 인간 중쇄 전이유전자 (WO 01/14424 의 실시예 2 에 기재됨) 를 갖는다. 상기 마우스의 림프구를 분리한 후, 이를 표준 프로토콜을 기초로 하여 PEG 를 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킬 수 있다. 그 후 생성된 하이브리도마를 스크리닝하여 항원-특이적 항체를 제조하는 것을 선별한다. 예를 들어, 면역화된 마우스의 비장 및 림프절-유래 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG 를 이용하여 SP 2/0 비(非)분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581) 에 융합시킨다. 세포를 편평 바닥 마이크로티터 플레이트에 대략 0.75 x 10⁷ 로 플레이팅한 후, 선택 배지 내에서 약 2 주간 인큐베이션한다. 개별 웰들을 그 후 ELISA 및/또는 FACS 로 스크리닝하여 인간 항-IL-13Rα1 단일클론 IgM 및 IgG 항체를 선별한다. 대규모의 하이브리도마 성장이 일어나면, 항체를 분비하는 하이브리도마를 재플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 여전히 인간 IgG, 항-IL-13Rα1 단일클론 항체에 대해 양성이면, 한계 희석으로 2 회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 후 안정한 서브클론들을 특징 분석을 위해 시험관내 배양하여 조직 배양 배지 중에서 항체를 생성시킨다.

유전자도입 마우스의 면역화 절차

GG2201 계통의 3 마리의 HCo7 마우스 (수컷 3 마리) (Medarex, San Jose, CA, USA) 및 GG2198 계통의 2 마리의 HCo12 마우스 (수컷 1 마리 및 암컷 1 마리) (Medarex, San Jose, CA, USA) 를 1 x 10⁶ HEK293 세포로 면역화하고, IL-13Rα1 용 발현 벡터로 트랜스펙션하였다. 복강내로 (i.p.) 및 꼬리 기부에서 피하 (s.c.) 로 번갈아 총 8 회의 면역화를 실시하였다. 첫번째 면역화에서는, 1 x 10⁶ HEK293: IL-13Rα1 세포 100 μl 를 완전 프로인트 어주번트 (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA) 100 μl 와 혼합하였다. 나머지 모든 면역화에서는, PBS 중의 세포 100 μl 를 불완전 프로인트 어주번트 (ICFA; Difco) 100 μl 와 혼합하였다.

마우스에 대한 추가접종 ( boosting )

항-IL-13Rα1 의 혈청 역가가 충분한 것으로 나타났을 때, 융합 4 및 3 일 전에 마우스를 200 μl PBS 중의 1 x 10⁶ HEK293: IL-13Rα1 세포로 정맥내로 (i.v.) 2 회 추가로 접종하였다.

실시예 2

ELISA 에 의한 HuMab 의 고정화 IL -13Rα 1 에의 결합 시험

본 발명의 항체가 재조합 IL-13Rα1 에 결합하는 능력을 측정하기 위해, IL-13Rα1 의 세포외 도메인 (R&D Systems, UK) 을 PBS (1 μg/ml) 에 용해시키고, 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하여 마이크로티터 플레이트 (NUNC Maxisorb) 에 흡착되게 하였다. 상기 플레이트를 세정 완충액 (WB = 0.9 % NaCl; 0.1% Tween® 20) 으로 세정한 후, 100 μl 인큐베이션 완충액 (IB = 1% 크로테인 (crotein) C 및 0.1% Tween® 20 을 함유한 PBS) 을 첨가한 후 실온에서 (RT) 30 분간 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 그 후, 연속 희석시킨 HuMab 및 대조군 항체 (100 μl/웰; IB 중 희석) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 다시 세정하고, IB 중에 최종 1:500 희석된 퍼옥시다제-접합된 토끼 항-인간 카파 (DAKO, Denmark) 와 함께 인큐베이션하여 결합한 인간 항체를 검출하였다. 퍼옥시다제-접합된 다클론 당나귀 항-염소 IgG (Santa Cruz; IB 중 1:1000 희석) 로 다클론 염소 항-hIL-13Rα1 항체를 검출하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션하고 이 후 세정한 후, 상기 플레이트들을 실온의 어두운 곳에서 즉시 사용가능한 (ready-to-use) ABTS^® 용액 (Roche Diagnostics GmbH) 으로 현상하였다. 최고 농도의 흡광도가 충분한 OD 에 도달한 후 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

검사된 IL-13R알파1 에 대한 모든 항체들은 인간 IL-13Rα1 의 고정화 세포외 도메인에 결합할 수 있었다. 측정된 EC₅₀ 값은 검사된 각종 LC 항체에 있어서 0.5 - 2 nM 범위였다. 음성 대조군인 HuMab 항-KLH 는 IL-13Rα1 의 고정화 세포외 도메인에 결합하지 않았다. 양성 대조군으로서 포함된 다클론 염소-항 인간 IL-13Rα1 항체는 또한 IL-13Rα1 의 고정화 세포외 도메인에 효율적으로 결합하였다(도 1).

실시예 3

IL -13Rα1/ IL -4Rα 이형이량체에 대한 IL -13 결합의 저해 ( ELISA )

마이크로티터 플레이트를 진탕기에서 4 ℃ 에서 하룻밤 3 μg/ml 농도의 PBS 중의 hIL-13Rα1:hFc 키메라 단백질 (R&D Systems, UK) 100 μl 로 코팅시켰다. 플레이트들을 WB 로 세정한 후, 연속 희석시킨 HuMab 및 대조군 항체 (100 μl/웰; IB 중의 희석물) 를 첨가하고, 실온에서 30 분간 인큐베이션하였다. 상기 플레이트들을 다시 세정한 후, IL-13 (R&D Systems, UK; 0.5 μg/ml; IB 로 희석) 및 IL-4Rα (R&D Systems, UK; 0.75 μg/ml; IB 로 희석) 의 혼합물을 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 세정한 후, 0.4 μg/ml 농도의 비오티닐화 항 IL-13 항체 (BAF213; R&D Systems, UK) 100 μl 를 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 세정한 후, IB 중에서 1:5000 으로 희석된 퍼옥시다제-커플링된 스트렙타비딘 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 으로 결합된 IL-13 을 검출하였다(인큐베이션 기간: 실온에서 1 h). 마지막으로, 플레이트들을 세정하고, 실온 (RT) 의 어두운 곳에서 즉시 사용가능한 ABTS^® 용액 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 으로 현상하였다. 45 내지 60 분 후, 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 은 IL-13 가 이형이량체성 수용체에 결합하는 것을 저해할 수 있었는데, 최대 저해값은 대략 50% 에서 80-85% 범위였다. 양성 대조군은 AF152 (다클론 토끼 항체) 이었다. 예상된 바대로, 음성 대조군인 항-KLH 는 IL-13 가 상기 이형이량체성 수용체에 결합하는 것을 저해하지 않았다. LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 에 있어서 수득된 IC₅₀ 값은 1.5 nM 내지 10.1 nM 이었다(도 2).

실시예 4

방사능리간드 (radioligand) 결합 검정

인간 IL-13Rα1 및 인간 IL-4Rα 를 발현하는 CHO 세포를 사용하여 결합 완충액 (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ 및 0.5% 소 혈청 알부민, pH 7.2 로 조정됨) 중에서 ¹²⁵I-IL-13 결합 검정을 수행하였다. 웰당 1x10⁵ 개의 세포를 상기 항체와 혼합하고, 15 분 내지 1 시간동안 예비인큐베이션하였다. 0.1 nM ¹²⁵I-IL-13 을 첨가하고, 상기 믹스 (mix) 를 4 ℃ 에서 4 시간동안 인큐베 이션하였다. 포화 결합 분석, 경쟁 분석 및 상기 세포주와 결합 평형에 도달하기까지 투입된 ¹²⁵I-IL-13 의 측정으로부터 상기 검정에 사용된 ¹²⁵I-IL-13 의 농도를 결정하였다. 시료들을 1% PEI/0.5% BSA 로 예비처리한 GF/C 필터 플레이트 상으로 수집하고, Packard TopCount 섬광 계수기로 계수하였다. 비선형 회귀 곡선 맞춤 (fit) 을 사용하여 PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA) 으로 데이터 분석을 수행하였다.

검사된 모든 IL-13R알파1 에 대한 항체는 표지된 IL-13 의 IL-13Rα1/IL-4Rα 복합체에의 결합을 차단한다. 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 에 있어서 산출된 IC₅₀ 값은 0.09 nM 내지 0.32 nM 이었고, AF152 에 있어서는 84.8nM 이었다(도 3).

실시예 5

HuMab 에 의한 인간 B 세포 및 단핵구에 대한 IL -13 유도성 CD23 상향조절의 저해

Ficoll Hypaque 밀도 구배에 의해 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 분리하였다. 세포를 RPMI 로 세정한 후, 이들을 RPMI/10% FCS 에 재현탁하고, 96 웰 편평 바닥 마이크로티터 플레이트 (Corning Incorporated Costar) 에 3x10⁵ PBMC/웰 (부피 50 μl) 로 살포하였다. 그 후, RPMI/10% FCS 중의 최종 농도 0.5 μg/ml 의 항-인간 CD40 항체 (Immunotech) 25 μl 및 RPMI/10% FCS 중의 최종 농도 10 μg/ml 의 항-인간 IgA+IgG+IgM 항체 (Immunoresearch) 25 μl 를 첨가하였다. 그 후, 연속 희석시킨 HuMab 및 대조군 항체 (50 μl/웰; RPMI/10% FCS 중의 희석물) 를 첨가하고, 세포를 인큐베이터 (37 ℃; 5% CO₂) 내에서 30 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 최종 농도 0.67 ng/ml 의 재조합 인간 IL-13 (R&D Systems) 을 첨가하고(50 μl/웰), 세포를 37 ℃/5% CO₂ 에서 72h 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 플레이트들을 원심분리하고, 배지를 흡입하였다. 부착된 세포의 분리를 위해 200 μl 의 Accutase (PAA) 를 첨가하고, 세포를 37 ℃; 5% CO₂ 에서 대략 5 분간 인큐베이션하였다. 플러싱 (flushing) 을 반복하여 세포를 떼어낸 후, 이를 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 원심분리 및 상청액 흡입 후, 세포를 항-CD23-PE, 항-CD20-FITC 및 항-CD14-APC (모두 BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 의 혼합물 200 μl 와 함께 인큐베이션하였다. 상기 세포를 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이션한 후, 원심분리하고, 상청액을 흡입하였다. 이러한 세정 단계를 1 회 반복하고, 마지막으로 세포를 200 μl 의 PBS/0.1% 인간 혈청 알부민에 재현탁하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 FACS Calibur 유세포 분석기 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 로 분석하였다. 대부분의 경우에, 10,000 건을 획득하였고, 이를 광산란 게이트 상에서 게이팅 (gating) 하여 생존가능한 림프구 및 단핵구만을 포함시켰다. 세포들을 B 림프구에 대하여는 CD19 양성 군집 (cluster) 상에서 또는 단핵구에 대하여는 CD14 양성 군집 상에서 예비게이팅 (pregating) 하고, CD23 발현이 있는지 추가로 분석하였다.

B-림프구에 대한 CD 23 상향조절 저해에 대하여 관찰된 IC₅₀ 값은 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 에 있어서 0.5 nM 내지 >70 nM 이었고, AF152 에 있어서는 13.6 nM 이었다. 인간 단핵구에 대한 IL-13 유도성 CD23 상향조절의 저해에 있어서도 유사한 프로필이 나타났다. 단핵구에 대해서 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 의 IC₅₀ 값은 0.1 nM 내지 62.8 nM 이었고, AF152 의 IC₅₀ 값은 62.9 nM 이었다.

실시예 6

자극으로서의 IL -13 또는 IL -4 에 대한 반응으로서의 TF -1 증식 검정

TF-1 세포 (ATCC # CRL 2003) 를 ATCC 변형 RPMI, 10% FBS, 1X 페니실린/스트렙토마이신, 2 ng/ml GM-CSF 를 함유한 배지에서 배양하였다. 검정 1 일 전에, 상기 세포를 GM-CSF 부재 배지에 유지시켰다. 웰당 5 x 10³ 개 세포를 적절한 농도의 항-IL-13Rα1 항체와 함께 37 ℃ 에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 세포를 2 ng/ml 의 인간 IL-13 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 또는 0.1 ng/ml 의 인간 IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 로 자극하고, 37 ℃ 에서 48 시간동안 인큐베이션하였다. 세포에 0.5 μCi ³H-티미딘을 펄스 주입하고, 이를 37 ℃ 에서 16-18 시간동안 인큐베이션하였다. Perkin Elmer Filtermate 96 수집기를 사용하여 1% PEI/0.25% BSA 로 전처리한 GFC 플레이트 상에 시료를 수집하였다. 상기 GFC 플레이트를 Perkin Elmer Top count 섬광 계수기로 계수하 였다. 비선형 회귀 곡선 맞춤 (GraphPad Software, San Diego, CA) 을 사용하여 PRISM 으로 데이터 분석을 수행하였다.

상기 검정에서 항-KLH 항체는 어떠한 저해도 나타내지 않았다. 이는 LC5002-007 도 마찬가지였다. 다른 모든 항체들은 상기 반응을 저해하였지만, LC5002-007 은 나머지 항체들보다 더 높은 IC 값으로 상기 반응을 저해하였다. 상이한 항체들에 있어서 관찰된 IC₅₀ 값은 하기와 같았다: AF152 에 있어서는 13.50 nM, LC5002-002 에 있어서는 9.21 nM, LC5002-003 에 있어서는 3.07 nM 및 LC5002-005 에 있어서는 0.39 nM. IL-4-유도성 TF-1 세포 증식에 있어서도 유사한 프로필이 나타났으나, 항체의 효력은 IL-13-유도성 반응에 비해 감소되었다. IL-4-유도성 증식에 대한 IC₅₀ 값은 항-IL4R 항체는 0.02 nM, AF152 는 74.37 nM 및 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 는 4.68 nM 내지 60 nM 이었다.

실시예 7

인간 폐 섬유아세포에 의한 IL -13 에 대한 반응으로서의 이오탁신 제조의 저해

HFL-1 세포 (인간 폐 섬유아세포, ATCC # CCL-153) 를 사용하여 상기 검정을 수행하였다. 12-웰 플레이트에 웰당 세포수 100,000 의 밀도로 세포를 플레이팅하고, 37 ℃ 에서 72 시간동안 인큐베이션하여, 포화 (confluency) 에 이르게 하였다. 그 후 세포를 무혈청 배지에서 24 h 동안 단식시킨 후, 37 ℃ 에서 1 h 동안 항-IL-13Rα1 항체로 처리하였다. 상기 처리 후, 세포를 37 ℃ 에서 48 h 동안 10 ng/ml IL-13 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 으로 자극하였다. 상청액을 수집하고, 시판중인 ELISA (R&D Systems 사제, Cat. No. DTX00) 를 사용하여 이오탁신 측정을 수행하였다. Spectromax 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 판독하고, PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA) 을 사용하여 상기 데이터를 분석하였다.

검사된 항체들은 이오탁신 방출 저해에 있어서 상이한 능력을 나타냈다. LC5002-007 을 제외한 나머지 모든 검사된 항체들은 일정 저해를 나타냈다. 3 내지 4 회의 상이한 실험으로부터 산출된 평균 IC₅₀ 값은 AF152 에서는 11.5 nM 및 항체 LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 및 LC5002-018 에서는 2.45 nM 내지 19.8nM 이었다.

실시예 8

인간 기관지 평활근 세포에서 IL -13-유도성 Stat -6 인산화의 저해

인간 기관지 평활근 세포 (BSMC; Clonetics, Cat. No CC-2576) 를 제조자의 지시사항에 따라 배양하였다. 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트에서 포화에 이를 때까지 배양하였다. 세포를 무혈청 배지에서 24h 동안 단식시키고, 다양한 양의 항체들을 첨가하였다. 플레이트를 1h 동안 인큐베이션한 후, 2.5 ng/ml IL-13 (R&D System) 으로 자극하였다. 15 분 인큐베이션 후, 상청액을 제거하고, 세포를 인산 완충액으로 세정한 후, 100 μl 의 용해 완충액을 첨가하였다. 상기 믹스를 얼음 상에서 잠깐 초음파처리하고, 원심분리하였다. 용해물을 인산화된 Stat-6 의 Western Blot 검출에 사용하였다. 등량의 단백질들을 SDS-겔 상에 로딩하고, 영동한 후, 막 (membrane) 으로 옮겼다. 항-Stat-6 항체는 Santa Cruz Biotechnology 사의 것 (Cat. No. SC-11762R) 이었고, 퍼옥시다제에 커플링된 2차 항체가 사용되었다. Amersham 의 ECL Plus System (Cat No RPN 2132) 을 사용하여 검출을 수행하였다. 정량은 Typhoon 9400 Imager 로 실시하였다.

본 검정에서 검사된 두 HuMab (LC50002-003 및 LC5002-005) 모두 IL-13-유도성 Stat-6 인산화를 저해하였다. 상기 검정에서 나타난 효력은 다른 기능적 검정에서와 유사하였다. 산출된 IC₅₀ 값은 AF152 에서는 18.64 nM, LC5002-003 에서는 5.98 nM 및 LC5002-005 에서는 1.18 nM 이었다.

실시예 9

항- hIL -13Rα1 HuMab 가변 도메인 (κ- 경쇄 및 γ1- 중쇄 ) 의 클로닝 및 서열 분석

항 hIL-13Rα1 HuMab 의 경쇄 가변 영역 V_L 및 중쇄 가변 영역 V_H 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표준 cDNA 합성/PCR 절차로 분리하였다. GeneRacer™ 키트 (Invitrogen) 를 사용하여 1x10⁶ - 1x10⁷ 하이브리도마 세포로부터 총 RNA 를 준비하였다. 하이브리도마 유래의 RNA 를 GeneRacer™ Oligo-dT Primer 의 첫번째 가닥 cDNA 합성 및 결찰에 대한 주형으로 사용하였다. ĸ-경쇄 및 γ1-중 쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 역방향 경쇄 및 중쇄 프라이머 및 5'-특이적 GeneRacer™ 프라이머를 사용하여 두번째 가닥 cDNA 합성 및 V_L 및 V_H 를 인코딩하는 cDNA 단편에 대한 추가적 PCR 증폭을 각각 수행하였다. Invitrogen™ Life Technologies 사의 TOPO™ TA 클로닝 키트 및 클로닝 벡터로서 pCR4-TOPO™ 를 사용하여 상기 PCR 산물을 클로닝하였다. 절단을 위해 EcoRI 를 사용하여 적절한 플라스미드들을 제한 맵핑하여 상기 클로닝된 PCR 산물을 동정하였는데, 예상된 / 산출된 DNA 단편 크기는 V_L 및 V_H 에 있어서 각각 약 740 및 790 bp 이었다. 클로닝된 PCR 단편의 DNA 서열들을 이중 가닥 서열분석으로 결정하였다. 일반적인 데이터 처리를 위해 GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Vector-NTI 8 (InforMax, Inc) 을 사용하였다. GCG 모듈 CLUSTALW 를 사용하여 DNA 및 단백질 서열을 정렬하였다. 서열 정렬은 프로그램 GENEDOC (버전 2.1) 를 사용하여 행하였다.

실시예 10

항- hIL -13Rα1 IgG1 HuMab 에 대한 발현 플라스미드의 구축

항-hIL-13Rα1 HuMab 경쇄 및 중쇄 인코딩 유전자들들을 개별적으로 포유류 세포 발현 벡터에서 조립하였다. 이에 의해, 항-hIL-13Rα1 HuMab 경쇄 가변 영역 (V_L) 및 인간 κ-경쇄 불변 영역 (C_L, 서열번호: 11) 을 인코딩하는 유전자 절편들이 연결되었고, 항-hIL-13Rα1 HuMab 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 인간 γ1-중쇄 불 변 영역 (C_H1-힌지-C_H2-C_H3, 서열번호: 12) 에 대한 유전자 절편들도 마찬가지로 연결되었다. 코돈을 사용한 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌 [Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S. 및 Foeller, C.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, NIH Publication No. 91-3242] 에 제시되어 있다. 항-hIL-13Rα1 HuMab κ-경쇄의 전사 단위는 하기 요소들로 이루어진다:

ㆍ 인간 거대세포바이러스 (HCMV) 로부터의 조기 발현 (immediate early) 인핸서 및 프로모터,

ㆍ Kozak 서열이 포함된 합성 5'-UT,

ㆍ 신호 서열 인트론이 포함된 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

ㆍ 5' 말단에 유일한 BsmI 제한 부위 및 3' 말단에 스플라이스 공여자 (splice donor) 부위 및 유일한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 항-hIL-13Rα1 HuMab 가변 경쇄 cDNA,

ㆍ 인트론 2 마우스 Ig-κ 인핸서를 비롯한 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역 [Picard, D. 및 Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82] 및

ㆍ 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.

항-hIL-13Rα1 HuMab γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 요소들로 이루어진다:

ㆍ 인간 거대세포바이러스 (HCMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,

ㆍ Kozak 서열이 포함된 합성 5'-UT,

ㆍ 신호 서열 인트론이 포함된 변형 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

ㆍ 5' 말단에 유일한 BsmI 제한 부위 및 3' 말단에 스플라이스 공여자 부위 및 유일한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 항-hIL-13Rα1 HuMab 가변 중쇄 cDNA,

ㆍ 마우스 Ig μ-인핸서를 비롯한 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),

ㆍ 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.

항-hIL-13Rα1 HuMab κ-경쇄 및 γ1-중쇄 발현 플라스미드의 기능적 요소들:

항-hIL-13Rα1 HuMab κ-경쇄 또는 γ1-중쇄 발현 카세트 외에도, 이들 플라스미드들은 하기를 갖는다:

ㆍ 하이그로마이신 저항성 유전자

ㆍ Epstein-Barr 바이러스 (EBV) 의 복제 원점 oriP

ㆍ 상기 플라스미드의 대장균에서의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 유래의 복제 원점, 및

ㆍ 대장균에서 암피실린 저항성을 제공하는 β-락타마제 유전자.

실시예 11

변이 (변형) 항- hIL -13Rα1 IgG1 을 위한 발현 플라스미드의 구축

변이 항-hIL-13Rα1 γ1-중쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드는 QuickChange^TM 위치지정 돌연변이유발 키트 (Stratagene) 를 사용하여 야생형 발현 플라스미드에 위치지정 돌연변이유발을 수행함으로써 생성할 수 있으며, 이는 표 1 에 기재되어 있다. 아미노산 번호부여는 EU 번호부여 방식에 따른 것이다 [Edelman, G.M., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., 및 Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, NIH Publication No. 91-3242].

돌연변이	설명
PVA-236; E233P 로 명기된 GLPSS331; L234V; L235A; 델타 G236;	인간 γ1-중쇄의 아미노산 서열 Glu₂₃₃Leu₂₃₄Leu₂₃₅Gly₂₃₆ 이 인간 γ2-중쇄의 아미노산 서열 Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅ 로 대체됨.
A327G; A330S; P331S	인간 γ1-중쇄의 아미노산 서열 Ala₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ala₃₃₀Pro₃₃₁ 이 인간 γ4-중쇄의 아미노산 서열 Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁ 로 대체됨
L234A; L235A	인간 γ1 -중쇄의 아미노산 서열 Leu₂₃₄Leu₂₃₅ 가 아미노산 서열 Ala₂₃₄Ala₂₃₅ 로 대체됨

실시예 12

재조합 항- hIL -13Rα1 HuMab 의 제조

10 % 초저 (ultra-low) IgG FCS (Gibco), 2 mM 글루타민 (Gibco), 1% v/v 비필수 아미노산 (Gibco) 및 250 μg/ml G418 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 이 보충된 DMEM (Gibco) 중에 배양된 부착 HEK293-EBNA 세포 (ATTC CRL-10852) 를 일시적 트랜스펙션하여 재조합 HuMab 를 생성하였다. 트랜스펙션을 위해 Fugene™ 6 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 트랜스펙션 시약을 시약 (μl) 대 DNA (μg) 의 비가 3:1 내지 6:1 범위가 되도록 사용하였다. 경쇄 인코딩 플라스미드 대 중쇄 인코딩 플라스미드의 몰비가 1:2 내지 2:1 가 되도록 하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 발현시켰다. 트랜스펙션 후 4 내지 11 일에 HuMab 함유 세포 배양물 상청액을 수집하였다.

예컨대, HEK293 에서의 인간 항체의 재조합 발현에 관한 일반 정보는 문헌 [Meissner, P., 등, Biotechnol Bioeng 75 (2001) 197-203] 에 제시되어 있다.

실시예 13

a) 키메라 hIL -13Rα1: hFc 를 사용한 HuMabs LC5002 -003, -005 및 - 007 의 친화력 분석

상호작용 분석을 위해, Biacore 3000 기구를 사용하였다. 25 ℃ 의 전개 (running) 및 반응 완충액, HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % 다중계면활성제 (polysurfactant) P, pH 7.4) 을 사용하였다. 포착 분자 (염소 항-인간-IgG, Fcγ 특이적) 를 유속 5 μl/분으로 20 분간 20 μg/ml 농도로 아민-커플링하였다. HuMab 를 유속 10 μl/분으로 1 분간 1 μg/ml 농도로 주입하였다. 500 nM 의 인간 감마 글로불린을 30 μl/분으로 3 분간 주입하여 유리 염소 항 인간 IgG, Fc_γ 에 대한 차단을 수행하였다. 분석물 (hIL-13Rα1:hFc 키메라 단백질) 을 5.63 nM 내지 90 nM 의 5 개 농도로 2 분간 주입하고, HBS-P 로 5 분간 세정하였다. 100 mM HCl 을 각각 1 분간 2 회 주사하여 표면을 재생하였다. 주입 칩, 검정 양식 및 서열 및 반응속도 데이터는 표 2 에 기재된 것과 같다. 시스템 고유 기저선 표류의 보정 및 잡음 신호 감소를 위해 시료 곡선에서 음성 대조군 데이터 (예컨대, 완충액 곡선) 를 제하였다. 센소그램 (sensorgram) 분석 및 친화력 데이터 산출을 위해 BiaEvaluation 버전 4.01 을 사용하였다. 반응속도 데이터를 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞추어 반응속도 데이터를 산출하였다(표 2).

hIL -13Rα1: hFc 를 이용한 HuMab 의 친화력 분석. Data 분석은 1:1 Langmuir 결합 모델을 기초로 함.
칩	포착	리간드	분석물	k _a (1/ Ms )	k _d (1/s)	K _D (M)
CM5	항-hFcγ	LC5002-003	hIL-13 Rα1:hFc	2.1x10⁵	1.4x10^-6	<6.5x10^-12
CM5	항-hFcγ	LC5002-005	hIL-13 Rα1:hFc	1.73x10⁵	3.12x10^-6	1.8x10^-11
CM5	항-hFcγ	LC5002-007	hIL-13 Rα1:hFc	1.19x10⁵	1x10^-6	<8.4x10^-12

b) hIL -13Rα1: hFc 키메라 단백질에서 절단된 hIL -13Rα 1 의 세포외 도메인을 이용한 HuMab LC5002 -003, -005 및 - 007 의 친화력 분석

상호작용 분석을 위해, Biacore 3000 기구를 사용하였다. 전개 및 반응 완충액은 25 ℃ 의 HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % 다중계면활성제 P, pH 7.4) 이었다. 포착 항체 분자 (항-hFcγ) 를 유속 5 μl/분으로 20 분간 100 μg/ml 농도로 아민-커플링하였다. HuMab 를 유속 10 μl/분으로 30 초간 10 μg/ml 농도로 주사하였다. 절단된 hIL-13Rα1 분자 (M_W 40kDa) 를 1.56 nM 내지 100 nM 사이의 7 개 농도로 200 초간 주사하고, HBS-P 로 5 분간 세정하였다. 100 mM HCl 를 각각 1 분간 유속 10 μg/ml 로 2 회 주사하여 표면 재생을 수행하였다. 주사의 칩, 검정 양식 및 서열 및 반응속도 데이터는 하기 표 3 에 기재된 것과 같다. 반응속도 데이터를 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞추어 반응속도 데이터를 산출하였다.

칩	포착	리간드	분석물	k _a (1/ Ms )	k _d (1/s)	K _D (M)
C1	항-hFcγ	LC5002-002	hIL-13Rα1	1.1x10⁶	6.5x10^-4	6.2x10^-10
C1	항-hFcγ	LC5002-003	hIL-13Rα1	1.3x10⁶	5.1x10^-4	3.9x10^-10
C1	항-hFcγ	LC5002-005	hIL-13Rα1	1.4x10⁶	3.0x10^-4	2.2x10^-10
C1	항-hFcγ	LC5002-007	hIL-13Rα1	1.9x10⁵	8.3x10^-4	4.4x10^-9
C1	항-hFcγ	LC5002-005, 변이 L234A; L235A	hIL-13Rα1	1.4x10⁶	2.9x10^-4	2.1x10^-10

c) hIL -13Rα1: hFc 키메라 단백질로부터 절단한 hIL -13Rα 1 의 세포외 도메인을 사용한 LC5002 - 005 의 재조합 변형체의 비교 친화력 분석

이 실험에서는, 하이브리도마에서 유래한 본래의 IgG1 의 친화력을 재조합 변형 IgG1-Ala-Ala 의 친화력과 비교하였다. 상호작용 분석을 위해, Biacore 3000 기구를 사용하였다. 전개 및 반응 완충액은 25 ℃ 의 HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % 다중계면활성제 P, pH 7.4) 이었다. 포착 항체 분자 (항-hFcγ) 를 유속 5 μl/분으로 20 분간 20 μg/ml 농도로 아민-커플링하였다. HuMab 를 유속 10 μl/분으로 1 분간 10 μg/ml 농도로 주사하였다. 절단된 hIL-13 Rα1 분자들 (분석물) 을 1,56 nM 내지 200 nM 사이의 8 개 농도로 5 분간 주사하고, HBS-P 로 5 분간 세정하였다. 100 mM HCl 를 각각 1 분간 2 회 주사하여 표면 재생을 수행하였다. 주사의 칩, 검정 양식 및 서열 및 반응속도 데이터는 표 4 에 기재된 것과 같다. 반응속도 데이터를 2가의 분석물 결합 모델에 맞추어 반응속도 데이터를 산출하였다.

칩	포착	리간드	분석물	k _a1 (1/ Ms )	k _d1 (1/s)	k _a2 (1/ RUs )	k _d2 (1/s)	K _D (M)
CM5	항-hFcγ	LC5002-005	hIL-13 Rα1	1.33x10⁵	3.6x10^-4	5.8x10^-3	0.06	2.7x10^-9
CM5	항-hFcγ	IgG1 ala-ala LC5002-005	hIL-13 Rα1	1.53x10⁵	4.2x10^-4	4.1x10^-3	0.04	2.8x10^-9

실시예 14

ELISA 를 이용한 HuMab 의 hIL -13Rα2 및 hIL -4Rα 에 대한 교차반응성 검사

키메라 단백질들인 hIL-13Rα2:hFc 및 hIL-4Rα:hFc (R&D Systems, UK) 를 PBS (1 μg/ml) 에 용해시키고, 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하여 마이크로티터 플레이트 (NUNC Maxisorb) 에 흡착되게 하였다. 상기 플레이트들을 세정 완충액 (WB = 0.9 % NaCl; 0.1% Tween® 20) 으로 세정한 후, 100 μl 인큐베이션 완충액 (IB = 1% 크로테인 C 및 0.1% Tween® 20 이 함유된 PBS) 을 첨가하고 실온에서 (RT) 30 분간 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 그 후, 연속 희석시킨 HuMab 및 대조군 항체 (100 μl/웰; IB 로 희석) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 다시 세정하고, IB 중에 최종 1:500 희석된 퍼옥시다제 접합 토끼 항-인간 카파 (DAKO, Denmark) 와 함께 인큐베이션하여 결합한 항체를 검출하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션하고 이어서 세정한 후, 상기 플레이트들을 실온의 어두운 곳에서 즉시 사용가능한 ABTS^® 용액 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 으로 현상하였다. 최대 농도의 흡광도가 충분한 OD 에 도달한 후 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

검사된 모든 IL-13R알파1 에 대한 항체들은 인간 IL-13Rα1 의 고정화 세포외 도메인에 결합할 수 있었으나, hIL-13Rα2 나 hIL-4Rα 에는 아니었다 (도 4).

실시예 15

HuMab 의 쥣과 IL -13Rα1 에 대한 교차반응성

키메라 단백질인 쥣과 IL-13Rα1:hFc (R&D Systems, UK) 를 PBS (1 μg/ml) 에 용해시키고, 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이션하여 마이크로티터 플레이트 (NUNC Maxisorb) 에 흡착되게 하였다. 상기 플레이트들을 세정 완충액 (WB = 0.9 % NaCl; 0.1% Tween® 20) 으로 세정한 후, 100 μl 인큐베이션 완충액 (IB = 1% Crotein C 및 0.1% Tween® 20 이 함유된 PBS) 을 첨가하고 실온에서 (RT) 30 분간 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 그 후, 연속 희석시킨 HuMab 및 대조군 항체 (HuMab 항-KLH 및 다클론 염소 항-hIL-13Rα1 (R&D Systems)) 를 상기 웰에 첨가하고(100 μl /웰; IB 로 희석), 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트들을 다시 세정하고, IB 중에 최종 1:500 으로 희석된 퍼옥시다제 접합 토끼 항-인간 카파 (DAKO, Denmark) 와 함께 인큐베이션하여 결합한 인간 항체를 검출하였다. 퍼옥시다제-접합된 당나귀 항-염소 IgG (Santa Cruz; IB 중 1:1000) 로 플레이트에 결합한 염소 항-hIL-13Rα1 항체를 검출하였다. 실온에서 1 시간 인큐베이션하고 이어서 세정한 후, 상기 플레이트들을 실온의 어두운 곳에서 즉시 사용가능한 ABTS^® 용액 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 으로 현상하였다. 최고 농도의 흡광도가 충분한 OD 에 도달한 후에 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다(도 5).

실시예 16

HuMab 의 사이노몰거스 ( Cynomolgus ) IL -13Rα1 에 대한 교차반응성

사이노몰거스 조직으로부터 RT-PCR 에 의해 IL-13Rα1 을 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 쥣과 세포주 Ba/F3 내로 트랜스펙션하였다. HuMab 가 사이노몰거스 IL-13Rα1 과 교차반응하는지 검사하기 위하여, 안정하게 트랜스펙션된 Ba/F3 세포 및 모 Ba/F3 세포를 10 μg/ml 의 HuMab 및 대조군 항체와 함께 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서는, 다클론 염소-항 hIL-13Rα1 (R&D Systems) 을 사용하였다. 포함된 음성 대조군은 하기였다: 인간 IgG1 골수종 단백질 (Nordic) 및 정상 염소 혈청. HuMab 를 검출하기 위해서 FITC 에 접합된 인간 IgG 에 대항하게 한 항체를 사용하고 염소 항체를 검출하기 위해서 FITC 에 접합된 염소 IgG 에 대항하게 한 항체를 사용하여, FACS 분석으로 결합한 항체를 검출하였다. 트랜스펙션된 Ba/F3 세포주 대 모 세포주에 대하여 검사된 개별 항체들에 대하여 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity, MFI) 를 비교하였다.

본 발명의 모든 HuMab 는 트랜스펙션된 Ba/F3 세포에서 발현된 사이노몰거스 IL-13Rα1 에 결합할 수 있었다. 인간 및 사이노몰거스 IL-13Rα1 간의 밀접한 상동성으로부터 예상되듯이, 다클론 AF152 항체 또한 사이노몰거스 IL-13Rα1 에 결합하였다. 상기 음성 대조군 항체는 트랜스펙션된 Ba/F3 세포주로 검사하였을 때 MFI 의 한계적 증가만을 나타내었다(표 5).

	항체	MFI Ba /F3	MFIBa /F3_ Cyno _ IL -13Rα1	Cyno _ IL -13Rα1 의 존재하에서 MFI 의 증가 배수
HuMab	LC5002-002	3.9	83.7	79.8
	LC5002-003	3.4	82.4	79.0
	LC5002-005	14.8	101.5	86.7
	LC5002-007	4.1	19	14.9
대조군	AF152	3.2	21.2	18.0
	정상 염소 IgG	3.3	5.7	2.4
	정상 인간 IgG1 (Nordic)	3.5	10.2	6.7
	항 인간 IgG-FITC 단독	3.3	5.5	2.2

실시예 17

IL -13Rα1 HuMab 의 Fc γ 수용체에의 결합 ( NK 세포 상의 Fc γ RIIIa 에의 결합)

본 발명의 항체가 자연 살해 (Natural Killer, NK) 세포 상의 FcγRIIIa (CD16) 에 결합하는 능력을 측정하기 위해서, 말초혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 분리하여 이를 FcγRIIIa 에 대한 차단 마우스 항체 (항-CD16, 클론 3G8, RDI, Flanders, NJ) 20 μg/ml 의 존재 또는 부재하에서 20 μg/ml 의 HuMab 항체 및 대조군 항체와 함께 인큐베이션하여, FcγRIIIa 를 경유한 결합을 입증하였다. 음성 대조군으로서는, FcγRIIIa 에 결합하지 않는 인간 IgG2 및 IgG4 (The Binding Site) 를 사용하였다. FcγRIIIa 결합에 대한 양성 대조군으로서 인간 IgG1 및 IgG3 (The Binding Site) 을 포함시켰다. PE-표지된 마우스 항-인간 CD56 (NK-세포 표면 마커) 항체 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 를 FITC-표지된 염소 F(ab)₂ 항-인간 IgG (Fc) 항체 (Protos immunoresearch, Burlingame, CA) 와 함께 사용하여 FACS 분석으로 NK 세포 상의 결합한 항체를 검출하였다. 검사된 HuMab 의 20 μg/ml 에서의 최대 결합 (Bmax: MFI±st.dev) 을 측정하였다.

580.6±245.8 의 Bmax (MFI) 값으로 알 수 있듯이 LC5002-005 는 FcγRIIIa 에 효율적으로 (대조군 IgG1 항체에 필적하는 정도로) 결합할 수 있었다. FcγRIIIa 대한 차단 항체의 첨가에 의해 LC5002-005 의 NK 세포에의 결합이 극적으로 감소되었는데(Bmax (MFI) 값: 260.4±95.90), 이는 FcγRIIIa 에 대한 특이적 결합을 나타낸다.

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Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-003 VH gamma/heavy chain variable domain <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-003 VL kappa/light chain variable domain <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-005 VH gamma/heavy chain variable domain <400> 5 Glu Val Gln Val Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Asp Trp Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ile Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-005 VL kappa/light chain variable domain <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-007 VH gamma/heavy chain variable domain <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Leu Asp Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-007 VL kappa/light chain variable domain <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-018 VH gamma/heavy chain variable domain <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Ser Trp Tyr Val Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5002-018 VL kappa/light chain variable domain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 12 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims

IL-13Rα1 에 결합하고, IL-13 의 생체활성을 저해하는 인간 항체로서, 이의 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 1 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 2 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 3 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 4 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 5 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 6 을, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 7 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 8 을, 또는 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 9 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 10 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
삭제
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제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 인간 γ1-중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

a) Gly₂₃₆ 이 결실된 아미노산 서열 Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅ 및/또는 아미노산 서열 Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁,

b) 아미노산 서열 Ala₂₃₄Ala₂₃₅ 또는

c) 아미노산 Ala₂₆₅ 및 Ala₂₉₇.
삭제
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제 1 항에 있어서, 하이브리도마 세포주 DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 또는 DSM ACC2712 로부터 수득되는 항체.
삭제
제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

a) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 1, 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 2, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

b) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 3 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 4, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

c) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 5 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 6, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12,

d) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 7 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 8, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12, 또는

e) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 9 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 10, κ 경쇄 불변 영역으로서 서열번호: 11 및 γ1 중쇄 불변 영역으로서 L234A 및 L235A 또는 D265A 및 N297A 돌연변이들을 임의로 갖는 서열번호: 12.
제 1 항에 따른 항체를 천식 또는 알레르기성 질환 환자를 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용하는 방법.
제 1 항에 따른 항체를 약학적으로 유효한 양으로 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환 환자를 치료하기 위한 약학 조성물.
제 1 항에 따른 재조합 항체를 제조할 수 있는 재조합 숙주 세포.
제 1 항에 따른 약학적으로 유효한 양의 항체를 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환 환자를 치료하기 위한 약학 조성물의 제조 방법.
IL-13Rα1 에 결합하고, IL-13 를 저해하는 인간 항체를 인코딩하는 핵산으로서, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 1 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 2 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 3 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 4 를, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 5 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 6 을, 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 7 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 8 을, 또는 중쇄 가변 영역으로서 서열번호: 9 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호: 10 을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 14 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터로서, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 벡터.
제 15 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
IL-13Rα1 에 결합하고, IL-13 를 저해하는 인간 항체의 제조 방법으로서, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 14 항에 따른 핵산을 발현시키고, 상기 세포로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 따른 항체를 재조합 발현 방법으로 제조하고, 상기 항체를 회수한 후, 상기 항체를 약학상 허용가능한 완충액 및/또는 어주번트와 배합하는 것을 특징으로 하는 천식 또는 알레르기성 질환 환자를 치료하기 위한 약학 조성물의 제조 방법.
하이브리도마 세포주 DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 또는 DSM ACC2712.
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