TWI306862B - Antibodies against il-13 receptor alpha 1 and uses thereof - Google Patents

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1306862 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗IL-13受體al(IL-13Ra(alpha)l)之人類抗 體、其製備方法及用途。 【先前技術】 IL-13係一種主要由Th2細胞但亦可由肥大細胞及nk細 胞產生之分泌型單體肽。11^13之生物學功能包括調節igE 生成及調介Th2發育。IL-13可與一由IL-13受體ai(IL_i3Ral) 鏈及IL-4受體a(lL-4Ra)鏈構成之受體複合體結合。^—^結 合主要係通過STAT6觸發信號轉導事件。IL-13可以低親和 力與IL-13 Ral單獨結合但不會與iL-4Ral結合。與此相反， IL-4可與IL-4Ra單獨結合但不會與lL-13Ral單獨結合。有人 曾闡述過IL-13之另一受體，gp lL-13Ra2。IL-13可以高親和 力與此受體結合。此受體可充當一誘餌受體。 IL-13在轉基因小鼠中之誘導型超量表現可引起一具有 許多哮喘患者特徵之表現型。該等小鼠出現黏液化生、巨 嗟細胞炎症、淋巴細胞炎症及嗜酸性粒細胞富集炎症、蛋 白激I# (如MMP-9、-12、-13、-2及-14，組織蛋白酶B、H、 κ及s)之上調且彼等亦出現表皮下纖維化。剔除IL_13之小 鼠由於Th2發育缺陷而出現Th2細胞因子生成的明顯減少。 儘管存在嗜酸性粒細胞炎症但此等小鼠不會發展成氣道高 反應（AHR)。藉由投與IL-13可恢復AHR，表明IL-13對於誘 發小鼠AHR而言既係必要條件亦係充分條件。與哮喘相關 之IL-13的其他重要生物學功能包括誘發杯狀細胞化生及 107551.doc 13〇6862 黏液生成。其直接作用於氣道上皮細胞、成纖維細胞及氣 道平滑肌細胞並在每一此等細胞類別中誘發不同的轉錄程 序。令人感興趣的是，化-^可降低平滑肌細胞中之腎上 腺素能反應，從而造成氣道狹窄。IL_13啟動子多態現象係 與過敏性哮喘之高風險性相關。IL_n基因中之多態現象係 與高水平之血清IgE相關。比_4與1；^13基因間之基因間序列 中單核苷酸多態現象係與特應性哮喘相關。 IL-13#抗劑曾用於若干動物模型中。舉例而言曾使用 過一可溶性小鼠IL-13Ra2-IgGFc融合蛋白質，其顯示出完 全逆轉卵清蛋白誘發之AHR及含黏液細胞之數目的效能。 即使在表現型完全出現以後給予該治療亦可獲得此逆轉。 除此之外’使用IL-13融合細胞毒素分子治療小鼠可達成慢 性真菌誘發之過敏性炎症中所有氣道疾病特徵的減輕。總 之，IL-13係一過敏反應效應臂之關鍵介體。 IL-13Ral係一造血素受體超家族（丨型細胞因子受體家族） 之成員並在 Obiri N. I等人，J. Biol. Chem.，270(1995) 8797-8804)及WO 96/29417中加以鑒定及闡述。lL-13Ral係一由 427個胺基酸（包含信號序列）構成之蛋白質。其DNA及蛋白 質序列闡述於WO 97/15663及SwissProt第P78552號中。 IL-13Ral係一以低親和力結合IL-13之糖基化蛋白質，然 而’當與IL-4Ra連接形成一異二聚體時，iL-13Ral可以高 親和力結合IL-13。此複合體亦係一 il-4之受體。 可自下列瞭解抗IL-13Ral之抗體：WO 96/29417、WO 97/15663、WO 03/080675、Graber P 等人之 Eur. J. Immunol， 107551.doc v<5>j 1306862 28(1998) 4286-4298、Poudrier J·等人之 J. Immunol, 163(1999) 1 153-1161、Poudrier J等人之 Eur. J. Immunol, 30(2000) 3157-3164、Aikawa M.等人之 Cytokine, 13(2001) 75-84。抗IL-13Ral之抗體可自 R&D Systems公司（USA)購 得。 【發明内容】 本發明包括一種可結合IL-13Ral並抑制IL-13生物活性之 抗體，其特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序列CDR3係選 自由SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR3序列組成之 群。 該抗體較佳係一人類抗體。 較佳地，該抗體之特徵在於其與IL-13Ral結合之親和力 係10_9 M(KD)或更低，較佳為1〇_9至10_13 Μ。 較佳地，該抗體之特徵在於其重鏈CDR1、CDR2及CDR3 序列係選自由SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR1、 CDR2及CDR3序列組成之群。 較佳地，該抗體之特徵在於該抗體之可變輕鏈胺基酸序 列 CDR1、CDR2及 CDR3 係選自由 SEQ ID NO : 2、4、6、8 或10之輕鏈CDR序列組成之群。 較佳地，該抗體之特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序 列 CDR1、CDR2及 CDR3 係選自由 SEQ ID NO : 1、3、5、7 或9之重鏈CDR序列組成之群，而該抗體之可變輕鏈胺基酸 序列 CDR1、CDR2及 CDR3 係選自由 SEQ ID NO : 2、4、6、 8或1 0之輕鏈CDR序列組成之群。 107551.doc •9·

v<5> _ I 1306862 該等CDR序列較佳係相互獨立地加以選擇且由FR區（構 架區）分開。 較佳地，該抗體之特徵在於包括作為重鏈CDR之SEQ ID NO : 1的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 2的CDR、作 為重鏈CDR之SEQ ID NO : 3的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 4 的 CDR、作為重鏈 CDR之 SEQ ID NO : 5 的 CDR及 作為輕鏈CDR之SEQ ID NO: 6的CDR、作為重鏈CDR之SEQ ID NO : 7的CDR及作為輕鏈CDR之SEQ ID NO : 8的CDR或 作為重鏈CDR之SEQ ID NO : 9的CDR及作為輕鏈CDR之 SEQ ID NO : 10的 CDR。 CDR序列係根據Kabat等人之 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中之標 準定義確定。在此基礎上，SEQ ID NO : 1至8之互補決定 區（CDR)具有以下序列： 重鏈 CDR : SEQ ID NO : 1、3、5、7、9之 CDR1(胺基酸 31 至 35) ; SEQ ID NO : 1、3、5、7、9之 CDR2(胺基酸 50至 66) ; SEQ ID NO : 1、3、9之 CDR3(胺基酸 99至 108) ; SEQ ID NO : 5 之 CDR3(胺基酸 99 至 107) ; SEQ ID NO : 7 之 CDR3(胺基酸99至112); 輕鏈 CDR : SEQ ID NO : 2、4、6、10 之 CDR1(胺基酸 24 至 34 ); SEQ ID NO: 8之 CDR1(胺基酸 24 至 35); SEQ ID NO : 2、4、6、10之 CDR2(胺基酸 50至 56); SEQ ID NO: 8之 CDR2(胺 基酸 51 至 57)及 SEQ ID NO : 2、4、6、10之 CDR3(胺基酸 89 107551.doc -10- 1306862 至 97) ; SEQ ID NO : 8之 CDR3(胺基酸 90 至 97)。 較佳地，本發明提供一抗體，該抗體包括作為互補決定 區（CDR)的下列序列： a) —包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體重 鍵； b) —包括SEQ ID NO : 2、4、6、8或10之輕鏈CDR的抗體輕 . 鏈，

其中該等CDR係相互獨立地加以選擇。 φ 較佳地，該抗體特徵在於包括作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 1及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 2、作為重鏈可變 區之SEQ ID NO : 3及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 4、作 為重鏈可變區之SEQ ID NO : 5及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO: 6、作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作為輕鏈可變 ' 區之SEQ ID NO : 8或作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作 為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 1 0。 較佳地，該抗體特徵在於包括：

® a)作為重鏈可變區之SEQ ID NO :卜作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 2、作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γΐ重 鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A及 Ν297Α的 SEQ ID NO : 12， b)作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 3及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 4，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為 γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A及 Ν297Α的 SEQ ID NO : 12， 107551.doc -11 - 1306862 c) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO: 5及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 6，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為 γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A及 Ν297Α的 SEQ ID NO : 12， d) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 7及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 8，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為 γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235 A或D265A及 N297A的 SEQ ID NO : 12，或 e) 作為重鏈可變區之SEQ ID NO : 9及作為輕鏈可變區之 SEQ ID NO : 10，作為κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作 為γΐ重鏈恆定區之視情況具有突變L234A及L235A或D265A 及 Ν297Α 的 SEQ ID NO : 12。 較佳地，該抗體特徵在於可與抗體LC5002-002、 LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及 / 或 LC5002-018 競爭結合IL-13Ral。較佳地，該抗體特徵在於包括作為可 變區之 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 或LC5002-018的可變區。此等抗體之可變區示於SEQ ID NO : 1至10中。此項技術領域中熟知該等可用恆定區。實 例示於SEQ ID NO: 11至12中。 該抗體較佳係一單株抗體或一以重組方式產生之抗體。 在一本發明實施例中，該抗體係一經類別轉換之人類抗 體。 在一本發明較佳實施例中，該抗體包含一包括下列之人 類γΐ重鏈： 107551.doc •12· ν<5> 1306862 a) 胺基酸序列PromVahMAla23 5 (缺失Glyn6)及/或胺基酸序 列 Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331， b) 胺基酸序列Ala234Ala235或 c) 胺基酸 Ala265 及 Ala297。 較佳地，本發明之抗體以一 6 nM或更低之IC5G值抑制 IL-13誘發之Stat-6磷酸化，以一20 nM或更低之IC5G值抑制 IL-13誘發之嗜伊紅趨化因子生成及/或以一 1〇 nM或更低 (IL-13)及60 nM或更低（IL-4)之ICsq值抑制IL-13或IL-4誘發 之細胞增殖（較佳為TF-1細胞（ATCC CRL 2003)之細胞增 殖）。根據實例6至8測定IL-13誘發之Stat-6鱗酸化、嗜伊紅 趨化因子生成及細胞增殖之誘發。 本發明抗體較佳不與變性IL-13Ral結合（結合親和力之 KD係1 (T6 Μ或更高）。較佳地，該抗體之特徵在於顯示實質 不具有與IL-13Ra2及IL-4Ra結合之交叉反應性（結合親和 力之KD係1〇_6 Μ或更高）。 本發明進一步提供可產生抗IL-13Ral之單株拮抗抗體的 雜交瘤細胞系。 本發明進一步提供編碼作為本發明抗體鏈之多肽的核 酸；包括該等核酸之表現載體；及用於重組產生此等抗體 之宿主細胞。本發明進一步提供以重組方式製備該等抗體 之方法。 由本發明核酸編碼之多肽係 a)—包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體重 鏈；及 107551.doc I3〇6862 b)-包括SEQ ID NO: 2、4、6、8或10之輕鏈CDR的抗體輕 此等多肽能夠與相應的其他抗體鏈組裝在一起產生一抗 體。 本發明抗體對需要皮質類固醇治療之患者很有益處。本 發明之抗體具有能夠對患有哮喘或過敏性疾病之患者產生 —益處的新穎性質及創造性性質。 本發明進一步提供用於治療哮喘及過敏性疾病之方法。 本發明進一步包括本發明抗體於治療哮喘及於製備一本 發明醫藥組合物中之用途。此外，本發明包括一製備本發 明醫藥組合物之方法。 本發明進一步包括一醫藥組合物，其包括一醫藥有效量 之本發明抗體，視情況連同一對調配用於醫藥目的之抗體 有用之緩衝劑及/或佐劑。 本發明進一步提供包括存於一醫藥上可接受之載劑中之 此等抗體的醫藥組合物。在一實施例中，醫藥組合物可包 含在一種製品或套組中。 本發明進一步包括一含有本發明核酸之載體，其能夠在 原核或真核宿主細胞中表現該核酸。 本發明進一步包括一含有本發明載體之原核或真核宿主 細胞。 本發明進一步包括一製備本發明重組人類抗體之方法， 其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表現本發明之核酸， 並自該細胞中回收該抗體。本發明進一步包括可以此重組 107551.doc -14- 1306862 方法獲得之抗體。 本發明進一步包括一種用於製備一醫藥組合物之方法， 其特徵在於以一不含該抗體之此種分析作為對照自複數個 抗IL-13Ral之抗體中選擇出一抗IL_i3Ral之抗體，藉由重組 表現產生該抗體，回收該抗體並使該抗體與一醫藥上可接 受之緩衝劑及/或佐劑相組合。較佳地，該抗體具有一或多 種上述額外性質。 【實施方式】 術語"IL-13IU1、鼠類 IL_13Rcd、IL_13、IL_13Ra2&IL 4Ra" 及其結構域為此項技術領域所熟知且由（例如）SwissPr〇t P78552、009030、P35225、Q14627 及 P24394界定。因此’ 除非另有說明’否則術語”IL-l3R(xl、IL_13、il-13R(x2及 IL-4Ra"係指人類多肽 IL_13Rcd、IL_13、IL_13Ra2&iL-4Ra。 本文所用術語，，人類抗體"包括具有可歸為確定之人類種 系免疫球蛋白序列（因其與此等種系序列具有高度序列相 似性或一致性）之可變區及恆定區（結構域）的抗體。人類抗 體已為當前技術領域所熟知（van Dijk，M A.，及van心

Winkel, J.G., Curr. 〇pin. Chem. Biol. 5(2001)368-374) 〇 可在轉基因動物(例如’小鼠)中產生人類抗體，該等動物能 夠在免疫後在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生一整組 人類抗體或經選擇之人類抗體。將人類種系免疫球蛋白基 因陣列轉移至此種系突變小鼠中可在抗原攻擊後導致人類 抗體的產生（參見例如]ak〇b〇vits，A等人，pn Nau. Ad

Sci. USA 90(1993)2551-2555 ;Jakobovits，Α·等人，Nature 10755 丨.doc -15- 1306862 362(1993)255-258 ; Bruggemann，Μ.等人，Year Immunol· 7(1993)33-40)。亦可在噬菌體展示文庫中產生人類抗體 (Hoogenboom，H.R·及 Winter，G.，J, Mol. Biol_ 227(1992) 381-388 ; Marks, J，D.等人，J. Mol. Biol. 222(1991)58卜 5 97)。亦可使用Cole等人及Boerner等人之技術製備人類單 株抗體（Cole 等人，Momoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，第 77頁（1985);及Boerner, P.等人， J_ Immunol· 147(1991)86-95)。一人類抗體涵蓋各種形式的 抗體’較佳為單株抗體’包括但不限於全抗體、抗體片段、 經類別轉換之抗體及基因工程抗體（變體或突變抗體），只要 此等保留本發明之特徵性質即可。尤佳者係重組人類抗 體。本文所用術語"單株抗體"係指所有具有大致相同胺基 酸序列之抗體分子製備物。 本文所用術語"重組人類抗體"擬包括可藉由重組方法製 備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如分離自一宿 主細胞（例如NS0或CHO細胞）或分離自一人類免疫球蛋白 基因之轉基因動物（例如，一小鼠）的抗體、或使用一轉染入 此一宿主細胞中之重組表現载體表現之抗體。此等重組人 類抗體具有呈重排形式之可變區及恆定區。該等本發明重 組人類抗體已經受活體内體細胞超突變。因此，重組抗體 VH及VL區之胺基酸序列可為經定義之人類種系vh及 序列但不必天然存在於整個人類抗體種系活體内。 術語”經類別轉換之抗體”係指一包括—來自一個來源或 107551.doc -16· 1306862 種系之可變區（即結合區）及至少一可與源自一不同來源或 種糸之抗體怪疋£相匹配之恆定區的一部分的單株抗體 (較佳為人類抗體）’該單株抗體通常可藉由重組DNA技術 製備。此等經類別轉換之抗體非天然產生者，因此，無法 直接自異種移植小鼠獲付。本發明所涵蓋之"經類別轉換之 抗體”形式係彼等其中恆定區與野生型恆定區序列存在差 異的抗體形式，該等差異可產生一具有本發明性質（尤其在 Clq結合及/或Fc受體（FcR)結合方面）之抗體，即藉由以改變 或突變產生。經類別變換之抗體係包括編碼免疫球蛋白可 變區之DNA片段及編碼免疫球蛋白恆定區之dna片段的經 表現之免疫球蛋白基因的產物。用於產生經類別變換之抗 體的方法已為業内所熟知，該等方法涉及習用重組DNA技 術及基因轉染技術（參見，例如，M〇rds〇n，s丄.等人’ Pr〇c

Natl· Acad· Sci. USA 81(1984)6851-6855;美國專利案第 5,202,238 號及第 5,2〇4,244號）。 本文所用"可變區'，（輕鏈之可變區（VL)、重鏈之可變區 (VH))表示每一直接參與抗體_抗原結合之輕鏈與重鏈對。 可變人類輕鏈及重鏈結構域具有相同之通用結構，且每一 結構域包含四個其序列高度保守之構架（FR)區，該等區 經由三個，，超變區”（或互補決定區，CDR)連接。構架區採用 —P(beU)_折4構象’而CDR則可形成能連#β_折疊結構之 回環（1〇〇ρ)。每—鏈中之CDR係藉由構架區來保持其三維結 構，並與另—财之CDR—起形成抗原結合位點。抗體重 107551.doc -17- 1306862 鏈及輕鏈之CDR3(較佳為重鏈CDR3)區在本發明抗體之結 合專一性/親和力方面具有特別重要的作用，且其藉此可提 供本發明之另一目的。 本文所用術語"超變區"或"一抗體之抗原結合部分”意指 一抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含，I互補 決定區”或”CDR”之胺基酸殘基^ "構架"或"FR"區係彼等除 本文所定義的超變區殘基以外之可變結構域區。因此，一 抗體之輕鏈及重鏈自N-端至C-端包含結構域FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。CDR及 FR區係根據Kabat 專人之 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版 ’ Public Health Service，National Institutes of Health，

Bethesda，MD(1991)中之標準定義確定。 H恆定結構域”並不直接參與一抗體至一抗原之結合，而 係展現各種效應物功能，端視其重鏈恆定區之胺基酸序列 而疋，抗體或免疫球蛋白可分為下列類別：IgA、igD、igE、 IgG及IgM，且可將此等中之若干類別進一步分為亞類（同型 物）’例如 IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4、IgAl 及 IgA2。將對應 於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定區分別稱作μ、δ、γ、α 及ε。本發明抗體較佳屬於QG1類型β 一抗體之Fc部分直接參與補體活化、clq結合、C3活化 及Fc受體結合，CIq之結合係由確定之⑽分結合位點引 起。此等結合位點為此項技術領域所知且闡述於下列文獻 及專利中.（例如）Lukas，T.L等人，j. immun。丨· 127(1981) 2555-2560 ; Bnmhouse，R.及 Cebra，j.j” M〇1. Immun〇1. 10755l.doc

•18- 1306862 16(1979)907-917 ; Burton, D.R·等人，Nature 288(1980) 338-344 ； Thommesen, J.E.等人，Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004 ; Idusogie，E.E.等人，丁.111111^11〇1.164(2000)4178-4184 ; Hezareh，Μ·等人，J. Virol. 75(2001)12161-12168 ; Morgan, A.等人，Immunology 86(1995)319-324 ;以及歐洲 專利第0 307 434號。此等結合位點係（例如）L234、L23 5、 D270、N297、E318、K320、K322、P331 及 P329(根據 Kabat EU索引編號，參見下文）。IgGl、IgG2及IgG3亞類抗體通 常會顯示補體活化、Clq結合及C3活化等功能’而IgG4不 會活化補體系統、不會結合C 1 q且不會活化C3。本文所用 術語”源自人類來源之Fc部分"係指較佳具有一經修飾後檢 測不到Clq結合、C3活化及/或FcR結合或與一人類IgGl抗體 相比結合程度至少降低50%(較佳降低70%)之人類IgGl亞類 抗體Fc部分之胺基酸序列的Fc部分。"一抗體之Fc部分"係 一為熟習此項技術者所熟知之術語’且係根據抗體之木瓜 蛋白酶解離來定義。本發明抗體包含一較佳具有一源自人 類來源之Fc部分胺基酸序列且較佳具有該等人類恆定區之 所有其他部分之Fc部分。較佳地，Fc部分係一來自人類IgG 1 亞類之經突變人類Fc部分。最佳者係包括一 γΐ-重鏈恆定區 (一實例示於SEQ ID NO : 11中）之具有突變L234A及L235A 或 D265A及 N297A(WO 99/51642)的 Fc部分。 人類恆定鏈（例如，γ 1 -重鏈）詳細闡述於Kabat等人之 Sequences of Proteins of Immunological Interest ’ 第 5版’ Public Health Service，National Institutes of Health ’ 107551.doc -19- 1306862

Bethesda，MD_(1991)及Briiggeman„ 以松 ^ Ά/Γ , mann，M等人之；[.£乂1).^^& 166(1987) 1351-1361 1 Love, T , i 人之Methods Enzymol. 178(1989) 515-527中。本發明之較佳恆定結構域不提供補 體結合。本文所用”可變區”（輕鏈之可變區（vl)、重鏈之可 變區（VH))表示輕鏈與重鏈對中每—直接參與抗體·抗原結 合之鏈。

本文所用術語"核酸或核酸分子”擬包括DNA分子及鹽 分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但較佳係雙鏈祖。 當核酸放置在另-核酸序列之功能關係中時，該核酸係 為"以可操作方式連接的”。例如，若前序列或分泌前導序 列之DNA被表現為參與多肽分泌之前蛋自，則該前序列或 分泌前導序狀職係以可操作方式連接至該多肽之腦 上啟動子或;t曰強子若可影響編碼序列之轉錄，則該啟動 子或增強子係以可操作方式連接至該編碼序列上；或若核 糖體結合位點經定位後可促進轉譯，則該核糖體結合位點 係以可操作方式連接至該編碼序列上。一般而言，”以可操 :方式連接的”意指經連接《DNA序列係順式的，且在分泌 前導序列之情形中’其既鄰接亦處於閱讀框中。然而，增 強子則無需是連續的。肖由在習知限制酶位點處之接合可 完成連接。若該等限_位點不存在，則可根制知操作 使用合成性寡核苷酸接頭或連接子。 如本文所用表現’’細胞”、,，細胞系"及，，細胞培養物，，可互換 使，用且所有此等表述皆包括其子代。目此，詞語"轉化子” 及轉化細胞包括原代受試細胞及源自其之培養物而不考 107551.doc -20- 1306862 慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量皆可能因特 意或無意突變而不精確相同。亦包括同最初轉化細胞中所 篩選者具有相同功能或生物學活性之變異子代。當擬使用 不同名稱時，可根據上下文而明瞭。 本文所用術語”與IL-13Ral之結合”意指在一體外分析中 (較佳在一其中抗體與一表面結合且藉由表面電漿共振 (SPR)量測與IL-13Ral之結合的結合分析中）抗體與 IL-13Ral之結合。”結合”意指一 10_8 Μ或更低，較佳為10_13 至10_9 Μ之結合親和力（KD)。”無結合”意指一 10_6 Μ或更高 之KD。本發明之抗體與人類IL-13Ral(且較佳亦可為小鼠 IL-13Ral)之胞外結構域結合。 可藉由 BIAcore 分析（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden )研究與IL-13Ral之結合。結合親和力係藉由術語 ka(與抗體/抗原複合物中之抗體締合之速率常數）、kd(解離 速率）及KD(kd/ka)界定。 IL-13與IL-13R(xl之結合可由本發明抗體抑制。在一用於 測定IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異二聚體之結合的ELISA中量 測以IC5Q表示之抑制作用。為實施此一分析，對IL-13Ral 實施固定化並加入IL-13與IL-4Ra。本發明抗體之IC5〇值（對 於IL-13與IL-13Ral之結合）係不大於6 nM。IC5Q值係作為至 少三個獨立的測量之平均值或中值加以量測。個別IC 5 〇值可 能會超出範圍。 較佳地，本發明之抗體顯示可與一選自由抗體1^匚5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5 002-007 或 LC5 002-0 18 107551.doc -21 - 1306862 組成之群的抗體在IL-13Ral之相同抗原決定部位與其結 合，或在與IL-13Ral結合時因彼等抗體結合引起之空間位 阻而受到抑制。藉由一 SPR分析使用一選自由抗體1^€5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或 LC5002-018 組成之群的固定化抗體及濃度為20至50 nM之IL-13Ral及 濃度為100 nM之待檢測抗體來檢測結合抑制作用。一50% 或以上之信號減少表明該抗體與一選自由抗體1^〇5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007或 LC5002-018 組成之群的抗體產生競爭。術語"抗原決定部位”意指一能 夠特異結合至一抗體之蛋白質決定子。抗原決定部位通常 由分子之化學活性表面基團（例如，胺基酸或糖之側鏈）組 成，且其通常具有特異性的三維結構特徵以及特異電荷特 徵。構象及非構象抗原決定部位之不同之處在於當存在變 性溶劑時，與構象抗原決定部位之結合會喪失，而與非構 象抗原決定部位之結合則不會喪失。本發明亦包括可與 IL-13Ral結合並抑制IL-1 3Ral生物活性之人類抗體，其特徵 在於與IL-13Ral結合之親和力係10_9 M(KD)或更低，較佳為 10·9至10·13 Μ且與鼠類IL-13Ral結合之親和力係10_7 M(Kd) 或更低，較佳為1(Γ8至1(Γ9 Μ。 在一本發明較佳實施例中，本發明抗體進一步由一或多 種選自由下列組成之群的特徵來表徵：結合參數ka、kd及 KD，與一選自由抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、1^5002-007或1^5002-018組成之群的抗體結合至同一 抗原決定部位上。 107551.doc -22· 1306862 本發明之抗體較佳係由重組方式產生。此等方法廣泛為 此項技術領域中已知且包括於原核及真核細胞中表現蛋白 質以及隨後分離抗體多肽且通常將其純化至醫藥上可接受 之純度。為表現蛋白質，藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈 之核酸或其片段插入至表現載體中。在諸如CH〇細胞、ns〇 細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿 菌細胞等適宜原核或真核宿主細胞中實施該表現，並自該 等細胞（上清液或裂解後之細胞）回收抗體。 以重組方法製備抗體已為此項技術領域所熟知且闡述 於，舉例而言 ’ Makrides, S.C·，Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202、Geisse，S.等人，卩1*〇16111丑\卩1'.?111*1£',8(1996) 271-282、Kaufman, R.J.，Mol. Biotechnol· 16(2000) 151.161、

Werner，R.G·’ Drug Res. 48(1998) 870-880等評論性文章中。 抗體可以完整細胞、細胞裂解物或一經部分純化或實質 純之形式存在。藉由標準技術（包括鹼/SDS處理、CsCl分離 紋帶法、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法及其他業内熟知 方法）實施純化以去除其他細胞組份或其他雜質，例如其他 細胞核酸或蛋白質。參見Ausubel，F.等人編寫之Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。 於NS0細胞中之表現闡述於（例如）Barnes, L.M.等人之

Cytotechnology 32(2000)109-123 中及 Barnes, L-M.等人之 Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270中。瞬時表現闡述於（例 如）Durocher，Y等人之Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變 107551.doc -23- 1306862 結構域之選殖闡述於Orlandi，R.等人之Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 86(1989) 3833-3837 ; Carter, P#A2Proc.Natl· Acad. Sci· USA 89(1992) 4285-4289 ;及Norderhaug，L等人 之J，Immunol. Methods 204(1997) 77-87中。一較佳瞬時表 現系統（HEK 293)闡述於Schlaeger，E.-J.及Christensen, K. 之 Cytotechnology 30(1999) 71-83 以及 Schlaeger，E.-J.之 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中。 例如’適於原核生物的控制序列包括一啟動子、視情況 包括一操縱序列及一核糖體結合位點。已知真核細胞可利 用啟動子、增強子及聚腺苷酸化信號。 適於藉由習用免疫球蛋白純化程序（例如，蛋白A-瓊脂糖 凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法） 自培養基中分離出單株抗體。使用習用程序易於分離並定 序編碼單株抗體之DNA及RNA。雜交瘤細胞可作為此DNA 及RNA之來源。一旦分離，即可將該DNA插入至表現載體 中’然後將該等載體轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白 之宿主細胞（例如CHO細胞、HEK 293細胞、或骨髓瘤細胞） 中’以便在宿主細胞中達成重組單株抗體之合成。 另外本發明抗體包括彼等具有”保守序列修飾"（核苦酸 及胺基酸序列修飾）之抗體，該等修飾不影響或改變本發明 抗體之上述特徵。可藉由諸如定點誘變及pCR介導之誘變 等業内已知標準技術來引入修飾。保守胺基酸取代包括其 中胺基酸殘基由一具有類似側鏈之胺基酸殘基取代的取 代。業内已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家 10755 丨.doc •24· 1306862 族包括具有鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸 性側鏈（例如’天冬胺酸、麩胺酸）、無電荷之極性側鏈（例 如’甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪 胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈 胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、 β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸）以及芳香族 側鍵（例如’路胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）之胺基酸。 因此’人類抗-IL-13Ral抗體中預期之非必需胺·基酸殘基較 > 佳可用相同側鏈家族中之另一胺基酸殘基取代。 胺基酸取代可以 Riechmann，L.等人（Nature 332(1988)

323-327)及 Queen，c 等人（Pr〇c Natl. Acad. Sci· USA 86(1989) 10029-1003 3)所述之分子模型為基礎之突變作用 達成。 藉由將適當核苷酸改變引入至該抗體DNA中，或藉由肽 合成作用可製備出人類IL-13Ral抗體之胺基酸序列變體。 g 然而’僅可在極有限的範圍（例如，如上所述者）内實施此等 修倚作用。舉例而言，儘管該等修飾作用不會改變上述抗 體特徵’例如，IgG同型物及抗原決定部位之結合，但其可 提高重組產物之產率、蛋白質穩定性或促進純化。 任何不參與維持抗·IL_13Ral抗體之正確構象之半胱胺酸 殘基亦可經取代（一般使用絲胺酸取代），以提高分子之氧化 穩定性並阻止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵結添加 於抗體中以提高其穩定性，特別係在該抗體係一抗體片段 (例如，Fv片段）之情形中。 107551.doc -25- 1306862 另一類抗體之胺基酸變體係改變抗體之原初糖基化形 式。"改變”意指删除一或多個存在於抗體中之碳水化合物 部分’及/或增加一或多個在抗體中原本不存在之糖基化位 點。抗體之糖基化通常係與N連接的。”與N連接的"係指碳 水化合物部分與一天門冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列 天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬酿胺·χ_蘇胺酸（其中X係除捕胺 酸外之任何胺基酸）係該碳水化合物部分與該天冬醯胺侧 鏈酶促連接之識別序列。故’多肽中存在任一種該等三肽

序列均可產生潛在性糖基化位點。通常，藉由改變胺基酸 序列以使抗體中含有一或多個上述三肽序列（對於與N-連 接的糖基化位點）來完成將糖基化位點輕易地加入至抗體 中〇 可藉由各種業内已知方法製備編碼抗_IL_13Ral抗體胺基 酸序列變體之核酸分子，此等方法包括但不限於自天然來 源刀離（對於天然存在之胺基酸序列變體之情形）或藉由對 早期製備之抗-IL-13R(xl抗體變體或非變體形式實施寡核苷 酸介導之（或定點）誘變、PCR誘變及序列盒誘變來製備。 另一類型之共價修飾作用涉及以化學方式或酶促方式將 糖苷偶聯至抗體上。該等程序很有益處，因其不需要在具 有N-或0-連接糖基化作用之糖基化能力之宿主細胞中產生 抗體。端視所用偶聯模式而定’糖類可結合至⑷精胺酸及 組胺酸、（b«離隸、⑷游離職（例如彼等半胱胺酸之 疏基)、⑷游離經基(例如彼等絲胺酸、蘇胺酸或經脯胺酸 之-基)、⑷芳族殘基(例如彼等苯丙胺酸、路胺酸或色胺 10755I.doc • 26 - \<9) 1306862 酸之芳族殘基）或（f)穀胺醯胺之醯胺基上。該等方法闌述於 WO 87/05330及 Aplin，J.D.與 Wriston，J.C, Jr., CRC Crit

Rev. Biochem. (1981) 259-306 中0 移除任何存在於抗體中之碳水化合物部分可以化學或酶 促方法完成。以化學方法實施去糖基化作用需要將抗體暴 露於化合物三氟甲石黃酸或一等效化合物中。此處理會切除 連接糖（N-乙酿胺基葡萄糖或N-乙醢半乳糖胺）以外的大部 分或全部糖類’而保留完整的抗體。以化學方法實施去糖 基化作用闡述於 Sojahr，Η·Τ_ 及 Bahl，O.P.(Arch. Biochem.

Biophys. 259(1987) 52-57)及 Edge，A_S.等人（Anal· Biochem. 1 18(1981) 131-137)中。以酶促方法切除抗體上碳水化合物 部分則可藉由使用各種如Thotakura，N.R.及Bahl, 0-P，（Meth. Enzymol· 13 8(1987) 350-359)所述之内切及外切 糖苷酶來達成。 抗體之另一類型共價修飾作用包括將該抗體以美國專利 案第 4,640,835 號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之方法 連接至各種非蛋白質聚合物之任一種上，例如，聚乙二醇、 聚丙二醇或聚氧化烯烴。 在又一態樣中，本發明提供自表現本發明人類抗_IL_ 13Ral抗體的非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）中分離之 B細胞。較佳地，該等經分離b細胞系自一已由一；[L·丨3Ral 抗原及/或表現IL-13Ral之細胞的純化或富集製備物免疫之 非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）得到。較佳地，該非人 107551.doc •27·

1306862 類轉基因動物（例如轉基因小鼠）具有一包括可編碼本發明 抗體全部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之 基因組。然後使經分離B細胞永生化以提供一人類抗_IL_ 13Ral抗體之來源（例如雜交瘤）。因此，本發明亦提供一種 能夠產生本發明人類單株抗體之雜交瘤。在一實施例中， 該雜交瘤包括一自一非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠） 得到的B細胞’該轉基因動物具有一融合至一永生化細胞之 基因組’該基因組包括可編碼本發明抗體之全部或一部分 之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因。 在一特定實施例中，非人類轉基因動物係一轉基因小 鼠，其具有一包括可編碼一本發明抗體之全部或一部分之 人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組。可用—IL_ 13Ral抗原及/或表現IL_13Ral之細胞的純化或富集製備物 來免疫該非人類轉基因動物。較佳地，該非人類轉基因動 物（例如轉基因小鼠）能夠產生針對IL_13Ral之人類單株抗 體的IgGl同型物。 可藉由使用IL-13Ral抗原及/或表現IL_13Ral之細胞的純 化或富集製備物免疫具有一包括可編碼一本發明抗體之全 部或一部分之人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉基因之基因組 的非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠）來產生本發明人類 單株抗體。隨後得到該動物之B細胞（例如脾臟b細胞）並將 其與骨n瘤細胞融合以形成可分泌抗IL_13Ral之人類單株 抗體的永生雜交瘤細胞。 在較佳實把例中，可使用攜帶部分人類免疫系統而非 107551.doc •28- 1306862 小鼠系統之轉基因小鼠來產生直接針對IL-13Rod之人類單 株抗體。此等轉基因小鼠（本文中稱為"HuMab"小鼠）含有一 編碼未重排人類免疫球蛋白基因（其包括重及γ)鏈及 <輕 鍵）（怪定區基因）之人類免疫球蛋白基因微小基因座’以及 使内源μ及κ鍵基因座失活之把標突變（Lonberg，Ν.等人， Nature 368(1994)856-859)。因此，該等小鼠展現出小鼠lgM 或K之表現的降低’且所誘導之人類重鏈及輕鏈轉基因響應 免疫而經受類別轉換及體細胞突變進而產生高親和力人類 IgG單株抗體（Lonberg，N.等人 ’ Nature 368(1994) 856_859 ; 論述於 Lonberg, N. ’ Handbook of Experimental Pharmacology 113(1994)49-101 中；Lonberg，N.及 Huszar， D.，Intern· Rev. Immunol. 25(1995)65-93 ;及 Harding, F.及 Lonberg，N.，Ann. N. Acad. Sci. 764(1995)536-546)。HuMab 小鼠之製備闡述於Taylor, L.等人之Nucleic Acids Research 20(1992) 6287-6295 ; Chen, J.等人之 International

Immunology 5(1993) 647-656 ; Tuaillon，N. #AiProc.Natl. Acad. Sci USA 90(1993) 3720-3724 ; Choi, T.K.等人之 Nature Genetics 4(1993) 1 17-123 ; Chen，J.等人之 EMBO J. 12(1993) 821-830 ; Tuaillon，N等人之 Immunol 152(1994) 2912-2920 ; Lonberg，N等人之Nature 368(1994) 856-859 ; Lonberg, N·，Handbook of Experimental Pharmacology 1 13(1994) 49-101 ; Taylor，L 等人之 Int. Immunol. 6(1994) 579-591 ; Lonberg, N.&Huszar，D.,Intern.Rev.Immunol· 25(1995) 65-93; Harding, F及 Lonberg, N·，Ann. N· Acad· Sci 107551.doc -29- 1306862 764(1995) 536-546 ; Fishwild，D.Μ. 等人之Nat.Biotechnol· 14(1996) 845-85卜所有該等參考文獻之全部内容以引用方 式併入本文中。進一步參閱，美國專利案第5,545,806號； 第 5,569,825號；第 5,625,126號；第 5,633,425號；第 5,789,650 號；第 5,877,397號；第 5,661，016號；第 5,814,318號；第 5,874,299 號；第 5,545,807 號；第 5,770,429 號；WO • 98/24884 ; WO 94/25585 ; WO 93/1227 ; WO 92/22645 以及 WO 92/03918。 φ 為產生針對IL-13Ral之完整人類單株抗體，可根據通用 方法用一 IL-13Ral抗原及/或表現IL-13Ral之細胞的純化或 富集製備物免疫HuMab小鼠，如Lonberg, N.等人在Nature 368(1994)856-859 中；Fishwild，D.M.等人在 Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851中及WO 98/24884中所述。較佳地，該等 小鼠在經第一次免疫時為6至16週齡。舉例而言，可使用一 可溶性IL-13Ral抗原之純化或富集製備物（例如自表現 IL-13Ral之細胞純化而得）經腹媒腔内免疫HuMab小鼠。若 ® 使用一 IL-13Ral抗原之純化或富集製備物免疫未產生抗 體，則亦可使用表現IL-13Ral之細胞（例如一腫瘤細胞系） 來免疫小鼠以促進免疫應答。有關各種抗原之累積經驗已 表明，當初始用存於完全Freund氏佐劑之抗原經腹膜腔（i.p.) 免疫且隨後每隔一周用存於不完全Freund氏佐劑之抗原交 替進行i.p.或s.c.免疫（例如，直至總共6次）時，HuMab轉基 因小鼠反應最佳。可用藉由使用眼窩後放血得到之血漿樣 品監控整個免疫程序過程中之免疫應答。可藉由ELISA篩 107551.doc -30- 1306862 選血漿，且可使用具有足夠抗比-^汉“人類免疫球蛋白滴 度的小鼠來使相應B細胞永生化。可在宰殺及切除脾臟及淋 巴結前3至4天用抗原經靜脈對小鼠加強免疫。預計對於每 一抗原可能需要實施2至3次融合。對於每一種抗原需免疫 若干小鼠。例如，可總共免疫5至12只HCo7及HC〇12係之 HuMab小鼠。 HCo7小鼠在其内源輕鏈⑻基因中具有一 JKD破壞（如

Chen, J.等人在 EMBO J. 12(1993)821-830 中所述）、在其内 源重鏈基因中具有一 CMD破壞（如WO 01/14424實例1中所 述）、一 KCo5人類κ輕鏈轉基因（如Fishwild, d.M.等人在Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851 中所述）以及一 HCo7人類重鏈 轉基因（如美國專利案第5,770,429號中所述）。 HCol2小鼠在其内源輕鏈（κ)基因中具有一 JKd破壞（如

Chen, J·等人在 EMBO J· 12(1993)821-830 中所述）、在其内 源重鏈基因中具有一CMD破壞（如W0 01/14424實例1中所 述）、一 KCo5人類κ輕鏈轉基因（如Fishwild, D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851 中所述）以及一 HCo 12 人類重 鏈轉基因（如W0 01/14424實例2中所述）。 可分離小鼠淋巴細胞並根據產生雜交瘤之標準程序使用 PEG使其與一小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後篩選所得到之 雜交瘤以用於產生抗原專一性抗體。例如，用50% PEG使 來自經免疫小鼠之源於脾臟與淋巴結之淋巴細胞的單一細 胞懸浮液與1/6量之SP 2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC ’ CRL 1581)融合。以約2χ105個細胞之量將該等細 107551.doc •31 · 1306862 胞鋪板於平底微量滴定板中，隨後在選擇培養基中培育約2 周。 隨後藉由ELISA篩選各孔以選出人類抗IL_i3Rai單株 IgM及IgG抗體。一旦出現大量雜交瘤生長，即分析培養基， 此通常係在10至14天之後。將分泌抗體之雜交瘤重新鋪板 並再次筛選，若仍對人類IgG、抗lL-13Ral單株抗體呈陽 性’則可藉由限制稀釋將其至少亞選殖2次。然後在活體外 培養穩定的亞係以在組織培養基中產生抗體以供定性。 由於CDR序列負責抗體-抗原相互作用，因此有可能藉由 在來自一不同人類抗體之構架序列上構建包含本發明cDR 序列的表現載體來表現本發明重組抗體（參見例如，

Riechmann，L.等人，Nature 332(1998)323-327 ; J0nes，P. 等人，Nature 321(1986)522-525 ;及 Queen，C·等人，Pr〇c

Natl. Acad.參見 U.S.A. 86(1989)10029-10033)。可自包括種 系人類抗體基因序列之公共DNA資料庫獲得此等構架序 列。此等種系序列將不同於成熟抗體基因序列，原因在於 其不包括完整組裝之可變基因（其在B細胞成熟期間藉由 V(D)J連接而形成）。種系基因序列在各個均勻交叉可變區 處亦將不同於一高親和力次級完整抗體之序列。 本發明較佳包括一編碼一與IL_13Ral結合之多肽的核酸 片段，該多肽可藉此抑制11^13與江_1311〇[1之結合，該片段 選自由下列組成之群： a)-包括SEQ ID NO : 1、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體重 鏈； I07551.doc 1306862 b)-包括SEQIDN0: 2、4、6、8或1〇之輕鏈cdr的抗體輕 鍵， 將重新構建之重鏈及輕鏈可變區與啟動子、轉譯起始 區、怪定區、3’非轉譯區、聚料酸化作用序列及轉錄終： 區之序列相組合，以形成表現載體構建體。重鏈及輕鏈表 現構建體可組合至單一載體中，經共轉染、連續轉染或分 別轉染至宿主細胞中，然後將該等宿主細胞融合成可表現 兩條鏈之單一宿主細胞。 因此，本發明提供一種用於製備本發明重組人類抗體之 方法’其特徵在於表現一編碼下列之核酸： a) —包括SEQ ID N0 : i、3、5、7或9之重鏈CDR的抗體重 鏈； b) -包括SEQ ID NO : 2、4、6、8或i 〇之輕鍵cdr的抗體輕 鍵。 本發明進一步包括本發明抗體在活體外鑒定IL-13Ral之 用途，較佳地係以免疫分析法測定樣品々IL:13Rai與本發 明抗體間之結合。 在另一態樣中，本發明提供一種組合物（例如，一種醫藥 組合物），其含有與一醫藥上可接受之載劑調配在一起的本 發明人類單株抗體的—種或其組合或其抗原結合部分。 本文所用"醫藥上可接受之載劑”包括任何及所有生理上 兼容之溶劑、分散介質、塗佈劑、抗細菌劑及抗真菌劑、 等渗劑及吸收延遲劑以及諸如此類。載劑較佳適於經靜脈 内、經肌内、經皮下 '非經腸、經脊髓或經表皮施用（例如， 107551.doc -33- 1306862 經注射或經輸注施用）β 嫌面藥上可接叉之鹽”意指可保留抗體所需生物活性且不 帶來任何不良之毒理學效應之鹽（例#，參見Berge，s M.等 人jJ· Pharm. SC1. 66(1977)丨-”）。該等鹽涵蓋於本發明中。 該等鹽之實例包括酸加成鹽及驗加成鹽。酸加成鹽包括彼 等衍生自無毒性無機酸者，例如氫氣酸鹽。 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之組合 物。熟習技術者㈣瞭，投與途徑及/或方式將端視期望結 果而變化。 為以某些投藥路徑投與本發明化合物，可能需要使用一 材料塗覆該化合物或將該化合物與該材料共投與，以避免 本發明化合物失去活性。舉例而言，該化合物可於合適載 脂質體或稀釋劑)中投與患者。醫藥上可接受之稀 釋劑I括鹽水及水性緩衝溶液。 制^上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及臨時配 -，，，，函注射用溶液或分散液所用之無菌粉末。用於醫藥活 性物質的該等介質及試劑之料已為#内所知。 =二短語"非經腸投與，，及，，以非經腸方式投與”意指 除絰％及局部投與以外之其他 #，日# β 1 仅一方式，通常係注射方 '、包括（不受限制）經靜脈内、經m & ^ n , 、二肌内、經動脈内、經 鞘内&囊内、經眼窩内、經心臟 内H答，& 啊1鉍皮内、經腹膜腔 内厶虱官、經皮下、經表皮下、經關銘向 蛱絪瞄T 關即内、經囊下、經 蛛，.賴下、經脊柱内、硬膜外及 贫楚4人 内〉主射及輸注。 該荨組合物亦可包含佐劑，例 肉Μ、潤濕劑、乳化 107551.doc 1306862 駭卜藉由上述滅菌程序及藉由引人各種抗細菌劑 及抗真菌劑(例如’對氧苯甲酸、氣丁醇、苯酚、山梨酸及 =似物）二者可確保防止微生物的存在。該組合物中亦可能 而要加入等參劑’例如糠類、氣化鈉及類似物。另外，藉 月t* i緩吸收之試劑（例如，單硬脂酸鋁及明膠）可 可注射醫藥形式之長效吸收。

卜不管選擇何種投與路徑，皆可藉由已為彼等熟習此項技 2者所知之習用方法將可以適#水合形式使用之本發明化 口物及/或本發明醫藥組合物調配成醫藥上可接受之劑型。 本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量水平可加以變 化’以獲得針對—特定患者、組合物及施用方式可有效達 到期望料效果且不使患者中毒之活性成份量。所選擇之 劑量水平端視各種醫藥動力學因素而定，料因素包括本 發明所用特定組合物或其酯、其鹽或其醯胺之活性、投與 路仫杈與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續 時間、其他與所用特定組合物—起使用之藥物、化合物及/ 或材料、待治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、健 康狀況及先前病史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。 該組合物必須係I菌的 只你…、囷的，且具有可以注射器遞送該組合 物之流動性。除水外，載査丨·^ &楚 執w 了為荨參緩衝鹽水溶液、乙醇、 多元酵（舉例而言，甘油、而_ 丙一％及液悲聚乙二醇及類似物） 及其合適之混合物。 舉例而言，可藉由使用 況下維持所需粒度及使用 塗佈劑（例如卵磷酯）、在分散狀 表面活性劑維持適當之流動性。 107551.doc -35- 1306862 在許多狀況下，較佳者係在組合物中加入等滲劑（例如糖 類）多元醇（例如甘露醇或山梨醇）及氣化鈉。可藉由在組 合物中加入一能延緩吸收之藥劑（例如單硬脂酸鋁或明膠） 來達成對可注射組合物之長期吸收。 提供下列實例、參考文獻、序列表及圖示係用於幫助理 解本發明，本發明之真實範圍於隨附申請專利範圍中闡 明。應瞭解，可對所列程序實施多種修改，此並不偏離本 發明之精神。 實例 實例1 雜交瘤之生成 藉由使用表現人類IL-13Ral之細胞免疫一具有一包括可 編碼全部或一部分本發明抗體之人類重鏈轉基因及人類輕 鏈轉基因之基因組的非人類轉基因動物（例如轉基因小鼠） 來製備本發明之人類單株抗體。然後得到該動物之B細胞 (例如脾臟B細胞）並將其與骨髓瘤細胞融合以形成可分泌 抗IL-13Ral之人類單株抗體的永生雜交瘤細胞。可使用攜 帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉基因小鼠來產生直 接針對人類IL-13Ral之人類單株抗體。此等轉基因小鼠（本 文中稱為"HuMab"小鼠）含有一編碼未重排人類免疫球蛋白 基因（其包括重（μ及γ)鏈及κ輕鏈）（恆定區基因）之人類免疫 球蛋白基因微小基因座，以及使内源μ及κ鏈基因座失活之 乾標突變（Lonberg’N.等人，Nature 368(1994)856-859)。因 此’該等小鼠展現小鼠IgM或κ之表現降低，且所誘導之人 107551.doc 36· 、妇 1306862 類重鏈及輕鏈轉基因響應免疫而經受類別轉換及體細胞突 變進而產生高親和力人類IgG單株抗體。為完全產生針對人 類IL-13Ral之人類單株抗體，可根據通用方法用表現人類 IL -13Ral之細胞免疫HuMab小鼠，如Lonberg，N.等人在

Nature 368(1994)856-859 中；Fishwild，D.M.等人在Nat. Biotechnol. 14(1996)845-851 中及 WO 98/24884 中所述。較 佳地’此等小鼠在經第一次免疫時為6至16週齡。舉例而 言，可使用經IL-13Ral轉染細胞經腹膜腔内免疫HuMab小 鼠。可用藉由眼窩後放血得到之血漿樣品監控整個免疫程 序過程中之免疫應答。可藉由ELISA及/或FACS來筛選血 毀。可使用具有足夠抗-人類IL-13 Ral人類免疫球蛋白滴度 的小鼠来永生化相應B細胞。可在宰殺及切除脾臟及淋巴結 前3至4天用抗原經靜脈對小鼠加強免疫。舉例而言，可免 疫HCo7或HCol2係HuMab小鼠。HCo7小鼠在其内源輕鏈（κ) 基因中具有一 JKD破壞（如Chen等人在（1993) EMBO J. 12 : 821-830中所述），在其内源重鏈基因中具有一 CMD破壞（如 WO 01/14424之實例1所述）並具有一 KCo5人類κ輕鏈轉基 因（如 Fishwild，D.M.等人在（1996) Nature Biotechnology 14:845-851中所述）及一 HCo7人類重鏈轉基因（如美國專利 第5,770,429號所述）。HC〇12小鼠在其内源輕鏈（1^)基因内具 有一 JKD 破壞（如 Chen, J_ 等人在 EMBO J. 12(1993)821-830 中所述）、在其内源重鏈基因中具有一 CMD破壞（如WO 01/14424實例1中所述）並具有一KC〇5人類κ輕鏈轉基因（如 Fishwild, D.M.等人在 Nat. Biotechnol. 14(1996)845-85 1 中 107551.doc -37· 1306862 所述）以及一 HCol2人類重鏈轉基因（如WO 0 l/l4424實例2 中所述）。可分離小鼠淋巴細胞並根據產生雜交瘤之標準程 序使用PEG使其與一小鼠骨趟瘤細胞系融合。隨後|帛選所 得到之雜交瘤以用於產生抗原專一性抗體。例如，用5 〇 % PEG使來自經免疫小鼠之源於脾臟與淋巴結之淋巴細胞的 單一細胞懸浮液與SP 2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞 (ATCC ’ CRL 1581)融合。以約〇.75xl07個細胞之量將該等 細胞鋪板於平底微量滴定板中，繼而在選擇培養基中培育 約2周。隨後藉由ELISA及/或FACS來篩選各孔以選出人類 抗-IL-13Ral單株IgM及IgG抗體。一旦出現大量雜交瘤生 長’則將分泌抗體之雜交瘤重新鋪板並再次篩選，若仍對 人類IgG、抗IL-13Ral單株抗體呈陽性，則可藉由限制稀釋 將其至少亞選殖2次。然後在活體外培養穩定的亞係以在組 織培養基中產生抗體以供定性。 轉基因小鼠之免疫程序 使用lxio6個經一 IL-13Ral之表現載體轉染的HEK293細 胞免疫3只HCo7小鼠（GG2201係）（3只皆為雄性小 鼠）（Medarex，San Jose，CA，USA)及 2只 HCol2小鼠（GG2198 係）（1 只雄性及 1 只雌性）（Medarex，San Jose，CA, USA)。以 腹膜腔内（i.p.)及尾基部皮下（s.c.)注射之方式交替實施總 共8次的免疫。對於第一次免疫，將1 〇〇微升1 X 1 〇6個 HEK293:IL-13Ral細胞與100微升完全Freund氏佐劑（CFA ; Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。對於其他所有免 疫，將存於PBS中之100微升細胞與1〇〇微升不完全Freund I07551.doc -38 * 1306862 氏佐劑（ICFA ; Difco)混合。 小鼠之加強免疫 當觀察到抗-IL-13R(xl之血清滴度已足夠時，在融合前4 及3天額外用存於200微升PBS之1χ1〇6個HEK 293:IL-13Rod 細胞經靜脈内（i.v.)對小鼠實施2次加強免疫。 實例2 藉由ELISA測試HuMab與固定化IL-13Ra丨的結合 為測定本發明抗體與重組IL-13Ral結合之能力，將 IL-13Ral之胞外結構域（R&D Systems，UK)溶於PBS中（1微 克/毫升）並藉由在4°C下培育過夜來使其吸附於微量滴定板 (NUNC Maxisorb)上。使用洗滌緩衝液(WB=〇9% NaC1 ; 0.1% Tween® 20)洗滌該等滴定板後，藉由添加ι〇0微升培 育緩衝液（IB =附有 1% crotein C及 0.1% Tween® 20之PBS) 並於室溫（RT)下培育3 0分鐘來封阻非專一性結合位點。隨 後添加經連續稀釋之HuMab及對照抗體（1〇〇微升/孔；存於 IB之稀釋液）並於rt下培育1小時。重新洗滌該等滴定板並 藉由使用過氧化物酶偶聯的兔抗_人類k(DAK〇，Denmark) 抗體在一存於IB之1:500最終稀釋液中檢測已結合之人類 抗體。使用過氧化物酶偶聯的多株驢抗_山羊Ig(3抗體（Santa Cruz ;存於IB之1:1〇〇〇稀釋液）來檢測多株山羊抗_hIL_ 13Ral抗體。在室溫下培育1小時並實施一後續洗滌步驟 後於 RT下使用即用 ABTS®溶液（R〇che Diagnostics GmbH) 在暗處顯色該等滴定板◎在最高濃度吸光率達到一足夠〇D 值後量測4〇5奈米處吸光率。 107551.doc -39- 1306862 經測試之全部抗IL-13Ral抗體皆能夠與固定化人類 IL-13Ral胞外結構域相結合。對於經測試之各種LC抗體， 測得EC50值係介於0.5至2 nM之間。陰性對照HuMab抗-KLH未與固定化IL-13Ral胞外結構域結合。所加入作為陽性 對照之多株山羊-抗人類IL-1 3Ral抗體亦可有效結合固定化 IL-13Ral胞外結構域（圖1)。 • 實例3 IL-13與IL-13Ral/IL-4Ra異二聚體（ELISA)之結合的抑制 # 在一振盪器上於4°C下使用存於PBS中之100微升濃度為 3微克/毫升之hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質（R&D Systems, UK) 塗覆微量滴定板。使用WB洗滌滴定板之後，添加經連續稀 釋之HuMab及對照抗體（100微升/孔；存於IB之稀釋液）並於 RT下培育30分鐘。重新洗滌該等滴定板且隨後加入一 IL-13(R&D Systems, UK; 0.5微克/毫升；經IB稀釋之稀釋 液）與 IL-4Ra(R&D Systems，UK ; 0.75微克/毫升；經IB稀 釋之稀釋液）之混合物並於RT下培育1小時。洗滌該等滴定 ® 板之後，加入濃度為0.4微克/毫升之100微升經生物素化之 抗 IL-13抗體（BAF213 ; R&D Systems，UK)並於 RT下培育 1 小時。洗蘇該等滴定板之後，藉由過氧化物酶偶聯的鏈黴 抗生素蛋白（Roche Diagnostics GmbH，DE)之存於IB中的 1:5000稀釋液（在RT下培育，時間為1小時）來檢測已結合之 IL-13。最後，洗滌該等滴定板並在室溫下（RT)用即用ABTS® 溶液（Roche)於暗處顯色。45至60分鐘後量測405奈米處之 吸光率。 107551.doc -40- 也 1306862 抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及LC5002-0 18能夠以介於約50°/❶至80-85%間之最大抑制值 抑制IL-1 3與異二聚體受體之結合。陽性對照係AF152(多株 兔抗體）。如所預計，陰性對照抗-KLH未抑制IL-13與異二 聚體受體之結合。對於LC5002-002、LC5002-003、 LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-018 所獲得 IC5。值係介 於1.5 nM至10.1 nM之間（圖2)。 實例4 放射性配體結合分析 使用表現人類IL-13Ral及人類IL-4Ra之CHO細胞在結合 緩衝液（25 mM HEPES、150 mM NaCM、1 mM CaCl2、5 mM MgCl2及0.5%牛血清白蛋白，調整至pH 7.2)中實施1251 IL-13結合分析。使每孔的lxlO5個細胞與抗體混合並預先培 育15分鐘至1小時。加入0.1 nM 125I-IL-13並在4°C下將該混 合物培育4小時。由飽和結合分析、競爭分析及125I IL-13 與細胞系結合達到平衡時125I IL-13輸入量之測定來確定試 驗中所用125I-IL-13之濃度。將樣品收集至一經1% PEI/0.5% BSA預處理之GF/C濾板上並使用Packard TopCount Scintillation計數器計數6藉由非線性回歸曲線擬合用 PRISM實施數據分析（GraphPad Software, San Diego, CA)。 測得所有抗IL-13Rctl之抗體皆會阻斷經標記IL-13與 IL-13Ral/IL-4Ra複合體之結合。計算得抗體LC5 002-002、 LC5 002-003、LC5002-005、LC5002-007及 LC5002-0 18之 IC50 值係介於0.09 111\4至0.32 11]^之間且人？152之1(：5〇值係84.8 107551.doc • 41 · 1306862 nM(圖 3)。 實例5

HuMab對人類B細胞及單核細胞上之IL-13誘發之CD23上 調的抑制 藉由一 Ficoll Hypaque密度梯度分離末梢血單核細胞 (PBMC)。使用RPMI洗滌之後，將該等細胞懸浮於RPMI/10% FCS中並以3xl05 PBMC/孔（體積為50微升）分佈於96孔平底 微量滴定板（Corning Incorporated Co star)中。隨後加入最終 濃度為0.5微克/毫升（存於RPMI/10% FCS中）之25微升抗-人 類CD40抗體（Immunotech)及最終濃度為10微克/毫升（存於 RPMI/10% FCS中）之25微升抗-人類IgA+IgG+IgM抗體 (Immunoresearch)。然後加入經連續稀釋之HuMab及對照抗 體（50微升/孔；存於RPMI/10% FCS中之稀釋液）並在培養箱 (37°C ; 5% C02)中培育該等細胞30分鐘。隨後加入最終濃 度為0.67毫微克/毫升之重組人類IL-13(R&D Systems)(50微 升/孔）並在37°C /5% C02下培育該等細胞72小時。經此培育 後，離心該等滴定板並抽吸出培養基。為分離黏壁細胞’ 加入200微升Accutase(PAA)並在37°C，5% C〇2下培育該等 細胞約5分鐘。藉由重複沖洗分離該等細胞並轉移至一圓底 滴定板中。離心並抽吸出上清液以後，使用一抗-CD23_PE 抗體、抗-CD20-FITC抗體及抗-CD14_APC抗體（全部皆來自 BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)之 200微升混合 物培育該等細胞。於4°C下’培育此等細胞30分鐘’隨後離 心並抽吸出上清液。重複此洗滌步驟一次且最後將該等細 107551.doc -42- 1306862 胞重新懸浮於200微升PBS/0.1%人類血清白蛋白中並使用 CellQuest軟體在一 FACS Calibur流式細胞儀（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)中分析。在大多數 情況下，獲得10,000個事件並使用一光散射儀閘道對其進 行門控以便僅包括成活淋巴細胞及單核細胞。使用一針對B 淋巴細胞之CD19陽性簇或一針對單核細胞之CD14陽性簇 來預門控此等細胞並進一步對其進行CD23表現分析。 抗體 LC5002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007 及LC5002-018抑制B-淋巴細胞上CD 23上調之IC5G值經觀 測係介於0.5 11]^至>7〇11]^之間且對於八？152該1(：5〇係13.6 nM。人們亦發現，對IL-13在人類單核細胞上誘發的CD23 上調之抑制具有一類似特性。在單核細胞上，抗體1^05002-002、LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007及 LC5002-018 之IC5〇值係介於0.1 nM至62.8 nM之間且對於AF152該IC50 係 62.9 nM。 實例6 TF-1響應於IL-13或IL-4刺激之增殖分析 使TF-1細胞（ATCC#CRL 2003)生長於含有經ATCC修飾 之RPMI、10% FBS、lx青黴素/鏈黴素、2毫微克/毫升 GM-CSF之培養基中。在分析之前1天，在無GM-CSF培養基 中培育該等細胞。使用適當濃度之抗-IL-13Ral抗體在37°C 下培育5x103個細胞/孔1小時。隨後使用2毫微克/毫升人類 IL-13(R&D Systems，Minneapolis，MN)或 0.1 毫微克/毫升人 類 IL-4(R&D Systems, Minneapolis，MN)刺激該等細胞並於 107551.doc -43- 1306862 37°C下培育48小時。使用0.5pCi 3H-胸苷對該等細胞施加規 律刺激並在37 °C下培育16至18小時。使用Perkin Elmer Filtermate 96收集器將樣品收集到經1% PEI/0.25% BSA預 處理之 GFC板上。使用一 Perkin Elmer Top count Scintillation計 數器計數該等GFC板。藉由非線性回歸曲線擬合（GraphPad Software, San Diego，CA )用 PRISM實施數據分析。 在此試驗中，抗-KLH抗體未顯示出任何抑制作用。在此 試驗中，LC5002-007亦未顯示出任何抑制作用。其他全部 1 抗體皆抑制該響應，但與其他抗體相比，LC5002-007以更 高之1C值抑制該響應。所測得不同抗體之IC5〇值係：13.50 nM(AF152)、9.21 nM(LC5002-002)、3.07 nM(LC5002-003) 及0.39 nM(LC5002-005)。經發現IL-4-誘發之TF-1細胞增殖 具有一類似特性，然而，與IL-13-誘發之響應相比，該等抗 體之效能較低。IL-4-誘發之增殖之IC5G值係0.02 nM(抗-IL4R抗體）、74.37 nM(AF152)且對於抗體 LC5002-002、 LC5002-003、LC5002-005、LC5002-007及 LC5002-018，該 > IC5〇值係介於4·68ηΜ至60nM之間。 實例7 人類肺成纖維細胞響應於Π-13之嗜伊紅趨化因子生成抑制 使用HFL-1細胞（人類肺成纖維細胞，ATCC# CCL-153)實 施此分析。以1〇〇,〇〇〇個細胞/孔之密度將細胞鋪板於一 12-孔板中並在37°C下培育72小時至達到鋪滿狀態。隨後在不 含血清之培養基中使此等細胞饑餓24小時並用抗-IL-13Ral 抗體在3 7°C下處理1小時。在此處理之後’使用1〇毫微克/ 107551.doc -44 - 1306862 毫升 IL-13(R&D Systems, Minneapolis, MN)在 37°C 下刺激 細胞48小時。收集上清液並使用自R&D Systems購得之 EUSA(目錄編號DTX00)實施啥伊紅趨化因子測定。使用 Spectromax微量板讀數器讀出吸光率並使用PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA )分析數據。 所測試抗體呈現不同程度之抑制嗜伊紅趨化因子釋放的 能力。除LC5002-007之外，所測試其他全部抗體皆呈現某 種程度之抑制。自3至4個不同實驗計算得到之平均IC5Q值對 於 AF152 為 11.5 nM 且對於抗體 LC5002-002、LC5002-003、 LC5002-005、LC5002-007 及 LC5002-018 係介於 2·45 nM 至 19.8 nM之間。 實例8 人類支氣管平滑肌細胞中IL-13-誘發之Stat-6磷酸化之抑制 根據製造商說明書培養人類支氣管平滑肌細胞（BSMC ; Clonetics，目錄編號CC-2576)。使細胞生長於12-孔組織培養 板中直至其達到鋪滿狀態。在不含企清之培養基中使細胞 饑餓24小時並加入不同數量的抗體。培育該等培養板1小時 且隨後使用2.5毫微克/毫升11^-13(尺&0 8丫816111)刺激。培育 1 5分鐘後，去除上清液，使用磷酸鹽緩衝液洗滌細胞並加 入100微升溶胞缓衝液。在冰上短暫超聲處理該混合物並離 心。溶胞產物用於磷酸化Stat-6之西方點潰分析檢測。將等 量蛋白質上樣至一 SDS-凝膠上，電泳並轉移至一膜上。抗-Stat-6抗體係購自 Santa Cruz Biotechnology(目錄編號 SC-il 762R)並 使用一 過氧化 物酶偶 聯的二 級抗體 。使 用購自 107551.doc -45 - 1306862

Amersham 之 ECL Plus System(目錄編號 RPN 2132)實施檢 測。在一 Typhoon 9400成像儀中進行定量。 在此分析中，經測試之兩種HuMab(LC50002-003及 LC5002-005)皆可抑制IL-13-誘發之Stat-6磷酸化。此分析中 測得之效能與其他功能性分析之效能相類似。經計算對於 AF152 IC5〇值係 18.64 nM，對於LC5002-003係 5.98 nM且對 於 LC5002-005係 1·18 nM。 實例9 抗-hIL-13Ral HuMab可變結構域（κ-輕鏈及γ丨-重鏈）之選殖 及序列分析 藉由標準cDNA合成/PCR程序來分離編碼抗-hIL-13Ral HuMab之輕鏈可變區VL及重鏈可變區VH之核苷酸序列。使 用 GeneRacerTM套組（Invitrogen)自 lxlO6至 lxlO7個雜交瘤細 胞中製備總RNA。將源自雜交瘤之RNA作為用來合成第一 鏈cDNA及連接GeneRacerTM Oligo-dT引物之模板。分別用 互補於K-輕鏈及γ 1 -重鏈恆定區之核皆酸序列的反向輕鏈和 重鏈引物及5'-專一性GeneRacer™引物來實施第二鏈cDNA 合成及VL與VH編碼cDNA片段之進一步PCR擴增。使用購自 InvitrogenTM Life Technologies之TOPOtmTA選殖套組並以 pCR4-TOPOTM作為選殖載體來選殖PCR產物。藉由使用 EcoRI消化之適宜質粒的限制性酶切圖譜來鑑別經選殖的 PCR產物且VL及VH之預期/計算DNA片段大小分別為約740 及790 bp。藉由雙鏈定序來確定經選殖PCR片段之DNA序 列。使用 GCG(Genetics Computer Group，Madison， 107551.doc -46- 1306862

Wisconsin)軟體包（版本 10.2)及 Vector-NTI 8(InforMax公司） 進行總體數據處理。使用GCG模組CLUSTALW比對DNA及 蛋白質序列。使用程式GENEDOC(版本2.1)來實施序列比 對。 實例10 一抗-hIL-13Ral IgG丨HuMab之表現質粒的構建 分別在哺乳動物細胞表現載體中組裝抗·hIL-13Ral HuMab輕鏈及重鏈編碼基因。由此可將編碼抗_hIL_13Ral HuMab輕鏈可變區（VL)及人類κ-輕鏈恆定區（cL，SEQ ID NO : 11)之基因片段與抗-hIL-13Ral HuMab重鏈可變區（VH) 及人類γΐ-重鏈恆定區（CH1-鉸鏈-CH2-CH3，SEQIDNO: 12) 之基因片段連在一起。關於人類輕鏈及重鏈之核苷酸序列 的一般資訊在 Kabat，E. A.，Wu, T. T.，Perry, Η. M.， Gottesman，K. S.及 Foeller, C. ,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號第 91-3242號 中給出，其中亦給出了關於密碼子使用的資訊。抗 -hIL-13Ral HuMab κ輕鏈之轉錄單位係由以下元件構成： •來自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟動 子， • 一包含一 Kozak序列之合成5'-UT， •一包含信號序列内含子之鼠類免疫球蛋白重鏈信號序列， •經選殖之抗hIL-13Rctl HuMab可變輕鏈cDNA ,其在5'末端 排列有一唯一 Bsml限制酶切位點且在3 ’末端排列有一剪接 供體位點及一唯一 Notl限制酶切位點， 107551.doc •47· 1306862 •人類基因組κ-基因惶定區，其包含内含子2小鼠ig_K增強子 [Picard, D.及 Schaffner，W.，Nature 307(1984)80-82]及 •人類免疫球蛋白K-聚腺苷酸化（"p〇ly A")信號序列。 抗hIL-13Ral HuMab γΐ-重鏈抗體之轉錄單元由下列元件構 成： •來自人類巨細胞病毒（HCΜV)之立即早期增強子及啟動 子， •一包含一 Kozak序列之合成5'_UT， •一包含信號序列内含子之經修飾鼠類免疫球蛋白重鏈信 號序列， •經選殖之抗hIL-13Ral HuMab可變重鏈cDNA，其在5,末端 排列有一唯一 BsmI限制酶切位點且在3'末端排列有一剪接 供體位點及一唯一 Notl限制酶切位點， •人類基因組γΐ-重鏈基因恆定區，其包含小鼠Ig μ_增強子 (Neuberger，M.S. ’ EMBO J. 2(1983)1373-1378) ’ •人類γΐ-免疫球蛋白聚腺苷酸化（"poly A")信號序列。 抗-hIL-13Ral HuMab κ-輕鏈及γΐ-重鏈表現質粒之功能元 件： 除抗-hIL-13RalHuMabK-輕鏈或γΐ-重鏈表現盒之外，此 等質粒亦包含 •一潮黴素抗性基因 • 一 Epstein-Barr病毒（EBV)複製起始點-〇riP， •來自載體pUC18之複製起始點，其允許此質粒在大腸桿菌 中複製，及 107551.doc -48- 1306862 •可在大腸桿菌中賦予氨苄青黴素抗性之β_内醯胺酶基因。 實例11 突變（變體）抗-hIL-13Ral IgGl之表現質粒的構建 藉由使用QuickChangeTM定點誘變套組（Stratagene)定點 誘變野生型表現質粒可生成編碼突變體抗_hIL-13Ral γΐ-重 鏈之表現質粒且闡述於表1中。根據EU編號方式編碼胺基 酸[Edelman，G.M·等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1969) 78-85 ； Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, Η. M., Gottesman, K. S.，and Foeller, C.,(1991) Sequences of Proteins of Immunologicallnterest，第 5版，NIH 出版號第 91-3242號]。 表1 突變 說明 PVA-236 ;用 E233P 表示 之GLPSS331 ; L234V ; L235A ； AG236; 使用人類γ2-重鏈之胺基酸序列Pr〇233Val234Ala235取代人類γΐ-重鍵之胺基酸序列GlU233LeU234LeU235Gly236 A327G； A330S ； P331S 使用人類γ4-重鍵之胺基酸序列Gry327Leu328Pr〇329Ser33〇Ser33i 取代人類γΐ -重鍵之胺基酸序列Ala327Leil328Pr〇329Ala33〇Pr〇331 L234A ； L235A 使用胺基酸序列Ala234AIa235取代人類γΐ-重鏈之胺基酸序列 LeU234LeU235 _ 實例12 重組抗-hIL-13Ral HuMab之產生 藉由瞬時轉染培養於補充有10%超低IgG FCS(Gibco)、2 111]^麩胺醯胺（0比(：〇)、1%¥/¥非必需胺基酸（〇丨1^〇)及25 0微 克/毫升 G418(Roche Diagnostic GmbH，DE)之 DMEM(Gibco) 中的HEK293-EBNA貼壁細胞（ATTC CRL-10852)來產生重 組HuMab。為進行轉染，以介於3:1至6:1之間的試劑（微升） 與 DNA(微克）比例使用 FugeneTM 6(R〇che Diagnostics GmbH， 107551.doc • 49- 、勿 1306862 DE)轉染試劑。使用一自1:2至2:1之輕鏈編碼質粒與重鏈編 碼質粒的莫耳比自兩種不同質粒表現免疫球蛋白輕鏈及重 鏈。在轉染後第4天至第11天時，收集含有HuMab之細胞培 養上清液。 有關人類抗體在（例如）HEK293中重組表現之一般資訊於

Meissner，P.等人之 Biotechnol. Bioeng. 75(2001)197-203 中 給出。 實例13 a)使用嵌合 hIL-13Ral:hFc 實施之 HuMab LC5002-003、 -005及-007的親和力分析 為進行相互作用分析，使用Biacore 3000儀器。使用25 °C之運行及反應緩衝液HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaCl，0.005%高分子表面活性劑p，pH 7.4)。以5微升/分鐘 之流速及20微克/毫升之濃度對捕捉分子（山羊抗-人類_IgG 抗體，具FcY專一性）實施20分鐘胺偶聯。以10微升/分鐘之 流速及1微克/毫升之濃度注射HuMab 1分鐘。藉由以3〇微升 /分鐘流速注射500 nM人類γ球蛋白3分鐘來達成對游離山 羊抗人類IgG、Fey的阻斷。以介於5·63 ηΜ至90 ηΜ之間的5 個濃度注射分析物（hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質）兩分鐘，並 用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2次1〇〇 mM HC1(每次i分鐘） 來凡成表面再生。芯片、分析形式及注射順序以及動力學 數據示於表2中。自樣品曲線減去陰性對照數據（例如，緩 衝液曲線）以校正系統内部基線漂移及降低干擾信號。使用 BiaEValuation版本4.01來分析感應圖譜及計算親和力數 107551.doc -50 - 1306862 據。藉由將動力學數據擬合於1:1 Langmuir結合模型計算動 力學數據（表2)。 表2: 使用hIL-13RahhFc實施之HuMab親和力分析（基於1:1 Langmuir結合模型之數據分析） 芯片 捕捉分子 配體 分析物 ka(l/Ms) kd(l/s) K〇(M) CM5 抗-hFcy LC5002-003 hIL-13 Ral:hFc 2.1x10s 1.4x10^ <6.5x10七 CM5 抗-hFcy LC5002-005 hIL-13 Ral:hFc 1.73x10' 3.12X10·5 1.8χ1〇·" CM5 抗-hFcy LC5002-007 hIL-13 Ral:hFc 1.19x10' lxl0'b <8.4><10'u b)使用裂解自hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質胞外結構域之 hIL-13Ral胞外結構域實施的 HuMab LC5002-003、-005 及 -0 0 7之親和力分析 使用Biacore 3000儀器進行相互作用分析。運行及反應緩 衝液係25°C 之HBS-P(10 mM HEPES，150 mM NaC卜 0.005% 高分子表面活性劑P，pH 7.4)。以5微升/分鐘流速及100微 克/毫升之濃度對捕獲抗體分子（抗-hFcY)實施20分鐘胺偶 聯。以10微升/分鐘之流速注射濃度為10微克/毫升之HuMab 達3 0秒。以介於1.5 6 nM與100 nM之間的7個濃度注射裂解 hIL-13Ral分子（Mw40kDa)200秒並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由 以10微克/毫升之流速注射2次100 mM HC1(每次1分鐘）來完 成表面再生。芯片、分析形式及注射順序及動力學數據對 應於下表3中之說明。藉由將動力學數據擬合於1:1 Langmuir結合模型計算動力學數據。 107551.doc •51 - 1306862 表3

芯片 捕捉分子 配體 分析物 ka(l/Ms) kd(l/s) Kd(M) C1 抗-hFcy LC5002-002 hIL-13Ral 1.1 xlO6 6.5xl〇·4 6.2x10-10 C1 抗-hFcy LC5002-003 hIL-13Ral 1.3xl06 5.1xl0'4 3.9xlO'10 C1 抗-hFcy LC5002-005 hIL-13Ral 1.4xl06 3.0xl〇·4 2.2xlO'10 C1 抗-hFcy LC5002-007 hIL-13Ral 1.9xl05 8.3xl0'4 4.4xl0'9 C1 抗-hFcy LC5002-005,突變 體L234A; L235A hIL-13Ral 1.4xl06 2.9xl0'4 2.1xlO'llJ c)使用裂解自hIL-13Ral:hFc嵌合蛋白質胞外結構域之 hIL-13Roil的胞外結構域實施的LCS002-005之重組變體的 親和力比較分析 在此等實驗中，將對源自雜交瘤之原始IgGl之親和力與 重組變體IgGl-Ala-Ala之親和力加以比較。對於相互作用分 析，使用Biacore 3000儀器。運行及反應緩衝液係25°C之 HBS-P(10 mM HEPES, 150 mM NaCl，0.005%高分子表面活 性劑P，pH 7.4)。以5微升/分鐘之流速及20微克/毫升之濃度 對捕獲抗體分子（抗-hFcy)實施20分鐘胺偶聯。以10微升/分 鐘之流速注射濃度為10微克/毫升之HuMab達1分鐘。以介 於1.56 nM至200 nM之間的8個濃度注射裂解hIL-13 Ral分 子（分析物）5分鐘並用HBS-P洗滌5分鐘。藉由注射2次100 mM HC1(每次1分鐘）來完成表面再生。芯片、分析形式及注 射順序及動力學數據對應於表4中之說明。藉由將動力學數 據擬合於一二價分析物結合模型計算動力學數據。 107551.doc -52- 1306862 表4 芯片 捕捉分子 配體 分析物 kal (1/Ms) Kd, 1/s) Ka2 il/RUs) K„2 (1/s) Kd(M) CM5 抗-hFcy LC5002-005 hIL-13 Ral 1.33xl05 3.6X10·4 5.8xl0'3 0.06 2.7x10·。 CM5 抗-hFcy IgGl ala-ala LC5002-005 hIL-13Ral 1.53xl05 4.2x1ο·4 4.1xl0'3 0.04 2.8xl0'9 實例14 藉由ELISA測試HuMab與hIL_13R<*2及hIL-4Ra之交叉反 應性* 將嵌合蛋白質 hIL-13Ra2:hFc 及 hIL-4Ra:hFc(R&D Systems，UK)溶於PBS(1微克/毫升）並藉由於4°C下培育過 夜來使其吸附於微量滴定板（NUNC Maxisorb)上。使用洗滌 緩衝液（WB=0.9% NaCl ; 0.1% Tween® 20)洗滌該等滴定板 後，藉由添加100微升培育緩衝液（IB =附有1% crotein C及 0.1% Tween® 20之PBS)並於室溫（RT)下培育30分鐘來封阻 非專一性結合位點。隨後添加經連續稀釋之HuMab及對照 抗體（100微升/孔；經IB稀釋之稀釋液）並於RT下培育1小 時。重新洗滌滴定板並用過氧化物酶偶聯的兔抗-人類κ抗 體（DAKO，Denmark)在一存於IB之1:500的最終稀釋液中培 育，藉此來檢測已結合抗體。於RT下培育1小時並實施一後 續洗滌步驟之後，使用即用ABTS®溶液（Roche Diagnostics GmbH，DE)於RT下在暗處顯色滴定板。在最高濃度吸光率 達到一足夠OD值後量測405奈米處吸光率。 所測試之全部抗IL-13Ral抗體皆能夠與人類IL-13Ral之 固定化胞外結構域結合，但其不能與hIL-13Ra2或hIL-4Ra 結合（圖4)。 107551.doc -53- 1306862 實例15

HuMab與鼠類IL-13Ral之交叉反應性 將嵌合蛋白質鼠類IL-13Ral :hFc(R&D Systems，UK)溶於 PBS(1微克/毫升）並藉由於4°C下培育過夜來使其吸附於微 量滴定板（NUNC Maxisorb)上。使用洗條缓衝液（WB = 0.9% NaCl ; 0.1% Tween® 20)洗滌該等滴定板後，藉由添加100 微升培育緩衝液（IB =附有1% Crotein C及0.1% Tween® 20 之PBS)並於室溫（RT)下培育30分鐘來封阻非專一性結合位 點。隨後向該等孔（100微升/孔；經IB稀釋之稀釋液）中添加 經連續稀釋之HuMab及對照抗體（HuMab抗-KLH抗體及多 株山羊抗-hIL-13Ral抗體（R&D Systems))並於RT下培育1小 時。重新洗滌滴定板並用過氧化物酶偶聯的兔抗-人類κ抗 體（DAKO，Denmark)在一存於IB之1:500的最終稀釋液中培 育，藉此來檢測已結合之人類抗體。藉由過氧化物酶偶聯 的驢抗-山羊IgG抗體（Santa Cruz;存於IB之1:1000稀釋液） 檢測已結合至該等滴定板之山羊抗-hIL- 13Ral抗體。於RT 下培育1小時並實施一後續洗滌步驟之後，於RT下使用即用 ABTS®溶液（Roche Diagnostics GmbH, DE)在暗處顯色滴定 板。在最高濃度吸光率達到足夠OD值後量測405奈米處吸 光率（圖5)。 實例16

HuMab與獼猴IL-13Ral之交叉反應性 藉由RT-PCR自獮猴組織分離編碼IL-13Ral之基因並轉 染至鼠類細胞系Ba/F3中。為測試HuMab是否會與獼猴 107551.doc • 54·

1306862 IL-13Ral交叉反應，使用10微克/毫升HuMab及對照抗體培 育經穩定轉染之Ba/F3細胞以及親代Ba/F3細胞。使用一多 株山羊抗人類hIL-13Ral抗體（R&D Systems)作為陽性對 照。所加入陰性對照係：一人類IgGl骨髓瘤蛋白（Nordic) 及正常山羊血清。藉由FACS分析使用一直接針對與FITC偶 聯之人類IgG的抗體（用以檢測HuMab)及一直接針對與 FITC偶聯之山羊IgG的抗體（用以檢測山羊抗體）檢測已結 合抗體。對在經轉染之Ba/F3細胞系與母體細胞系上測試之 各個抗體之平均螢光強度（MFI)加以比較。 本發明之全部HuMab皆能夠與經轉染Ba/F3細胞中表現 之獼猴IL-13Ral相結合。如根據人類和獼猴IL-13Ral之間 的近源性所預計的，多株AF152抗體亦可與獼猴IL-13Ral 結合。當用經轉染之Ba/F3細胞系測試時，陰性對照抗體僅 顯示MFI之少量增加（表5)。 表5 抗體 MFI Ba/F3 MFIBa/F3 Cyno IL-13Ral — 存在 Cyno_IL-13Ral時， ΜΪΊ之增加倍數 HuMab LC5002-002 3.9 83.7 79.8 LC5002-003 3.4 82.4 79.0 LC5002-005 14.8 101.5 86.7 LC5002-007 4.1 19 14.9 對照 AF152 3.2 21.2 18.0 正常山羊IgG 3.3 5.7 2.4 正常人類 IgGl (Nordic) 3.5 10.2 6.7 107551.doc -55- 1306862 僅有抗-人類 IgG-FITC 3.3 5.5 2.2 實例17 IL-13Ral HuMab與Fey受體之結合（結合NK細胞上 FcyRIIIa) 為測定本發明抗體結合天然殺傷（NK)細胞上 FcyRIIIa(CD16)之能力，分離末稍血單核細胞（PBMC)，並 在存在或不存在20微克/毫升針對FcyRIIIa之封阻小鼠抗體 (抗- CD16，選殖 3G8，RDI，Flanders，NJ)下與 20 微克 / 毫升 HuMab抗體及對照抗體一起培育以驗證經由FcyRIIIa之結 合。將不結合 FcyRIIIa之人類 IgG2及 IgG4(The Binding Site) 用作陰性對照。將人類IgGl及IgG3(The Binding Site)用作 FcyRIIIa結合之陽性對照。藉由FACS分析使用經PE標記之 小鼠抗人類CD56(NK-細胞表面標記物）抗體（BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)以及一經FITC標 記之山羊F(ab)2抗人類 IgG(Fc)抗體 （Protos immunoresearch，Burlingame，CA)來檢測已結合於 NK細胞 上之抗體。測定所測試HuMab在20微克/毫升（Bmax:MFI土 st.dev)下之最大結合。 如由 580.6±245.8 之 Bmax(MFI)值所顯示，LC5002-005 能 夠有效結合FcyRIIIa(與對照IgGl抗體相當）。添加一針對 FcyRIIIa之阻斷抗體顯著降低LC5002-005與NK細胞之結 合，（Bmax(MFI)值為260.4±95.90)表明可特異結合 FcyRIIIa。 107551.doc -56-

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1306862

Tuaillon, Ν·,等人，Immunol. 152 (1994) 2912-2920 美國專利案第4,640,835號 美國專利案第4,496,689號 美國專利案第4,301,144號 美國專利案第4,670,417號 美國專利案第4,791，192號 美國專利案第4，179,337號 美國專利案第5,202,238號 美國專利案第5,204,244號 美國專利案第5,545,806號 美國專利案第5,545,807號 美國專利案第5,569,825號 美國專利案第5,625，126號 美國專利案第5,633,425號 美國專利案第5,661，016號 美國專利案第5,770,429號 美國專利案第5,789,650號 美國專利案第5,814,318號 美國專利案第5,874,299號 美國專利案第5,877,397號 van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol 5 (2001) 368-374

Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 WO 87/05330 WO 92/22645 WO 92/03918 WO 93/1227 WO 94/25585 WO 96/29417 WO 97/15663 WO 98/24884 WO 01/14424 WO 03/080675 107551.doc -59- 1306862 [序列表說明] SEQ ID NO : 1 HuMab LC5002-002之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 2 HuMab LC5002-002之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 3 HuMab LC5002-003之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 4 HuMab LC5002-003之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 5 HuMab LC5002-005之重鏈可變結構域 SEQ ID NO : 6 HuMab LC5002-005之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 7 HuMab LC5002-007之重鏈可變結構域 # SEQ ID NO : 8 HuMab LC5002-007之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO : 9 HuMab LC5002-018之重鏈可變結構域 SEQIDNO: 10 HuMab LC5002-018之輕鏈可變結構域 SEQ ID NO · 11 κ輕鏈恆定區 SEQ ID NO ： 12 γΐ重鏈恆定區 【圖式簡單說明】 圖1展示抗-IL-13Ral抗體與固定化重組人類IL-13Ral多 肽之結合。包括多株兔-抗-人類IL-13Ral抗體AF152(R&D ^ 系統）及作為一陰性對照HuMab之抗-KLH抗體。 圖2展示抗-IL-13Ral抗體對IL-13與固定化IL-13Ral/ IL-4Ra受體之結合的抑制。 圖3展示抗-IL-13Ral抗體對IL-13與CHO細胞（表現 IL-13Ral及IL-4Ra2)之結合的阻斷。包括一作為一陽性對照 之市售多株抗-IL-13Ral 抗體（AF152，R&D Systems, Minneapolis, MN) ° 圖4展示抗-IL-13Ral抗體與hIL-13Ral之結合及其與功能 •60- 107551.doc 1306862 相關受體hIL-13Ra2及hIL-4R<x之結合性質。 圖5展示抗-IL-13Rctl抗體結合固定化重組鼠類IL-13Ral 多肽之能力。包括多株山羊-抗-人類IL-13Ral抗體AF152 (R&D系統）及作為一陰性對照HuMab之抗-KLH抗體。

107551.doc 61 1306862 序列表 <110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120> 抗IL-13受體αΐ之抗體及其用途 <130> 22922 <140> 094147847 <141> 2006-05-23 <150> ΕΡ 05000003.3 <151> 2005-01-03 <150 ΕΡ 05002229.2 <151> 2005-01-03 <160> 12

<17〇> Patent工n version 3.2 <210> 1 <211> 119

<212> PRT 人工合成 <220> <223> LC5002-QQ2VHy/重鏈可變結構域 <400> 1

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn lie Tyr 20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val He Ser Gly Arg Gly He Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asel Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Ser Ser Ser Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 107551.doc 1306862

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 > > Λ > 0 12 3 111 1 2 2 2 2 2 107 PRT人工合成 <220> <223> LCSQ02-002 VL K/輕鏈可變結構域 <400> 2 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu 1 5 10

Ser Ala Ser Val Gly 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin 20 25

Gly lie Ser Arg Trp 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala 35 40

Pro Lys Ser Leu lie 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro 50 55

Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 8B 90

Asn Ser Tyr Pro Trp 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> 人工合成 <220> <223> LC5〇〇2-〇〇3 VH γ/重鏈可變結構域 <400> 3

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu 15 10 lie Gin Pro Gly Gly 15 107551.doc 2 \ 1306862

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn lie Tyr 20 25 3〇

Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val lie Ser Gly Arg Gly lie Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Ser Ser Tyr Trp 100

Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 107

<212> PRT <213>人工合成 <220> <223> LCS002-003VLK/輕鏈可變結構域 <400> 4

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30

Leu Ala. Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

107551.doc 1306862

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 5 <211> 118 <212> PRT <213> 人工合成 <220> <223> LC5002-005 VH γ/重鏈可變結構域

<400> 5

Glu Val Gin Val Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 . 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly 工le Ser Gly Ser Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Glu Gly Asp Trp lie Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Leu Val lie Val Ser Ser 115 -4 107551.doc 1306862 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213>人工合成_ <220> <223> LC5002-005 VLk/輕鏈可變結構域 <400> 6

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Glrx Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser His Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> 人工合成 <220> <223> LC5〇〇2-〇〇7 VH γ/重鏈可變結構域 <400> 7

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 107551.doc 1306862

Ala Phe Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie lie Pro lie Leu Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Glu Thr Leu Asp Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213>人工合成 <220> <223> LC5002-QQ7 VL K/$莖鏈可變結構域 <400> 8

Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala lie Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 6- 107551.doc 1306862

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Tyr Gly Ser Ser Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Tlxr Lys Val Glu lie Lys 100 105 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < 9 119

PRT 人工合成 <220> <223> LCSCQ2-C18 VH γ/重鏈可變結構域 <400> 9

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ph.e Thr Phe Asn lie Tyr 20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val lie Ser Gly Ser Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Ser Ser Trp Tyr Val Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107

<212> PRT <213>人工合成 I07551.doc 1306862 <220> <223> LC50Q2-018 VL K/輕鏈可變結構域 <400> 10

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 8Q

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> 人類 <400> 11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 107551.doc 1306862

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 65 70

Lys His Lys Val Tyr Ala 85

Pro Val Thr Lys Ser Phe 100

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 75 80 Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 90 95 Arg Gly Glu Cys 105 <210> 12 <211> 330 <212> PRT <213> 人類 <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5

Ser Thr Ser Gly Gly Thr 20

Phe Pro Glu Pro Val Thr 35

Gly Val His Thr Phe Pro 50

Leu Ser Ser Val Val Thr 65 70

Tyr lie Cys Asn Val Asn 85

Lys Val Glu Pro Lys Ser 100

Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115

Lys Pro Lys Asp Thr Leu 130 107551.doc

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 10 15 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45 Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 75 80 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 90 95 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Leu Pjie Pro Pro 120 125 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 9- 140 1306862

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Tlir 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325. 330 107551.doc -10-

Claims (1)

1. DO^S®47847 號專利申請* .中文申請專利範圍替換本(97年10月） --- %十、申請專利範圍： 曰修(更)正木 -— --------- 1· 一種結合IL-13Ral且抑制IL-13生物活性之人類抗體，其 特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸序列CDR3係SEQ ID NO : 5之重鏈CDR3序列。 2. 如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體之可變重鏈胺基酸 序列 CDR1 及 CDR2 係 SEQ ID NO: 5 之重鏈 CDR1 及 CDR2 * 序列。 3. 如請求項1或2之抗體，丼特徵在於該抗體之可變輕鏈胺基 Φ 酸序列CDR1、CDR2及CDR3係SEQ ID NO : 6之可變輕鏈 胺基酸序列CDR1、CDR2及CDR3。 4. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於包含一包括下列之人類 γ 1 -重鍵· a) 缺失Gly236之胺基酸序列Pr〇233Val234Ala235及/或胺基 酸序列 Gly327Leu328Pr〇329Ser330Ser33i， b) 胺基酸序列Ala234Ala235 ’或 C)胺基酸 Ala265及 A1&297。 Φ 5.如請求項1或2之抗體，其特徵在於包括作為重鏈可變區之 SEQ ID NO : 5及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 6。 6. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於包括作為重鏈可變區之 SEQ ID NO : 5及作為輕鏈可變區之SEQ ID NO : 6、作為 κ輕鏈恆定區之SEQ ID NO : 11及作為γΐ重鏈怪定區之視 情況具有突變L234A及L235A或D265A及Ν297Α之SEQ ID NO : 12。 7. —種如請求項1至6中任一項之抗體於製備一醫藥組合物 107551-971001.doc 1306862 的用途。 8 _ —種醫藥組合物，其包括一醫藥有效量之如請求項1至6 中任一項之抗體。 9· 種重組宿主細胞’其可產生如請求項1至6中任一項之重 組抗體。 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 種製備一醫藥組合物之方法，該醫藥組合物包括一醫藥 有效量之如請求項1至6中任一項之抗體。 種編碼如請求項1至6中任一項之抗體之核酸，其特徵在 於包括一編碼SEQ ID NO : 5之重鏈CDR的抗體及SEQ ID 〇 6之輕鍵cdr的抗體的核酸。 種表現載體，其包含如請求項u之核酸，能夠在一原核 或真核宿主細胞中表現該核酸。 原核或真核伟主細胞，其包含如請求項12之載體。 :種製備-結合IL_13Ral且抑制仏七與結合之 夕肽”法’其特徵在於在一原核或真核宿主細胞中表現 如請求川之編碼-重鏈之核酸及編碼—輕鏈之核酸，並 自該細胞回收該多肽。 —種如請求項1至6中任一瑁夕浐 項之抗體於製備用於治療有q 療哮喘或抗過敏需要之患者之藥物的用途。 一種製備醫藥組合物夕古、土 # # 、 平、且口物之方法’其特徵在於藉由重組表現^ 法產生如明求項1至6中任一項之^_雜 τ 貝之抗體，回收該抗體並使言 抗體與醫藥上可接受之选 安又之綾衝劑及/或佐劑相組合。 107551-971001.doc